Summary
En el manuscrito, describimos el uso de un análisis de reportero de fluorescencia basada en levadura a identificar componentes celulares implicados en la trata de personas y matar procesos de los citotóxicos a una subunidad de la ricina toxina de planta (RTA).
Abstract
Bacteriana y planta A / toxinas B explotan las vías de tráfico naturales en las células eucariotas para llegar a sus destinos intracelulares en el citosol y en última instancia matar. Tal A / toxinas B consisten en generalmente un enzimático activo Asubunit (p. ej., toxina de ricina (RTA)) y una o más células enlace Bsubunit(s), que es responsables de toxina vinculante específico para receptores de superficie celular. Nuestro conocimiento actual de cómo A las toxinas B son capaces de intoxicar eficientemente células ayudó a los científicos para entender los mecanismos celulares fundamentales, como la endocitosis y la proteína intracelular clasificación en células eucariotas superiores. Desde un punto de vista médico, asimismo es importante identificar las rutas de tráfico principales toxina para encontrar soluciones de tratamiento adecuada para pacientes o para eventualmente desarrollar aplicaciones terapéuticas de toxina para terapia del cáncer.
Desde el análisis del genoma del tráfico en células de mamíferos la toxina B es complejo, lento y caro, varios estudios sobre una / transporte de la toxina B han llevado a cabo en el organismo del modelo de la levadura Saccharomyces cerevisiae. A pesar de ser menos complejos y fundamentales procesos celulares de levadura y las células eucariotas superiores pueden transferirse a la situación mamífera son similares y muy a menudo los resultados obtenidos en la levadura.
Aquí, describimos un análisis reportero rápido y fácil de utilizar para analizar el tráfico intracelular de RTA en la levadura. Una ventaja esencial de la prueba de nuevo es la oportunidad para investigar no sólo retro-desplazamiento de RTA desde el retículo endoplásmico (ER) en el citosol, pero algo endocitosis y toxina retrógrada transportan de la membrana del plasma en la sala de emergencia. El ensayo hace uso de un plásmido reportero que permite una medición indirecta de la toxicidad de la RTA a través de emisión de fluorescencia de la proteína fluorescente verde (GFP) después de la traducción en vivo . Como RTA eficientemente previene la iniciación de la biosíntesis de la proteína por 28S rRNA depurinación, este ensayo permite la identificación de proteínas de la célula huésped involucrado en el transporte intracelular de RTA a través de la detección de cambios en la emisión de fluorescencia.
Introduction
Pacientes que sufren de infecciones por bacterias de producir la toxina representan una grave carga médica y financiera para cada sistema de salud social, en particular tratamientos terapéuticos eficaces son todavía en gran parte desaparecidos. Desarrollar nuevas estrategias terapéuticas, los mecanismos complejos de la intoxicación del médicamente relevante A las toxinas B como la toxina del cólera, Shiga toxina ricina necesita ser entendido completamente a nivel molecular basado en ensayos poderos novela que deben aplicarse.
En los últimos años, varios estudios intentaron analizar A / transporte de la toxina B en levaduras y células de mamíferos mediante métodos desperdiciadores de tiempo y costosa como toxina radiactivo etiquetado1,2 , así como basado en el siRNA se acerca a3. En algunos casos, trata de la toxina ha sido visualizado en vivo por microscopía de fluorescencia después de acoplamiento químico o genética de subunidades de la toxina individual con fluoróforos, puntos cuánticos o proteínas fluorescentes4,5. Por desgracia, tales modificaciones conducen a menudo a propiedades naturales inactivadas o alteradas de las toxinas. Otra forma elegante de responder indirectamente a una amplia variedad de cuestiones científicas es el uso de sistemas de reportero basados en enzimas como lacZ, luciferasa o proteínas fluorescentes (e.g. GFP o Discosoma sp. (proteína fluorescente roja dsRed)).
En este manuscrito, se describe un protocolo simple que identifica los componentes celulares necesarios para el transporte intracelular de RTA aplicada extracelularmente en S. cerevisiae. Por lo tanto, un plásmido reportero de fluorescencia que contiene una señal N-terminal ER-import seguida de GFP actúa como un sensor de la biosíntesis de proteína, que indirectamente mide la inhibición de la traducción de RTA-mediado proteína GFP fluorescencia emisión después de la en vivo traducción6. En caso que endocitosis RTA o tráfico intracelular negativamente (o positivamente) sufre en un mutante de levadura especial eliminación en comparación con el tipo salvaje, esto se puede detectar a través de un aumento (o disminución) en la fluorescencia de GFP emisión6.
Hasta ahora, todos los métodos de análisis de transporte de RTA en células de levadura fueron restringidos en el proceso de retro-desplazamiento ER al citosol de RTA. En un sistema tan artificial, que contiene una señal de importación ER RTA se expresa de un promotor inducible, resultando en un fenotipo suicida1,7. Aunque la célula Unión subunidad B de ricina es además que falta en la configuración experimental descrita en este manuscrito y, por lo tanto, no totalmente representa la situación natural de ricina holotoxin intoxicación8, transporte de la toxina del plasma membrana a través del aparato de Golgi al ER puede mímico de cerca con este ensayo novela. Curiosamente, los resultados preliminares obtenidos en el estudio piloto indican que las vías de tráfico utilizadas por RTA revelan similitudes sorprendentes con la ruta de intoxicación de ricina holotoxin.
En Resumen, el método descrito puede ser utilizado para determinar el papel específico de las proteínas celulares en endocitosis RTA y trata de levadura. Además, este montaje experimental podría ser fácilmente adaptado a otro ribosoma inactivar las toxinas producida y secretada de diversas levaduras y especies bacterianas como zymocin o toxina Shiga.
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Protocol
Nota: Un resumen del flujo de trabajo experimental general se representa en la figura 1.
PRECAUCIÓN: RTA es altamente tóxica para los seres humanos. Se necesita permiso de laboratorio de seguridad S2 (bioseguridad nivel 2 equivalente). Favor de utilizar guantes durante todo el experimento.
1. la expresión heteróloga de su etiquetado RTA en Escherichia coli
- Transformar las células de e.coli con el plásmido de expresión pET24-RTA(su) 6 o el vector vacío pET24a(+) usando electroporación estándar protocolos9,10. Las células que contienen el plásmido vacío sirven como control negativo.
- Después de la selección de clones positivos en placas de LB (100 μg/mL) que contiene kanamicina, inocular las células que contienen el plásmido de expresión de la RTA o el vector vacío en medio dekan 5 mL LB (medio LB con 100 μg/mL de kanamicina) e incube a 37 ° C y 220 rpm por 24 h.
- Suplemento 1 LB de Lkan mediana con precultivo 5 mL e incubar las células a 37 ° C y 220 rpm hasta que las células han alcanzado un OD600 de 0.8-1.0 (aproximadamente 3-4 h). Después de eso, reduzca la temperatura de cultivo a 28 ° C y preparar un 1 M de la solución madre de Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) de H2O.
- Inducen la expresión de la RTA de la e. coli añadiendo IPTG a una concentración final de 1 mM.
- Después de 3,5 horas a 28 ° C y 220 rpm, cosecha las células por centrifugación a 10,000 x g y 4 ° C durante 10 minutos, lavar el pellet dos veces con 5 mL de tampón de unión (500 mM NaCl, imidazol de 10 mM y 20 mM KH2PO4 pH = 7.4) a 10.000 x g y 4 ° C por 10 min y resuspender pellet en 5 mL de tampón de Unión.
Nota: Protocolo puede hacer una pausa en esta etapa y las células pueden almacenarse a 80 ° C por varios días.
2. purificación de su etiquetado RTA mediante cromatografía de afinidad
- Someter a ultrasonidos las células en hielo utilizando el siguiente protocolo: pulso s 15 (20 micras), 30 de s de pausa. Repita este paso cinco veces.
- Centrifugar células lisado en 21.000 x g y 4 ° C por 15 minutos y filtrar el sobrenadante utilizando un sistema de filtros de jeringa estériles (tamaño de poro de 0,2 μm).
Nota: Pellets celulares de sonicación con éxito muestras muestran fronteras transparentes. - Utilizar un sistema automatizado de purificación con 5 mL Ni2 +-basado en columna de afinidad para purificar la fracción de su etiquetado RTA de la estéril filtrada e. coli sobrenadante. En general, utilice una velocidad de elución de 1 mL/min y enfriar el sistema de purificación todo para evitar la Unión de la toxina no eficiente y pérdida de la actividad de la toxina.
Nota: Los parámetros para la purificación eficiente de RTA se enumeran en la tabla 1. Véase también Becker et al. para más información9.- Brevemente, equilibrar la columna de afinidad con 20 mL de tampón de Unión para eliminar el buffer de almacenamiento. Aplicar el sobrenadante estéril filtrado en la columna de afinidad utilizando una jeringa.
- Lavar la columna con 25-35 mL de tampón de Unión para eliminar las proteínas no Unidas de la columna. Realizar el paso de lavado hasta absorbancia UV a 280 nm es cercana al valor inicial de la UV.
- Eluir la fracción unida de la RTA en 20-35 mL de tampón de elución (imidazol de 500 mM, 500 mM NaCl, 20 m m KH2PO4, pH = 7.2) y mantener la muestra en hielo (figura 2A y figura 2B).
Nota: Elución de la fracción de RTA se caracteriza por un aumento en la absorción de UV. Tenga en cuenta para recoger exclusivamente esta fracción para evitar la contaminación con proteínas encuadernadas no específicas. - Utilice 20 μl de las muestras eluídas a cabo azul Coomassie tinción11 o mancha blanca /negra occidental análisis12,13 (opcional). Utilizar primaria contra su anticuerpos (1:1, 000) y secundaria anti-anti-ratón-IgG-HRP (1:10, 000) para detectar RTA y verificar la pureza de la muestra (figura 3).
- Eluídas fracción RTA en una columna de 5 mL desalación del desalt y equilibrar la muestra en 0,8 M sorbitol.
- Vuelva a colocar la columna de afinidad de sistema de purificación de la columna de la desalación y primero equilibrar la columna con 20 mL de sorbitol de 0,8 M.
- La fracción de RTA eluída se aplica a la columna por medio de una jeringa. Lavar la columna con 100 mL de sorbitol de 0,8 M y eluir la fracción RTA desalada en un tubo de 15 mL en cuanto a la absorción UV comienza a aumentar (figura 2).
- Almacenar la fracción RTA eluída a 4 ° C.
Nota: Directamente deje de muestreo fracción de RTA cuando aumenta la conductancia para evitar la contaminación de sal. Parámetros para el procedimiento de desalación se enumeran en la tabla 1.
- Concentrado de fracción de RTA eluída a 10.000 x g y 4 ° C por 30-180 min., usando una columna de giro de corte 10 kDa hasta un volumen final de 1-2 mL y almacenar la muestra a 4 ° C durante 3-4 semanas.
PRECAUCIÓN: No congelar la muestra desde la congelación conduce a una pérdida completa de actividad de RTA. - Determinar la concentración de proteína usando un kit de determinación de la proteína convencional. Concentración de la proteína debe estar en el rango de 1-1.5 mg/mL.
Nota: RTA tiende a precipitar si la concentración de proteína es muy alta (> 5 mg/mL).
3. transformación y eliminación de la pared celular de levadura
- Transformar a mutantes de deleción de levadura salvaje o seleccionado con la GFP reportero plásmido pRS315-K28SP- GFP6 utilizando acetato de litio estándar transformación métodos14. Incubar las células en el abandono de la leucina (d/o) placas de glucosa (glucosa 2%, agar 1,5%, sulfato de amonio 0,5%, 0,17% levadura nitrógeno Base (YNB) y 0.087% d/o mix sin leucina) a 30 ° C durante 2-3 días para la selección de clones positivos.
- Escoger 3 clones de levaduras diferentes de cada placa y sembrar los clones en 100 mL de leucina d/o medio de rafinosa (rafinosa 2%, sulfato de amonio 0,5%, 0,17% YNB y 0.087% d/o mezclar sin leucina) en 220 rpm y 30 ° C a OD600 = 1.0-2.0 (2-4 x 107 células/mL).
Nota: El crecimiento de las células de las levaduras diferentes de eliminación es diferente. Monitor OD600 mediante un espectrofotómetro. - Para calcular los valores de OD600 , diluir las muestras a OD600 = 0.1-0.3 (1:5 a 1:10 diluciones) y medir OD600 en un espectrofotómetro. Como referencia, el uso de H2O complementado con la correspondiente cantidad de medio de leucina d/o raffionose.
- Después de terminar paso 3.5, 4 μL de la cultura spheroplasted 50 mL de la mezcla con 496 μl de tampón de spheroplasting (aproximadamente 2 × 106 Esferoplastos) y centrifugar 10 min a 400 x g.
- Pellets de resuspender en 10 mL de H2O destilada, muestra de vortex por 30 s y placa 10 μl de la muestra en placas de glucosa de d/o leucina (glucosa 2%, agar 1,5%, sulfato de amonio 0,5%, 0,17% YNB y 0.087% d/o mix sin leucina).
- Incube las células durante 3 días a 30 ° C. Contar el número total de colonias de células crecidas en la placa. Para la evaluación de datos, utilizar sólo las muestras con eficiencia superior al 98% (total de número de la colonia de células < 40 colonias/placa).
4. GFP reportero ensayo medida en placas de 96 pocillos
- Semilla a los Esferoplastos de células de levadura obtenidas en el paso 3.7 en placas de 96 pocillos (200 μL/pocillo).
- Añadir 70 μl leucina estabilizada d/o rafinosa de medio que contiene el control negativo (efluente de una Ni2 +-afinidad purificado célula de lisado de células inducida por IPTG de e. coli expresando el vector vacío) o purificada RTA en una concentración final de RTA de 5 μm ( correspondiente a 160 g/L RTA) en cada pocillo.
- Añadir 30 μL estabilizado galactosa solución (30% galactosa, sorbitol de 0,8 M) para inducir la expresión de GFP y posteriormente iniciar la medición.
Nota: Realizar al menos 3 repeticiones técnicas por experimento y 3 biológicos Replica por cepa de levadura. - Después de terminar la preparación de la muestra (pasos 4.1-4.3), pone la placa de 96 pocillos en un lector de fluorescencia y comenzar la medición. Utilice el filtro de 475/509 nm sistema requerido para la detección de la fluorescencia de GFP. Realizar mediciones a 30 ° C, 120 rpm y con un diámetro de agitación de 1 mm sobre una ventana de tiempo de 20 h (medición de intervalos de 10 min).
Nota: El conjunto de filtro GFP está normalmente disponible en todos los sistemas de lector. Temperatura, ventana de tiempo, medición de intervalos y la RTA concentración puede ajustarse a necesidades propias. Resultados representativos se muestran en la figura 4. - Opcional: Usar controles internos adicionales en la medida de control de calidad. Preparar un control negativo añadiendo medio rafinosa d/o 30 μl de leucina estabilizado en lugar de 30% galactosa (sin inducción de GFP). Además, añadir 70 μl de solución de 0,8 M sorbitol estabilizado G418 (300 μg/mL). El inhibidor de la proteína traducción G418 sirve como control positivo para la inhibición de la proteína impide la expresión de GFP en la levadura.
- Calcular la fluorescencia de GFP relativa en porcentaje para el momento de 20 h según la siguiente ecuación (ver Figura 4A):
donde NC es el control negativo
- Por otra parte, determinar la fluorescencia de GFP relativa para cada punto de medición (en este caso 10 min, véase también paso 4.4) utilizando la ecuación anterior. Como se muestra en la Figura 4B, crear un gráfico por borrar las intensidades de fluorescencia de GFP (eje y) con el tiempo (eje x).
donde NC es el control negativo
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Representative Results
El flujo de trabajo general del protocolo descrito en este manuscrito se ilustra en la figura 1, más o menos resumiendo los pasos solo para la purificación exitosa de RTA y el posterior experimento de ensayo de reportero GFP. Puede encontrarse una descripción más detallada de cada paso individual en el protocolo. La figura 2 ilustra el resultado esperado de una purificación exitosa de RTA por cromatografía de afinidad (figura 2A) y control de vectores vacíos (figura 2B). Figura 2 muestra un resultado representativo de un experimento de desalación ilustrando la separación ideal de la cima de la proteína (azul) y el pico eluyó sal (marrón). Una eficaz purificación de RTA se presenta en forma de un gel SDS de tinción de Coomassie en la figura 3. Finalmente, la figura 4 resume algunos resultados originales obtenidos por este reportero sencilla y robusta basada en GFP ensayo método6. Figura 4A ilustra que el ensayo de reportero GFP establecido es capaz de producir resultados confiables y representa esquemáticamente el plásmido de reportero GFP usado en este estudio. En la gráfica, la fluorescencia de GFP relativa de Esferoplastos de levaduras en condiciones RTA-tratadas y no tratadas se compara con los demás. Como era de esperarse, las células no inducida, así como tratados de G418 no mostrar casi ninguna fluorescencia de GFP. En las células no tratadas y negativos tratados con control (vacío vector), expresión de GFP no se ve afectado y no se observaron diferencias significativas entre ambas muestras. Por el contrario, RTA tratamiento conduce a la esperada reducción de la fluorescencia de GFP mediada por su inhibición de la actividad del ribosoma. En la Figura 4B, se muestra una curva de tiempo de inhibición de fluorescencia de GFP RTA-inducida. Este tipo de presentación de datos contiene información adicional sobre el momento de expresión de GFP (90 min después de la inducción de galactosa) y el punto de partida de la inhibición traduccional por RTA (210 min después de la aplicación en las células de tipo salvaje). El retraso en la disminución de la fluorescencia RTA-mediada probablemente refleja la cinética de absorción y el transporte intracelular de RTA en el citosol. Figura 4 ilustra la fluorescencia de GFP relativa obtenidos de mutantes de levaduras seleccionadas después de una 20 h RTA-tratamiento, comparado con RTA-tratamiento y en comparación con células de tipo salvaje tratadas con RTA. Los componentes ERAD Hrd1p y Der1p fueron escogidos como positivos adecuados controles porque estudios anteriores ya demostraron que ambas proteínas están implicadas en retrotranslocation ER al citosol de RTA en levadura1. Por lo tanto, ambos mutantes muestran el aumento esperado en la fluorescencia de GFP en comparación con células de tipo salvaje. Por el contrario, los valores relativos de la fluorescencia de GFP en Δyos9 y Δnup120 células no son significativamente diferentes. Ya se ha descrito que la falta de las lectinas de control de calidad de ER Yos9p ni una falta en la proteína Nup20p del poro nuclear afecta a RTA toxicidad y transporte1. Una lista de los parámetros de la cromatografía y la desalación de afinidad específica puede encontrarse en la tabla 1.
Figura 1: flujo de trabajo General de RTA purificación y ensayo de reportero basada en GFP. La purificación de RTA (izquierda) comienza con la transformación de e. coli con la expresión o el vector vacío, seguida de cultivo y expresión de RTA inducida por IPTG. Después de la lisis celular y filtración estéril, el sobrenadante se purifica mediante cromatografía de afinidad de Ni2 + y pureza de la muestra es verificado mediante tinción de Coomassie o Western blot. Antes las fracciones eluídas de RTA están listas para usar en el experimento de ensayo reportero GFP, fracciones deben ser desalado y concentrado, y se determinará la concentración de proteína. El experimento de ensayo de reportero GFP (derecha) comienza con la transformación de mutantes de deleción tipo salvaje o las levaduras con la construcción de la expresión de GFP. Después de la cultivación, la pared celular se elimina por tratamiento enzimático para permitir la absorción de RTA en vivo . Entonces, fluorescencia de GFP de Esferoplastos de células de levadura se mide condiciones toxina tratada y no tratada con el tiempo en un lector de fluorescencia (475/509 nm). Finalmente, la fluorescencia de GFP relativa se determina mediante la ecuación que se muestra en el paso 4.6 y aparece como se ilustra en la figura 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cromatografía de afinidad representativa y desalación resultados de células de e. coli que contienen pET-RTA(su) 6 o el control de vector vacío. (A) gráfico típico de purificación de una muestra de lisado de células de e. coli expresando RTA(su) 6 de vector pET24-RTA(su) 6. La curva azul representa la absorción UV a 280 nm causado por los anillos aromáticos de los aminoácidos Tyr y Trp y Cys y sirve como indicador de la proteína. Durante la carga de la columna, las proteínas son detectadas en el paso (0-10 mL). Después de quitar las proteínas por lavado con tampón de Unión, concentración de tampón de elución se incrementa de 0 a 100% (curva roja) y proteínas consolidadas son inmediatamente eluidas de la columna. El pico de la curva azul entre 25 y 30 mL representa la fracción de limite su etiquetado RTA (caja negra). (B) gráfica de purificación típico de una e. coli lisado de las células que expresan el control de vectores vacíos. Mismo protocolo de depuración como en (A). Como se muestra en la caja negra, proteínas no se eluyen de la columna en el control negativo. (C) diagrama de desalación de una muestra de(su) 6 pET24-RTA de e. coli después de la purificación de la afinidad. El diagrama muestra la separación de la fracción proteica de RTA (pico de absorción de nm 280 entre 20-30 mL) y la fracción de sal (aumento del pico de conductancia después de 30 mL).Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de diversas muestras antes y después de la purificación de la afinidad de representante occidental. 20 μl célula lisado (carriles 2-4) o la muestra purificada (carriles 5-7) de diferentes variantes de RTA (sólo RTA fue utilizado en este estudio) analizadas por SDS-PAGE y la coloración de azul de Coomassie. Carril 1, escala de proteína; carril 2, RTA no modificado; carril 3, RTAHDEL; carril 4, RTAKDEL; carril 5, RTA no modificado; carril 6, RTAHDEL; carril 7, RTAKDEL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: resultados representativos obtienen por el análisis del reportero de mutantes de deleción levadura de tipo salvaje y las tratadas con RTA. (A) pariente GFP fluorescencia de tipo salvaje Esferoplastos de levaduras que contiene el reportero plásmido pRS315-K28SP- GFP (derecha) debajo inducida (3% galactosa, GFPind.) y no inducida (2% rafinosa, GFPrepr.) condiciones después de 20 h GFP inducción. Fluorescencia de GFP relativa se analizó también en presencia de RTA (5 μm), G418 (300 μg/mL) o el control negativo (NC). El inhibidor de la proteína traducción G418 sirve como control positivo y evita la expresión de GFP en la levadura. Se indican valores promedios y desviación estándar (SD). (B) relativa GFP fluorescencia de (A) muestra como el curso del tiempo más de 20 h. Este diagrama proporciona información adicional sobre el tiempo de inhibición de la expresión y traducción de la GFP por RTA; el comportamiento de la curva refleja indirectamente la cinética de absorción de RTA y transporte intracelular en el citosol. (C) resultado representativo de defectuoso de mutantes de levaduras seleccionadas en proteínas celulares que están involucradas (Hrd1p y Der1p) o no involucrados (Yos9p y Nup120p) en RTA trata de levadura1,6. La línea punteada representa un umbral de significación que se basa en la emisión de fluorescencia obtenida por las cepas de control positivo (para más explicaciones ver referencia6). Se indican valores promedios y desviación estándar (SD). La figura fue modificada de Becker et al. 6 por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Parámetro de cromatografía de afinidad | ||
| Medición de parámetros de | UV (280 nm), concentración de tampón de elución, conductancia | |
| Configuración | Variable unidad | Valor |
| Tasa de flujo | mL/min | 1 |
| Presión máxima de la columna | MPa | 0.35 |
| Longitud de onda | nm | 280 nm |
| Tampón de Unión | Posición de la bomba | A |
| Tampón de elución | Posición de la bomba | B |
| Tampón de elución de concentración a partir | % | 0 |
| Compensación del volumen del sistema | mL | 10 |
| Equilibrio de la columna | mL | 20 |
| Inyección de muestra en jeringa de superloop | mL | volumen de lisado celular |
| Paso de lavado | mL | 20-35 |
| Paso de elución | mL | 20-35 |
| Tampón de elución de concentración durante la elución | % | 100 |
| Recalibración de la columna con 20% EtOH | mL | 50 |
| Parámetro de la desalación | ||
| Medición de parámetros de | Ultravioleta (280 nm), conductancia | |
| Configuración | Variable unidad | Valor |
| Tasa de flujo | mL/min | 4 |
| Presión máxima de la columna | MPa | 0.35 |
| Longitud de onda | nm | 280 nm |
| Tampón de Unión | Posición de la bomba | A |
| Tampón de elución | Posición de la bomba | B |
| Tampón de elución de concentración a partir | % | 0 |
| Compensación del volumen del sistema | mL | 10 |
| Equilibrio de la columna | mL | 20 |
| Inyección de muestra en jeringa de superloop | mL | volumen de lisado celular |
| Inyección de búfer desalación (0,8 M sorbitol) | mL | 100 |
| Recalibración de la columna con 20% EtOH | mL | 50 |
Tabla 1: parámetros utilizados para la purificación de la afinidad basada en la columna y la desalación. Lista de todos los ajustes de la columna correspondiente (p. ej., flujo, concentración de tampón de elución, equilibrado y duración del paso de lavado) y parámetros medidos (p. ej., conductancia o absorción UV).
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Discussion
Cuando se realiza el protocolo anterior, recomendamos las siguientes sugerencias para lograr un resultado exitoso del experimento.
Para la expresión de proteínas heterólogas, es importante no exceder la concentración de 1 mM IPTG. Concentraciones de IPTG > 1 mM inhibir expresión de RTA inducida por el promotor y plomo para bajar rendimientos de toxina. Además, las células no deben ser cultivadas a temperaturas superiores a 28 ° C para evitar la formación de cuerpo de inclusión, plegable ineficiente y la inactivación de la toxina. Expresión de RTA a temperatura más baja (e.g., 20-28 ° C) es posible y también conduce a la producción de la toxina activa biológica. Sin embargo, la reducción de temperatura adicional no mejora significativamente RTA actividad plegable y resulta en un menor rendimiento de toxina total en comparación con 28 ° C (datos no mostrados).
Parámetros de depuración de la cromatografía de afinidad (tabla 1) están optimizados para el uso de un sistema de purificación automatizada equipada con 5 mL Ni2 + afinidad columna y debe ajustarse a otros sistemas de columna casera o comercial si RTA pureza y rendimiento son subóptimos. En caso de óptima pureza de RTA (indicada por la aparición de más proteínas en geles de SDS tinción de Coomassie), un aumento de la concentración de imidazol del búfer de enlace normalmente reduce la Unión inespecífica de proteínas cargadas positivamente a las columna, aumentando así la total pureza de RTA. En el caso de óptimo rendimiento de RTA, introducción de pasos de sonificación adicional (4-8 pulsos), incubación más largo tiempo (5 h) o volúmenes más grandes de la cultura (> 1 L) puede ayudar a mejorar el rendimiento general de la toxina. Sin embargo, también es la oportunidad para purificar con éxito RTA a través de sistemas de base de la columna de spin (datos no mostrados) si no existe un sistema automatizado en el laboratorio.
Durante el paso de la desalación, es importante omitir el procedimiento de muestreo tan pronto como la conductancia comienza a elevarse. Contaminación con sal, especialmente imidazol, influye en la medición de la concentración de proteína, dando por resultado la incorrecta determinación de concentración de RTA que afecta directamente el contenido de RTA utilizado en el ensayo de reportero GFP.
Es esencial almacenar purificada RTA a 4 ° C y evitar la congelación. Muestras congeladas muestran una actividad reducida de la RTA en celda de XTT ensayos de vitalidad en las células HeLa (datos no mostrados). Las muestras purificadas pueden conservarse alrededor de 3-4 semanas antes de su actividad biológica se disminuye continuamente. Además, altas concentraciones de RTA (≥ 5 mg/mL) después de la concentración de la columna de giro son importantes porque RTA muestra una tendencia a precipitar en 0,8 M sorbitol.
Un inconveniente del método es el hecho de que RTA normalmente no es tomada por las células de levadura intacta. Para lograr resultados confiables, la pared celular de levadura debe ser extirpado completamente por tratamiento enzimático. Por lo tanto, es esencial para comprobar la eficacia de la formación del spheroplast de cada cepa de levadura por los métodos descritos en los pasos 3.4-3.5. En caso de preparación del spheroplast óptimo, el tiempo de incubación y la concentración de enzima lítico deben optimizados y monitoreados mediante microscopía de contraste de fase. Overdigestion (formación del espíritu) se puede prevenir reduciendo el tiempo de concentración o incubación de enzima lítica mientras que el enfoque opuesto es necesario en caso de digestión insuficiente. Datos de cepas con pared celular insuficiente eliminación deben ser excluidos de la evaluación de los datos.
También debe señalarse que la disposición experimental no imitan totalmente el proceso de intoxicación natural de ricina. La subunidad de B de Unión celular de ricina (RTB) falta que es normalmente responsable de enlace de toxina eficaz para residuos de galactosa en la superficie celular de las células mamíferas15. Teóricamente, esta limitación puede superarse realizando el experimento con holotoxin ricina purificada que contiene su subunidad A y B. Sin embargo, las células de levadura no poseen residuos de galactosa en su superficie celular que podría mediar la Unión de RTB8; Este hecho también explica por qué las células de levadura intacta no son sensibles contra la ricina. Por lo tanto, no está claro si RTB actuaría como componente de unión de la célula en el modelo de la levadura. Curiosamente, estudios anteriores ya demostraron que RTA capaces de llegar al citosol de las células de mamífero sin su célula atascamiento de subunidad B16. Para entender este fenómeno, decidimos usar sólo RTA en la configuración experimental para identificar los componentes celulares de la levadura que facilitan el tráfico de la membrana plasmática en el citosol de la toxina. Sorprendentemente, los componentes implicados en RTA trata de levadura muestran semejanzas llamativas a los componentes necesarios para el transporte de holotoxin ricina eficiente en células de mamíferos6. Basado en estos resultados, se puede ser especulado que RTB desempeña un papel menor en el transporte intracelular de la ricina que supone previamente y sólo es importante para el contacto inicial a la superficie de células de mamífero.
En cambio, sistemas de siRNA en células de mamífero perfectamente reflejan la situación de la toxina natural, pero son costosos y desperdiciadores de tiempo3. Además, el uso de mutantes de deleción de levadura tiene la ventaja importante que los mutantes muestran un knock-out completado de la proteína de interés, mientras que los sistemas basados en el siRNA generalmente conducen a una reducción del nivel de proteína. En algunos casos, niveles de proteína residual pueden ser suficientes para el transporte de la toxina por el que no se observa ningún fenotipo y, así, la implicación de la proteína específica no es visible en sistemas basados en el siRNA.
Aunque sólo no esenciales levaduras eliminación fueron utilizados en la original estudio6, cepas sensibles a la temperatura así como disminución de la abundancia por cepas de colección mRNA perturbación (húmedo)17 (expresión reducida nivel de esencial proteínas) además son adecuadas para este tipo de método en el futuro. En general, el papel de las proteínas esenciales no puede ser investigados con este ensayo debido a su falta de viabilidad, por lo tanto representan una limitación del sistema de ensayo.
Sin embargo, el nuevo ensayo del periodista constituye una estrategia elegante y alternativa a los métodos existentes que intentan analizar el transporte de RTA en el organismo modelo S. cerevisiae. Los estudios existentes utilizan sistemas de expresión de RTA basados en el plásmido intracelulares y se limitan al análisis de la retro-translocación de la ER en el citosol1,7. Implementación exitosa de la aplicación extracelular de RTA ahora abre la posibilidad para estudiar no sólo ER retrotranslocation sino también indirectamente analizar transporte RTA de la PM aunque el Golgi al ER.Como la función celular y la localización de la mayoría de levaduras genes hoy en día es descubierto y disponible en las bases de datos, las proteínas identificadas candidato pueden distribuirse directamente en compartimientos específicos o vías de transporte.
En general, el método de ensayo de reportero introducida representa un enfoque fácil y robusto para identificar candidatos las proteínas implicadas en el tráfico intracelular de las toxinas o subunidades de la toxina (p. ej., RTA) que bloquean la proteína traducción en vivo. Desviación estándar relativamente baja (1-10%), así como la reproducibilidad de datos en el estudio original confirma estas declaraciones. Debido al formato de la placa de 96 pocillos, una proyección rápida de varios mutantes de levadura es posible dentro de un día después de la purificación de la toxina.
En el futuro, existe la posibilidad de utilizar el método para el cribado de alto rendimiento de las bibliotecas de eliminación de la levadura. En la configuración actual, la concentración aplicada de RTA (5 μm) es capaz de disminuir la fluorescencia de GFP relativa al 50%. En estas condiciones, el método ofrece la ventaja de identificar a mutantes de la canceladura con negativo (mayor fluorescencia de GFP) y positivo (menor fluorescencia de GFP) efectos sobre el transporte de RTA. Para proyecciones de rendimiento alta, una diferencia más fuerte entre las muestras tratadas y no tratadas a veces es beneficiosa. Utilizando concentraciones más altas de la RTA o aumentar el intervalo de medida (p. ej., 48 h), un bloque aún más pronunciado de la expresión de GFP debe ser alcanzable.
Es a destacar que este método no está restringido solamente para analizar el proceso de intoxicación de extracelular RTA aplicada en levadura, pero también es la oportunidad para analizar la importación de ER de RTA expresando RTA a través de un plásmido en esta variedad de reportero GFP (datos no se muestra). Además, el enfoque de la investigación además se puede adaptar para estudiar vías de transporte intracelular de otras biosíntesis de proteínas inhibiendo proteínas como zymocin18 en el futuro. En contraste con el modo de matar bien caracterizado de zymocin, relativamente poco se sabe sobre las vías de tráfico responsables de transporte eficiente de la toxina en el citosol19,20. Así, zymocin representa a un óptimo candidato para futuros estudios como zymocin es tomado naturalmente por las células de levadura. Por lo tanto, puede omitirse la eliminación de la pared celular que mejora el rendimiento general del ensayo de reportero GFP (con respecto a tiempo y costos). Con la ayuda de este ensayo de la poderosa periodista, sería factible a diseccionar las rutas de transporte intracelular de zymocin en la levadura.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Partes de este estudio fueron amablemente patrocinadas por una subvención de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial and yeast strains | |||
| E. coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
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