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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Analyse der Kommunikation zwischen Monozyten und primären Brustkrebs-Zellen in einer extrazellulären Matrix (ECME) extrahieren-basiertes dreidimensionales System

Published: January 8, 2018 doi: 10.3791/56589
Automatic Translation
*1,2, *1, 1
1Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez, 2Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México
* These authors contributed equally

Summary

Hier beschreiben wir eine dreidimensionale Kultur-Methode, um die Morphologie des primären Brustkrebs-Zellen, sowie deren direkte/indirekte Wechselwirkungen mit Monozyten und die Ergebnisse wie Kollagen-Abbau, Immunzelle Rekrutierung, Zelle studieren analysieren Invasion, und Förderung der Krebs-in Verbindung stehenden Entzündung.

Abstract

Eingebettet in die extrazelluläre Matrix (ECM), normale und neoplastische epitheliale Zellen eng mit hämatopoetischen und nicht blutbildenden Zellen so stark beeinflussen Normalgewebe Homöostase und Krankheit Ergebnis kommunizieren. Bei Brustkrebs spielen Tumor-assoziierten Makrophagen (TAMs) eine entscheidende Rolle im Krankheitsverlauf, Metastasierung und Wiederholung; Daher ist es wichtig zur Bekämpfung der Krankheit, Verständnis der Mechanismen des Monocyte Chemoattraction Tumor Mikroumgebung und deren Wechselwirkungen mit Tumorzellen. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung eines dreidimensionalen (3D) Kokultur Systems von menschlichen Brustkrebszellen (BrC) und menschlichen Monozyten. BrC-Zellen produziert hohe basale geregelten auf-Aktivierung, normale T-Zelle ausgedrückt und abgesondert (RANTES), Monocyte Lockstoffgradient Protein-1 (MCP-1) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (G-CSF), während in Kokultur mit Monozyten, Pro-inflammatorische Zytokine Interleukin (IL) -1 Beta (IL-1β) und IL-8 wurden zusammen mit Matrix-Metalloproteinasen (MMP)-1, MMP-2 und MMP-10 bereichert. Dieser Tumor Stroma Mikroumgebung gefördert Widerstand gegen Anoikis in MCF-10A 3D Azini-ähnliche Strukturen, Chemoattraction von Monozyten und Invasion der aggressiven BrC Zellen. Die hier vorgestellten Protokolle bieten eine kostengünstige Alternative zur Intra-Tumor Kommunikation studieren und sind ein Beispiel für das große Potenzial, das in-vitro- 3D Zellsysteme bereitstellen, um die Besonderheiten der Tumorbiologie im Zusammenhang mit Tumor zu verhören Aggression.

Introduction

Tumorbiologie ist weit komplizierter, als bisher angenommen. Montage Beweise zeigt, dass Tumorzellen mehr als eine bloße Bulk unkontrolliert wuchernde Zellen; Vielmehr scheinen verschiedene neoplastische Zellen verschiedene Aufgaben anzeigen hoher Organisation und Hierarchie innerhalb der Tumor-1. Tumorzellen sind auch in intime Kommunikation mit nicht-transformierten Zellen: Makrophagen, Endothelzellen, Fibroblasten, Lymphozyten, Fettzellen zwischen den anderen Zellen sind alle eingetaucht in das Gerüst Proteine und Polysaccharide, die das ECM darstellen. Zahlreiche direkte und indirekte Wechselwirkungen entstehen zwischen den transformierten und nicht-transformierten Zellen und mit der ECM, die einen starken Einfluss auf die Krankheit Ergebnis2,3ausübt. Im konkreten Fall des BrC ist es besonders wichtig, die Kommunikation der BrC Zellen mit TAMs, wenn man bedenkt, dass TAMs gefunden wurden, um eine entscheidende Rolle in der Entwicklung des Tumors, wodurch das Risiko von Metastasen und Wiederauftreten der Krankheit4 zu zergliedern ,5.

Intra-Tumor Interaktionen und ihre möglichen Ergebnisse zu analysieren, neue 3D in-vitro- Ansätze wurden basierend auf den Einsatz von ECM-Extrakte, die eine sehr viel komplexere Mikroumgebung bieten näher an der Realität der Tumorbiologie, im Vergleich zu die konventionelle Monolage Zellkulturen, in denen die Zellen wachsen, befestigt an Kunststoff. Petersen und Bissell6 hat das erste Modell der Vorsteherdrüse und bösartige Mamma Epithelzellen kultiviert auf einer Basalmembran Laminin-reiche und waren die ersten, die 3D organotypischen Strukturen zu beschreiben, die Vorsteherdrüse Menschen diskriminieren Brust Epithelzellen von ihren bösartigen Pendants. Ein Jahrzehnt später, das Modell von Debnath, Muthuswamy, entwickelt und Brugge7,8,9 vorgesehen ein wertvolles Instrument um die biologischer Signalwege beeinträchtigt bei malignen Transformation von Drüsen Azini, erhellen diese als große Azini Formation durch Wildwuchs, Verlagerung der tight Junction-Proteine als Beweis für Sehbehinderte Zelle Polarisation und Verlust der Azini Lumen durch Zellresistenz, Anoikis, tritt ein programmierter Zelltod, die in Anchorage-abhängige Zellen, wenn sie von den umliegenden ECM zu lösen. Die Modelle der Sameni, Jedeszko und Sloane konzentrierten sich auf bildgebende proteolytische Aktivität von Zellen, die Invasivität, eine weitere wichtige Eigenschaft von Tumor Malignität10,11,12in engem Zusammenhang. Diese Modelle setzen auf Protein-Matrizen mit verschiedenen Fluoreszenz abgeschreckt Protein Substrate gemischt (DQ-Gelatine, DQ-Kollagen I und DQ-Kollagen IV), in welche fluoreszierende Signale sind bezeichnend für den proteolytischen Abbau von Kollagen. 3D-Modelle kann werden auch verwendet, um Stammzellen Eigenschaften beider nicht transformiert und Tumorzellen, in welcher Zelle Aggregate, auch genannt Sphäroide zu studieren, kultiviert in Suspension oder ECM-ähnliche Proteine für Mechanismen der Zelldifferenzierung, asymmetrische Verhören Zellteilung, Einhaltung von Zelle zu Zelle und Zelle Motilität13,14. Invasion-Assays ermöglichen testen die innere Aggressivität des Tumors und die Identifikation der Moleküle, die als Chemoattractants während der invasiven Verfahren15 dienen. Insgesamt, 3D Modelle repräsentieren eine erschwingliche Diversifikation in Vitro Zellkultur, die normal und onkogenen Gewebe Morphogenese genauer zu reflektieren.

Wir haben ein 3D Co Zellkultursystem basierend auf der oben genannten Modelle7,10,11, entworfen mit beiden menschliche kommerzielle BrC Zelllinien des bekannten aggressiven Potenzial (luminalen und Triple-negativen Typen) und primäre Zellen von BrC Patienten explantiert. Wir zuerst ein Modell entwickelt, wo waren entweder nicht-aggressive (MCF-7) oder aggressive (MDA-MB-231) BrC Zellen Co kultiviert mit U937 Monozyten im Auszug extrazelluläre Matrix (ECME)-basierten 3D System, das erlaubt direkten Zell-Zell-Interaktionen. Diese Ko-Kulturen wurden verwendet, um festzustellen, wie die Kommunikation zwischen diesen beiden Linien die Transkription einer Reihe von Genen im Zusammenhang mit Krebs aggressives Verhalten beeinflusst. Eine deutliche Steigerung der Cyclooxygenase-2 (COX-2) Abschrift wurde beobachtet, die fiel mit einer erhöhten Produktion von eines seiner Produkte, Prostaglandin E2 (PGE2), ein Befund, die die Rolle der Entzündung in der Tumorprogression hervorgehoben. Erhöhter Transkription von MMP wurde auch beobachtet, dass mit mehr Kollagen Proteolyse korreliert, wenn aggressive MDA-MB-231 Zellen zusammen mit U937 Monozyten in DQ-Kollagen IV-haltigen Kulturen gezüchtet wurden. Der Hinweis unterstützte unsere Ko-Kulturen nicht die Annahme, dass Zell-Zell-Interaktion-Mechanismen für den Abbau von Kollagen benötigt werden. Es schlug eher, dass die Kommunikation zwischen den beiden Linien durch sekretierten Moleküle vermittelt wurde. Darüber hinaus enthalten die Überstände geerntet aus dieser Kokultur Assays lösliche Faktoren, die Drüsen gebildet durch nicht-transformierten MCF-10A Zellen13Azini unorganisiert. Es wurde festgestellt, dass aggressive und primäre BrC Zellen abgesondert erhöhte Niveaus der Monocyte chemotaktische Moleküle MCP-1, GM-CSF und RANTES. So skizziert wir eine 3D Culture in der Zellen in Zelle Kultur Einsätze, Zell-Zell-Interaktionen zu verhindern getrennt wurden. Diese Kulturen wurden verwendet, um die indirekte Kommunikation zwischen BrC Zellen und Monozyten zu adressieren. Für diese Tests, nicht-aggressive und aggressive kommerzielle BrC-Zell-Linien und primären BrC Zellen und drei verschiedene Arten von menschlichen Monozyten: kommerzielle U937 und THP-1 Zellen und primäre Monozyten (PMs) aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern (alle isoliert Monozyten im nicht aktivierten Zustand verwendet wurden) wurden verwendet. Erhöhte Konzentrationen von inflammatorischen Zytokinen IL-1β und IL-8 wurden beobachtet, um in Kokultur angereichert werden. Ebenso wurde festgestellt, dass MMP-1, MMP-2 und MMP-10 auch in der BrC-Zellen-Monocyte-Ko-Kulturen und damit verstärkenden zurück Ergebnisse14erhöht wurden. In diesem Manuskript ist ein Punkt-für-Punkt-Workflow Erstisolierung BrC Zellen und Erprobung in 3D Kulturen zusammen mit repräsentative Ergebnisse vorgestellt. Diese Arbeit ist ein gutes Beispiel für das große Potenzial, das in-vitro- 3D Zellsysteme bereitstellen, um spezifische Aspekte der Tumorbiologie zu befragen.

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Protocol

Proben von BrC Patienten wurden von der Gewebebank der Unidad de Investigación En Virología y Cáncer, Krankenhaus Infantil de México Federico Gómez erhalten. Diese Studie wurde von der wissenschaftlichen genehmigt, ethische und Biosicherheit review Boards der Hospital Infantil de México Federico Gómez: Comité de Investigación, Comité de Ética de Investigación und Comité de Bioseguridad. Alle Patienten wurden prospektiv eingeschrieben und informierten sich über die Art der Studie: diejenigen zur Teilnahme bereit unterzeichnet eine schriftliche Einwilligungserklärung vor der Probenentnahme und wurden nach den ethischen Richtlinien und am besten klinischen Praxis behandelt die Institution. Die Identität der Teilnehmer war für die Dauer der Studie anonymisiert. Eingeschlossenen Patienten wurden mit invasives Duktales Karzinom, histologische Grad 2 und klinische Phase II, mit keine vorherigen neoadjuvante Therapie vor Resektion Gewebe diagnostiziert. Patienten waren alle Frauen im Alter von durchschnittlich 56,8 Jahre alt (Bereich 42 bis 75)14.

1. 3D Zellkulturen

  1. Samen 0,1 x 106 MCF-10A Zellen oder primäre BrC in 25 cm2 Kulturflaschen mit DMEM/F12 Kulturmedium ergänzt mit 5 % Pferd Serum, 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin, 100 ng/mL Cholera Toxin, 0,5 µg/mL Hydrocortison, 10 µg/mL Insulin und 20 ng/mL des Epidermal Growth Factor (EGF). 0,1 x 106 kommerzielle BrC Samenzellen, MCF-7 Zellen und MDA-MB-231 Zellen in 75 cm2 Kultur Fläschchen mit Kulturmedium DMEM/F12 mit 10 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin ergänzt. Inkubation bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung.
  2. Spülen Sie nach 48 h die Zelle monomolekularen Film mit 10 mL von sterilen 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Trypsinize die Zelle Monolage mit 3 mL Lösung 0,05 % Trypsin und 0,48 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) für 5-10 Minuten bei 37 ° C. Fügen Sie 200 µL des entsprechenden Serums, Trypsinization zu stoppen und 7 mL Medium ohne Zusätze. Aufschwemmen der Zellen durch pipettieren und entfernen Sie ein Aliquot von 10 µL Zellen in einer Neubauer-Kammer zu zählen.
  3. Verbreiten Sie in jede Vertiefung eine Folie 8-Brunnen Kammersystem eine 40 µL Basis von reinen ECME, gefolgt von einer Inkubationszeit von 30 min bei 37 ° C.
  4. In jede Vertiefung Platzzellen 800 Nukleinsäuretablette in 400 µL DMEM/F12 (ohne Phenol rot) ergänzt, wie in Schritt 1.1 aber mit folgenden Änderungen: für primäre BrC Zellen und MCF-10A, fügen Sie 4 ng/mL von EGF und 2 % ECME; für MCF-7 und MDA-MB-231, fügen Sie nur 2 % ECME.
  5. Inkubieren Sie Kulturen bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung. Nährmedien alle 48 h zu ersetzen.
  6. Datensatz morphologische Änderungen der Zellen alle 24 h für 15 Tage mit einem optischen Mikroskop. Um die Morphologie des primären BrC zu analysieren sind Zellen, MCF-10A und MDA-MB-231 gute Referenz Zelllinien für Beispiele der bestellten acinar Bildung und ungeordneten aggressiven Krebs-ähnliche Strukturen, beziehungsweise.
  7. Erhalten Sie Bilder von Zellen im Hellfeld Mikroskopieren bei 100 X und 200 X Vergrößerung zu, und vergleichen Sie Zellmorphologie mit Referenz MCF-10A und MDA-MB-231-Zell-Linien (Abbildung 1).

2. erhalten primäre Krebszellen von Tumorgewebe

Hinweis: Um zu erhalten verwenden epithelialen Tumorzellen Gewebe aus resezierten Primärtumoren von BrC Patienten mit keine vorherigen neoadjuvante Therapie; vermeiden Sie nekrotischen Bereiche und arbeiten mit einem Minimum von 0,5 cm3 des Tumorgewebes.

  1. Waschen Sie Tumorgewebe mit sterilen 1 X PBS und disaggregieren Sie es mechanisch mit einem Skalpell in 1 – 2 mm Fragmente.
  2. Das Gewebe in einer sterilen 20 mL Glasflasche mit Kappe für 2 h bei Raumtemperatur (RT) mit 2 mL der Lösung folgen zu verdauen: Mischen Sie 1 mg/mL Kollagenase Typ I und 100 U/mL Hyaluronidase in DMEM/F12 mittlere mit 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin , unter ständigem Rühren.
  3. Filtern Sie die entstandene Suspension durch sterilisierte Stücke aus Tüll, große Stücke von unverdauten Gewebe zu beseitigen. Anschließend filtern Sie die Zellsuspension durch eine sterilisierte 100 µm-Poren-Membran.
  4. Pellet-Zellen bei 430 X g für 5 min bei RT und zweimal mit sterilen 1 X PBS waschen. Kultur-Primärzellen in DMEM/F12 Medium mit 5 % Pferd Serum, 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin, 100 ng/mL Cholera Toxin, 0,5 µg/mL Hydrocortison, 10 µg/mL Insulin und 20 ng/mL des EGF ergänzt. Ersetzen Sie das Medium alle 48 h. pflegen bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 Kulturen % CO2 -Umgebung.
  5. Sicherstellen Sie, dass die isolierten Zellen epithelialen Zellen mit einem standard Protokoll von Immunocytochemistry14. Testen Sie drei epitheliale Marker: ein Gremium von Cytokeratin (PanCK), Mucin-1 (Muc-1) und Epithelzelle Adhäsionsmolekül (EpCAM).

(3) PM Zellen aus peripherem Blut zu isolieren.

  1. Auszug ca. 40 mL des peripheren Blutes aus einer gesunden Freiwilligen, verdünnen das Blut in einem Verhältnis von 1:3 mit sterilen Endotoxin-frei 1 X PBS und ein gradient Dichtetrennung unterziehen.
  2. Legen Sie in einem konischen Rohr 2 mL Polysucrose und Natrium Diatrizoate Medium mit einer Dichte von 1,077 g/mL. Überlagern Sie vorsichtig und langsam 8 mL verdünnte Blut. Zentrifuge für 30 min, 765 X g bei RT. Verwendung der langsamsten Geschwindigkeit der Beschleunigung-Verzögerung der Zentrifuge.
    Hinweis: Nach der Zentrifugation vier Schichten gebildet werden von unten nach oben: die roten Blutkörperchen Pellet, mittlere Dichte Verlaufsebene, die mononukleären Zellen-Schicht (es erscheint als einen feinen weißen Ring) und der Plasmaschicht.
  3. Sorgfältig die mononukleären Zellschicht aus den Gradienten mit einem sterilen Pasteurpipette abrufen und waschen Sie sie dreimal mit 1 X PBS, jeweils gefolgt von langsamer Zentrifugation (430, 275 und 191 X g) für 10 min bei RT
  4. Verwenden Sie negative Auslese Protokolle zur Aktivierung der Zellen zu vermeiden. Ein Beispiel für ein solches Protokoll ist Folgendes:
    1. Waschen Sie die mononukleären Zellen einmal mit einer gepufferten Waschlösung (0,5 % Rinderserumalbumin, 2 mM EDTA in 1 X PBS). Zählen der Zellen in einer Neubauer-Kammer und eine Dichte von 1 x 107 Zellen/30 µL einer gepufferten Lösung anzupassen.
    2. Fügen Sie für jeden 1 x 107 Zellen 10 µL einer FcR Sperrung Reagenz und 10 µL eines Monocyte-Biotin-Antikörper-Cocktails, die Anti-Human-CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123 und Glycophorin A (im kommerziellen Kits enthalten) enthält.
    3. Mischen Sie die Zellen und 15 min bei 4 ° c inkubieren Fügen Sie eine zusätzliche 30 µL gepuffert Waschlösung plus 20 µL Anti-Biotin Microbeads (im Kit enthalten); Zellen zu mischen und 20 min bei 4 ° c inkubieren
    4. Waschen der Zellen einmal mit einer gepufferten Lösung Zentrifugieren bei 430 X g für 5 min bei RT und in 1,5 mL Aufschwemmen gepufferte Lösung für magnetische Trennung.
    5. Laden der Zellsuspension auf eine vorab gespült magnetische Trennsäule und 7 mL gepufferten Lösung. Sammeln der Monocyte angereicherte Fraktion in einem 15 mL konische Röhrchen, die Zellen zu zählen und wenn nicht sofort kultiviert, Einfrieren Monozyten bei einer Dichte von 2 x 106 Zellen/1 mL DMEM/F12 Medium ergänzt mit 50 % FBS und 10 % DMSO bei −80 ° C.
      Hinweis: Vermeiden Sie die Verwendung Monozyten nach mehr als 2 Monaten einzufrieren, da ihre Lebensfähigkeit gefährdet werden kann.
  5. Pflegen Kulturen von PMs in DMEM/F12 Medium ergänzt mit 6 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin, bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung.
  6. Führen Sie jede Reihe von Experimenten mit PMs von mindestens zwei verschiedenen Spendern unabhängig, wie pooling Monozyten von verschiedenen Spendern Monocyte Aktivierung führen können.

4. Aufbau 3D Co Kulturen

  1. 3D Ko-Kulturen mit der indirekten Interaktion
    Hinweis:     führen Sie diese Tests in 24 wohlen flach-Boden Kultur Platten mit Polycarbonat Zelle Kultur Einsätze mit Membranen von 0,4 µm Porengröße. In diesem Test können Überstände und Zellen am Ende des Experiments abgerufen werden.
    1. 2 x 106 U937 und THP-1 Monozyten in 10 mL RPMI 1640 Medium ergänzt um 10 % zu kultivieren FBS, 1 % Antibiotikum/antimykotische, und kultivieren Sie frische PMs in ergänzt DMEM/F12-Medium (wie bereits zuvor in Schritt 3.5), bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 Umgebung.
    2. Platte 4 x 105 Monozyten in 1 mL/auch des entsprechenden Mediums (ergänzt mit 2 ECME und 2 % FBS Monozyten U937 und THP-1, oder 2 % ECME und 6 % FBS für PMs).
    3. Legen Sie einen Einsatz in jede Vertiefung und 0,9 mL 4 x 105 BrC Zellsuspension in das entsprechende Medium (ergänzt mit 2 ECME und 2 % FBS für kommerzielle Zelllinien oder 5 % Pferd Serum für primäre BrC-Zellen). Ersetzen Sie Hälfte der gesamten Medien alle 48 h.
    4. Inkubation bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung für 5 Tage und die Überstände zu erholen. Rufen Sie Zellen durch Trypsinization ab, wenn nachfolgende Analyse durchgeführt wird.
    5. Enthalten Sie Steuerelemente von einzelnen Zellkulturen mit den jeweiligen Medien.
  2. 3D Ko-Kulturen mit direkter Interaktion
    1. Beschriften Sie BrC Zellen und Monozyten mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen vor Zellkultur ermöglicht unabhängige Sortierung von jeder Zelle Abstammung nach Kultur für die Analyse von mRNA und Protein-Expression. Verwenden Sie handelsübliche Derivate von Cumarin und Rhodamin, die frei durch die Zellmembran lebender Zellen bestehen. Ein allgemeines Protokoll für die Kennzeichnung lautet wie folgt:
      1. Bereiten Sie eine Monolage BrC Zellen von Interesse (2 × 106 Zellen in einem 25 cm2 Kultur Kolben) und ersetzen Sie die standard-Medium mit ausreichend vorgewärmt Arbeitslösung der Fluoreszenzfarbstoff (1:2 000 der Fluoreszenzfarbstoff in standard-Basis-medium ohne jede Ergänzung). Inkubieren Sie 30 min bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung. Die Farbstofflösung Aspirieren und spülen Sie Sie mit der ausreichenden sanft 1 X PBS. Aspirieren der PBS und fügen Sie die standard-Medium.
      2. Trypsinize die Zelle Monolage mit 2 mL einer Lösung von 0,05 % Trypsin und 0,48 mM EDTA für 5-10 Minuten bei 37 ° C. Fügen Sie 200 µL der FBS, Trypsinization zu stoppen und 7 mL des entsprechenden Mediums ohne Zusätze. Aufschwemmen der Zellen durch pipettieren. Nehmen Sie eine Aliquote von 10 µL Zellen in einer Neubauer-Kammer zu zählen. Fahren Sie mit der Kokultur Protokoll nach Zellzählung.
      3. Pellet-Zellen bei 430 X g für 5 min bei RT (führen Sie die erste da Monozyten in Suspension wachsen). Verwerfen Sie überstand und Aufschwemmen Sie sanft Zellen mit 3 mL einer vorgewärmten Arbeitslösung der Fluoreszenzfarbstoff (1:2 000 der Fluoreszenzfarbstoff in einem standard Basis Medium ohne Zusätze). Inkubation für 30 min bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung.
      4. Pellet-die Zellen wieder verwerfen die Farbstofflösung arbeiten und sanft mit 5-7 mL 1 X PBS aufzuwirbeln. Pellet-einmal mehr, die PBS zu verwerfen und Aufschwemmen Zellen in ca. 5-7 mL standard-Medium. Nehmen Sie eine Aliquote von 10 µL Zellsuspension auf Zellen in einer Neubauer-Kammer zählen. Fahren Sie mit der Kokultur Protokoll nach Zellzählung.
    2. Legen Sie die Kokultur wie folgt:: genug ECME an der Unterseite des Brunnens zu einer gleichmäßigen Schicht in jede Vertiefung eine Folie 4-Well Kammersystem zu verbreiten. Platte 20 µL einer einzelnen Zelle Suspension mit 5 × 105 BrC Zellen pro Bohrloch beschriftet.
    3. Nach 15-20 min Inkubation bei 37 ° C, hinzufügen eine Suspension von 2,5 x 105 beschriftet Monozyten in 80 µL Assays Medium (ergänzt mit 60 % ECME).
    4. Lassen Sie ECME, 15-20 Minuten bei 37 ° c erstarren
    5. Fügen Sie 1 mL einer 1:1 Mischung der BrC Zellen und Monocyte Nährmedien.
    6. Inkubieren Sie Ko-Kulturen bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung für 24 h, 48 h oder 5 Tage zum Nachverfolgen von Änderungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten.
    7. Verschlechtern Sie ECM Proteine um die Zellen von den Kulturen zu erholen. Aspirieren Sie und entsorgen Sie das Medium geben Sie 0,5 mL 1 X PBS mit Trypsin 0,1 % und 0,25 % EDTA hinzu und 3 h bei 37 ° c inkubieren Nach der Inkubation hinzufügen 0,5 mL 1 X PBS mit 10 % FBS zu neutralisieren die Trypsin, Aufschwemmen der Zellen durch Pipettieren kräftig um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten.
    8. Pellet-Zellen bei 765 X g für 5 min bei RT, den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in 5 mL 1 X PBS mit 10 % FBS. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
    9. Vorbehaltlich der Zellsuspension Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) mit dem entsprechenden Instrument. Sicherstellen Sie, dass die endgültige Bevölkerung mindestens 95 % rein).
    10. Nach dem sortieren, waschen Sie die Zellen mit sterilen 1 X PBS, Pellet (430 X g für 5 min bei RT), und in sterilen 1 X PBS Aufschwemmen. Zellen können nach bestimmten Protokollen für RNA Isolierung oder Protein-Analyse verarbeitet werden.
    11. Wiederholen Sie jeder Test dreimal, einschließlich 3D Kulturen von jeder einzelnen Zelle Abstammung als Kontrollen.
  3. Direkte Interaktion der 3D Ko-Kulturen zu beurteilen, Kollagen-Abbau
    1. 3D Co Zellkulturen zu etablieren, wie unter Punkt 4.2, mit den zusätzlichen Schritt des Hinzufügens von 32,5 µg/mL Typ IV Kollagen beschriftet mit Fluorescein erfolgt auf der ECME beschrieben. Die Endkonzentration von Kollagen IV in der ECME beträgt 0,5 %. Wachsen Sie die Kulturen in einem 35-mm-Deckgläschen in einem Petrischalen gelegt.
    2. Verteilen Sie eine Schicht von 40 µL ECME in den Boden der Petrischale. Lassen Sie ECME, bei 37 ° c erstarren
    3. 2.5 x 105 BrC Zellen in 10 µL des Mediums und Zellen zu beruhigen.
    4. Fügen Sie eine Suspension von 1,25 x 105 U937 Monozyten in 40 µL Assays Medium (ergänzt mit 60 % der DQ-Kollagen IV mit der Bezeichnung ECME).
    5. Lassen Sie ECME, 15-20 Minuten bei 37 ° c erstarren
    6. 2 mL einer 1:1 Mischung aus BrC Zellen und Monocyte Nährmedien hinzugeben.
    7. Inkubieren Sie die Ko-Kulturen für 5 Tage bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung. Nährmedien alle 48 h zu ersetzen.
    8. Analysieren Sie die Fluoreszenzemission in einem konfokalen scanning Mikroskop und Messen Sie die integrierte optische Dichte (IOD) pro 50 µm2 Kultur. Vergleichen Sie IODs gegenüber einzelnen Kulturen und die Kultur zum Zeitpunkt Null (Abbildung 2).

5. Analyse der Überstände von 3D Kulturen gemeinsam mit indirekten Interaktion

  1. Nach 5 Tagen Kokultur Wiederherstellen der Überstände aus der oberen und die unteren Fächer der 3D Ko-Kulturen und von den einzelnen 3D Culture-Steuerelementen. Mischen Sie nun jede Überstand durch pipettieren. Aliquoten und Store der Überstand bei −20 ° C bis zur Verwendung (bis zu einem Monat).
    Hinweis: Halten Sie Überstände bei −80 ° C, wenn Lagerung länger als einen Monat sein wird.
  2. Analysieren Sie die Überstände mit multiplexing Assay Plattformen, Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA) oder Wulst-basierten Immunoassays nach dem Hersteller empfohlenen Verfahren.
    Hinweis: Überstände können auch von Western-Blot analysiert oder konzentriert durch spezifische Pore Filter Größe bereichert Proteinfraktionen ausführen Zymography Analyse16,17zu erhalten. Alternativ können Sie die Überstände als konditionierte Medien für andere Experimente, wie unten beschrieben. Konditionierte Medien erhält in der Regel aus einer 5-Tage-Kultur (Abbildung 3).

6. Charakterisierung der Effekte Überstände aus primären BrC Zellen auf Azini Entstehung und Struktur der Azini

  1. In jede Vertiefung einer Folie 8-Well-Kammer System verbreiten eine 40 µL-Basis von ECME und lassen Sie es für 30 min bei 37 ° c zu festigen
  2. Samen 800 MCF-10A Zellen/gut in 400 µL ergänzt DMEM/F12 Kulturmedium, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
  3. 400 µL konditionierten Medien oder ergänzten DMEM/F12 Kulturmedium mit 20 ng/mL des menschlichen rekombinantes IL-1β hinzufügen.
  4. Ort der Kammer-Folie in eine Glas-Petrischale mit einer 35 mm-Petrischale gefüllt mit 2 mL PBS, eine feuchte Umgebung zu schaffen.
  5. Medien/überstand alle 48 h zu ersetzen.
  6. Erfassen Sie glanduläre Azini Bildung alle 24 h für 14 Tage mit einem optischen Mikroskop.
  7. Nach 14 Tagen der Kultur, Fleck Azini mit 100 µL 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) in einer Konzentration von 100 nM in 1 X PBS, Zellkerne zu beobachten. 25 min bei RT in ständigem Rühren inkubieren. Spülen Sie dreimal mit 1 X PBS für 5 min, jedes Mal in ständigem Rühren an RT. Mount mit einem Eindeckmittel spezifische Vorbereitung fluoreszierende Färbung. Mit transparenten Lack zu versiegeln und pflegen lichtgeschützt bei 4 ° C.
  8. Analysieren Sie die Azini mit einem konfokalen Mikroskop Aufnahmen von transversalen Stacks in unterschiedlichen Tiefen der Azini (Abb. 4A, B, C).
  9. Visualisieren Sie verschiedene zelluläre Proteine in den Azini mit richtigen Färbung Protokolle. Zum Beispiel war E-Cadherin gefärbt, zur Beurteilung von Zelle zu Zelle Adhäsion, Zellpolarität und/oder Lumen Bildung18 (Abbildung 4D).

(7) Migration Assays

Hinweis: Migration-Assays von U937 durchführen, THP-1 und frischen PMs in 24 wohlen flach-Boden-Kultur-Platten aus Polycarbonat mit Zell-Kultur-Einsätze mit Membranen von 8 µm Porengröße. Es wurde bereits gezeigt, dass die Chemokine GM-CSF, MCP-1 und RANTES abgesondert in hohen Konzentrationen in den einzelnen 3D Kulturen die aggressive BrC-Zell-Linien gefunden wurden. Es wurde vorgeschlagen, dass diese Zytokine kritisch zur Gewinnung von Monozyten auf der Website des Primärtumors waren; Dies war im Migration-Assays mit der Zytokine als Chemoattractants getestet.

  1. Kultur U937, THP-1 oder frische PMs wie in Schritt 4.1.1 beschrieben.
  2. Spülen Sie einmal jeder Einsatz mit 200 µL RPMI 1640 ohne Sera Membran Hydrat.
  3. Füllen Sie es mit 50 µL der kalten ECME, legen Sie die Einsätze in einer 24-Well flach-Boden-Kultur-Platte und ermöglichen Sie die ECME polymerisieren für 1 h bei 37 ° C.
  4. Fügen Sie 180 µL RPMI ohne FBS im oberen Fach der Platte. Fügen Sie in die untere Kammer ohne sprudelnden 800 µL RPMI ergänzt mit entweder 100 ng/mL von GM-CSF, MCP-1 oder RANTES als Lockstoffgradient. Verwenden Sie Medium ohne die Zytokine als Negativkontrolle. Inkubieren Sie für 30 min bei 37 ° C, einen Chemokin-Gradienten zu etablieren.
  5. Statt 1,5 x 105 jeder Art von Monocyte in ein steriles Röhrchen, waschen zweimal legen mit 1 mL 1 x PBS und Zentrifuge bei 430 X g für 5 min bei RT Aufschwemmen Monozyten in 20 µL von RPMI ohne FBS, Sie sie in den Einschüben , und sehr sorgfältig homogenisieren die Zellsuspension (der letzte Band der oberen Kammer ist 200 µL).
  6. Ermöglichen die Zellwanderung Fortschritt für 24 h bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung.
    Hinweis: Wie Monozyten nicht-Anhänger sind, werden wandernden Zellen in der Regel in den Medien von der unteren Fach.
  7. Entfernen Sie die Einsätze, die Medien abrufen und zählen von Zellen auf 2, 4, 6 und 24 h mit einer Neubauer-Kammer oder einem Durchflusszytometer; Alternativ, besonders wenn keine Zellen in den Medien gefunden werden, Abrufen von Bildern des unteren Teils der Einsätze mit einer Digitalkamera. Die mittlere Zellzahl von 3 Zufallsfelder (bei 100 X Vergrößerung) dient der Analyse (Abbildung 5).

(8) Invasion Assays

Hinweis: Führen Sie Invasion Assays der BrC Zellen in Kultur 24 wohlen flach-Boden Platten mit Polycarbonat Zelle Kultur Einsätze mit Membranen von 8 µm Porengröße. In unserer ursprünglichen Studien war IL-8 eines der Zytokine in die Überstände der BrC Zelle/Monocyte 3D Co Kulturen bereichert. Wurde getestet, ob dieses Zytokin bei der Invasion des BrC-Zell-Linien beteiligt war.

  1. BrC Zellen in 75 cm2 Fläschchen zu erweitern. MCF-7, T47D, HS578T und MDA-MB-231 als beschrieben in Schritt 1.2 (aber ohne ECME) und primäre BrC Zellen wie unter Punkt 2.4 beschrieben.
  2. Waschen, sobald jede Zellkultur Polycarbonat 8 µm-Pore Membran einfügen mit 200 µL Medium ohne Sera (das verwendete Medium ist abhängig von der Zelllinie getestet), die Membran zu hydratisieren.
  3. Füllen Sie den Einsatz mit 50 µL der kalten ECME (1:4 Verdünnung ECME:cold Medium ohne FBS), legen Sie die Einsätze in einer 24-Well flach-Boden-Kultur-Platte und ermöglichen Sie die ECME polymerisieren für 1 h bei 37 ° C.
  4. Sobald die ECME polymerisiert ist, fügen Sie 180 µL der jeweiligen Zelle Medien ohne FBS. Hinzufügen von 800 µL Medien ohne FBS durch die Schlitze des Einsatzes. Inkubieren Sie für 30 min bei 37 ° C, eine IL-8 Steigung zu etablieren.
    Hinweis: Vermeiden Sie Luftblasen in den Medien. Verwendeten Medien ohne FBS ist ergänzt mit 100 ng/mL IL-8 als Lockstoffgradient oder reine Medien ohne FBS als Negativkontrollen
  5. Erhalten Sie insgesamt 6 x 105 Zellen jeder Zelle Zeile wie folgt:
    1. Verwerfen Sie Überstände zu, einmal mit 10 mL 1 X PBS spülen Sie ab und fügen Sie 2 mL 0,05 % Trypsin/0,48 mM EDTA für 2 min bei 37 ° C, die Zellen zu lösen. Hinzugeben Sie 4 mL ergänzt Medium, um die Trypsin-Reaktion zu stoppen und erneut kräftig durch pipettieren.
  6. Nehmen Sie 10 µL Zellsuspension auf die Zellen in einer Neubauer-Kammer zählen aliquoten. Nehmen Sie ein Volumen von Zellsuspension mit 6 x 105 Zellen. 430 X g für 5 min bei RT Zentrifugieren, überstand verwerfen und spülen Sie Zellen in 1 mL 1 X PBS. Wiederholen Sie noch einmal die Spülung.
  7. Aufzuwirbeln Sie die Zellen in den jeweiligen Medien ohne FBS 20 µL und Platz in die Einsätze mit 180 µL des jeweiligen Mediums ohne FBS. Homogenisieren Sie sorgfältig die Zellsuspension durch pipettieren.
  8. Ermöglichen der Zellinvasion zum Fortschritt für 48 h bei 37 ° C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Umgebung.
  9. Verwerfen Sie nach 48 h entnehmen Sie den Einsatz überstand und spülen Sie den Einsatz einmal sehr sorgfältig mit 200 µL 1 X PBS. Entfernen Sie mit einem Applikator Baumwolle Spitze das überschüssige von PBS.
    Hinweis: Invasiven Zellen sind in der Regel auf die andere Seite des Einsatzes zu angebracht, wie in diesem Fall, wo Zellen sind Anhänger.
  10. Beheben Sie die Zellen zu, indem man das Einfügen in einen Brunnen einer 24-Well flach-Boden-Kultur-Platte mit 1 mL/spülen Sie gut 4 % Paraformaldehyd für 15 min bei RT Afterwards, die Einsätze einmal mit 1 X PBS.
  11. Färben der Zellen durch die Platzierung des Einsatzes in einem Brunnen, einer 24-Well flach-Boden-Kultur-Platte mit 1 mL/gut von 1 X PBS mit 0,2 % Kristallviolett für 45 min bei RT. sorgfältig mit einem Baumwoll-gespitzten Applikator entfernen alle ECME vom oberen Rand der Membran , die enthält Zellen, die nicht migriert haben, und spülen Sie gründlich mit destilliertem Wasser zu beseitigen fixiert invasive Zellen.
  12. Zählen Sie die eindringenden Zellen durch die Beobachtung der unteren Seite des Einsatzes unter den inversen Mikroskop. Die mittlere Zellzahl von 3 Zufallsfelder (bei 100 X Vergrößerung) dient. In Fällen, wo die Zellen eingedrungen als Cluster und sind schwierig zu einzeln zählen, Abrufen von Bildern aus 3 Zufallsfelder (bei 100 X Vergrößerung) mit einer digitalen Kamera. Analysieren Sie die Bilder mit Software für die Bildanalyse und verwenden Sie das IOD um zu quantifizieren Zellinvasion (Abbildung 6).

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Representative Results

Morphologische Analyse des BrC Zellen in 3D Kulturen:

Die Morphologie des primären BrC Zellen wachsen in 3D Kulturen bei niedrigen und hohen dichten wurde über 5 Tage untersucht. Während der ersten 48 Std. Zellen halten die ECME und eine geringe Dichte zu erhalten. Zu diesem Zeitpunkt kann deutlich gewürdigt werden, dass Zellen eine längliche Spindel-ähnliche Form, einige mit zwei oder mehr langen zytoplasmatischen Projektionen und präsentieren ohne offensichtliche Zell-Zell-Kontakten zu zeigen. Nach 5 Tagen Kultur vermehrt Zellen unter Beibehaltung ihrer ursprünglichen Morphologie. Darüber hinaus sie Strukturen ähnlich Netze ohne eine bestimmte strukturelle Organisation gebildet, und scheinen gestapelten mit keine Kontakt-Hemmung. Ein Vergleich mit nicht-transformierten MCF-10A Zellen wurde gemacht, die kugelförmigen Strukturen ähnlich glanduläre Azini bilden. Diese Zellen zeigen eine charakteristische Morphologie der abgerundeten gut abgegrenzt und organisierte Strukturen in homogene Größen (von ca. 50 µm). Im Gegenteil, teilen primäre BrC Zellen eine viel stärkere Ähnlichkeit mit aggressiven BrC Zellen MDA-MB-231 (Abbildung 1).

Analyse der direkten Zell-Zell-Interaktionen und Kollagen-Abbau:

Wir entwarfen ein 3D Kokultur Modell, um Folgendes zu bewerten: Zelle Morphologie, Kollagen-Abbau, Zellwanderung, und ob es eine direkte Interaktion zwischen BrC Zellen und Monozyten in der Kokultur. Nach 5 Tagen beide MCF-7 und MDA-MB-231 kommerzielle BrC Zellen bilden unorganisiert Aggregate in 3D Kulturen, aber sie unterscheiden sich in ihrer Morphologie. Aggressive Zellen MDA-MB-231 bilden Aggregate mit länglichen Formen mit einigen Zellen vom Rest zu trennen, während nicht-aggressive MCF-7 Zellen Aggregate, bilden wo Zellen erhalten abgerundete Formen und sie scheinen mehr dicht komprimierte (Abbildung 2 tendenziell A, B). DQ Kollagen IV wurde eingebaut, um proteolytischen Abbau (grün), mit beiden BrC Kulturen ausstellenden fluoreszierende Aktivität zu visualisieren. Proteolytische Aktivität quantitativ zu bewerten, wurde grün fluoreszieren als IOD sechs 50 µm2 Felder gemessen. Ein Vergleich wurde zwischen einzelnen 3D von MDA-MB-231 Zellen und Co Kulturen mit U937 Monozyten vorgenommen. Statistisch signifikanter Anstieg der Proteolyse in Kokultur (Abbildung 2C) wurde beobachtet. Auch eine Analyse der konfokalen Mikroskopie von seriellen Transversal stapelt alle 10 µm von MDA-MB-231 und U937 Monozyten war Kokultur durchgeführt (Abb. 2D). Diese Analyse ergab, dass U937 Monozyten gegen aggressive Zellen MDA-MB-231 mit ein paar Monozyten erreichen die Zellschicht BrC migriert. Jedoch war es offensichtlich, dass Zell-Zell-direkte Interaktion-Websites nicht unbedingt mit höheren proteolytischen Tätigkeitsbereiche zeitgleich wurden: stattdessen Bereiche der Kollagen-Abbau gleichmäßig verteilten sich in der Kultur, führt zu der Folgerung, dass Kollagen Abbau war das Ergebnis der indirekten Kommunikation vermittelt durch sezernierten Faktoren. Daher war die 3D Kokultur Modell geändert, um der Platzzellen in verschiedenen Kompartimenten, getrennt durch eine poröse Membran, Zell-Zell-Kommunikation auf Basis von sezernierten Faktoren zu ermöglichen, und vermeiden Zelle Kennzeichnung und Sortierung nach Kultur.

Analyse der IL-1β in Überstände aus 3D Kulturen:

Arbeiten mit den indirekten Interaktion 3D Kulturen, die Überstände von einzelnen primären BrC geerntet wurden und ihre 5 Tage Co Kulturen mit PM. Diese Überstände wurden die simultane Analyse von 18 Zytokine und 5 MMPs mit kommerziellen Kits und ein Instrument, das speziell für diese Analyse unterzogen. Alle Analyten getestet beobachtet deutlich erhöhte Niveaus der IL-1β und IL-8 in der BrC Zelle-Monocyte Co Primärkulturen, beide entscheidende inflammatorischen Zytokinen, die zuvor von malignen Progression15, zugeordnet wurden 18 , 19 , 20 (Abbildung 3, Ergebnisse für IL-1β). Dieses Beispiel ist eine andere Art von Analyse, dass 3D Kulturen ermöglichen, um das Kommunikationsnetz zu imitieren, das den Tumor Mikroumgebung prägt.

Charakterisierung der Überstände und Azini Struktur:

Auf der Grundlage der experimentellen 3D-System von Debnath, Muthuswamy und Brügge7, wo MCF-10A etabliert als ein Modell der zugeordneten Onkogenese, Auswertung, ob Mechanismen entwickelt die sezernierten Faktoren aus der primären BrC-Zelle Überstände beeinflusst die Bildung der MCF-10A 3D Azini-ähnliche Strukturen, ähnlich wie die Aktivität beobachtet nach Transduktion von viralen und zelluläre Onkogene7,21 durchgeführt wurde. MCF-10A Zellen wurden angebaut mit zwei unterschiedlichen Überstände aus zwei primäre BrC-Zelllinien, Lumen Bildung (als Maß für die Beständigkeit gegen Anoikis) zu beobachten. Am 14. Tag die Sphäroide wurden von konfokalen Mikroskopie transversalen Schnitten bei 0, 25, 50, 75 und 100 % Tiefe bewertet, und in beiden Fällen festgestellt wurde, dass MCF-10A Zellen hinterzogenen Anoikis (gemessen durch das zählen der zentrale (luminalen) Zellen in den Azini (Abbildung 4 B, C)). So fehlen MCF-10A Zelle Azini, die mit den konditionierten Medien von BrC Zellen gebildet werden ein wohlgeformtes hohlen Lumen, im Gegensatz zu MCF-10A, die mit ihrer standard Kulturmedium (wie beschrieben in Schritt 1.2) (Abb. 4A) angebaut werden. In der 3D Kokulturen-System wurde IL-1β hoch abgesondert; Daher wurden die MCF-10A-Zellen auch mit menschlichen rekombinantes IL-1β18angebaut. Abbildung 4 D zeigt eine konfokalen Mikroskopie transversale geschnitten in 50 % Tiefe von der Azini in Anwesenheit von IL-1β (untere Platten) und zeigt, dass dieses Zytokin auch Widerstand gegen Anoikis verleiht. Somit fördern lösliche Faktoren sezerniert primäre BrC-Zellen, wie IL-1β, das Überleben von nicht-transformierten MCF-10A-Zellen, die ECM Interaktionen, verlieren ein Merkmal der invasiven Krebsarten.

3D Ko-Kulturen fördern eine Entzündungsreaktion, die Migration von Monozyten und Invasion der Krebszellen zugeordnet:

Wir zeigten zuvor, dass primäre BrC Zellen in 3D Culture basale hohe Pro-inflammatorischen Chemokine bekannt, Monozyten14gewinnen absondern. Daher analysierten wir die wandernden Kapazitäten der Monozyten als Reaktion auf die Chemokine gefunden in den konditionierten Medien der BrC Zellen angereichert. Die wandernden Kapazität des kommerziellen Monozyten U937 und THP-1 und frischen PMs wurde als Reaktion auf drei verschiedenen Chemokine bewertet: GM-CSF, MCP-1 und RANTES. U937 und THP-1 Monozyten waren in der Lage, die Migration als Reaktion auf GM-CSF und MCP-1, mit U937 als die reaktionsschnellste, während beide Monozyten eine null Reaktion auf RANTES hatte. PMs zeigte vor allem eine hohe basale wandernden Aktivität und die stärkste Reaktion auf MCP-1 (Abbildung 5). IL-8 wurde auch nach der 3D Kokultur primären BrC Zellen und Monozyten bereichert. So haben wir analysiert, ob IL-8 die Kapazität der Invasion von kommerziellen und primäre BrC-Zell-Linien ändert. Die kommerzielle aggressive BrC Zelllinien (HS578T und MDA-MB-231) drangen in Reaktion auf IL-8, während die nicht-aggressive (MCF-7 und T47D) nicht überfallen. Überraschend waren die primäre BrC Zellen mehr invasiv als kommerzielle aggressive BrC-Zelllinien als Reaktion auf IL-8 (Abbildung 6A, richtigen Platten). In einigen Fällen Zellen eindringen als Cluster und deswegen IOD Analyse war notwendig (Abb. 6B).

Figure 1
Abbildung 1 : Repräsentative Bilder von BrC Zellen in 3D Kulturen. Von links nach rechts: Kontrolle von nicht-transformierten MCF-10A Zellen bilden charakteristische glanduläre Azini mit Morphologie, gut abgegrenzten Zellkontakte, gerundet und organisierte Strukturen homogene Größe (ca. 50 µm auf Durchschnitt, optische Vergrößerung 200 X). Mittleren Tafeln zeigen primäre BrC-Zellen kultiviert bei niedriger Dichte (2 Tage) und high-Density (5 Tage). Zellen der ECME halten und pflegen eine geringe Dichte zu frühen Zeitpunkten. Es ist offensichtlich, dass die Zellen eine längliche Spindel-ähnliche Form, einige mit zwei oder mehr langen zytoplasmatischen Projektionen und keine offensichtlichen Zellezelle Adhäsion zu präsentieren. Auf der anderen Seite gebildet mit hoher Dichte Zellen zu späteren Zeitpunkten Strukturen ähnlich Netze ohne eine bestimmte strukturelle Organisation. Diese Zellen erschien aufgetürmt zeigt keine Kontakt-Hemmung. Eine Kontrolle der kommerziellen MDA-MB-231-Zellen nach 5 Tagen in 3D Culture wird angezeigt; Diese aggressive BrC-Zellen haben eine viel stärkere Ähnlichkeit mit BrC Primärkulturen (optische Vergrößerung von 100 X). Skala bar stellt 50 µm. 800 Zellen wurden zu Beginn des Experiments ausgesät. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Analyse des ECM Abbaus. Non-aggressive MCF-7 Zellen gefärbt mit einem gelben Fluorochrom (A) und aggressive MDA-MB-231 gefärbt mit einem roten Fluorochrom (B) für 5 Tage in 3D Bedingungen kultiviert; 0,5 % des grünen Fluoreszenz-markierten Kollagen IV wurde eingebaut, um ECM-Abbau zu visualisieren. In A und Bdie oberen linken Bilder entsprechen die Stufen der Kollagen-Abbau, die oberen rechten Platten stellen die optische Bilder unten links repräsentieren die BrC-Zellen und die richtigen Platten unten zeigen die Verschmelzung von fluoreszierenden und optische Bilder. Für A und Bsind die optische Vergrößerung 200 X und Maßstabsleiste von 100 µm vorgestellt. (C) repräsentative Bilder von ECM Proteolyse (grün) in 3D Culture von MDA-MB-231 Einzelzellen als Kontrolle, im Vergleich mit ECM Proteolyse von 3D Kokulturen von MDA-MB-231 mit U937 Monozyten. Maßstabsleisten repräsentieren 10 µm. IOD (integrierte optische Dichte) von sechs 50 µm2 Felder aus jeder Zustand gemessen wurde. Der Mittelwert und der Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von der Quantifizierungen werden dargestellt; zwei Sternchen repräsentieren einen statistisch signifikanten Unterschied mit p < 0,01 (Mann-Whitney-Test). (D) direkte Interaktion von MDA-MB-231-Zellen (graue Schatten Masse) mit Fluoreszent gefärbt U937 Monozyten (Orange); grüne Fluoreszenz entspricht Proteolyse. Seriellen Scheiben wurden generiert jeder 10 µm konfokalen Mikroskopie, die Lokalisierung und direkte Interaktionen zwischen beiden Zelllinien anzugehen. Optische Vergrößerung 200 X; Maßstabsleisten darstellen 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: IL-1β Konzentration in 3D Ko-Kulturen erhöht. Ein repräsentatives Ergebnis der IL-1β Ebenen (Pg/mL) in Überstände aus acht (PC1-8) primäre BrC Zellen, einzeln in 3D (3D) kultiviert, und verglichen ihre 3D Ko-Kulturen mit PM (CC). Eine Kontrolle der PM in einzelnen 3D Culture wurde aufgenommen zum Vergleich (PM). Ergebnisse wurden von einer größeren multiplexing Analyse extrahiert wo mehrere Zytokine gleichzeitig in jeder Probe, durch eine Immunodetection-basierte Technik als kommerzielle Kit erhältlich erkannt wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Sezernierten Faktoren von primären BrC-Zellen induzieren Widerstand gegen Anoikis in nicht-transformierten MCF-10A Zellen. MCF-10A Zellen wurden in 3D Bedingungen mit standard Nährmedien (Spalte A und oberen Platten d), angebaut in denen beobachtet werden kann, dass die Azini präsentieren typische hohle Lumen (25-75 % Tiefe mit einem roten Quadrat markiert); Wenn MCF-10A Zellen mit zwei unterschiedlichen Überstände aus zwei BrC Primärkulturen (Spalten B und C) angebaut wurden, sind Lumen nicht hohl aber gefüllt mit Zellen, die Resistenz gegen Anoikis bezeichnen. Ebenso, wenn MCF-10A Zellen kultiviert wurden in 3D Bedingungen hinzufügen von menschlichen rekombinantes IL-1β (20 ng/mL), keine hohlen Lumen kann bei 50 % Tiefe konfokalen Mikroskopie Abschnitte der Azini (untere Platten d) geschätzt werden. Die rechts ovale Karikatur stellt der konfokalen Mikroskopie-Abschnitte, die in 0, 25, 50, 75 und 100 % Tiefe von der Azini vorgenommen wurden. Bilder zeigen Kerne mit DAPI (blau) und E-Cadherin in grün gefärbt. Optische Vergrößerung 200 X, Maßstabsleisten repräsentieren 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Wandernde Kapazität von Monozyten. Repräsentative Bilder der wandernden Kapazität von U937, THP-1 und PM in Reaktion auf GM-CSF, MCP-1 und RANTES. Steuerung ohne Chemokin sind im Preis inbegriffen (1. Spalte von links nach rechts). Die Zahlen unter den Bildern zeigen die Anzahl der wandernden Zellen in jedem Zustand; U937 und THP-1 Monozyten waren hauptsächlich reagieren auf GM-CSF und MCP-1, während PM eine hohe wandernde Kapazität schlechthin zeigte, und die reaktionsschnellste Zellen auf MCP-1 waren. Optische Vergrößerung von 100 X; Maßstabsbalken entspricht 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Aggressiv und primäre BrC Zellen eindringen in Reaktion auf IL-8. A. Invasion-Assays mit zwei nicht-aggressive (MCF-7 und T47D), zwei sehr aggressiv (HS578T und MDA-MB-231)-BrC-Zell-Linien und eine BrC Primärkultur in Reaktion auf IL-8 als Lockstoffgradient verwendet. Obere Platten entsprechen Kontrollen ohne Chemokin zeigt keine Invasion untere Platten zeigen die Reaktion auf IL-8, mit sehr aggressiven BrC und primäre BrC Zellen dringen durch die Membran der Zelle Kultur einfügen. B. Beispiel für Zellen, die in Büscheln eindringen; in diesen Fällen erfolgt die Messung der Invasion mit einem Bild-Analyse-Programm Invasion in Bezug auf IOD (integrierte optische Dichte) pro Fläche zu bestimmen. Die Zahlen unter den Bildern stehen für die Anzahl der eindringenden Zellen in jedem Zustand. Optische Vergrößerung von 100 X; Maßstabsleisten darstellen 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

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Discussion

Epithelzellen wachsen in eine 3D räumliche Konformation und deren Wechselwirkung mit den ECM-Proteinen ist von zentraler Bedeutung für die Gewebe-Homöostase. Viele Krebs-Studien basieren auf Zellen in Monolayer (2D) angebaut und obwohl sie für ein Verständnis von vielen Aspekten der Tumorbildung und Progression entscheidend gewesen sind, kann Monolagen nicht rekapitulieren die Merkmale, denen Zellen, für die ECM auferlegt Instanz: Begrenzung der Verbreitung, Haftung-abhängige Zelle überleben, apikalen basolateralen Polarität, ECM Umbau, Zelldifferenzierung, etc. Wichtig ist, nicht nur die Interaktion zwischen Tumorzellen und ECM sind entscheidend für das Fortschreiten von Krebs, sondern auch die Kommunikation zwischen Tumor und nicht-Tumor-Zellen wie Immunzellen aufgebaut. Die Protokolle, die hier zur Verfügung gestellten erleichtern das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Immunzellen und Krebszellen in der Umgebung zur Verfügung gestellt von der ECM, die entzündliche Reaktion durch diese Interaktionen gefördert, und wie diese entzündliche Erkrankung erstellen ein positive Schleife Chemoattraction von Monozyten und weitere Invasion von Krebszellen zu fördern.

Ein großer Vorteil der Verwendung von ECME ist, dass freuen Sie sich auf eine biologische Gerüst geeignet, um eine Vielzahl von experimentellen 3D durchführen22Modelle. Es ist angereichert mit ECM Proteine wie Laminin, Kollagen IV, Entactin, Heparan Sulfat Proteoglykan und Wachstumsfaktoren, welche in Vivo mit Epithelzellen interagieren würde. Ein Nachteil ist, dass weil es Lysates murinen Sarkome stammen, die Konzentration ihrer Bestandteile zwischen verschiedenen Chargen variiert. Also, ist es oft notwendig, mehrere Lose um homogener Daten zu charakterisieren. Im Labor wird jede neue Charge getestet auf zwei Arten: 1) durch die Auswertung der richtige Azini Neubildung von MCF-10A und (2) durch die Beurteilung der Invasivität der BrC Zellinien von etablierten invasiven Kapazität. Eine weitere Möglichkeit ist, mit anderen Gerüstprodukte wie Hydrogel, arbeiten, einen synthetischen Nanofaser-Peptid-Gerüst ist. Die Steifigkeit von 3D Culture kann gesteuert werden, durch Anpassung der Konzentration von Hydrogel23,24. Wichtig ist, könnte dieses System angewendet werden, um die Interaktion zwischen jede Art von neoplastischen Zellen und hämatopoetischen oder nicht blutbildenden Zellen zu studieren. Es könnte sogar möglich, komplexere Systeme mit mehr als zwei verschiedenen Zell-Linien entwerfen sein. Ein wichtiger Vorteil von 3D Modellen ist, dass sie Studium der Zellmorphologie und Zelle Organisation geprägt von ECM-Interaktionen, die während der onkogenen Transformation geändert werden. Ebenso kann man studieren Onkogene Funktionen wie proteolytischen Abbau und ob Zellen zunächst in verschiedenen Schichten des Kultur-Signals zueinander platziert, direkten Interaktion/Kommunikation zu fördern. Darüber hinaus können andere Zelle Linien mit verschiedenen Fluorochromes beschriftet werden, so dass sie nach dem Experiment zu bestimmten Fragen für jede einzelne Zelle, z. B. mit RNA und/oder Protein Ausdruck Analyse13isoliert werden können. Hier wird IL-1β Sekret auf das Medium im BrC Zellen/PM Co Primärkulturen gezeigt, unterstützt eine mögliche zentrale Rolle dieses Zytokin bei der indirekten Kommunikation zwischen Tumorzellen und Monozyten, die malignen Progression auslöst.

Ein weiterer wesentlicher experimentelles Protokoll im Labor ist die Analyse der Azini Bildung in 3D Kulturen nicht-transformierten MCF-10A Zellen. Dieser Test wurde verwendet für viralen und zellulären Onkogen Aktivität zu testen und zu testen, wie der Tumor Mikroumgebung Funktion im Zusammenhang mit aggressiven Krebsarten beeinflusst. Zum Beispiel während der normalen Entwicklung der Azini, luminalen zentralen Zellen verlieren Kontakt mit der Basalmembran Proteine (bereitgestellt von ECME) auslösenden Mechanismen des Zelltods, bekannt als Anoikis. Es wurde beobachtet, dass sowohl die Überstände von primären BrC Zellen oder rekombinantes IL-1β MCF-10A Zellen Widerstand gegen die Anoikis fördern. Da eine hohe Konzentration von IL-1β auf BrC Zelle-Monocyte Interaktion gefördert wird, unterstützt diese Beobachtung, dass das Tumor-Stroma integraler Bestandteil der Tumorprogression zu hoch aggressive Phasen ist.

Die Migration und Invasion Protokolle hier beschriebenen bilden nützlich 3D ergänzende Assays, die wir die Fähigkeit der Zellen unterstützen zu migrieren oder Eindringen in Reaktion auf Reize aus der Tumor-Stroma abgeleitet. Es wurde gezeigt, dass Chemokine (GM-CSF und MCP-1) gefunden in erhöhten Konzentrationen in 3D Kulturen von primären BrC Zellen U937, Migration fördern können THP-1 und PMs, unterstützen die Fähigkeit der aggressiven Tumorzellen, eine Pro-inflammatorische Mikroumgebung zu fördern. Darüber hinaus IL-8, die auch in erhöhter Konzentration in die Überstände von Ko-Kulturen von BrC Zellen/Monozyten, findet erhöhte Invasion von kommerziellen aggressive BrC-Zellen (HS578T und MDA-MB-231) und primäre BrC Zellen gefördert.

Über den Zustand der Zellen ist es wichtig, mit primären BrC Zellen zu arbeiten, bevor sie erreichen zehn Passagen zur profitieren Sie von ihrer Verbreitung Spitze und zur Vermeidung möglicher Post-Isolierung genetischer und epigenetischer Veränderungen durch in-vitro- Kultur. Ein weiterer wesentlicher Aspekt bei der Arbeit mit Primärzellen ist zur Bestätigung ihrer Identität nach Isolierung. Wir haben ein Panel von Biomarkern um ihre Identität epitheliale Herkunft zu bestimmen, die welche PanCK, Muc-1 und EpCAM (angegeben in Schritt 2.5) enthält. Ebenso ist es vorzuziehen, frische PMs zu verwenden, von denen jede Charge versichert getestet wird, dass sie auf der gleichen Stufe der Differenzierung sind. Jede neue Charge verwendet präsentiert den Phänotyp CD34Neg CD11bpos CD14pos CD64pos CD68Neg CD16Neg, die nicht aktivierte unreifen Monozyten entspricht. Wichtig ist, verwechseln wir nicht Monozyten von verschiedenen Spendern als Mischergebnisse Monocyte-Aktivierung. Stattdessen wir unabhängig getestet BrC Co Kulturen mit Monozyten von mindestens zwei verschiedenen Spendern.

3D Culture-Systeme haben noch die Einschränkung, dass nur einige Elemente der Tumorbiologie zuverlässig modelliert werden können. Eine neue Alternative ist die komplexe 3D Modelle von Organellen, die auf die Erweiterung und Differenzierung von Stammzellen in-vitro-. Organellen auch aufzubauen hochorganisierte epitheliale Strukturen. Beispiele sind der Magen 25,26, Leber 27und Niere Organellen28. Allerdings müssen noch organoide Modelle für jedes menschliche Organ erreicht werden; Darüber hinaus benötigen sie viel komplexe und teure experimentelle Bedingungen.

Zusammenfassend hier beschreiben wir ausführlich einen Workflow von Assays: ausgehend von Isolation der Tumorzellen von BrC Patienten, testen ihre entzündliche Kapazität in einem ECME-basierten 3D Culture Modell testen, wie diese entzündliche Mikroumgebung dient sie zu rekrutieren Weitere Entzündungszellen, wie z. B. Monozyten schließlich Analyse der Kommunikation zwischen den beiden Arten von Zellen, und wie die Kommunikation weiter eine entzündliche Mikroumgebung fördert, die Progression zu mehr aggressive Krebsstadien fördert. Darüber hinaus beschreiben wir die Morphologie und Phänotyp der primären BrC Zellen. In Zukunft werden Studien, es interessant sein zu anderen entzündlichen Zellen zu testen oder auch test der Kommunikation zwischen BrC und mehrere Zellen, die oft in der Tumor-Stroma gefunden. Diese Multiple 3D Zellkulturen bieten ein größeres Bild der biologisch in Vivo bei Tumorprogression passiert. Vergleiche zwischen in-vitro- Daten und der Patient klinische Outcome werden mögliche Mechanismen zu identifizieren, die einen höheren Einfluss auf Krebs Aggressivität haben.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch CONACyT FONSEC SSA, IMSS/ISSSTE Projekt Nr. 233061, Ezequiel M. Fuentes-Pananá und Fondo de Apoyo a la Investigación, Krankenhaus Infantil de México Federico Gómez (Projektnummer HIM-2014-053) unterstützt. Espinoza-Sánchez NA ist Doktorand aus Programa de Doctorado de Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) und erhielt der 231663 Stipendium CONACYT. E-S-NA, auch der finanzielle Unterstützung durch das mexikanische Institut der sozialen Sicherheit (IMSS) anerkennen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U937 American Type Culture Collection ATCC  CRL-1593.2 Monocytic cell line/histiocytic lymphoma 
THP-1 American Type Culture Collection ATCC  TIB-202 Monocytic cell line/acute monocytic leukemia 
MCF-10A American Type Culture Collection ATCC  CRL-10317 Non-transformed breast cell line
MCF-7 American Type Culture Collection ATCC  HTB-22 Breast Cancer Cell line
T47D American Type Culture Collection ATCC  HTB-133 Breast Cancer Cell line
HS578T American Type Culture Collection ATCC  HTB-126 Breast Cancer Cell line
MDA-MB-231 American Type Culture Collection ATCC  HTB-26 Breast Cancer Cell line
RPMI 1640 medium GIBCO BRL Life Technologies 11875-093
DMEM High Glucose  GIBCO BRL Life Technologies 11964-092 4.5 g/L glucose
DMEM/F12 GIBCO BRL Life Technologies 11039-021
Antibiotic/Antimycotic GIBCO BRL Life Technologies 15240-062 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone
Fetal Bovine Serum GIBCO BRL Life Technologies 16000-044
Horse serum  GIBCO BRL Life Technologies 16050114
0.05% Trypsin-EDTA 1X GIBCO BRL Life Technologies 25300-062
PBS 1X (Phosphate Buffered Saline GIBCO BRL Life Technologies 20012-027
Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech AF-100-15 (1.00mg)
Insulin SIGMA-ALDRICH I1882-100MG
Hydrocortisone SIGMA-ALDRICH H088-5G
Cholera toxin Vibrio cholerae SIGMA-ALDRICH C8052-1MG
Matrigel  Corning Inc 356237 Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C
GM-CSF PeproTech 300-03
MCP-1 PeproTech 300-04
RANTES PeproTech 300-06
IL-8 PeproTech 200-08
IL-1β PeproTech 200-01B
Crystal-violet Hycel México 541
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH P6148
Transwell permeable supports (inserts) Corning Inc 3422 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates 
Transwell permeable supports (inserts) Thermofisher Scientific 140620 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates 
Monocyte Isolation Kit II Human  Miltenyi Biotec 130-091-153
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay EMD Millipore HCYTOMAG-60K
Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) Luminex Corporation 40-072
Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) Nalge Nunc International 177402
Glass bottom microwell 35mm petri  dishes MatTek Corp. P35G-1.5-14-C

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References

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Krebs-Biologie Ausgabe 131 dreidimensionale (3D) Kultur extrazelluläre Matrix-Extrakt (ECME) Kultur Co System Tumor maligne Tumor Mikroumgebung Kommunikation Brustkrebs (BrC) Monozyten
Analyse der Kommunikation zwischen Monozyten und primären Brustkrebs-Zellen in einer extrazellulären Matrix (ECME) extrahieren-basiertes dreidimensionales System
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Espinoza-Sánchez, N. A., Chimal-Ramírez, G. K., Fuentes-Pananá, E. M. Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System. J. Vis. Exp. (131), e56589, doi:10.3791/56589 (2018).

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