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Medicine

Diferenciais efeitos de drogas hipolipemiantes na morfologia das partículas de colesterol de modulação

Published: November 10, 2017 doi: 10.3791/56596
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 1,4, 5
1Plaxgen Inc, 2Millipore Sigma, 3Cytometry Laboratories, Purdue University, 4San Francisco General Hospital, 2M16 Clinical Chemistry, University of California, San Francisco, 5Molecular Medicine Research Institute

Summary

O objetivo deste estudo foi avaliar em vitro hipolipemiantes efeitos de drogas em modulando a morfologia das partículas de colesterol. Comparação de drogas hipolipemiantes revelou variações no seu efeito em modulando as características morfológicas das partículas de colesterol.

Abstract

Tratamento de pacientes com dislipidemia com fármacos hipolipemiantes leva a uma redução significativa no nível de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e um baixo a moderado nível de aumento do colesterol da lipoproteína de alta densidade (HDL) no plasma. No entanto, um possível papel destas drogas em alterar a morfologia e distribuição das partículas de colesterol é mal compreendido. Aqui, descrevemos em vitro avaliação dos efeitos de drogas hipolipemiantes na modulação das características morfológicas das partículas de colesterol, usando o método de matriz de placa em combinação com imaging citometria de fluxo. Análises de imagem das partículas de colesterol indicaram que a lovastatina, sinvastatina, ezetimiba e atorvastatina induzem a formação de partículas em forma de vertente globulares e lineares, Considerando que a niacina, fibratos, fluvastatina e Rosuvastatina induzem o formação de apenas globular em forma de partículas. Em seguida, muito purificada lipoproteína de baixa densidade (VLDL) e partículas de LDL incubadas com estas drogas mostraram alterações na morfologia e imagem textura de colesterol subpopulações de partículas. Além disso, o rastreio de 50 amostras de soro revelou a presença de um maior nível de linear em forma de partículas de HDL colesterol em indivíduos com dislipidemia (média de 18,3%) em comparação com as amostras de idade de correspondência normal (média de 11,1%). Observou-se também variações consideráveis em efeitos de drogas hipolipemiantes na redução linear em forma de formação partículas de LDL e HDL colesterol em amostras de soro. Esses achados indicam que drogas hipolipemiantes, além de seus efeitos hipolipidémico mediada por células, diretamente podem modular a morfologia das partículas de colesterol por um mecanismo não-enzimática de ação. Os resultados destes resultados têm potencial para informar o diagnóstico de aterosclerose e prever a terapia ideal hipolipemiantes.

Introduction

Numerosos estudos clínicos têm demonstrado os efeitos benéficos das drogas hipolipemiantes em reduzir os níveis plasmáticos de colesterol de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e um baixo a moderado nível de aumento do colesterol da lipoproteína de alta densidade (HDL), que impede a incidência de primária e secundária de eventos cardiovasculares adversos relacionados à aterosclerose1,2,3,4,5. Estatinas, um grupo de inibidores da HMG-CoA redutase enzima, bloqueiam a síntese endógena de colesterol no fígado que, em vez de chumbo para abaixar circulando os níveis de colesterol LDL no sangue6,7. Da mesma forma, os lipídios diminuindo o efeito de niacina é mediado pela sua inibição direta e não-competitivas de hepatócito diacilglicerol aciltransferase-2, uma enzima hepática chave envolvidos na síntese de triglicérides8. Comparativamente, a ezetimiba reduz o nível plasmático de LDL, limitando a absorção do colesterol exógeno por ligação a proteína 1 de C1-Like de Niemann-Pick (NPC1L1) localizada nas células epiteliais do intestino delgado9. Fenofibrato, outro drogas hipolipemiantes, reduz substancialmente as concentrações plasmáticas de triglicérides e também moderadamente diminui o colesterol LDL através o Peroxissoma proliferator-activated receptores via10. Além disso, o ácido graxo ômega-3 é relatado para ter o efeito antiaterosclerótico devido à sua capacidade para reduzir os níveis plasmáticos de LDL11.

As drogas hipolipemiantes, além de seu efeito primário na redução de colesterol LDL, têm um número de efeitos pleiotrópicos benéficos, incluindo realçando o nível de HDL, melhorando funções endoteliais, reduzir a inflamação e inibição plaquetária agregações12,13,14. No entanto, o mecanismo subjacente destas drogas no aumento de partículas de colesterol HDL e modificando suas características estruturais não são totalmente compreendidos. Uma vez que estes medicamentos são amplamente prescritos para tratar doenças cardiovasculares relacionadas com a aterosclerose (doenças cardiovasculares), é essencial para investigar suas possíveis funções na determinação das características morfológicas e distribuição das partículas de lipídios. O plasma humano lipidome consiste de aproximadamente 600 distintos lípidos e 22 tipos diferentes de moleculares de colesterol que estão presentes em vários tamanhos, formas, densidades e composições15,16,17 . Métodos analíticos tais como ultracentrifugação, NMR e eletroforese em gel de gradiente são usados para caracterizar partículas LDL e HDL e seus subfractions18,19. No entanto, a aplicação destes métodos é limitada a estudos que visam determinar o efeito de drogas em morfologia e montagem das partículas de lipídios de modulação. A matriz de placa com base de citômetro de fluxo é um ensaio de bioquímico funcional desenvolvido para a deteção e a visualização de soro derivado lipídico e amiloide placa partículas20. As vantagens do em vitro método descrito neste estudo de imagem possibilitam a identificação de lipídios-modulando efeitos de drogas em alterar a morfologia e distribuição das partículas de colesterol em amostras de buffer e soro.

Protocol

1. preparação de fluorescente-etiquetadas colesterol e drogas hipolipemiantes

Nota: agregados de colesterol fluorescente-etiquetadas e estatinas foram preparadas conforme descrito em nosso artigo anterior 21. para obter detalhes dos reagentes, citômetro de fluxo, analisadores químicos e software de análise de dados utilizados neste estudo de imagem, consulte Tabela de materiais.

  1. Solubilizar colesterol liofilizado fluorescente-etiquetadas (1 mg, Ex / Em = 495 nm nm/507) em pó em 1 mL de álcool a 100%.
  2. Centrifugar a amostra para 3 min a 2.040 x g e usar os sobrenadantes contendo agregados de colesterol de fluorescência-etiquetada solúvel no ensaio da matriz chapa.
  3. Para a preparação de drogas, individualmente solubilizar os pós (2 mg) de omega-3 ácidos graxos em 1 ml de álcool a 100%, lovastatina, Atorvastatina, ezetimiba e sinvastatina.
  4. Após a centrifugação por 3 min a 2.040 x g, use os sobrenadantes contendo drogas no ensaio de.
  5. Da mesma forma, solubilizar individualmente os pós (2 mg) de fluvastatina, rosuvastatina, niacina e fibratos em 1 mL de água desionizada para fazer uma solução stock de 2 mg/mL.
  6. Após a centrifugação por 3 min a 2.040 x g, use os sobrenadantes contendo drogas no ensaio da matriz chapa.

2. Ensaio de placa matriz para análise In Vitro e de formação de partículas de colesterol

  1. uso química analisador-1 (consulte a tabela de materiais) para configurar o ensaio da chapa de matriz para a formação de partículas de colesterol. Realize o ensaio em um fundo redondo, placa de 96 poços de ligação baixa proteína usando os reagentes preparados na secção 1. Manter o volume final de reação em cada poço em 200 µ l e realizar todos os ensaios em triplicado.
    1. Primeiro, carga 194.5 µ l de fosfato tampão salino (PBS) para cada poço.
    2. Para cada poço, adicionar 2,5 µ l (5 µ g) de cada solução de drogas hipolipemiantes e agitar a placa por 30 s, colocando-o no prato de analisador-1 reação química a misturar uniformemente a droga na solução. Nenhuma droga é adicionada para as amostras de controlo negativo.
    3. Finalmente, adicionar solução agregada de colesterol fluorescente-etiquetadas µ l (2 µ g) 2 a cada poço e agitar a placa por 30 s, colocando-o no prato de analisador-1 reação química.
    4. Incubar a placa num agitador de laboratório para 2 h a 37 ° C e 200 rpm.
    5. Após a incubação, adquirir as imagens de partículas por citometria de fluxo de imagem.

3. Capturar imagens de colesterol partículas usando Imaging Flow Cytometry

  1. abrir o modelo de aquisição de dados para carregar as configurações corretas do instrumento. Clique em " arquivo ", em seguida, selecione " modelo aberto … " e selecione o arquivo de modelo.
  2. Clique " carga de Flush, fechamento, " para preparar o instrumento para o carregamento de amostra.
  3. Quando o " carregar amostra " abre caixa de diálogo, clique " Okey " carregar 50 µ l das amostras de cada bem preparado na secção 2 no citômetro de fluxo de imagem.
    4. Clique
  4. " executar | Configuração " para visualizar as partículas na área de imagem em tempo real.
    5. Clique em
  5. quando as partículas na área de imagem estão em foco bom, " executar | Adquirir " para adquirir imagens de cada objeto simultaneamente de forma elevado-throughput para campo escuro (lado dispersão/SSC), campo claro (BF), fluorescência verde e amarela fluorescência.
  6. Repita os passos para adquirir 5.000-10.000 partículas de cada amostra de 3,2-3.5.
  7. Analisar todos os arquivos de imagem raw usando o software de análise de imagem para determinar a intensidade de fluorescência do objeto e variações morfológicas.
    1. Clique o " ferramentas " botão no topo do software de análise de imagem e, em seguida, selecione " arquivos de dados do lote " do menu drop-down, que irá abrir o " lotes " janela.
    2. No " lotes " janela, clique no " adicionar lote " botão, que irá abrir o " definir um lote " janela.
    3. No " definir um lote " janela, clique no " adicionar arquivos " botão e selecione os arquivos de imagem raw, clique no " modelo " botão e selecione o arquivo de modelo de análise de dados apropriados e, em seguida, selecione " Okey " e " enviar lotes " para iniciar o processamento e análise dos arquivos de imagem raw.

4. Placa matriz ensaio com base em avaliação de hipolipemiantes drogas efeito sobre partículas de colesterol purificado

  1. , conforme descrito no passo 2.1, realizar o ensaio de formação de partículas de colesterol lipoproteínas/partículas purificado de HDL, LDL e VLDL. Realizar o ensaio da chapa de matriz em uma placa de 96 poços.
    1. Primeiro, carregar todos os poços com PBS; use um volume final de 200 µ l de cada poço.
  2. Para o controle negativo, adicionar 4 µ g VLDL, LDL, ou proteínas/partículas de HDL individualmente em cada bem sem drogas e agitar a placa por 30 s.
    1. Para examinar o efeito de drogas hipolipemiantes, adicionar 4 µ g VLDL, LDL, ou proteínas/partículas de HDL individualmente a cada bem e agitar a placa por 30 s.
    2. Para poços adicionados com 4 µ g VLDL, LDL ou HDL, adicionar 2,5 µ l (5 µ g) de ezetimiba, sinvastatina, lovastatina ou niacina de solução e agitar a placa por 30 s, colocando-o no analisador de química-1.
    3. Finalmente, adicionar solução agregada de fluorescência-etiquetada colesterol µ l (2 µ g) 2 a todos os poços e agitar a placa por 30 s, colocando-o no prato de analisador-1 reação química.
  3. Incubar a placa por 2h em um shaker de laboratório situado a 37 ° C e 200 rpm.
  4. Adquirir as amostras usando citometria de fluxo de imagem seguindo passos 3.1-3.5.
  5. Analisar arquivos de imagem raw usando o software de análise de imagem, conforme descrito na etapa 3.7.
  6. No modelo de análise, use o seguinte esquema associado para identificação de subpopulações de partículas de colesterol.
    1. Em um terreno de contagem de pixels verde canal saturado (eixo x) e canal de campo escuro a contagem de pixels saturados (eixo y), rejeitar objetos com um ou mais pixels saturados em qualquer canal.
    2. Sinopse as objetos/partículas sem pixels saturados usando intensidade canal verde (eixo x) e intensidade SSC (eixo y): objetos caem em uma das três regiões (VLDL, LDL, HDL) baseadas no seu canal verde e intensidades SSC.
      Nota: Estes portões foram criados com baseados nos dados gerados a partir de experiências de controle realizadas usando HDL, LDL e VLDL partículas/proteínas purified sem a droga.
  7. Para determinar o efeito de drogas hipolipemiantes para cada amostra, calcular as concentrações de partículas de lipoproteína total, bem como a percentagem de cada subpopulação (VLDL, LDL, HDL) como descrito no passo 6.5.
    1. Calcular a partícula concentrações (partículas/mL), utilizando a seguinte equação:
      Equation
      Nota: O VLDL, LDL e HDL gating regiões na fluorescência ponto-trama detectar ~ 80% de seus respectivas subpopulações e os restantes ~ 20% das partículas se sobrepõem com outras regiões associadas.

5. Medição das concentrações de lipídios nas amostras de soro

  1. para determinar as concentrações de LDL, HDL, colesterol e triglicérides pelo analisador de química-2, usar amostras de soro obtidas de indivíduos normais e dislipidemia correspondência idade.
  2. Definir concentração anormal de LDL, HDL, colesterol e triglicérides com base na sua concentração identificada além dos valores de referência superior e inferior em amostras de soro.
  3. Siga a valor de referência normal as recomendaçõesDED pelo fabricante do reagente: colesterol (4-200 mg/dL), HDL (3.0-65 mg/dL), LDL (4-100 mg/dL) e triglicerídeos (9-200 mg/dL).
  4. Identificar amostras de soro que têm um valor anormal como abaixo do valor de referência inferior ou superior a referência maior valor para o colesterol e triglicérides e usá-los para a seleção na presença e na ausência de drogas hipolipemiantes.

6. Analisando o efeito das drogas na formação de partículas de colesterol em amostras de soro

  1. uso a química analisador-1 para configurar o ensaio da chapa de matriz para a formação de partículas de colesterol em amostras de soro. Realize o ensaio em um fundo redondo, placa de 96 poços de ligação de baixa proteína. Utilizar um volume final de reação de 200 µ l/poço e realizar todos os ensaios em triplicado.
  2. Preparar o prato por carregar os reagentes de forma gradual.
    1. Preparar os poços controle.
    2. Carga 193 µ l de PBS a cada poço.
    3. Adicionar 2,5% (v/v) de soro (amostra de apenas um soro por alvéolo) e agitar a placa por 30 s, colocando-o no prato de reação química analisador.
    4. Adicionar 2 µ l (2 µ g) de colesterol fluorescência-etiquetada agregar solução em cada poço e agitar a placa por 30 s, colocando-o em um prato de analisador-1 reação química.
  3. Preparar os poços com drogas.
    1. µ L 191 de carga de PBS a cada poço.
    2. Adicionar 2,5% (v/v) de soro (amostra de apenas um soro por alvéolo) e agitar a placa por 30 s, colocando-o em um prato de analisador-1 reação química.
    3. Adicionar 2 µ l a ezetimiba, lovastatina, sinvastatina ou niacina solução (4 µ g) para todos os poços excepto os poços de controle negativo. Adicione apenas uma droga por bem e agitar a placa por 30 s, colocando-o em um prato de analisador-1 reação química.
    4. Adicionar 2 µ l de fluorescência-etiquetada colesterol agregar a solução (2 µ g) em cada poço e agitar a placa por 30 s, colocando-o no prato de analisador-1 reação química.
  4. Carregar drogas somente após todos os poços (controle e tratados com drogas) foram carregados com suas respectivas amostras e adicionar colesterol fluorescência-etiquetada no final desta etapa.
  5. Incubar a placa por 2h em um shaker de laboratório situado a 37 ° C e 200 rpm.
  6. Adquirir as amostras por imagem citômetro de fluxo seguindo as configurações descritas nas etapas 3.1-3.6.
  7. Usar a software para todos os arquivos de imagem usando o mesmo modelo, como descrito nos passos 3.7 de processamento em lote de análise de imagens.
    1. Realizar a análise de dados por portões de desenho sobre a trama, conforme descrito nas etapas 4.5 e 4.6.
  8. Para determinar a hipolipemiantes drogas efeito/resposta (baixa, moderada e alta) para cada amostra, calcular a concentração de partículas de lipoproteína total, bem como a percentagem da composta de totais partículas de HDL, LDL e VLDL subpopulações.
  9. Sinopse os HDL, LDL e VLDL populações em um histograma do objeto ' s imagem de campo claro, largura subtraída de comprimento (comprimento - largura) e o portão em regiões globulares ou lineares: objetos com (comprimento - largura) ≤ 2 µm cair o região globular para calcular a percentagem de globulares e linear em forma de partículas.
  10. Comparar a porcentagem de globulares e linear em forma de LDL e HDL colesterol partículas identificados para cada amostra de soro incubada com e sem cada droga. Entre três vias valores obtidos para cada amostra de soro, aceitar a porcentagem de globulares e linear em forma de partículas de LDL e HDL que caem dentro do intervalo de ± 2 SD para determinação do efeito droga.

Representative Results

Ensaio da chapa de matriz com base em análise de efeitos de drogas hipolipemiantes na formação de partículas de colesterol:

Para avaliar o efeito das estatinas em modulando a morfologia das partículas de colesterol, agregados de colesterol fluorescente-etiquetadas individualmente foram incubados com lovastatina, sinvastatina, Atorvastatina, rosuvastatina e fluvastatina no buffer. Todas estas amostras foram adquiridas usando citometria de fluxo de imagem para capturar imagens das partículas de colesterol para análise de morfologia, conforme mostrado na Figura 1 e Figura 2. Curiosamente, analisar o efeito de drogas na formação de partículas de colesterol em buffer indicado que a Atorvastatina, sinvastatina e lovastatina induzem a formação de uma população heterogênea de partículas de colesterol exibindo diversos tamanhos e formas, Figura 3a -c. Por outro lado, as partículas de colesterol formaram na presença de Rosuvastatina, fluvastatina, e o controle negativo (sem drogas) foram homogêneos em forma e morfologia, como mostrado na Figura 3d-f. Além disso, observou-se que Atorvastatina, sinvastatina e lovastatina induziram a formação de partículas de colesterol, exibindo as duas morfologias vertente globulares e linear, Considerando que a Rosuvastatina e fluvastatina induzida a formação de colesterol partículas com apenas globular morfologia. O efeito de estatinas em induzir a formação de cadeias lineares foi encontrado na ordem de 16% para lovastatina, sinvastatina 2% e 0,2% para atorvastatina.

Para avaliar mais o efeito de drogas hipolipemiantes na formação de partículas, agregados de colesterol fluorescente-etiquetadas individualmente foram incubados com ezetimiba, fibrato, niacina e ácido graxo ômega-3. Como observado com as estatinas, estas drogas induziram a formação de partículas de colesterol com heterogêneos tamanhos e formas, conforme exibido na figura 4a-d. Entre eles, a ezetimiba induzida a formação de partículas de colesterol, exibindo as duas morfologias vertente globulares e linear, Considerando que fibratos, niacina e ácido graxo ômega-3 induzida a formação de partículas única globular em forma de colesterol. Por conseguinte, o efeito de drogas na cordoalha linear em forma de formação de partículas de colesterol foi da ordem de 3% para 0% para a ezetimiba, fibrato, 0% de niacina e 0% de ácido graxo ômega-3.

A análise morfológica revelou que cada vertente globulares ou linear em forma de partículas de colesterol é composta de muitas partículas menores ligados entre si. Os tamanhos das partículas de colesterol globulares positivo fluorescente identificados estão na faixa de ~ 2-30 µm2, Considerando que os tamanhos das partículas de forma lineares estão na faixa de ~ 2-60 µm2.

Analisando o efeito de drogas hipolipemiantes em partículas de LDL e VLDL purificada:

Para continuar a analisar a formação de partículas de colesterol na presença de lipoproteínas, os agregados de colesterol fluorescente-etiquetadas individualmente foram incubados com proteínas/partículas purificadas de HDL, LDL e VLDL. Os resultados mostraram que, em comparação com a incubação com partículas de LDL e HDL, o que os agregados de colesterol incubados com proteínas VLDL causadas a formação de um maior número de partículas de colesterol, Figura 5. Além disso, duas grandes frações de partículas de colesterol foram observadas em populações de VLDL sugerindo sua transformação parcial em uma fração LDL durante a incubação com os agregados de colesterol fluorescente-etiquetadas. A análise de imagem de partículas indicou a presença de ambos globulares (~ 97%) e partículas de (~ 3%) de forma lineares entre populações de HDL, LDL e VLDL. O tamanho varia de partículas globulares é ~ 2-30 µm2, enquanto que os intervalos de tamanho de partículas lineares são ~ 2-60 µm2.

Para examinar o efeito de drogas hipolipemiantes purificada partículas, as partículas de VLDL e LDL individualmente foram incubadas com ezetimiba, sinvastatina, lovastatina e niacina. Como resultado, em comparação com experimentos de controle sem a droga, o efeito de drogas observado na formação de partículas de VLDL foi maior em ezetimiba, sinvastatina, lovastatina e niacina. As partículas de LDL incubadas com as drogas mostraram uma grande fração única e o efeito induzido na formação de partículas foi maior no ezetimiba, sinvastatina, lovastatina e niacina, Figura 6.

Variações dos efeitos de drogas hipolipemiantes em alterar a distribuição das partículas de colesterol em amostras de soro:

As experiências anteriores foram realizadas na solução tampão com lipoproteínas purificadas para avaliar o efeito de drogas. Daí, na próxima etapa, a eficácia das drogas hipolipemiantes na formação de partículas de colesterol foi examinada usando 50 amostras de soro coletadas de 25 indivíduos com dislipidemia e 25 indivíduos normais idade-combinadas. A resposta da droga em cada amostra de soro foi medida com base nas alterações no perfil de formação de partículas de colesterol na presença e na ausência de drogas. No ensaio de matriz da chapa, cada amostra de soro foi exibida contra ezetimiba, lovastatina, sinvastatina e drogas de niacina. Os resultados revelaram disparidade entre estas drogas em modulando a distribuição de partículas de HDL, LDL e VLDL em amostras de soro, particularmente seu efeito em reduzir o LDL e aumentar a formação de partículas de colesterol HDL. Três representantes das amostras de soro de dislipidemia exibindo únicas respostas às drogas hipolipemiantes são mostrados na Figura 7.

Identificação do efeito de droga na morfologia modulando de soro derivado partículas de colesterol HDL e LDL:

A análise do fenótipo das partículas de colesterol derivado de soro revelou a presença de cadeias lineares e globular em forma de VLDL, LDL, e subpopulações de HDL, confirmando assim uma morfologia semelhante identificada nos experimentos realizados tanto no buffer e com partículas de lipoproteína purificado conforme mostrado na Figura 8. No entanto, a distribuição de subpopulações de partículas do colesterol de forma globular e linear amplamente variado entre dislipidemia e idade-combinadas em indivíduos normais. Notavelmente, os ensaios de controle realizados sem as drogas mostraram diferenças na distribuição de strand linear em forma de partículas de colesterol LDL entre dislipidemia (média de 2,0%) e idade de correspondência normal (média de 1,3%) amostras de soro. Da mesma forma, observou-se um aumento do nível de strand linear em forma de partículas de HDL colesterol em amostras de dislipidemia (média de 18,3%) em comparação com a idade de correspondência (média de 11,1%) amostras de soro. Em correlação, os ensaios realizados na presença de drogas em amostras de soro de dislipidemia mostrou uma redução significativa na linear em forma de HDL colesterol partículas formação para ezetimibe (média de 11,5%), sinvastatina (média de 8,3%), lovastatina (média de 11,7%), e não há redução de niacina (média de 18,3%). Além disso, foi observada uma diminuição na formação de linear em forma de partículas de colesterol LDL em amostras de soro de dislipidemia quando incubadas com as drogas exibidas na tabela 1.

Além disso, os ensaios realizados na presença de drogas no samp de soro controle idade-combinadosLes mostrou redução significativa na linear em forma de partículas de colesterol HDL em ezetimibe (média 8,2%), sinvastatina (média de 5,0%), lovastatina (média 8,7%) e niacina (média de 10,8%) como mostrado na tabela 2. Tanto dislipidemia e soro normal de idade correspondente amostras exibindo induzido redução linear em forma de LDL e HDL colesterol partículas mostrou um aumento relativo de partículas de colesterol em forma globular (dados não mostrados).

Figure 1
Figura 1: Diagrama ilustrando o processo de visualização em vitro da morfologia de partículas de colesterol. (a, b) A adição de drogas hipolipemiantes, em amostras de soro ou tampão. (c), a adição de colesterol solúvel fluorescência-etiquetada agregados para as amostras. (d) aquisição resultantes amostras para análise morfológica das partículas de colesterol insolúveis usando citometria de fluxo de imagem. Barras de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: identificação de duas morfologias distintas de partículas de colesterol utilizando a citometria de fluxo de imagem. (um) partículas estão separadas em populações globulares ou lineares, com base na análise textural de imagens o campo claro. Especificamente, o ponto-enredo de dizer H homogeneidade (eixo x) e dizer H entropia (eixo y) contém duas regiões fechadas para detectar globular (vermelho) e vertente linear em forma de partículas de colesterol (azul). (b) imagens exibindo morfologia das partículas de forma globulares, identificados na população 1. (c) imagens de strand linear em forma de partículas identificadas na população 2. (d) histograma mostrando a distribuição de todas as partículas de colesterol positivo fluorescente usado para determinar a sua concentração e subpopulações. Barras de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: imagem galerias exibindo o efeito das estatinas em modulando a formação de partículas de colesterol. Campo claro refere-se à área semelhante ao FSC no citômetro de fluxo convencional. Canal verde refere-se a emissão de fluorescência detectada em 505-560 nm e canal amarelo refere-se a emissão de fluorescência detectada em 560-595 nm. (a-e) Galerias de imagem, morfologia das partículas de colesterol formaram na presença de lovastatina, sinvastatina, Atorvastatina, rosuvastatina e fluvastatina, respectivamente. (f) formação de partículas de colesterol na ausência de estatina (controle negativo). Barras de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: demonstrando o efeito diferencial de drogas hipolipemiantes na formação de partículas de colesterol de modulação. (a-d) Galerias de imagem, morfologia das partículas de colesterol formaram na presença de ezetimiba, fibrato, niacina e ácido omega-3 gordos, respectivamente. Canal verde refere-se a emissão de fluorescência detectada em 505-560 nm e canal amarelo refere-se a emissão de fluorescência detectada em 560-595 nm. Barras de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: análise de HDL, LDL e VLDL colesterol partículas formação na ausência da droga. Lotes do ponto: Eixo x exibe um espectro de partículas de colesterol detectado no canal de fluorescência verde (505-560 nm) e eixo y apresenta dispersão de lado. Gating mostra regiões de partículas de HDL, LDL e VLDL detectadas nos lotes do ponto de fluorescência. (a) formação de partículas de colesterol na presença de VLDL purificada. (b) representante imagens de partículas de VLDL. (c) formação de partículas de colesterol na presença de LDL purificada. (d) representante imagens de partículas LDL. (e) formação de partículas de colesterol na presença de HDL purificada. imagens (f), representante das partículas de HDL. Barras de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: demonstrar o efeito de lipídio abaixando drogas na purificado de partículas de VLDL e LDL colesterol. (um) VLDL partículas sem a droga. (b), VLDL partículas incubadas com ezetimibe. (c), VLDL partículas incubadas com lovastatina. (d), VLDL partículas incubadas com sinvastatina. (e), VLDL partículas incubadas com niacina. (f), LDL partículas incubado sem a droga. partículas (g), LDL incubadas com ezetimibe. (h), LDL partículas incubadas com lovastatina. (eu) LDL partículas incubadas com sinvastatina. (j), LDL partículas incubadas com niacina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: fluorescência-lotes do ponto mostrando um efeito diferencial de lipídio abaixando drogas na modulação de HDL, LDL e VLDL formação de partículas de colesterol em amostras de soro. Linha superior, seleção da resposta de baixo nível droga soro 1 apresentando aumento 0 a formação de partículas de HDL 15%; fila do meio, seleção da resposta de drogas nível moderado soro 2 apresentando no aumento de 16 para partículas de HDL de 50%; Linha inferior, seleção da resposta do soro 3 apresentando maior nível de droga no aumento de 51 a 100% as partículas de HDL. (a, f, k) Amostras de soro, sem drogas. (b, g, l) As amostras de soro incubadas com ezetimibe. (c, h, m) As amostras de soro incubadas com lovastatina. (d, i, n) As amostras de soro incubadas com sinvastatina. (e, j, ó) As amostras de soro incubadas com niacina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: galerias de imagem, morfologia das partículas de colesterol identificada no soro da amostra 1. Canal verde mostra imagens da emissão da fluorescência das partículas; dispersão de lado (canal ciano) mostra imagens do laser da excitação luz espalhada pelas partículas. (um) colesterol de forma Globular e linear partículas formam sem a droga. (b, c, d, e) Partículas de colesterol formaram na presença de ezetimiba, sinvastatina, lovastatina e niacina, respectivamente. Barras de escala= 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ID de soro Sem drogas (controle) Com ezetimiba Com lovastatina Com sinvastatina Com niacina
Partículas de LDL % lineares, Partículas de HDL % lineares, Partículas de LDL % lineares, Partículas de HDL % lineares, Partículas de LDL % lineares, Partículas de HDL % lineares, Partículas de LDL % lineares, Partículas de HDL % lineares, Partículas de LDL % lineares, Partículas de HDL % lineares,
PNDS-01 1.73 45,2 0,81 18,1 0,61 16.1 0,59 13,9 2.26 33,6
PNDS-02 2.86 35,9 1.26 30,9 1.27 22,7 0,73 15.2 3.03 37,7
PNDS-03 2,04 35,8 0.87 4.82 1,02 4.14 0.36 3,06 0.45 9,57
PNDS-04 2,56 32,9 1.15 21,8 1.12 18,6 0,77 17.2 3.37 36,5
PNDS-05 0.42 29,2 0,24 5,62 0.22 8,72 0.16 9,91 0.35 22.2
PNDS-06 1.8 28.1 0.4 16,8 0.62 15 0.42 9.27 2.28 38,4
PNDS-07 1.8 26,5 0.85 10.5 1.18 19,9 0.62 7,32 1.29 23,4
PNDS-08 0,98 22,8 0.86 7.28 1,55 10.2 0,14 5.98 0,59 13.3
PNDS-09 3,87 22.1 1,98 9,56 1,87 10.3 1.46 7,96 2.86 9.88
PNDS-10 4.46 21,9 2,57 13,6 4.04 17.1 2.28 11,9 0,71 25,7
PNDS-11 1.57 19.2 1.15 9,24 1.37 6,98 0,74 5,03 1.37 16
PNDS-12 1.06 16,7 0,66 4.38 0.7 4,74 0,99 6,36 1.14 4.73
PNDS-13 4.85 16.6 1.28 30,4 1.4 32,6 0.8 16.6 4,02 31
PNDS-14 2.08 16 0,68 15,4 0.64 16.5 1,97 10.2 1.25 20.11
PNDS-15 1.5 11,9 1.14 13.3 1.21 11.4 0.8 6.12 1.38 4,59
PNDS-16 1.82 10.4 2,04 9.59 1.24 5,62 0.91 5,38 1.31 7.61
PNDS-17 1,05 10.3 1,02 4.7 1.78 15.1 0.93 7.81 1.27 13
PNDS-18 1.11 8.76 0,54 3,68 0,61 3.51 1.01 5,03 1,02 6,69
PNDS-19 1 8,52 0.75 6,67 0.76 5.86 0.91 8.36 1.22 11,9
PNDS-20 3.54 7,92 3.78 12 3,56 5,81 3.28 8.28 3.44 12.3
PNDS-21 1,88 7.69 2.12 11.4 1.73 9.54 1,77 8,34 2.32 16,7
PNDS-22 1.64 7.17 0.35 5,75 0,56 13.2 0,14 4.33 1.23 17,8
PNDS-23 1,54 6,27 1.25 7.24 1,02 6.12 0,73 3.58 1.42 6,69
PNDS-24 0,53 6.22 0,52 4,49 0.91 5,57 0,54 4.01 0.65 10.5
PNDS-25 2,97 5.1 1,59 11 1,88 9 1,03 6,54 2,61 29.1

Tabela 1: triagem de dislipidemia amostras de soro no ensaio de matriz da chapa mostram o efeito diferencial de drogas hipolipemiantes. Comparados aos controles sem drogas (colunas 2, 3), as amostras de soro incubadas com ezetimiba (colunas 4, 5), lovastatina (colunas 6, 7), sinvastatina (colunas 8, 9) e niacina (colunas 10, 11) mostraram variações na indução linear em forma de colesterol LDL e HDL formação de partículas.

ID de soro Sem drogas Com ezetimiba Com lovastatina Com sinvastatina Com niacina
Partículas de LDL % lineares, Partículas de HDL % lineares, Partículas de LDL % lineares, Partículas de HDL % lineares, Partículas de LDL % lineares, Partículas de HDL % lineares, Partículas de LDL % lineares, Partículas de HDL % lineares, Partículas de LDL % lineares, Partículas de HDL % lineares,
PNAN-01 2.05 26,8 0.62 11,9 0,56 16,9 0,52 9.28 1.4 11,9
PNAN-02 1.35 26.3 1.68 21,8 2.59 23,6 0.79 6,92 2.16 29,7
PNAN-03 2.4
24,9 0,53 7,54 0,57 13,8 0.55 5.82 1.7 4.71 PNAN-04 1.99 21.5 1,54 9.45 1.56 8,25 0.31 3,74 2.88 20,8 PNAN-05 1,77 18,8 1,49 6,03 1,65 5.5 0,54 4,67 1.2 8.19 PNAN-06 1.12 15.2 0,67 4.42 2.68 13.3 0,5 2.37 1,54 16.3 PNAN-07 1,03 14,4 0.79 6.83 1.45 7.91 0,67 5,36 1.57 12 PNAN-08 0,98 14.3 0,88 4.48 2 7.1 0,19 2.66 1,02 18,1 PNAN-09 2.85 14.1 1.95 12.6 2.34 12.5 0.7 6.24 1.84 18,7 PNAN10 1.01 10.4 0.8 5.07 0,51 5.9 0.87 6.5 1.63 10.9 PNAN-11 0,92 12.4 0.21 9.94 0,29 3.31 0,29 6,52 0,58 10.4 PNAN-12 0.6 10.5 0,56 5.78 1.06 4,74 0.4 3.32 0.91 11,8 PNAN-13 1.25 10.3 0.45 3.79 0,67 6.53 0,27 3.17 0.8 6.28 PNAN-14 1,03 9,86 1.12 8.51 1,05 6,91 0.6 5.94 1,05 8.14 PNAN-15 2.28 8.1 1.93 10.4 2.14 8.86 1.56 6.84 2.31 8,61 PNAN-16 1,98 7.69 0.45 4.36 1 5.46 0,27 2.89 0,49 4.12 PNAN-17 1.72 6,72 0.75 14,8 0,74 9.26 0,49 5.58 1,98 12,8 PNAN-18 2.45 6.38 0.85 16,8 0,89 14.2 0,58 5.9 1.8 20,6 PNAN-19 1.67 5.12 0,58 8.63 0.65 5.7 0.64 8.8 1,88 2.08 PNAN-20 1.17 4.41 0.85 7,77 0.91 6,43 0,69 5,08 1.21 6.12 PNAN-21 0.31 4.18 0,48 6,95 0,19 5.09 0.15 2.1 0,29 5.93 PNAN-22 0,77 4,02 1.24 7,41 0,61 5.02 0,29 3.49 0.42 3,98 PNAN-23 0.4 1.25 0.75 6.25 0,88 5.91 0.9 5,06 0,82 6,71 PNAN-24 0.45 1.1 0,63 2.5 0.55 5.32 0.9 4.3 0,71 3.5 PNAN-25 0.36 1 0,73 2.4 0,66 5.1 0,82 4 0.7 3.4

Tabela 2: triagem de amostras de soro controle idade-combinadas em ensaio de matriz da chapa mostram o efeito diferencial de drogas hipolipemiantes. Comparados aos controles sem drogas (colunas 2, 3), as amostras de soro incubadas com ezetimiba (colunas 4, 5), lovastatina (colunas 6, 7), sinvastatina (colunas 8, 9) e niacina (colunas 10, 11) mostraram variações na indução linear em forma de colesterol LDL e HDL formação de partículas.

Discussion

Em geral, a distribuição e propriedades funcionais das partículas de colesterol HDL, LDL e VLDL na circulação sanguínea são determinadas principalmente pela metabólico, genético, epidemiológico, celular e plasma fatores22,23. No presente estudo, analisar os efeitos da modificação de lipídios drogas no buffer revelaram que drogas altamente lipofílicas como a ezetimiba, sinvastatina, lovastatina e atorvastatina induziram uma complexidade de nível superior na morfologia das partículas de colesterol em comparação com o efeito de nível mais baixo observado com drogas altamente hidrofílicas de Rosuvastatina e fluvastatina. Estes resultados estão em boa concordância com nosso estudo anterior, descrevendo um efeito não enzimáticos mecanismo baseado das estatinas em LDL e HDL formação de partículas de colesterol no buffer e soro amostras21de modulação. Por conseguinte, os resultados do presente estudo revelaram um mecanismo não-enzimática de ação da ezetimiba, fibrato, niacina e ácido graxo ômega-3 drogas que podem desempenhar um papel directo na formação de partículas de colesterol de modulação. É possível que as interações entre drogas e agregados de colesterol leva à assembleia de partículas de colesterol de grandes dimensões que são 2-60 µm2, exibindo morfologias vertente globulares e linear.

Além disso, os resultados obtidos usando partículas de lipoproteína purificada sugerem interações entre agregados de colesterol e fatores de plasma, incluindo proteínas HDL, LDL e VLDL que podem alterar as composições e propriedades morfológicas do colesterol partículas. Os resultados do tratamento de drogas envolvendo partículas de lipoproteína purificada indicam um efeito de drogas de nível superior na formação de partículas de VLDL em relação ao seu efeito observado na formação de partículas de colesterol LDL. As ezetimiba, sinvastatina e lovastatina drogas foram usadas como pro-drogas e suas doses em ensaios podem ser maiores do que as concentrações fisiológicas.

Curiosamente, triagem de amostras de soro mostrou variações do efeito de drogas em alterar os perfis de formação de partículas de colesterol HDL, LDL e VLDL, especialmente seus efeitos sobre as formações da linear em forma de partículas de LDL e HDL. Estas drogas induziram redução linear em forma de LDL e HDL formação de partículas de colesterol em dislipidemia e amostras de soro normal de idade correspondente. Os efeitos de droga observados na redução da formação de partículas de forma linear foi maior no ezetimiba, sinvastatina, lovastatina e niacina. A identificação das partículas de colesterol com morfologias vertente globulares e linear nas amostras de soro normal e dislipidemia sugere que as partículas com morfologias semelhantes podem formar em condições na vivo . Estudos anteriores identificaram a presença de disco e cristais de colesterol de agulha-como na ateroma de humanos e ApoE- / - e LDLR- / - ratos modelos24,25,26 ,de27,28.

As partículas de HDL circulantes no sangue existem como uma mistura heterogênea e o nível das partículas de HDL de pequeno e grande porte juntamente com atividade funcional são fatores importantes para exercer seu efeito cardio-protetor através do transporte reverso de colesterol percurso de29,30. Estudos recentes salientaram a importância de identificar subfractions de partículas HDL colesterol para elucidar seu papel em várias funções biológicas como o efluxo de colesterol, anti-inflamatório, anti-trombótica e antioxidativo31 . Além disso, vários estudos têm relatado o efeito da terapia de hipolipemiantes em aumentar um ponto baixo para moderar o nível de HDL no plasma1,5,21. Nesse sentido, os resultados deste estudo fornecem introspecções novas em características morfológicas das partículas de colesterol. Notavelmente, a detecção de um maior nível de linear em forma de partículas de HDL colesterol nas amostras de soro de dislipidemia assuntos sugere que eles podem ser o biomarcador confiável para diagnóstico e avaliar os efeitos da modificação de lipídios drogas em pacientes. No entanto, mais investigação é necessária usando grandes amostras clínicas para entender melhor as partículas de colesterol com morfologias distintas e sua associação à DCV.

No ensaio de matriz da chapa para examinar o efeito de drogas no conjunto de partículas de colesterol, usamos 2 µ g de fluorescência rotulado agregados de colesterol e 5 µgof cada droga porque: (1) drogas competitivamente ligar para ambos fluorescência rotulado de colesterol e endógenos lípidos presentes nas amostras de soro; (2) de cada amostra, adquirimos as partículas de colesterol de 5.000 a 10.000 que são montadas em grandes tamanhos e formas, que variam de ~ 2-60 µ2; (3) observamos um variações de resposta de drogas entre as amostras de soro, incubadas com as drogas (doses 300 ng de 5 µ g) e ~ 15% deles incubadas com altas doses não mostrou nenhuma alteração detectável no perfil de formação de partículas de colesterol; e (4) a interação entre agregados de colesterol e drogas hipolipemiantes é mediada por um processo não enzimáticos. Portanto, as concentrações dos reagentes usados no ensaio podem ser superiores a seu nível fisiológico.

Em conclusão, temos com sucesso demonstrado as vantagens de um em vitro método descrito neste estudo para determinar o efeito de um amplo espectro de drogas hipolipemiantes na morfologia e composição de colesterol de modulação de imagem partículas. A abordagem de Visualizar e quantificar a morfologia das partículas de lipídios, empregando uma constelação de algoritmos de análise de imagem pode ajudar o diagnóstico de aterosclerose e avaliar os resultados da terapia de hipolipemiantes em pacientes.

Disclosures

Dr. Madasamy recebeu o apoio de concessão de Plaxgen, Inc e tem um interesse financeiro concorrente. Os outros autores têm sem interesses financeiros concorrentes para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por uma pesquisa Plaxgen subsídio concedido a SM (PLX-1008). Agradecemos a Palo Alto Medical Research Foundation Research Institute para a coleta de amostras de soro de indivíduos aterosclerose sob aprovação do IRB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TopFluor fluorescent cholesterol Avanti Polar lipids store 100 µl aliquots at -20 °C
simvastatin (pro-drug) Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
lovastatin (pro-drug) Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
rosuvastatin Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
atorvastatin Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
fluvastatin Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
ezetimibe (pro-drug) Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
Niacin MilliporeSigma store 100 µl aliquots at -20 °C
fibrate MilliporeSigma store 100 µl aliquots at -20 °C
omega-3 fatty acid MilliporeSigma store 100 µl aliquots at -20 °C
purified VLDL proteins/particles Lee Bio
purified LDL proteins/particles Lee Bio
purified HDL proteins/particles Lee Bio
Human age-matched serum Dx Biosamples
Human atherosclerosis serum Bioserve
Human normal serum Stanford Blood center
LDL measurement reagent pack Roche Diangostics
HDL measurement reagent pack Roche Diangostics
Total cholesterol measurment Roche Diangostics
96-well microtitre plates
Triglycerides measurement Roche Diangostics
Amnis Imaging Flow cytometer Amnis Inc
IDEAS image analysing software Amnis Inc
Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 Awarness Technology
Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 Roche Diangostics

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