Summary
Het doel van deze studie was om te evalueren in vitro lipide-verlagende drug effecten bij het moduleren van de morfologie van cholesterol deeltjes. Vergelijking van lipide-verlagende geneesmiddelen toonde variaties in hun effect bij het moduleren van de morfologische kenmerken van cholesterol deeltjes.
Abstract
Behandeling van dyslipidemia patiënten met lipide-verlagende medicijnen leidt tot een aanzienlijke vermindering van low-density lipoproteins (LDL) niveau en een lage tot matige hoeveelheid toename van high-density lipoproteïne (HDL) cholesterol in plasma. Een mogelijke rol van deze drugs veranderen morfologie en verdeling van de deeltjes van cholesterol is echter slecht begrepen. Hier beschrijven we de evaluatie in vitro van lipide-verlagende drug effecten bij het moduleren van de morfologische kenmerken van cholesterol deeltjes met de plaque matrix methode in combinatie met stroom cytometry imaging. Beeld analyses van de deeltjes die cholesterol aangegeven dat Lovastatine, simvastatine en ezetimibe Atorvastatine de vorming van zowel lineaire als bolvormige strand-vormige deeltjes veroorzaken, overwegende dat niacine, fibrates en Fluvastatine Rosuvastatine veroorzaken de vorming van alleen bolvormige-vormige deeltjes. Volgende, gezuiverde zeer low-density lipoprotein (VLDL) en LDL deeltjes geïncubeerd met deze drugs toonde veranderingen in de morfologie en afbeelding textuur van cholesterol deeltjes subpopulaties. Bovendien, screening van 50 serummonsters bleek de aanwezigheid van een hoger niveau van lineaire gevormde HDL cholesterol deeltjes bij patiënten met dyslipidemia (gemiddelde van 18,3%) in vergelijking met de normale leeftijd-matched (gemiddelde van 11,1%) monsters. Wij merkte tevens aanzienlijke verschillen in lipide-verlagende drug effecten op het verminderen van lineaire LDL en HDL cholesterol deeltjes vorming in serummonsters gevormd. Deze bevindingen wijzen erop dat lipide-verlagende geneesmiddelen, naast de cel-gemedieerde hypolipidemic gevolgen ervan, rechtstreeks morfologie van cholesterol deeltjes door een niet-enzymatische mechanisme van actie moduleren kunnen. De resultaten van deze resultaten hebben potentieel te informeren van de diagnose van atherosclerose en voorspellen van optimale lipide-verlagende therapie.
Introduction
Talrijke klinische studies hebben aangetoond dat gunstige effecten van de lipide-verlagende geneesmiddelen bij het verminderen van plasma niveaus van low-density lipoproteins (LDL) cholesterol en een lage tot matige hoeveelheid toename van high-density lipoproteïne (HDL) cholesterol, die Hiermee voorkomt u dat zowel primaire als secundaire gevallen van atherosclerose-nadelige cardiovasculaire gebeurtenissen1,2,3,4,5. Statines, een groep van HMG-CoA reductase enzym remmers, blokkeren endogene cholesterol synthese in de lever dat in beurt leiden tot lagere niveau van LDL-cholesterol in het bloed6,7 circulerende. Evenzo is de lipide verlagen effect van niacine gemedieerd door zijn directe en concurrerend remming van de hepatocyte diacylglycerol acyltransferase-2, een belangrijke leverenzym triglyceride synthese8deelnemen. Betrekkelijk, vermindert ezetimibe plasma niveau van LDL door absorptie van exogene cholesterol door binding aan eiwitten van Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) gelegen in de epitheliale cellen van de dunne darm9te beperken. Fenofibraat, een andere lipide-verlagende drug, aanzienlijk vermindert de plasmaconcentraties van triglyceriden en vermindert ook matig LDL cholesterol via de peroxisome proliferator-geactiveerde receptoren traject10. Bovendien, omega-3 vetzuur is gemeld dat het anti-atherosclerotische effect vanwege haar vermogen om lagere niveaus van het plasma van LDL11.
De lipide-verlagende geneesmiddelen, naast hun primaire effect op het verlagen van LDL cholesterol, hebben een aantal gunstige pleiotropic effecten, met inbegrip van de verbetering van het HDL-niveau, verbetering van endothelial functies, vermindering van ontsteking en remming van de bloedplaatjes aggregaties12,13,14. Het onderliggende mechanisme van deze drugs in de verhoging van HDL cholesterol deeltjes en wijzigen hun structurele kenmerken zijn echter niet volledig begrepen. Aangezien deze geneesmiddelen zijn algemeen voorgeschreven voor de behandeling van atherosclerose-gerelateerde cardiovasculaire aandoeningen (CVDs), is het essentieel om hun mogelijke rol bij het bepalen van de morfologische kenmerken en verdeling van de deeltjes lipide verder te onderzoeken. De menselijk plasma lipidome bestaat uit ongeveer 600 verschillende lipiden en 22 verschillende moleculaire soorten cholesterols die aanwezig in verschillende maten, vormen, densiteiten en composities15,16,17 zijn . Analytische methoden zoals ultra-centrifugeren en NMR gradiënt gelelektroforese worden gebruikt voor het karakteriseren van de LDL en HDL-deeltjes en hun subfractions18,19. Toepassing van deze methoden is echter beperkt tot studies gericht op het vaststellen van het effect van drugs bij het moduleren van de morfologie en de assemblage van de lipide-deeltjes. De stroom cytometer gebaseerde plaque array is een functionele biochemische assay ontwikkeld voor detectie en visualisatie van serum verkregen lipide en amyloid plaque deeltjes20. De voordelen van in vitro imaging in deze studie beschreven methode inschakelen identificatie van lipide-modulerende effecten van de drug in het veranderen van de morfologie en de verdeling van de deeltjes van de cholesterol in buffer en serum monsters.
Protocol
1. voorbereiding van de TL-geëtiketteerden Cholesterol en lipide-verlagende geneesmiddelen
Opmerking: aggregaten van de TL-geëtiketteerden cholesterol en statines werden voorbereid zoals beschreven in ons vorige artikel 21. Zie Tabel van materialen voor details van de reagentia, imaging stroom cytometer, chemie analyzers, en software van de analyse van gegevens in deze studie gebruikt.
- Solubilize TL-geëtiketteerden gelyofiliseerd cholesterol (1 mg, Ex / Em = 495 nm/507 nm) poeder in 100% alcohol 1 mL.
- Het monster gedurende 3 minuten op 2,040 x g centrifugeren en gebruik het supernatant met oplosbare fluorescentie-geëtiketteerden cholesterol aggregaten in de plaque matrix assay.
- Voor de bereiding van geneesmiddelen, individueel de poeders (2 mg) van simvastatine, Lovastatine Atorvastatine, ezetimibe en omega-3 vetzuur in 1 ml 100% alcohol solubilize.
- Na het centrifugeren gedurende 3 minuten op 2,040 x g, gebruiken het supernatant met drugs in de assay.
- Ook solubilize individueel de poeders (2 mg) Fluvastatine Rosuvastatine, niacine, en fibrate in 1 mL gedeïoniseerd water te maken van een stamoplossing van 2 mg/mL.
- Na het centrifugeren gedurende 3 minuten op 2,040 x g, gebruiken het supernatant met drugs in de plaque matrix assay.
2. Plaque Array Assay voor onderzoek In Vitro Cholesterol deeltjes vorming
- gebruik chemistry analyzer-1 (zie tabel van materialen) instellen op de plaque matrix assay voor cholesterol deeltjes vorming. Het uitvoeren van de bepaling in een ronde bodem, laag eiwitgehalte bindende 96-wells-plaat met behulp van de reagentia die in sectie 1 worden bereid. Het volume van de uiteindelijke reactie in elk putje op 200 µL handhaven en alle testen uitvoeren in drievoud.
- Eerste, belasting 194,5 µL van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan elk putje.
- Elk Nou, toevoegen van 2,5 µL (5 µg) van elke drug lipide-verlagende oplossing en schud de plaat voor 30 s door het op de plaat te mengen gelijkmatig het geneesmiddel in oplossing chemicaliënverbruik opvalt analyzer-1 reactie te plaatsen. Geen drug wordt toegevoegd aan de negatieve controlemonsters.
- Ten slotte 2 µL (2 µg) TL-geëtiketteerden cholesterol statistische oplossing toevoegen aan elk putje en schud de plaat voor 30 s door deze te plaatsen op plaat chemicaliënverbruik opvalt analyzer-1 reactie.
- De plaat op een lab-shaker voor 2 h vastgesteld op 37 ° C en 200 rpm Incubeer.
- Na incubatie, verwerft u de beelden van deeltjes door imaging stroom cytometry.
3. Vastleggen van beelden van Cholesterol deeltjes met behulp van Imaging Stroom Cytometry
- Open de gegevenssjabloon voor de overname voor het laden van de juiste instrumentele instellingen. Klik op " bestand ", selecteer vervolgens " Open sjabloon … " en selecteer het sjabloonbestand.
- Klik op " Flush, Lock en Load " ter voorbereiding van het instrument voor monster laden.
- Wanneer de " laden monster " dialoog doos wordt geopend, klikt u op " OK " te laden 50 µL van de monsters uit elk goed voorbereid in sectie 2 in de beeldvorming stroom cytometer.
- Klik " uitvoeren | Setup " de deeltjes in het imaginggebied in real-time bekijken. Klik op
- wanneer de deeltjes in het imaginggebied in goede focus, " uitvoeren | Verwerven " te verwerven van de beelden van elk object gelijktijdig in zodanig hoge gegevensdoorvoer voor donkere velden (kant scatter/SSC), heldere (BF), groene fluorescentie en gele fluorescentie.
- Herhaal stap 3.2-3.5 te verwerven van 5.000-10.000 deeltjes van elk monster.
- Analyseren alle raw-afbeeldingsbestanden met behulp van de software van de analyse van de afbeelding voor het bepalen van object fluorescentie intensiteit en morfologische variaties.
- Klik op de " Tools " knop aan de bovenkant van de software van de analyse van de afbeelding en selecteer vervolgens " gegevens batchbestanden " uit de drop-down menu, die wordt geopend de " partijen " venster.
- In de " partijen " venster, klik op de " Batch toevoegen " knop, die wordt geopend de " definiëren een Batch " venster.
- In het " definiëren een Batch " venster, klik op de " bestanden toevoegen " knop en selecteer de raw-afbeeldingsbestanden, klikt u op de " sjabloon " knop en selecteert u de juiste gegevens analyse sjabloonbestand en vervolgens " OK " en " dienen partijen " om te beginnen van de verwerking en analyse van de raw-afbeeldingsbestanden.
4. Plaque Array Assay gebaseerd evaluatie van lipide-verlagende Drugs Effect op de Cholesterol-deeltjes gezuiverd
- zoals beschreven in stap 2.1, voeren de cholesterol deeltjes vorming bepaling met behulp van gezuiverde VLDL, LDL en HDL lipoproteïnen/deeltjes. Uitvoeren van de bepaling van de matrix plaque in een 96-wells-plaat.
- Eerste, laden alle putjes met PBS; gebruiken van een 200 µL eindvolume voor elk putje.
- Voor de negatieve controle, 4 µg VLDL, LDL, toevoegen of HDL eiwitten/deeltjes individueel in elk goed zonder drugs en schud de plaat voor 30 s.
- Voor de behandeling van het lipide-verlagende drug effect, 4 µg VLDL, LDL, toevoegen of HDL eiwitten/deeltjes individueel aan elk goed en schud de plaat voor 30 s.
- Voor wells toegevoegd met 4 µg VLDL of LDL, HDL, voeg 2.5 µL (5 µg) ezetimibe, simvastatine, Lovastatine of niacine-oplossing toe en schud de plaat voor 30 s door deze te plaatsen in chemistry analyzer-1.
- Ten slotte 2 µL (2 µg) cholesterol fluorescentie-geëtiketteerden statistische oplossing toevoegen aan alle putjes en schud de plaat voor 30 s door deze te plaatsen op plaat chemicaliënverbruik opvalt analyzer-1 reactie.
- De plaat gedurende 2 uur in een lab shaker vastgesteld op 37 ° C en 200 rpm Incubeer.
- Verwerven van de monsters met behulp van imaging stroom cytometry na maatregelen 3.1-3.5.
- Analyseren van raw-afbeeldingsbestanden met behulp van de software van de analyse van de afbeelding, zoals beschreven in stap 3.7.
- In de analyse template, gebruik van de volgende gating regeling voor de identificatie van cholesterol deeltjes subpopulaties.
- Op een perceel van aantal (x-as) van de pixels van de groene kanaal verzadigd en donkere veld kanaal aantal verzadigde pixels (y-as), objecten met een of meer verzadigde pixels in elk kanaal verwerpen.
- De objecten/deeltjes uitzetten zonder verzadigde pixels met behulp van groene kanaal intensiteit (x-as) en SSC intensiteit (y-as): objecten vallen in een van de drie gewesten (VLDL, LDL, HDL) op basis van hun groene kanaal en SSC intensiteiten.
Opmerking: Deze poorten waren gemaakt op basis van gegevens die zijn gegenereerd op basis van controle experimenten uitgevoerd met behulp van gezuiverde VLDL, LDL en HDL deeltjes/eiwitten zonder de drug.
- Om te bepalen van het effect van de drug lipide-verlagende voor elk monster, als volgt berekend: de totale lipoproteïne deeltjes concentraties, evenals het percentage van elke subpopulatie (VLDL, LDL, HDL) beschreven in stap 6.5.
- Berekenen het deeltje concentraties (deeltjes/mL) met behulp van de volgende vergelijking:
Opmerking: The VLDL, LDL en HDL gating regio's in de fluorescentie dot-plot detecteren ~ 80% van hun respectieve subpopulaties, en de resterende ~ 20% van de deeltjes elkaar overlappen met andere gating gebieden.
- Berekenen het deeltje concentraties (deeltjes/mL) met behulp van de volgende vergelijking:
5. Meting van lipide concentraties in het serummonsters
- gebruiken voor het bepalen van de concentraties van LDL, HDL, cholesterol en triglyceriden door chemistry analyzer-2, serummonsters verkregen van leeftijd-matched normaal en dyslipidemia onderwerpen.
- Definiëren voor abnormale concentratie van LDL, HDL, cholesterol en triglyceriden gebaseerd op hun concentratie dan de bovenste en onderste referentiewaarden in serummonsters geïdentificeerd.
- Volg de normale referentie waarde aanbevelenDED door de fabrikant reagens: cholesterol (4-200 mg/dL), HDL (3.0-65 mg/dL) (4-100 mg/dL) LDL en triglyceriden (9-200 mg/dL).
- Identificeren serummonsters die een abnormale waarde hebben, als dan de lagere referentiewaarde of boven de hogere verwijzing voor cholesterol en triglyceriden waarde, en deze voor screening in de aanwezigheid en de afwezigheid van lipide-verlagende geneesmiddelen gebruiken.
6. Analyseren van het Effect van Drugs op Cholesterol deeltjes vorming in serummonsters
- Gebruik de chemie analyzer-1 de plaque matrix assay voor cholesterol deeltjes vorming in serummonsters instellen. Het uitvoeren van de bepaling in een ronde bodem, laag eiwitgehalte bindende 96-wells-plaat. Gebruik een laatste reactie volume van 200 µL per putje en alle testen uitvoeren in drievoud.
- De plaat door het laden van reagentia op een stapsgewijze manier bereiden.
- Bereiden de controleputjes.
- Load 193 µL van PBS aan elk putje.
- Toevoegen van 2,5% (v/v) patiënten serum (slechts één serummonster per putje) en schud de plaat voor 30 s door deze te plaatsen op de plaat van de reactie van chemicaliënverbruik analyzer.
- Toevoegen 2 µL (2 µg) van fluorescentie-geëtiketteerden cholesterol statistische oplossing in elk putje en schud de plaat voor 30 s door deze te plaatsen op een plaat chemicaliënverbruik opvalt analyzer-1 reactie.
- Bereiden de putjes met drugs.
- Load 191 µL van PBS aan elk putje.
- Toevoegen van 2,5% (v/v) patiënten serum (slechts één serummonster per putje) en schud de plaat voor 30 s door deze te plaatsen op een plaat chemicaliënverbruik opvalt analyzer-1 reactie.
- Toevoegen 2 µL ezetimibe, simvastatine en Lovastatine niacine oplossing (4 µg) aan alle putjes met uitzondering van de negatieve controle putten. Voeg slechts één drug per putje en schud de plaat voor 30 s door deze te plaatsen op een plaat chemicaliënverbruik opvalt analyzer-1 reactie.
- Toevoegen 2 µL van fluorescentie-geëtiketteerden cholesterol statistische oplossing (2 µg) in elk putje en schud de plaat voor 30 s door deze te plaatsen op plaat chemicaliënverbruik opvalt analyzer-1 reactie.
- Drugs laden nadat alle putjes (controle en drug-behandeld) zijn geladen met hun respectieve serummonsters en fluorescentie-geëtiketteerden cholesterol toevoegen aan het eind van deze stap.
- De plaat gedurende 2 uur in een lab shaker vastgesteld op 37 ° C en 200 rpm Incubeer.
- Verwerven van de monsters door imaging stroom cytometer volgende instellingen beschreven in stap 3.1-3.6.
- Gebruik van de afbeelding analyseren van software voor batch-verwerking van alle afbeeldingsbestanden dezelfde sjabloon gebruiken zoals beschreven in stappen 3.7.
- De data-analyse uitvoeren door de tekening van poorten op het perceel, zoals beschreven in stappen 4.5 en 4.6.
- Om te bepalen van het lipide-verlagende drug effect/antwoord (laag, normaal en hoog) voor elk monster, het berekenen van de totale lipoproteïne deeltje concentratie, alsook het percentage van de totale deeltjes bestaande uit VLDL, LDL en HDL subpopulaties.
- Plot de VLDL, LDL en HDL populaties in een histogram van het object ' s helder veld image, breedte afgetrokken van lengte (lengte - breedte) en poort in bolvormige of lineaire regio's: objecten met (lengte - breedte) ≤ 2 µm vallen de bolvormige regio voor de berekening van het percentage van bolvormige en lineaire gevormde deeltjes.
- Vergelijken het percentage van de bolvormige en lineaire gevormde LDL en HDL cholesterol deeltjes voor elk serummonster geïncubeerd met en zonder elk medicijn geïdentificeerd. Onder drievoudige voor elke serummonster verkregen waarden, accepteren het percentage bolvormige en lineaire vormige LDL en HDL-deeltjes die binnen het bereik van SD ±2 voor bepaling van het effect van de drug vallen.
Representative Results
Plaque Array Assay gebaseerde analyse van lipide-verlagende Drug effecten op Cholesterol deeltjes vorming:
Voor de evaluatie van het effect van statines bij het moduleren van de morfologie van cholesterol deeltjes, werden TL-geëtiketteerden cholesterol aggregaten individueel geïncubeerd met Lovastatine, simvastatine, Atorvastatine, Fluvastatine in de buffer en Rosuvastatine. Al deze monsters werden verkregen met behulp van imaging stroom cytometry om beelden van de deeltjes van de cholesterol voor morfologie analyse zoals aangegeven in Figuur 1 en Figuur 2te vangen. Interessant, analyseren het effect van de drug op cholesterol deeltjes vorming in buffer aangegeven dat atorvastatin, lovastatin en simvastatin veroorzaken de vorming van een heterogene populatie van cholesterol deeltjes worden getoond diverse maten en vormen, Figuur 3a -c. Omgekeerd, de deeltjes cholesterol gevormd in aanwezigheid van Rosuvastatine, Fluvastatine, en de negatieve controle (zonder drugs) waren homogene in vorm en morfologie zoals weergegeven in figuur 3d-f. Daarnaast werd naar voren gebracht dat atorvastatin, lovastatin en simvastatin de vorming van cholesterol deeltjes tentoonstellen van beide bolvormige en lineaire strand morphologies, veroorzaakt overwegende dat Rosuvastatine en Fluvastatine de vorming van cholesterol veroorzaakt deeltjes met alleen bolvormige morfologie. Het effect van statines op de vorming van lineaire strengen inducerende werd gevonden in de volgorde van 0,2% voor Atorvastatine, 16% voor Lovastatine en 2% voor simvastatine.
Als u wilt verder evalueren van het effect van lipide-verlagende geneesmiddelen op deeltjes vorming, werden TL-geëtiketteerden cholesterol aggregaten individueel geïncubeerd met ezetimibe, fibrate, niacine en omega-3 vetzuur. Zoals opgemerkt met de statines, geïnduceerde deze drugs de vorming van cholesterol deeltjes met heterogene maten en vormen, zoals weergegeven in figuur 4a-d. Onder hen, ezetimibe veroorzaakt de vorming van cholesterol deeltjes tentoonstellen van beide bolvormige en lineaire strand morphologies overwegende dat fibrate, niacine en omega-3 vetzuur veroorzaakt de vorming van enige bolvormige-vormige cholesterol deeltjes. Dienovereenkomstig, was het effect van drugs op de lineaire strand vormige cholesterol deeltjes vorming in de volgorde van 3% voor ezetimibe, 0% voor fibrate, 0% voor niacine en 0% voor omega-3 vetzuur.
De morfologische analyse bleek dat elk deeltje bolvormige of lineaire strand vormige cholesterol bestaat uit vele kleinere deeltjes aan elkaar gekoppeld. De maten van fluorescerende positieve bolvormige cholesterol deeltjes geïdentificeerd zijn in het bereik van ~ 2-30 µm2, overwegende dat de grootte van de lineaire gevormde deeltjes in de range van ~ 2-60 µm2.
Analyseren van het Effect van lipide-verlagende geneesmiddelen op gezuiverde VLDL en LDL deeltjes:
Verder onderzoek naar de vorming van cholesterol deeltjes in het bijzijn van lipoproteïnen, waren de TL-geëtiketteerden cholesterol aggregaten individueel geïncubeerd met gezuiverde VLDL, LDL en HDL eiwitten/deeltjes. De resultaten vertoonden, in vergelijking met de incubatie met LDL en HDL-deeltjes, die de cholesterol-aggregaten geïncubeerd met VLDL eiwitten veroorzaakt de vorming van een groter aantal cholesterol deeltjes, Figuur 5. Bovendien werden twee grote fracties van cholesterol deeltjes waargenomen in VLDL populaties suggereren hun gedeeltelijke omzetting in een LDL-fractie tijdens de incubatie met de TL-geëtiketteerden cholesterol aggregaten. De beeldanalyse van deeltjes aangegeven de aanwezigheid van zowel bolvormige (~ 97%) en lineaire gevormde (~ 3%) deeltjes onder VLDL, LDL en HDL populaties. De grootte varieert van bolvormige deeltjes zijn ~ 2-30 µm2, terwijl de grootte varieert van lineaire deeltjes ~ 2-60 µm2 zijn.
Voor de behandeling van het lipide-verlagende drug effect op gezuiverde deeltjes, waren de VLDL en LDL deeltjes individueel geïncubeerd met ezetimibe, lovastatin en simvastatin niacine. Dientengevolge, was vergeleken met controle experimenten zonder de drug, het effect van de drug waargenomen op VLDL-deeltjes formatie hoger in ezetimibe, simvastatine, Lovastatine en niacine. De LDL-deeltjes geïncubeerd met de drugs toonde een grote één fractie en de drug-geïnduceerde effect op de vorming van deeltjes was hoger in ezetimibe, simvastatine, Lovastatine en niacine, Figuur 6.
Variaties van de effecten van de Drug lipide-verlagende in de verdeling van de deeltjes van de Cholesterol in serummonsters wijzigen:
De voorgaande experimenten werden uitgevoerd in de bufferoplossing met gezuiverde lipoproteins van de voor de evaluatie van het effect van de drug. Vandaar, in de volgende stap, de effectiviteit van lipide-verlagende geneesmiddelen op cholesterol deeltjes vorming werd onderzocht met behulp van 50 serummonsters verzameld vanaf 25 personen met dyslipidemia en 25 leeftijd-matched normale onderwerpen. De reactie van de drug in elke serummonster werd gemeten op basis van wijzigingen in het profiel van cholesterol deeltjes vorming in de aanwezigheid en de afwezigheid van drugs. In de plaque matrix assay, werd elke serummonster vertoond tegen ezetimibe, lovastatin en simvastatin niacine drugs. De resultaten onthuld ongelijkheid onder deze drugs bij het moduleren van de verdeling van de VLDL, LDL en HDL-deeltjes in serummonsters, met name hun effect op de vermindering van de LDL en verhogen HDL cholesterol deeltjes vorming. Drie vertegenwoordigers van dyslipidemia serummonsters exposeren unieke reacties tot de lipide-verlagende medicijnen worden weergegeven in Figuur 7.
Identificatie van het Effect van de Drug op modulerende morfologie van Serum verkregen LDL en HDL Cholesterol deeltjes:
Het fenotype-onderzoek van serum afkomstige cholesterol deeltjes bleek de aanwezigheid van zowel lineaire strengen en bolvormige gevormde VLDL, LDL, en HDL subpopulaties, dus de bevestiging van een soortgelijke morfologie geïdentificeerd in de experimenten uitgevoerd zowel in de buffer en met gezuiverde lipoproteïne deeltjes zoals aangegeven in Figuur 8. Echter, de verdeling van de bolvormige en lineaire gevormde cholesterol deeltjes subpopulaties wijd gevarieerd onder dyslipidemia en leeftijd-matched normale onderwerpen. Het besturingselement testen uitgevoerd zonder de drugs bleek met name verschillen in de verdeling van de lineaire strand vormige LDL cholesterol deeltjes tussen dyslipidemia (gemiddelde van 2,0%) en leeftijd-matched normale (gemiddelde van 1,3%) serummonsters. Ook een verhoogd niveau van lineaire strand vormige HDL cholesterol deeltjes werd waargenomen in dyslipidemia monsters (gemiddelde van 18,3%) ten opzichte van de leeftijd-matched serummonsters (gemiddelde van 11,1%). In correlatie, de tests uitgevoerd in de aanwezigheid van drugs in serummonsters van dyslipidemia toonde een significante vermindering in lineaire gevormde HDL cholesterol deeltjes formatie voor simvastatine (gemiddelde van 8,3%), ezetimibe (gemiddelde van 11,5%), Lovastatine (gemiddelde van 11,7%), en geen vermindering voor Niacine (gemiddelde van 18,3%). Daarnaast werd een afname van de vorming van lineaire gevormde LDL cholesterol deeltjes waargenomen in serummonsters van dyslipidemia wanneer geïncubeerd met de drugs weergegeven in tabel 1.
Bovendien, de tests uitgevoerd in de aanwezigheid van drugs in het besturingselement van de leeftijd-matched serum sampLes toonde significante vermindering in de lineaire vorm van HDL cholesterol deeltjes in simvastatine (gemiddelde van 5,0%), ezetimibe (gemiddelde 8,2%), Lovastatine (gemiddelde 8,7%) en niacine (gemiddelde 10,8%) als aangegeven in tabel 2. Zowel de dyslipidemia als de leeftijd-matched normale serum monsters exposeren drug-geïnduceerde vermindering van de lineaire gevormde LDL en HDL cholesterol deeltjes toonde een relatieve stijging in bolvormige gevormde cholesterol deeltjes (gegevens niet worden weergegeven).
Figuur 1: Diagram illustreert het proces van in vitro visualisatie van cholesterol deeltjes morfologie. (a, b) De toevoeging van lipide-verlagende drug in buffer of serum monsters. (c) de toevoeging van oplosbare cholesterol fluorescentie-geëtiketteerden aggregaten voor de monsters. (d) het verwerven van de resulterende monsters voor morfologische analyse van onoplosbare cholesterol deeltjes met behulp van imaging cytometry van de stroom. Schaal bars = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: identificatie van twee verschillende morphologies van cholesterol deeltjes met behulp van imaging stroom cytometry. (een) deeltjes worden gescheiden in lineair of bolvormige populaties op basis van de analyse van de textuur van de heldere veld beelden. In het bijzonder de dot-plot van bedoel H homogeniteit (x-as) en betekenen H entropie (y-as) bevat twee omheinde gebieden voor het opsporen van bolvormige (rood) en lineaire strand vorm (blauw) cholesterol deeltjes. (b) beelden morfologie van bolvormige gevormde deeltjes geïdentificeerd in bevolking 1 weer te geven. (c) afbeeldingen van lineaire streng gevormde deeltjes geïdentificeerd in populatie 2. (d) Histogram weergeven van de distributie van alle fluorescerende positieve cholesterol deeltjes gebruikt om te bepalen hun concentratie en subpopulaties. Schaal bars = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Image galleries weergeven van het effect van statines bij het moduleren van cholesterol deeltjes vorming. Helder veld verwijst naar het gebied vergelijkbaar met FSC in de cytometer van de conventionele stroom. Groene kanaal verwijst naar fluorescentie emissie gedetecteerd in de 505-560 nm, en gele kanaal naar fluorescentie emissie gedetecteerd in de 560-595 nm. (a-e) Afbeeldingenalbums morfologie van cholesterol deeltjes gevormd in aanwezigheid van Lovastatine, simvastatine, Atorvastatine, Fluvastatine, en Rosuvastatine respectievelijk weer te geven. (f) Cholesterol formatie van de deeltjes in de afwezigheid van statine (negatieve controle). Schaal bars = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: demonstreren de differentiële effect van lipide-verlagende geneesmiddelen bij het moduleren van cholesterol deeltjes vorming. (a-d) Afbeeldingenalbums weergeven morfologie van cholesterol deeltjes gevormd in aanwezigheid van ezetimibe, niacine, fibrate, en omega-3 vetzuur, respectievelijk. Groene kanaal verwijst naar fluorescentie emissie gedetecteerd in de 505-560 nm, en gele kanaal naar fluorescentie emissie gedetecteerd in de 560-595 nm. Schaal bars = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: analyse van VLDL, LDL en HDL cholesterol deeltjes formatie in het ontbreken van drug. Stip-Staanplaatsen: X-as wordt weergegeven een spectrum van cholesterol deeltjes ontdekt in het groene fluorescentie kanaal (505-560 nm) en y-as worden weergegeven naast scatter. Regio's van VLDL, LDL en HDL-deeltjes ontdekt in de fluorescentie dot-percelen toont gating. (een) Cholesterol deeltjes vorming in aanwezigheid van gezuiverde VLDL. (b) vertegenwoordiger beelden van VLDL-deeltjes. (c) Cholesterol deeltjes vorming in aanwezigheid van gezuiverde LDL. (d) vertegenwoordiger beelden van LDL deeltjes. (e) Cholesterol deeltjes vorming in aanwezigheid van gezuiverde HDL. (f) vertegenwoordiger beelden van HDL-deeltjes. Schaal bars = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: VLDL en LDL cholesterol deeltjes aan te tonen het effect van lipide verlagen van drugs op gezuiverd. (een) VLDL deeltjes zonder de drug. (b) VLDL-deeltjes geïncubeerd met ezetimibe. (c) VLDL-deeltjes geïncubeerd met Lovastatine. (d) VLDL-deeltjes geïncubeerd met simvastatine. (e) VLDL-deeltjes geïncubeerd met niacine. (f) LDL deeltjes geïncubeerd zonder de drug. (g) LDL deeltjes geïncubeerd met ezetimibe. (h) LDL deeltjes geïncubeerd met Lovastatine. (ik) LDL deeltjes geïncubeerd met simvastatine. (j) LDL deeltjes geïncubeerd met niacine. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: fluorescentie dot-plots een differentiële effect van lipide verlagen van drugs bij het moduleren van VLDL, LDL en HDL cholesterol deeltjes vorming in serummonsters tonen. Bovenste rij, screening van serum 1 weergegeven: laag niveau drug reactie in het verhogen van 0 tot 15% HDL deeltjes vorming; middelste rij, screening van serum 2 weergegeven: matig niveau drug reactie bij het vergroten van 16 tot en met 50% HDL deeltjes; Onderste rij, screening van serum 3 weergegeven: hogere niveau drug reactie toename van 51 tot 100% HDL-deeltjes. (a, f, k) Serummonsters zonder drugs. (b, g, l) Serummonsters geïncubeerd met ezetimibe. (c, h, m) Serummonsters geïncubeerd met Lovastatine. (d, i, n) Serummonsters geïncubeerd met simvastatine. (e, j, o) Serummonsters geïncubeerd met niacine. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: Image galleries worden getoond van de morfologie van cholesterol deeltjes geïdentificeerd in serum monster 1. Groene kanaal toont beelden van de fluorescentie-emissie van de deeltjes; kant scatter (cyaan kanaal) toont beelden van de excitatie-laser licht verstrooid door de deeltjes. (een) bolvormige en lineaire gevormde cholesterol deeltjes gevormd, zonder de drug. (b, c, d, e) Cholesterol deeltjes gevormd in aanwezigheid van ezetimibe, lovastatin en simvastatin niacine, respectievelijk. Schaal bars= 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Serum-ID | Zonder drugs (Control) | Met Ezetimibe | Met Lovastatine | Met simvastatine | Met niacine | |||||
| % Lineair LDL deeltjes | % Lineair, HDL-deeltjes | % Lineair LDL deeltjes | % Lineair, HDL-deeltjes | % Lineair LDL deeltjes | % Lineair, HDL-deeltjes | % Lineair LDL deeltjes | % Lineair, HDL-deeltjes | % Lineair LDL deeltjes | % Lineair, HDL-deeltjes | |
| PNDS-01 | 1,73 | 45.2 | 0.81 | 18.1 | 0.61 | 16.1 | 0.59 | 13,9 | 2.26 | 33,6 |
| PNDS-02 | 2,86 | 35,9 | 1.26 | 30.9 | 1.27 | 22,7 | 0,73 | 15.2 | 3.03 | 37,7 |
| PNDS-03 | 2.04 | 35,8 | 0,87 | 4,82 | 1.02 | 4.14 | 0.36 | 3,06 | 0,45 | 9,57 |
| PNDS-04 | 2,56 | 32,9 | 1.15 | 21,8 | 1.12 | 18.6 | 0.77 | 17.2 | 3.37 | 36,5 |
| PNDS-05 | 0,42 | 29.2 | 0,24 | 5.62 | 0.22 | 8,72 | 0.16 | 9.91 | 0.35 | 22.2 |
| PNDS-06 | 1.8 | 28.1 | 0.4 | 16,8 | 0.62 | 15 | 0,42 | 9.27 | 2.28 | 38.4 |
| PNDS-07 | 1.8 | 26.5 | 0,85 | 10.5 | 1.18 | 19,9 | 0.62 | 7.32 | 1.29 | 23.4 |
| PNDS-08 | 0.98 | 22,8 | 0.86 | 7.28 | 1.55 | 10.2 | 0.14 | 5.98 | 0.59 | 13.3 |
| PNDS-09 | 3,87 | 22.1 | 1.98 | 9.56 | 1.87 | 10.3 | 1.46 | 7,96 | 2,86 | 9.88 |
| PNDS-10 | 4.46 | 21,9 | 2,57 | 13,6 | 4.04 | 17.1 | 2.28 | 11,9 | 0.71 | 25,7 |
| PNDS-11 | 1,57 | 19.2 | 1.15 | 9.24 | 1.37 | 6,98 | 0,74 | 5.03 | 1.37 | 16 |
| PNDS-12 | 1,06 | 16,7 | 0,66 | 4,38 | 0,7 | 4,74 | 0.99 | 6.36 | 1.14 | 4,73 |
| PNDS-13 | 4,85 | 16,6 | 1.28 | 30.4 | 1.4 | 32,6 | 0.8 | 16,6 | 4.02 | 31 |
| PNDS-14 | 2.08 | 16 | 0.68 | 15,4-inch | 0.64 | 16,5 | 1.97 | 10.2 | 1,25 | 20.11 |
| PNDS-15 | 1.5 | 11,9 | 1.14 | 13.3 | 1.21 | 11.4 | 0.8 | 6.12 | 1,38 | 4,59 |
| PNDS-16 | 1.82 | 10.4 | 2.04 | 9.59 | 1.24 | 5.62 | 0.91 | 5.38 | 1.31 | 7.61 |
| PNDS-17 | 1.05 | 10.3 | 1.02 | 4.7 | 1.78 | 15.1 | 0.93 | 7.81 | 1.27 | 13 |
| PNDS-18 | 1.11 | 8.76 | 0.54 | 3,68 | 0.61 | 3.51 | 1.01 | 5.03 | 1.02 | 6.69 |
| PNDS-19 | 1 | 8.52 | 0,75 | 6.67 | 0.76 | 5.86 | 0.91 | 8.36 | 1.22 | 11,9 |
| PNDS-20 | 3.54 | 7.92 | 3.78 | 12 | 3.56 | 5.81 | 3.28 | 8,28 | 3.44 | 12.3 |
| PNDS-21 | 1,88 | 7.69 | 2.12 | 11.4 | 1,73 | 9.54 | 1,77 | 8.34 | 2.32 | 16,7 |
| PNDS-22 | 1.64 | 7.17 | 0.35 | 5,75 | 0,56 | 13.2 | 0.14 | 4.33 | 1.23 | 17,8 |
| PNDS-23 | 1.54 | 6.27 | 1,25 | 7.24 | 1.02 | 6.12 | 0,73 | 3.58 | 1.42 | 6.69 |
| PNDS-24 | 0,53 | 6.22 | 0.52 | 4,49 | 0.91 | 5.57 | 0.54 | 4.01 | 0.65 | 10.5 |
| PNDS-25 | 2.97 | 5.1 | 1,59 | 11 | 1,88 | 9 | 1.03 | 6,54 | 2.61 | 29.1 |
Tabel 1: Screening van dyslipidemia serummonsters in de plaque matrix assay tonen de differentiële effect van lipide-verlagende geneesmiddelen. Vergeleken met besturingselementen zonder drugs (kolommen 2, 3), serummonsters geïncubeerd met ezetimibe (kolommen 4, 5), Lovastatine (kolommen 6, 7), simvastatine (kolommen 8, 9), en niacine (kolommen 10, 11), bleek variaties op inducerende lineaire-vormige LDL en HDL cholesterol de formatie van de deeltjes.
| Serum-ID | Zonder drugs | Met Ezetimibe | Met Lovastatine | Met simvastatine | Met niacine | |||||
| % Lineair LDL deeltjes | % Lineair, HDL-deeltjes | % Lineair LDL deeltjes | % Lineair, HDL-deeltjes | % Lineair LDL deeltjes | % Lineair, HDL-deeltjes | % Lineair LDL deeltjes | % Lineair, HDL-deeltjes | % Lineair LDL deeltjes | % Lineair, HDL-deeltjes | |
| PNAN-01 | 2.05 | 26,8 | 0.62 | 11,9 | 0,56 | 16,9 | 0.52 | 9.28 | 1.4 | 11,9 |
| PNAN-02 | 1.35 | 26.3 | 1.68 | 21,8 | 2,59 | 23,6 | 0.79 | 6,92 | 2.16 | 29,7 |
| PNAN-03 | 2.4 | |||||||||
Tabel 2: Screening van leeftijd-matched controle serummonsters in de plaque matrix assay tonen de differentiële effect van lipide-verlagende geneesmiddelen. Vergeleken met besturingselementen zonder drugs (kolommen 2, 3), serummonsters geïncubeerd met ezetimibe (kolommen 4, 5), Lovastatine (kolommen 6, 7), simvastatine (kolommen 8, 9), en niacine (kolommen 10, 11), bleek variaties op inducerende lineaire-vormige LDL en HDL cholesterol de formatie van de deeltjes.
Discussion
In het algemeen, worden de distributie en de functionele eigenschappen van VLDL, LDL en HDL cholesterol deeltjes in de bloedsomloop voornamelijk bepaald door metabole, genetische, epidemiologische, mobiele en plasma factoren22,23. In de huidige studie, onderzoek naar de effecten van het lipide-aanpassen drugs in de buffer is gebleken dat zeer lipofiele geneesmiddelen zoals ezetimibe, simvastatine, Lovastatine en Atorvastatine een hogere niveau complexiteit op de morfologie van cholesterol deeltjes veroorzaakte vergeleken met het lagere niveau effect waargenomen met zeer hydrofiele Rosuvastatine en Fluvastatine drugs. Deze resultaten zijn in goede overeenstemming met onze eerdere studie met een beschrijving van een niet-enzymatische mechanisme gebaseerd effect van statines bij het moduleren van de LDL en HDL cholesterol deeltjes vorming in de buffer en serum monsters21. Dienovereenkomstig, de resultaten van de huidige studie bleek een niet-enzymatische werkingsmechanisme van ezetimibe, niacine, fibrate, en omega-3 vetzuur drugs die een directe rol bij het moduleren van de vorming van cholesterol deeltjes kunnen spelen. Het is mogelijk dat de interacties tussen geneesmiddelen en cholesterol aggregaten leidt tot de vergadering van groot formaat cholesterol deeltjes die groter zijn 2-60 µm2, bolvormige en lineaire strand morphologies exposeren.
Bovendien, suggereren de resultaten verkregen met behulp van gezuiverde lipoproteïne deeltjes interacties tussen cholesterol aggregaten en plasma factoren zoals VLDL, LDL en HDL eiwitten die de composities en morfologische eigenschappen van de cholesterol veranderen kunnen deeltjes. De drug behandelingsresultaten met gezuiverde lipoproteïne deeltjes aangegeven een hoger niveau drug effect op VLDL-deeltjes vorming in vergelijking met hun effect waargenomen op LDL cholesterol deeltjes vorming. De Lovastatine, simvastatine en ezetimibe drugs werden gebruikt als pro-drugs en hun doses bij de testen mag hoger zijn dan de fysiologische concentraties.
Interessant, vormige screening van serummonsters toonde variaties van drug effect op het veranderen van de profielen van VLDL, LDL en HDL cholesterol deeltjes vorming, met name hun effect op de formaties van lineaire LDL en HDL-deeltjes. Deze drugs geïnduceerde korting op lineaire LDL en HDL cholesterol deeltjes vorming in zowel dyslipidemia als leeftijd-matched normale serummonsters gevormd. De effecten van de drug waargenomen op het verminderen van lineaire gevormde deeltjes formatie was hoger in ezetimibe, simvastatine, Lovastatine en niacine. De identificatie van cholesterol deeltjes met bolvormige en lineaire strand morphologies in de normale en dyslipidemia serummonsters suggereert dat deeltjes met soortgelijke morphologies in in vivo voorwaarden kunnen ontstaan. Eerdere studies gebleken dat de aanwezigheid van schijf en cholesterol van naald-achtige kristallen in de atherosclerotische plaques van ApoE- / - de mens en de LDLR- / - muizen modellen24,25,26 ,27,28.
De HDL-deeltjes circuleren in het bloed aanwezig zoals een heterogene mengsel en het niveau van kleine en grote HDL-deeltjes samen met functionele activiteit zijn belangrijke factoren om te oefenen hun cardio-beschermende effect via de reverse cholesteroltransport traject29,30. Recente studies hebben gewezen op het belang van de identificatie van de HDL cholesterol deeltje subfractions voor het ophelderen van hun rol in meerdere biologische functies zoals cholesterol efflux, anti-ontsteking, anti-trombotische en anti-oxidatieve31 . Daarnaast hebben een aantal studies het effect van therapie bij het vergroten van een laag om te matigen HDL-niveau in het plasma1,5,21lipide-verlagende gemeld. Dienovereenkomstig, de resultaten van deze studie geven nieuwe inzichten over morfologische kenmerken van cholesterol deeltjes. Met name de detectie van een hoger niveau van lineaire gevormde HDL cholesterol deeltjes in de serummonsters van dyslipidemia onderwerpen suggereert dat ze kunnen de betrouwbare biomerker voor zowel diagnose en evaluatie van de gevolgen van het wijzigen van het lipide medicijnen in patiënten. Er is echter verder onderzoek vereist grote klinische monsters met de cholesterol deeltjes met verschillende morphologies en hun deelname aan CVD beter te begrijpen.
In de plaque matrix assay voor de behandeling van het effect van de drug op de vergadering van cholesterol deeltjes, gebruikten we 2 µg fluorescentie met cholesterol aggregaten en 5 µgof elke drug omdat het label: (1) drugs concurrerend binden aan beide fluorescentie label cholesterol en endogene lipiden aanwezig in het serummonsters; (2) van elk monster verkregen we 5.000 tot 10.000 cholesterol deeltjes die zijn gemonteerd in grote maten en vormen variërend van ~ 2-60 µ2; (3) we waargenomen een grote verschillen van drug reactie onder serummonsters geïncubeerd met de drugs (doses 300 ng 5 µg) en ~ 1-5% van hen geïncubeerd met hoge doses toonde geen waarneembare veranderingen in het profiel van de vorming van de deeltjes van de cholesterol; en (4) de interactie tussen cholesterol aggregaten en lipide-verlagende geneesmiddelen wordt gemedieerd door een niet-enzymatische proces. Vandaar, de concentraties van de in de test gebruikte reagentia kunnen hoger zijn dan hun fysiologische niveau.
Kortom, we met succes is gebleken dat de voordelen van een in vitro imaging methode beschreven in deze studie voor het bepalen van het effect van een breed spectrum van lipide-verlagende geneesmiddelen op het moduleren van de morfologie en de samenstelling van de cholesterol deeltjes. De aanpak van visualiseren en kwantificeren van de morfologie van lipide deeltjes door gebruik te maken van een constellatie van afbeelding analyse algoritmen kan zowel de diagnose van atherosclerose en te evalueren van de resultaten van lipide-verlagende therapie bij patiënten helpen.
Disclosures
Dr. Madasamy financiële steun ontvangen Plaxgen, Inc en een concurrerende financieel belang heeft. De andere auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen openbaar te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door een Plaxgen onderzoek subsidie aan SM (PLX-1008). Wij danken Palo Alto Medical Research Foundation Research Institute voor het verzamelen van serummonsters van atherosclerose onderwerpen onder goedkeuring van de IRB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TopFluor fluorescent cholesterol | Avanti Polar lipids | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| simvastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| lovastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| rosuvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| atorvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| fluvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| ezetimibe (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| Niacin | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| fibrate | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| omega-3 fatty acid | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| purified VLDL proteins/particles | Lee Bio | ||
| purified LDL proteins/particles | Lee Bio | ||
| purified HDL proteins/particles | Lee Bio | ||
| Human age-matched serum | Dx Biosamples | ||
| Human atherosclerosis serum | Bioserve | ||
| Human normal serum | Stanford Blood center | ||
| LDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
| HDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
| Total cholesterol measurment | Roche Diangostics | ||
| 96-well microtitre plates | |||
| Triglycerides measurement | Roche Diangostics | ||
| Amnis Imaging Flow cytometer | Amnis Inc | ||
| IDEAS image analysing software | Amnis Inc | ||
| Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 | Awarness Technology | ||
| Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 | Roche Diangostics |
References
- Pahan, K. Lipid-lowering drugs. Cell Mol Life Sci. 63, 1165-1178 (2006).
- Laforest, L., et al. Prevalence of low high-density lipoprotein cholesterol and hypertriglyceridaemia in patients treated with hypolipidaemic drugs. Arch Cardiovasc Dis. 102, 43-50 (2009).
- Roberts, W. C. Preventing and arresting coronary atherosclerosis. Am Heart J. 130, 580-600 (1995).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. A century of cholesterol and coronaries: from plaques to genes to statins. Cell. 16, 161-172 (2015).
- Drexel, H. Statins, fibrates, nicotinic acid, cholesterol absorption inhibitors, anion-exchange resins, omega-3 fatty acids: which drugs for which patients? Fundam Clin Pharmacol. 23, 687-692 (2009).
- Camelia, S., Anca, S. Statins: Mechanism of action and effects. J.Cell.Mol.Med. 5, 378-387 (2001).
- Schaefer, E. J., et al. Comparisons of effects of statins (atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, and simvastatin) on fasting and postprandial lipoproteins in patients with coronary heart disease versus control subjects. Am J Cardiol. 93, 31-39 (2004).
- Meyers, C. D., Kamanna, V. S., Kashyap, M. L. Niacin therapy in atherosclerosis. Curr Opin in Lipid. 15, 659-665 (2004).
- Phan, B. A., Dayspringm, T. D., Toth, P. P. Ezetimibe therapy: mechanism of action and clinical update. Vasc Health Risk Mana. 8, 415-427 (2012).
- Leitersdorf, E., Fruchart, J. C. Mechanism of action of fibrates on lipid and lipoprotein metabolism. Circulation. 98, 2088-2093 (1998).
- Backes, J., Anzalone, D., Hilleman, D., Catini, J. The clinical relevance of omega-3 fatty acids in the management of hypertriglyceridemia. Lipids Health Dis. 15, 118 (2016).
- Davidson, M. H. Clinical Significance of Statin Pleiotropic Effects Hypotheses Versus Evidence. Circulation. 111, 2280-2281 (2005).
- Chinetti-Gbaguidi, G., Fruchart, J. C., Staels, B. Pleiotropic effects of fibrates. Curr Atheroscler Rep. 7, 396-401 (2005).
- McTaggart, F., Jones, P. Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit. CardiovascDrugs Ther. 22, 321-338 (2008).
- Quehenberger, O., et al. The Human Plasma Lipidome. N Engl J Med. 365, 1812-1823 (2011).
- Lund-Katz, S., et al. Mechanisms responsible for the compositional heterogeneity of nascent high density lipoprotein. J. Biol Chem. 288, 23150-23160 (2013).
- Krauss, R. M. Lipoprotein subfractions and cardiovascular disease risk. Curr Opin Lipidol. 21, 305-311 (2010).
- Krauss, R. M., Burke, D. J. Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteins in normal humans. J Lipid Res. 23, 97-104 (1982).
- Rosenson, R. S., et al. HDL measures, particle heterogeneity, proposed nomenclature, and relation to atherosclerotic cardiovascular Events. Clinic Chemi. 57, 392-410 (2011).
- Madasamy, S., et al. Plaque array method and proteomics-based identification of biomarkers from Alzheimer's disease serum. Clin Chim Acta. 441, 79-85 (2015).
- Madasamy, S., et al. Nonenzymatic Mechanism of Statins in Modulating Cholesterol Particles Formation. Am J Cardiol. 118, 1187-1191 (2016).
- Peter, O. K. Clinical relevance of the biochemical, metabolic, and genetic factors that influence low-density lipoprotein heterogeneity. Am J Cardiol. 90, 30-47 (2002).
- Weissglas-Volkov, D., Pajukanta, P. Genetic causes of high and low serum HDL-cholesterol. J Lipid Res. 51, 2032-2057 (2010).
- Abela, G. S. Effect of statins on cholesterol crystallization and atherosclerotic plaque stabilization. Am J Cardiol. 107, 1710-1717 (2011).
- Nidorf, S. M., Eikelboom, J. W., Thompson, P. L. Targeting cholesterol crystal-induced inflammation for the secondary prevention of cardiovascular disease. Cardiovasc Pharmacol Ther. 19, 45-52 (2014).
- Thacker, S. G., Zarzour, A., Chen,, et al. High density lipoprotein reduces inflammation from cholesterol crystals by inhibiting inflammasome activation. Immunol. 149, 306-319 (2016).
- Kim, S. H., Lee, E. S., Lee, J. Y., et al. Multiplex coherent anti-stokes Raman Spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids. Circ Res. 106, 1332-1341 (2010).
- Lim, R. S., Suhalim, J. L., Miyazaki-Anzai, S., et al. Identification of cholesterol crystals in plaques of atherosclerotic mice using hyperspectral CARS imaging. J Lipid Res. 52, 2177-2186 (2011).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Curr Opin Lipidol. 21, 229-238 (2011).
- Kontush, A. HDL particle number and size as predictors of cardiovascular disease. Front in Pharmacol. , (2015).
- Karathanasis, S. K., Freeman, L. A., Gordon, S. M., Remaley, A. T. The changing face of HDL and the best way to measure it. Clin. Chem. 63, 196-210 (2017).
