Summary
Das Ziel dieser Studie war es, in-vitro- Lipid-senkenden Medikament Auswirkungen Modulation der Morphologie der Cholesterin-Partikel zu bewerten. Vergleich der Lipidsenker ergab Variationen in ihrer Wirkung Modulation der morphologischen Merkmale der Cholesterin-Partikel.
Abstract
Behandlung von Dyslipidämie Patienten mit lipidsenkenden Medikamenten führt zu einem deutlichen Rückgang der Low-Density-Lipoproteine (LDL) Ebene und eine geringe bis mäßige Niveau der Anstieg des High-density-Lipoprotein (HDL) Cholesterins im Plasma. Allerdings ist eine mögliche Rolle dieser Medikamente bei Veränderung der Morphologie und Verteilung von Cholesterin-Partikel schlecht verstanden. Hier beschreiben wir die in-vitro- Bewertung der lipidsenkenden Drogenwirkungen Modulation morphologischen Merkmale der Cholesterin-Partikel mit der Plaque-Array-Methode in Kombination mit bildgebenden Durchflusszytometrie. Bild-Analysen der Cholesterin-Partikel angedeutet, dass Lovastatin, Simvastatin, Ezetimib und Atorvastatin die Bildung von Kugelsternhaufen und linearen Strang geformt Partikel induzieren, veranlaßt Niacin, Fibrate, Fluvastatin und Rosuvastatin das Bildung von nur kugelig geformten Partikeln. Nächste, gereinigte sehr Low density Lipoprotein (VLDL) und LDL-Partikel, die mit diesen Medikamenten inkubiert zeigten Veränderungen in der Morphologie und Image Textur des Cholesterins Partikel Subpopulationen. Screening von 50 Serumproben ergab darüber hinaus die Anwesenheit von ein höheres Maß an lineare geformte HDL-Cholesterin-Partikel bei Patienten mit Dyslipidämie (Mittelwert von 18,3 %) im Vergleich zu den Beispielen Alter abgestimmt Normal (Mittelwert von 11,1 %). Wir beobachten auch, dass erhebliche Unterschiede in Lipid-senkenden Medikament Auswirkungen auf die Verringerung der linearen LDL und HDL Cholesterin-Partikel-Bildung in Serumproben geformt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Lipidsenker, neben ihrer Zell-vermittelten lipidsenkende Wirkung, Morphologie der Cholesterin-Partikel direkt von einem nicht-enzymatische Wirkmechanismus modulieren können. Die Ergebnisse dieser Ergebnisse haben Potenzial, Diagnose der Atherosklerose zu informieren und optimalen lipidsenkenden Therapie vorherzusagen.
Introduction
Zahlreiche klinische Studien haben bewiesen, wohltuende Wirkung der Lipid-senkende Medikamente bei der Verringerung der Plasmaspiegel von Low-Density-Lipoproteine (LDL) Cholesterin und einem niedrigen bis moderaten Anstieg der High-density-Lipoprotein (HDL) Cholesterin, die primäre und sekundäre Vorfälle im Zusammenhang mit Arteriosklerose kardiovaskuläre Nebenwirkungen1,2,3,4,5verhindert. Statine, eine Gruppe von HMG-CoA-Reduktase-Enzym-Inhibitoren, blockieren die körpereigene Cholesterinsynthese in der Leber, dass wiederum führen zu niedrigeren Niveaus von LDL-Cholesterin im Blut6,7im Umlauf. Ebenso ist die Senkung der Wirkung von Niacin Lipid durch seine direkte und nichtkompetitiv Hemmung der Hepatozyten Diacylglycerol Acyltransferase-2, ein Schlüsselenzym Leber beteiligt Triglycerid-Synthese8vermittelt. Vergleichsweise, reduziert Ezetimib Plasmaspiegel von LDL durch die Absorption der exogene Cholesterin durch die Bindung an Niemann-Pick-C1-Like-1 (NPC1L1) Protein befindet sich in den Epithelzellen des Dünndarms9Begrenzung. Fenofibrate, einem anderen Lipid-senkenden Medikament, reduziert deutlich die Plasmakonzentrationen von Triglyceriden und LDL-Cholesterin durch das Peroxisom davon aktiviert Rezeptoren Weg10auch mäßig verringert. Außerdem ist Omega-3-Fettsäure berichtet, um die Anti-atherosklerotische Wirkung wegen seiner Fähigkeit, die Plasmaspiegel von LDL11zu senken.
Lipidsenker, neben ihrer primären Effekt auf die Senkung des LDL-Cholesterins, haben eine Reihe von vorteilhaften pleiotrope Effekte einschließlich Erhöhung der HDL, Verbesserung der endotheliale Funktionen, Verringerung der Entzündung und Hemmung der Thrombozyten Aggregationen12,13,14. Aber der zugrunde liegende Mechanismus dieser Medikamente bei Erhöhung der HDL-Cholesterin-Partikel und ändern ihre strukturellen Merkmale sind nicht vollständig geklärt. Da diese Medikamente häufig zur Behandlung von Atherosklerose-Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs) vorgeschrieben sind, gilt es weiter zu untersuchen, ihre mögliche Rolle bei der Bestimmung der morphologischen Merkmale und Verteilung der Lipid-Partikel. Die menschlichen Plasma-Lipidome besteht aus etwa 600 verschiedene Lipide und 22 verschiedenen molekularen Arten von Lipoproteinen, die in verschiedenen Größen, Formen, dichten und Kompositionen15,16,17 . Analytische Methoden wie Ultra-Zentrifugation, NMR und Gradienten Gelelektrophorese werden verwendet, um LDL und HDL-Partikel und ihre Unterfraktionen18,19charakterisieren. Jedoch beschränkt sich die Anwendung dieser Methoden auf Studien zur Bestimmung der Wirkung von Drogen in der modulierenden Morphologie und Montage der Lipid-Partikel. Flow Cytometer basierend Plaque Array ist eine funktionelle biochemischen Assays entwickelt, für die Erkennung und Visualisierung von Serum Lipid und Amyloid Plakette Partikel20abgeleitet. Die Vorteile von in-vitro- bildgebendes Verfahren, die in dieser Studie beschriebenen ermöglicht die Identifizierung von Lipid-modulierende Drogenwirkungen Morphologie und Verteilung von Cholesterin-Partikel im Puffer und Serumproben zu ändern.
Protocol
1. Vorbereitung der Fluoreszenz-markierten Cholesterin und Lipidsenker
Hinweis: fluoreszierende beschriftet Cholesterin Aggregate und Statine wurden vorbereitet, wie im vorherigen Artikel beschrieben 21. Informationen von Reagenzien, imaging Durchflusszytometer, Chemie-Analysatoren und Datenanalyse-Software in dieser Studie verwendeten Tabelle der Materialien finden.
- Solubilisieren Leuchtstofflampen beschriftet lyophilisierter Cholesterin (1 mg, Ex / Em = 495 nm/507 nm) Pulver in 1 mL 100 % Alkohol.
- Die Probe für 3 min bei 2.040 x g Zentrifugieren und verwenden Sie die Überstände mit löslichen Fluoreszenz-markierten Cholesterin Aggregate in der Plaque Array Assays.
- Zur Herstellung von Medikamenten, individuell solubilisieren Pulver (2 mg) von Simvastatin, Lovastatin, Atorvastatin, Ezetimib und Omega-3-Fettsäure in 1 ml 100 % Alkohol.
- Nach Zentrifugation für 3 min bei 2.040 x g, verwenden Sie die Überstände, die Drogen in der Probe enthalten.
- In ähnlicher Weise anderweitig individuell Pulver (2 mg) von Fluvastatin, Rosuvastatin, Niacin, und fibrate in 1 mL entionisiertem Wasser zu einer Stammlösung von 2 mg/mL.
- Nach Zentrifugation für 3 min bei 2.040 x g, verwenden Sie die Überstände mit Drogen in der Plaque Array Assays.
2. Plaque-Array-Assay für Prüfungs-In vitro- Cholesterin-Partikel-Bildung
- Verwendung Chemie Analyzer-1 (siehe Tabelle der Materialien), um die Plaque-Array-Assay für Cholesterin-Partikel-Bildung einzurichten. Führen Sie den Assay in rundem Boden, eiweißarme Bindung 96-Well-Platte mit den Reagenzien, die in Abschnitt 1 vorbereitet. Das endgültige Reaktionsvolumen in jede Vertiefung in 200 µL pflegen und führen alle Assays in dreifacher Ausfertigung.
- Zuerst, Last 194,5 µL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in jede Vertiefung.
- Jeweils gut 2,5 µL (5 µg) jeder lipidsenkenden Medikamenten-Lösung hinzufügen und schütteln Sie die Platte für 30 s, indem es auf Chemie Analyzer-1 Reaktion Platte um das Medikament gleichmäßig in Lösung zu mischen. Kein Medikament wird hinzugefügt, um die negativen Kontrollproben.
- Schließlich jede Vertiefung 2 µL (2 µg) Leuchtstofflampen beschriftet Cholesterin aggregierte Lösung hinzu und schütteln Sie die Platte für 30 s, indem es auf Chemie Analyzer-1 Reaktion Platte.
- Inkubieren Sie die Platte auf einem Lab-Shaker für 2 h bei 37 ° C und 200 u/min eingestellt.
- Nach der Inkubation erwerben Bilder von Partikeln durch bildgebende Durchflusszytometrie.
3. Bilder von Cholesterin Partikel mittels Imaging Flow Cytometry Erfassung
- öffnen die Datenvorlage Akquisition, die richtigen Einstellungen zu laden. Klicken Sie " Datei ", und wählen Sie dann " geöffnete Vorlage … " und wählen Sie die Vorlagendatei.
- Klicken Sie " Flush, Lock, Last ", das Instrument für Probenbeladung vorzubereiten.
- Wenn die " laden Probe " Dialog öffnet sich, klicken Sie auf " OK " 50 µL der Proben von jedem gut vorbereitet in Abschnitt 2 in der bildgebenden Durchflusszytometer laden.
- Klicken Sie " laufen | Setup ", die Partikel im Bereich Bildverarbeitung in Echtzeit anzeigen.
- Wenn die Partikel in der imaging-Bereich in guten Fokus sind klicken Sie auf " ausführen | Erwerben, ", Bilder der einzelnen Objekte gleichzeitig in einer Hochdurchsatz-Weise für Dunkelfeld (Side Scatter/SSC), Hellfeld (BF), grüne Fluoreszenz und gelbe Fluoreszenz erwerben.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.5 um 5.000-10.000 Partikel von jeder Probe erwerben.
- Analysieren alle raw-Bilddateien mit der Bildanalyse-Software zur Bestimmung der Fluoreszenzintensität Objekt und morphologische Varianten.
- Klicken Sie auf die " Tools " Schaltfläche am oberen Rand der Bildanalyse-Software, und wählen Sie dann " Batch-Daten-Dateien " aus dem Dropdown-Menü öffnet die die " Chargen " Fenster.
- In der " Chargen " Fenster, klicken Sie auf die " Batch hinzufügen " Schaltfläche, öffnet die " definieren eine Charge " Fenster.
- In der " definieren einen Batch " Fenster, klicken Sie auf die " Dateien hinzufügen " Taste und wählen Sie die raw-Bild-Dateien, klicken Sie auf die " Vorlage " Taste und wählen Sie die entsprechenden Daten-Analyse-Template-Datei, und wählen Sie dann " "OK" " und " einreichen Chargen " Verarbeitung und Analyse der raw-Bilddateien beginnen.
4. Plaque Array Assays basierte Auswertung von lipidsenkenden Medikamenten Wirkung auf gereinigt Cholesterin-Partikel
- wie unter Punkt 2.1 beschrieben durchführen den Cholesterin Partikel Bildung Assay mit gereinigtem VLDL, LDL und HDL-Lipoproteine/Partikel. Führen Sie Plaque Array Assays in eine 96-Well-Platte.
- Zuerst, laden alle Vertiefungen mit PBS; verwenden Sie eine 200 µL Endvolumen für jedes gut.
- Für negative Kontrolle hinzufügen 4 µg VLDL, LDL oder HDL Proteine/Partikel einzeln in jedem auch ohne Drogen und schütteln Sie die Platte für 30 s.
- Für die Prüfung der Lipid-senkende Wirkung, hinzufügen 4 µg VLDL, LDL oder HDL Proteine/Partikel individuell zu jedem gut und schütteln Sie die Platte für 30 s.
- Für Brunnen mit 4 µg VLDL, LDL und HDL hinzugefügt, fügen 2,5 µL (5 µg) Ezetimib, Lovastatin, Simvastatin oder Niacin-Lösung und schütteln Sie die Platte für 30 s indem man sie in Chemie Analyzer-1.
- Schließlich alle Brunnen 2 µL (2 µg) Fluoreszenz-markierten Cholesterin aggregierte Lösung hinzu und schütteln Sie die Platte für 30 s, indem es auf Chemie Analyzer-1 Reaktion Platte.
- Die Platte für 2 h in einem Labor-Shaker set bei 37 ° C und 200 u/min inkubieren.
- Erwerben die Proben unter Verwendung bildgebender Durchflusszytometrie nach Schritte 3.1-3.5.
- Raw-Bilddateien mit Bildanalyse-Software, wie unter Punkt 3.7 beschrieben zu analysieren.
- In der Analyse-Vorlage verwenden das folgende gating Schema zur Identifizierung von Cholesterin-Partikel-Subpopulationen.
- Auf einem Grundstück von Grünkanal gesättigt Pixelzahl (x-Achse) und Dunkelfeld-Kanal gesättigten Pixelzahl (y-Achse), Objekte mit einer oder mehreren gesättigten Pixel in jedem Kanal ablehnen.
- Zeichnen die Objekte/Partikel ohne gesättigten Pixel mit Grünkanal Intensität (x-Achse) und SSC Intensität (y-Achse): Gegenstände fallen in eine der drei Regionen (VLDL, LDL, HDL) anhand ihrer Grünkanal und SSC Intensitäten.
Hinweis: Diese Tore wurden erstellt, basierend auf Daten aus Experimente mit gereinigten VLDL, LDL und HDL Partikel/Proteine ohne die Droge durchgeführt.
- Um die Lipid-senkenden Medikament Wirkung für jede Probe ermitteln, berechnen Sie total Lipoprotein Partikel Konzentrationen sowie der Prozentsatz der einzelnen Teilgesamtheit (VLDL, LDL, HDL) als beschrieben Schritt 6.5.
- Berechnen die Partikel Konzentrationen (Partikel/mL) mit Hilfe der folgenden Gleichung:
Hinweis: die VLDL, LDL und HDL Anspritzung Regionen in den Fluoreszenz-Dot-Plot erkennen ~ 80 % von ihren jeweiligen Untergruppen, und die restlichen ~ 20 % der Partikel überschneiden sich mit anderen gating Regionen.
- Berechnen die Partikel Konzentrationen (Partikel/mL) mit Hilfe der folgenden Gleichung:
5. Messung der Lipid-Konzentrationen im Serumproben
- für die Bestimmung der Konzentrationen von LDL, HDL, Cholesterin und Triglyceriden durch Chemie Analyzer-2, verwenden Serumproben aus Alter abgestimmt Normal und Dyslipidämie Themen.
- Definieren Sie abnormale Konzentration von LDL, HDL, Cholesterin und Triglyceride, die basierend auf ihrer Konzentration identifiziert darüber hinaus die obere und untere Referenzwerte in Serumproben.
- Folgen die normalen Referenz-Wert-EmpfehlungenDED vom Reagenz Hersteller: Cholesterin (4-200 mg/dL), HDL (3.0-65 mg/dL), LDL (4-100 mg/dL) und Triglyceride (9-200 mg/dL).
- Identifizieren, die einen abnormalen Wert haben, wie unter dem niedrigeren Referenzwert oder über die höheren Referenz für Cholesterin und Triglyceride Wert, und sie für das Screening in an- und Abwesenheit von lipidsenkenden Medikamenten Serumproben.
6. Analyse der Wirkung von Drogen auf Cholesterin-Partikel-Bildung in Serumproben
- Gebrauch der Chemie Analyzer-1, um die Plaque-Array-Assay für Cholesterin-Partikel-Bildung in Serumproben einzurichten. Führen Sie den Assay in rundem Boden, eiweißarme Bindung 96-Well-Platte. Verwenden Sie eine endgültige Reaktionsvolumen von 200 µL/Well und führen alle Assays in dreifacher Ausfertigung.
- Die Platte durch das Laden von Reagenzien in gewissem Sinne schrittweise vorbereiten.
- Bereiten die Kontroll-Vertiefungen.
- Last 193 µL PBS in jede Vertiefung.
- Fügen 2,5 % (V/V) Patientenserum (nur eine Serumprobe pro Well) und schütteln Sie die Platte für 30 s, indem es auf Chemie Analyzer Reaktion Platte.
- Add 2 µL (2 µg) Fluoreszenz-markierten Cholesterinspiegel aggregieren Lösung in jede Vertiefung und schütteln Sie die Platte für 30 s, indem es auf eine Chemie-Analysator-1 Reaktion-Platte.
- Bereiten die Brunnen mit Drogen.
- Last 191 µL PBS in jede Vertiefung.
- Fügen 2,5 % (V/V) Patientenserum (nur eine Serumprobe pro Well) und schütteln Sie die Platte für 30 s, indem es auf eine Chemie-Analysator-1 Reaktion-Platte.
- Add 2 µL Ezetimib, Lovastatin, Simvastatin oder Niacin-Lösung (4 µg) in alle Vertiefungen mit Ausnahme der Negativkontrolle Brunnen. Fügen Sie nur ein Medikament pro Bohrloch und schütteln die Platte für 30 s, indem es auf eine Chemie-Analysator-1 Reaktion-Platte.
- Add 2 µL der Fluoreszenz-markierten Cholesterin aggregieren Lösung (2 µg) in jede Vertiefung und schütteln Sie die Platte für 30 s, indem es auf Chemie Analyzer-1 Reaktion Platte.
- Laden Sie Medikamente nur nach alle Wells (Steuern und Medikament behandelten) mit ihren jeweiligen Serumproben geladen wurden, und fügen Sie Fluoreszenz-markierten Cholesterinspiegel am Ende dieses Schrittes.
- Die Platte für 2 h in einem Labor-Shaker set bei 37 ° C und 200 u/min inkubieren.
- Erwerben die Proben durch bildgebende Durchflusszytometer folgenden Einstellungen beschrieben Schritte 3.1-3.6.
- Das Bild Analyse Software für Batch-Verarbeitung alle Image-Dateien, die über die gleiche Vorlage wie 3.7 beschrieben.
- Die Datenanalyse durch Tore auf dem Grundstück zu zeichnen, wie 4.5 und 4.6 beschrieben.
- An die Lipid-senkenden Medikament Wirkung/Antwort (niedrig, moderat und hoch) für jede Probe bestimmen, zu berechnen, die total Lipoprotein Partikelkonzentration sowie den Prozentsatz der die Gesamtzahl Partikeln bestehend aus VLDL, LDL und HDL Subpopulationen.
- Plotten der VLDL, LDL und HDL Populationen auf ein Histogramm des Objekts ' s Hellfeld Bild, Breite (Länge - Breite) und Tor in entweder kugelförmig oder lineare Regionen subtrahiert: Objekte mit (Länge - Breite) ≤ 2 µm fallen in die kugelförmige Region für die Berechnung des Anteils von Kugelsternhaufen und lineare geprägt Partikel.
- Vergleichen Sie den Prozentsatz von Kugelsternhaufen und linear geformten LDL und HDL Cholesterin Partikel für jede Serumprobe inkubiert, mit und ohne jedes Medikament identifiziert. Unter dreifacher Werte für jede Serumprobe, akzeptieren der Prozentsatz der kugelige und lineare Form LDL und HDL-Partikel, die in SD ±2 Bereich zur Bestimmung von der Drogenwirkung fallen.
Representative Results
Plaque-Array-Assay basierte Analyse der Lipid-senkenden Medikament Auswirkungen auf Cholesterin-Partikel-Bildung:
Für die Bewertung der Wirkung von Statinen Modulation Morphologie der Cholesterin-Partikel, wurden fluoreszierende beschriftet Cholesterin Aggregate individuell mit Lovastatin, Simvastatin, Atorvastatin, Rosuvastatin und Fluvastatin im Puffer inkubiert. Diese Proben wurden aufgenommen mit bildgebenden Durchflusszytometrie Aufnahmen der Cholesterin-Partikel für Morphologie-Analyse wie in Abbildung 1 und Abbildung 2gezeigt. Interessanterweise, Analyse der Drogenwirkung auf Cholesterin-Partikel-Bildung im Puffer angegeben, dass Simvastatin, Lovastatin und Atorvastatin induzieren die Bildung von einer heterogenen Bevölkerung von Cholesterin-Partikel, die Anzeige von verschiedenen Größen und Formen, Abbildung 3a -C. Umgekehrt, die Cholesterin-Teilchen im Beisein von Rosuvastatin, Fluvastatin, und die negative-Kontrolle (ohne Droge) waren homogen in Form und Morphologie wie in Abbildung 3d-fgezeigt. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Simvastatin, Lovastatin und Atorvastatin die Bildung von Cholesterin-Partikel, die sowohl kugelförmig und linearen Strang Morphologien ausstellen, induziert während Rosuvastatin und Fluvastatin die Bildung von Cholesterin induziert Teilchen mit nur kugelförmig Morphologie. Die Statine Auswirkungen auf Induktion die lineare Stränge Bildung fand sich in der Größenordnung von 16 % für Lovastatin, Simvastatin 2 % und 0,2 % für Atorvastatin.
Um die Wirkung der Lipidsenker auf Partikel Bildung weiter zu bewerten, wurden fluoreszierende beschriftet Cholesterin Aggregate individuell mit Ezetimib, fibrate, Niacin und Omega-3-Fettsäure inkubiert. Wie mit der Statine beobachtet, induziert diese Medikamente die Bildung von Cholesterin-Partikel mit heterogenen Größen und Formen wie in Abb. 4a-dangezeigt. Unter ihnen, Ezetimib induziert die Bildung von Cholesterin-Partikel, die sowohl kugelförmig und linearen Strang Morphologien ausstellen, während fibrate, Niacin und Omega-3-Fettsäure induziert die Bildung von nur kugelig geformten Cholesterin-Partikel. Dementsprechend wurde die Wirkung von Medikamenten auf dem linearen Strang geformt Cholesterin-Partikel-Bildung in der Größenordnung von 3 % für Ezetimib, 0 % für fibrate, 0 % für Niacin und 0 % für Omega-3-Fettsäure.
Die morphologische Analyse ergab jedes kugelförmig oder linearen Strang geformt-Cholesterin-Partikel besteht aus vielen kleineren Teilchen miteinander verbunden. Die Größe der fluoreszierenden positive kugelige Cholesterin-Partikel identifiziert sind im Bereich von ~ 2-30 µm2, während die Größen der linear geformten Partikel im Bereich von ~ 2-60 µm2sind.
Analyse der Wirkung der Lipidsenker auf gereinigten VLDL und LDL-Partikel:
Um die Cholesterin Partikel-Bildung in Gegenwart von Lipoproteinen weiter zu untersuchen, wurden die Leuchtstoff-Label Cholesterin Aggregate individuell mit gereinigtem VLDL, LDL und HDL Proteine/Partikel inkubiert. Die Ergebnisse zeigten, im Vergleich zu der Inkubation mit LDL und HDL-Partikeln, die Cholesterin-Aggregate mit VLDL Proteine verursacht die Bildung eine höhere Anzahl von Cholesterin-Partikel, Abbildung 5inkubiert. Darüber hinaus wurden zwei große Fraktionen der Cholesterin-Partikel in VLDL Populationen, was auf ihre teilweise Umwandlung in Sekundenbruchteilen LDL während der Inkubation mit Leuchtstoff-Label Cholesterin Aggregate beobachtet. Die Bildanalyse von Partikeln angegeben das Vorhandensein von kugelförmigen (~ 97 %) und linear geformten (~ 3 %) Partikel VLDL, LDL und HDL Bevölkerung. Die Größe reicht von kugelförmigen Partikeln sind ~ 2-30 µm2, während die Größenbereiche der linearen Partikel ~ 2-60 µm2.
Für die Prüfung der lipidsenkenden Drogenwirkung auf gereinigten Partikel, wurden die VLDL und LDL-Partikel einzeln mit Ezetimib, Simvastatin, Lovastatin und Niacin inkubiert. Infolgedessen lag im Vergleich zu Experimente ohne die Droge, die Drogenwirkung auf VLDL-Partikel-Bildung beobachtet in Ezetimib, Simvastatin, Lovastatin und Niacin. Die LDL-Partikel mit den Drogen inkubiert zeigte einen großen einzigen Bruchteil und die Arzneimittel-induzierte Wirkung auf Partikel Bildung lag in Ezetimib, Simvastatin, Lovastatin und Niacin, Abbildung 6.
Variationen von der Lipid-senkende Wirkungen der Droge in die Änderung der Verteilung der Cholesterin-Partikel in Serumproben:
Die vorhergehenden Versuche wurden in der Pufferlösung mit gereinigtem Lipoproteine für die Bewertung der Drogenwirkung durchgeführt. Daher im nächsten Schritt wurde die Wirksamkeit der Lipidsenker auf Cholesterin-Partikel-Formation mit 50 Serumproben von 25 Patienten mit Dyslipidämie und 25 Alter abgestimmt gesunden Probanden untersucht. Die Droge Antwort in jedem Serumprobe wurde basierend auf Änderungen im Profil der Cholesterin-Partikel-Bildung in an- und Abwesenheit von Drogen gemessen. In der Plaque-Array-Assay wurde jede Serumprobe gegen Ezetimib, Simvastatin, Lovastatin und Niacin Medikamente gezeigt. Die Ergebnisse zeigten Unterschiede zwischen den diese Medikamente Modulation die Verteilung von VLDL, LDL und HDL-Partikeln in Serumproben, insbesondere deren Auswirkungen auf reduzieren LDL und HDL-Cholesterin-Partikel-Bildung zu erhöhen. Drei Vertreter der Dyslipidämie Serumproben präsentiert einzigartige Antworten auf die Lipid-senkende Medikamente sind in Abbildung 7dargestellt.
Identifizierung der Drogenwirkung auf modulierenden Morphologie des Serums abgeleitet LDL und HDL-Cholesterin-Partikel:
Die Phänotyp-Analyse der Serum-abgeleitet Cholesterin-Partikel ergab das Vorhandensein von linearen Litzen und kugelig geformten VLDL, LDL, und HDL Subpopulationen, und bestätigt damit eine ähnliche Morphologie gekennzeichnet in den Experimenten durchgeführt, sowohl im Puffer und mit gereinigten Lipoprotein Partikel wie in Abbildung 8dargestellt. Allerdings war die Verteilung der Kugelsternhaufen und linear geformten Cholesterin Partikel Subpopulationen sehr unterschiedlich unter Dyslipidämie und gesunden Probanden Alter abgestimmt. Vor allem zeigte die Kontrolle-Assays durchgeführt ohne die Drogen, dass Unterschiede in der Verteilung der linearen Strang Serumproben LDL-Cholesterin-Partikel zwischen Dyslipidämie (Mittelwert von 2,0 %) und Alter abgestimmt Normal (Mittelwert von 1,3 %) geprägt. In ähnlicher Weise verzeichneten ein erhöhtes Maß an linearen Strang geformt HDL-Cholesterin-Partikel Dyslipidämie Proben (Mittelwert von 18,3 %) im Vergleich zu den Alter abgestimmt Serumproben (Mittelwert von 11,1 %). In Korrelation durchgeführt der Assays in Anwesenheit von Drogen in Dyslipidämie Serumproben zeigte eine signifikante Reduktion in linear geformten HDL Cholesterin Partikel Bildung für Simvastatin (Mittelwert von 8,3 %), Ezetimib (Mittelwert von 11,5 %), Lovastatin (Mittelwert von 11,7 %), und keine Ermäßigung für Niacin (Mittelwert von 18,3 %). Darüber hinaus verzeichneten ein Rückgang bei der Bildung von linear geformten LDL-Cholesterin-Partikel Dyslipidämie Serumproben wenn inkubiert mit den Medikamenten, die in Tabelle 1dargestellt.
Darüber hinaus die Ausführung der Assays in Anwesenheit von Drogen in Alter abgestimmt Kontrolle Serum sampLes zeigten signifikante Reduktion in der linearen Form HDL-Cholesterin-Partikel in Simvastatin (Mittelwert von 5,0 %), Ezetimib (mittlere 8,2 %), Lovastatin (mittlere 8,7 %) und Niacin (mittlere 10,8 %) wie dargestellt in Tabelle 2. Dyslipidämie und Alter abgestimmt normalen Serum Proben ausstellenden Medikamenten-induzierten Rückgang der linear geformten LDL und HDL Cholesterin Partikel zeigten eine relative Zunahme kugelig geformten Cholesterin-Partikel (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 1: Diagramm zur Veranschaulichung des Prozesses der in-vitro- Visualisierung der Cholesterin-Partikel-Morphologie. (a, b) Die Zugabe von lipidsenkenden Medikamenten in Puffer oder Serum Proben. (c) die Zugabe von Fluoreszenz-markierten lösliche Cholesterin Aggregate zu den Proben. (d) die resultierenden Proben für die morphologische Analyse der unlösliche Cholesterin-Partikel mit bildgebenden Durchflusszytometrie zu erwerben. Skalieren von Balken = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Identifizierung von zwei unterschiedliche Morphologien der Cholesterin-Partikel mit bildgebenden Durchflusszytometrie. (ein) Partikel sind in linear oder kugelige Populationen basierend auf strukturelle Analyse der Hellfeld Bilder getrennt. Insbesondere die Dot-Plot bedeutet H Homogenität (x-Achse) und meine H Entropie (y-Achse) enthält zwei abgegrenzte Regionen zur Erkennung von kugelförmigen (rot) und linearen Strang geformt (blau) Cholesterin-Partikel. (b) Bilder mit Morphologie der kugelförmigen geformten Partikel in der Bevölkerung 1 identifiziert. (c) Bilder von linearen Strang geformt Partikel in Bevölkerung 2 identifiziert. (d) Histogramm zeigt die Verteilung aller fluoreszierende positiven Cholesterin-Partikel verwendet, um ihre Konzentration und Subpopulationen zu bestimmen. Skalieren von Balken = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Bild Galerien anzeigen die Wirkung der Statine Cholesterin-Partikel-Bildung Modulation. Hellfeld bezieht sich auf den Bereich ähnlich wie FSC in der konventionellen Durchflusszytometer. Grünkanal bezieht sich auf Fluoreszenzemission im 505-560 nm erkannt, und gelben Kanal auf Fluoreszenzemission im 560-595 nm erkannt. (a-e) Bildergalerien anzeigen Morphologie der gebildeten in Anwesenheit von Lovastatin, Simvastatin, Atorvastatin, Rosuvastatin und Fluvastatin, bzw. Cholesterin-Partikel. (f) Cholesterin Partikel-Bildung in der Abwesenheit von statin (Negativkontrolle). Skalieren von Balken = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: zeigt die unterschiedliche Wirkung der Lipidsenker Modulation Cholesterin-Partikel-Bildung. (a-d) Bildergalerien anzeigen Morphologie der Cholesterin-Partikel gebildet bzw. im Beisein von Ezetimib, Niacin, fibrate, und Omega-3-Fettsäure. Grünkanal bezieht sich auf Fluoreszenzemission im 505-560 nm erkannt, und gelben Kanal auf Fluoreszenzemission im 560-595 nm erkannt. Skalieren von Balken = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Analyse der VLDL, LDL und HDL Cholesterin Partikel Bildung in Ermangelung von Droge. Punkt-plottet: X-Achse zeigt ein Spektrum von Cholesterin-Partikel in den grünen Fluoreszenz-Kanal (505-560 nm) erkannt und Y-Achse Side Scatter. Anspritzung zeigt Regionen von VLDL, LDL und HDL-Partikel in den Fluoreszenz-Dot-Parzellen erkannt. (ein) Cholesterin-Partikel-Bildung im Beisein von gereinigten VLDL. (b) Vertreter Bilder VLDL-Partikel. (c) Cholesterin-Partikel-Bildung im Beisein von gereinigten LDL. (d) Vertreter Bilder LDL-Partikel. (e) Cholesterin-Partikel-Bildung im Beisein von gereinigten HDL. (f) Vertreter Bilder von HDL-Partikeln. Skalieren von Balken = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Nachweis der Wirkung von Lipid-senkenden Medikamenten auf VLDL und LDL-Cholesterin-Teilchen gereinigt. (ein) VLDL Partikel ohne die Droge. (b) VLDL-Partikel mit Ezetimib inkubiert. (c) VLDL-Partikel mit Lovastatin inkubiert. (d) VLDL-Partikel mit Simvastatin inkubiert. (e) VLDL-Partikel mit Niacin inkubiert. (f) LDL-Partikel inkubiert ohne die Droge. (g) LDL-Partikel mit Ezetimib inkubiert. (h) LDL-Partikel mit Lovastatin inkubiert. (ich) LDL-Partikel mit Simvastatin inkubiert. (j) LDL-Partikel mit Niacin inkubiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Fluoreszenz Dot-Darstellungen zeigen eine unterschiedliche Wirkung von Lipid-senkenden Medikamenten Modulation VLDL, LDL und HDL Cholesterin-Partikel-Bildung in Serumproben. Obere Reihe, Screening von Serum 1 zeigt niedrige Ebene Medikament Antwort 0 bis 15 % HDL-Partikel-Bildung zu erhöhen; mittlere Reihe, Screening von Serum 2 zeigen moderate Ebene Medikament Antwort 16 bis 50 % HDL-Partikel zu erhöhen; Untere Reihe, Screening von Serum 3 zeigen höhere Ebene Medikament Antwort 51 bis 100 % HDL-Partikel zu erhöhen. (a, f, k) Serumproben ohne Drogen. (b, g, l) Serumproben mit Ezetimib inkubiert. (c, h, m) Serumproben mit Lovastatin inkubiert. (d, i, n) Serumproben mit Simvastatin inkubiert. (e, j, o) Serumproben mit Niacin inkubiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: Bilder-Galerien, die Morphologie der Cholesterin-Partikel im Serum identifiziert anzeigen Beispiel 1. Grün-Kanal zeigt Bilder von der Fluoreszenzemission von den Partikeln; Side Scatter (Cyan Kanal) zeigt Bilder von der Erregung-Laser Licht von den Teilchen gestreut. (ein) kugelförmig und linear geformten Cholesterin Teilchen ohne die Droge. (b, c, d, e) Cholesterin Teilchen im Beisein von Ezetimib, Simvastatin, Lovastatin und Niacin, beziehungsweise. Maßstabsleisten= 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Serum-ID | Ohne Droge (Control) | Mit Ezetimib | Mit Lovastatin | Mit Simvastatin | Mit Niacin | |||||
| % Linear, LDL-Partikel | % Linear, HDL-Partikel | % Linear, LDL-Partikel | % Linear, HDL-Partikel | % Linear, LDL-Partikel | % Linear, HDL-Partikel | % Linear, LDL-Partikel | % Linear, HDL-Partikel | % Linear, LDL-Partikel | % Linear, HDL-Partikel | |
| PNDS-01 | 1,73 | 45,2 | 0.81 | 18.1 | 0,61 | 16.1 | 0,59 | 13.9 | 2.26 | 33,6 |
| PNDS-02 | 2,86 | 35,9 | 1.26 | 30.9 | 1.27 | 22,7 | 0,73 | 15.2 | 3.03 | 37,7 |
| PNDS-03 | 2.04 | 35,8 | 0,87 | 4.82 | 1.02 | 4.14 | 0,36 | 3.06 | 0,45 | 9,57 |
| PNDS-04 | 2,56 | 32,9 | 1.15 | 21,8 | 1.12 | 18,6 | 0,77 | 17.2 | 3.37 | 36,5 |
| PNDS-05 | 0,42 | 29.2 | 0,24 | 5.62 | 0,22 | 8.72 | 0,16 | 9.91 | 0,35 | 22.2 |
| PNDS-06 | 1.8 | 28.1 | 0,4 | 16,8 | 0,62 | 15 | 0,42 | 9.27 | 2.28 | 38,4 |
| PNDS-07 | 1.8 | 26.5 | 0.85 | 10.5 | 1.18 | 19,9 | 0,62 | 7.32 | 1.29 | 23.4 |
| PNDS-08 | 0,98 | 22,8 | 0,86 | 7.28 | 1,55 | 10.2 | 0,14 | 5.98 | 0,59 | 13.3 |
| PNDS-09 | 3,87 | 22.1 | 1,98 | 9,56 | 1,87 | 10.3 | 1.46 | 7.96 | 2,86 | 9,88 |
| PNDS-10 | 4.46 | 21,9 | 2,57 | 13.6 | 4.04 | 17.1 | 2.28 | 11.9 | 0,71 | 25.7 |
| PNDS-11 | 1,57 | 19.2 | 1.15 | 9,24 | 1.37 | 6,98 | 0,74 | 5.03 | 1.37 | 16 |
| PNDS-12 | 1.06 | 16.7 | 0.66 | 4.38 | 0,7 | 4,74 | 0.99 | 6.36 | 1.14 | 4.73 |
| PNDS-13 | 4.85 | 16.6 | 1.28 | 30.4 | 1.4 | 32,6 | 0,8 | 16.6 | 4.02 | 31 |
| PNDS-14 | 2.08 | 16 | 0,68 | 15.4 | 0.64 | 16.5 | 1.97 | 10.2 | 1.25 | 20.11 |
| PNDS-15 | 1.5 | 11.9 | 1.14 | 13.3 | 1.21 | 11.4 | 0,8 | 6.12 | 1.38 | 4,59 |
| PNDS-16 | 1,82 | 10.4 | 2.04 | 9,59 | 1.24 | 5.62 | 0.91 | 5.38 | 1.31 | 7.61 |
| PNDS-17 | 1.05 | 10.3 | 1.02 | 4.7 | 1,78 | 15.1 | 0.93 | 7,81 | 1.27 | 13 |
| PNDS-18 | 1.11 | 8.76 | 0,54 | 3.68 | 0,61 | 3.51 | 1.01 | 5.03 | 1.02 | 6,69 |
| PNDS-19 | 1 | 8,52 | 0,75 | 6.67 | 0,76 | 5,86 | 0.91 | 8,36 | 1.22 | 11.9 |
| PNDS-20 | 3,54 | 7,92 | 3,78 | 12 | 3.56 | 5,81 | 3.28 | 8.28 | 3.44 | 12.3 |
| PNDS-21 | 1.88 | 7,69 | 2.12 | 11.4 | 1,73 | 9,54 | 1,77 | 8.34 | 2.32 | 16.7 |
| PNDS-22 | 1.64 | 7.17 | 0,35 | 5,75 | 0,56 | 13.2 | 0,14 | 4.33 | 1.23 | 17.8 |
| PNDS-23 | 1,54 | 6.27 | 1.25 | 7,24 | 1.02 | 6.12 | 0,73 | 3.58 | 1.42 | 6,69 |
| PNDS-24 | 0,53 | 6.22 | 0,52 | 4.49 | 0.91 | 5.57 | 0,54 | 4.01 | 0,65 | 10.5 |
| PNDS-25 | 2.97 | 5.1 | 1.59 | 11 | 1.88 | 9 | 1.03 | 6.54 | 2.61 | 29.1 |
Tabelle 1: Screening von Dyslipidämie Serumproben in der Plaque-Array-Test zeigen die unterschiedliche Wirkung der Lipidsenker. Im Vergleich zu Kontrollen ohne Droge (Spalten 2, 3), inkubiert Serumproben mit Ezetimib (Spalten 4, 5), Lovastatin (Spalten 6, 7), Simvastatin (Spalten 8, 9) und Niacin (Spalten 10, 11) zeigte Variationen über Induktion linear-förmigen LDL und HDL-Cholesterin Partikel-Bildung.
| Serum-ID | Ohne Drogen | Mit Ezetimib | Mit Lovastatin | Mit Simvastatin | Mit Niacin | |||||
| % Linear, LDL-Partikel | % Linear, HDL-Partikel | % Linear, LDL-Partikel | % Linear, HDL-Partikel | % Linear, LDL-Partikel | % Linear, HDL-Partikel | % Linear, LDL-Partikel | % Linear, HDL-Partikel | % Linear, LDL-Partikel | % Linear, HDL-Partikel | |
| PNAN-01 | 2.05 | 26,8 | 0,62 | 11.9 | 0,56 | 16,9 | 0,52 | 9.28 | 1.4 | 11.9 |
| PNAN-02 | 1.35 | 26.3 | 1,68 | 21,8 | 2,59 | 23,6 | 0.79 | 6,92 | 2.16 | 29.7 |
| PNAN-03 | 2.4 | |||||||||
Tabelle 2: Screening von Alter abgestimmte Steuerung Serumproben in der Plaque-Array-Test zeigen die unterschiedliche Wirkung der Lipidsenker. Im Vergleich zu Kontrollen ohne Droge (Spalten 2, 3), inkubiert Serumproben mit Ezetimib (Spalten 4, 5), Lovastatin (Spalten 6, 7), Simvastatin (Spalten 8, 9) und Niacin (Spalten 10, 11) zeigte Variationen über Induktion linear-förmigen LDL und HDL-Cholesterin Partikel-Bildung.
Discussion
Im Allgemeinen sind die Verteilung und die funktionellen Eigenschaften der VLDL, LDL und HDL-Cholesterin-Partikel in den Blutkreislauf hauptsächlich durch metabolische, genetische, epidemiologischen, Mobilfunk und Plasma Faktoren22,23bestimmt. In der vorliegenden Studie untersucht die Auswirkungen der Lipid-modifizierende Drogen im Puffer ergab, dass hoch lipophile Drogen wie Ezetimib, Simvastatin, Lovastatin und Atorvastatin eine höhere Ebene Komplexität auf die Morphologie der Cholesterin-Partikel induziert im Vergleich zu der unteren Ebene Wirkung mit hoch hydrophilen Rosuvastatin und Fluvastatin Drogen beobachtet. Diese Ergebnisse sind in guter Übereinstimmung mit unseren früheren Studie beschreibt eine nicht-enzymatische Mechanismus Wirkung von Statinen LDL und HDL Cholesterin-Partikel-Bildung in den Puffer und Serum Proben21Modulation. Dementsprechend zeigten die Ergebnisse aus dieser Studie ein nicht-enzymatische Wirkmechanismus von Ezetimib, Niacin, fibrate, und Omega-3-Fettsäure-Drogen, die eine direkte Rolle bei der Modulation der Cholesterin-Partikel-Bildung spielen können. Es ist möglich, dass die Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Cholesterin Aggregate führt bis zur Montage von Großformat-Cholesterin-Partikel, die 2-60 µm2, sind kugelförmig und linearen Strang Morphologien ausstellen.
Außerdem empfehlen die erzielten Ergebnisse mit gereinigtem Lipoprotein Partikel Wechselwirkungen zwischen Cholesterin Aggregate und Plasma Faktoren einschließlich VLDL, LDL und HDL Proteine, die die Kompositionen und die morphologischen Eigenschaften des Cholesterins verändern kann Partikel. Die Droge Behandlungsergebnisse mit gereinigtem Lipoprotein Partikel zeigten eine höhere Ebene Drogenwirkung auf VLDL-Partikel-Bildung im Vergleich zu ihrer Wirkung auf LDL-Cholesterin-Partikel-Bildung beobachtet. Die Lovastatin, Simvastatin und Ezetimib Medikamente dienten als Pro-Drogen und ihre Dosen in den Tests können höher sein als die physiologischen Konzentrationen.
Interessant, geformte screening von Serumproben zeigte Variationen der Drogenwirkung auf die Profile der VLDL, LDL und HDL-Cholesterin-Partikel-Bildung zu verändern, insbesondere deren Auswirkungen auf die Formationen der lineare LDL und HDL-Partikel. Diese Medikamente induzierte Reduktion auf lineare geformte LDL und HDL Cholesterin Partikel Bildung in Dyslipidämie und normalen Serumproben Alter abgestimmt. Die Arzneimittelwirkungen beobachtet auf die Verringerung der linear geformten Partikeln Bildung lag in Ezetimib, Simvastatin, Lovastatin und Niacin. Die Identifizierung von Cholesterin-Partikel mit kugelförmigen und linearen Strang Morphologien in Normal und Dyslipidämie Serumproben deutet darauf hin, dass Teilchen mit ähnlichen Morphologien in in Vivo Bedingungen bilden können. Frühere Studien haben das Vorhandensein von Scheibe und nadelartige Cholesterin-Kristalle in den atherosklerotischen Plaques Menschen- und ApoE- / - und LDLR- / - Mäusen Modelle24,25,26 identifiziert. ,27,28.
Die HDL-Partikel im Blut zirkulierenden vorhanden sein, da eine heterogene Mischung und das Niveau der klein und groß HDL-Partikel sowie funktionelle Aktivität wichtige Faktoren sind, die ihre Herz-Kreislauf-Schutz wirken über den umgekehrten Cholesterin-transport Weg29,30. Jüngste Studien haben deutlich gemacht, dass die Bedeutung der Identifizierung von HDL-Cholesterin Partikel Unterfraktionen für die Aufklärung ihrer Rolle in mehrere biologische Funktionen wie Cholesterin Efflux, entzündungshemmende, Anti-thrombotische und anti-oxidativen31 . Darüber hinaus haben eine Reihe von Studien die Wirkung der lipidsenkenden Therapie bei der Steigerung von eines niedrigen Niveau von HDL im Plasma1,5,21moderieren berichtet. Entsprechend liefern der Ergebnisse aus dieser Studie neue Erkenntnisse auf morphologische Merkmale der Cholesterin-Partikel. Insbesondere die Erkennung von einer höheren Ebene linear geformten HDL Cholesterin-Partikel in Serumproben von Dyslipidämie Themen legt nahe, dass sie die verlässliche Biomarker für die Diagnose und Bewertung der Auswirkungen der Lipid-modifizierende möglicherweise Drogen bei Patienten. Weitere ist Untersuchung jedoch erforderlich, mit großen klinischen Proben, um die Cholesterin-Partikel mit verschiedenen Morphologien und deren Zuordnung zu CVD besser zu verstehen.
In der Plaque Array Assays für die Prüfung der Drogenwirkung auf Montage von Cholesterin-Partikel, verwendeten wir 2 µg der Fluoreszenz bezeichnet Cholesterin Aggregate und 5 µgof Droge, weil: (1) Drogen kompetitiv an beiden Fluoreszenz bezeichnet Cholesterin binden und endogene Lipide in die Serumproben vorhanden; (2) von jeder Probe erwarben wir 5.000 bis 10.000 Cholesterin-Partikel, die in großen Größen und Formen von ~ 2-60 µ2montiert werden; (3) Wir beobachteten eine große Unterschiede der Droge Reaktion zwischen Serumproben inkubiert mit Drogen (Dosen 300 ng zu 5 µg) und ~ 1-5 % von ihnen inkubiert mit hohen Dosen zeigten keine nachweisbaren Änderungen im Profil der Cholesterin-Partikel-Bildung; und (4) die Interaktion zwischen Cholesterin Aggregate und Lipidsenker wird durch ein nicht-enzymatische Prozess vermittelt. Daher können die Konzentrationen der im Test verwendeten Reagenzien höher als ihre physiologischen Ebene sein.
Zusammenfassend haben wir erfolgreich demonstriert die Vorteile einer in-vitro- bildgebendes Verfahren beschrieben in dieser Studie zur Bestimmung der Wirkung eines breiten Spektrums von lipidsenkenden Medikamenten auf modulierenden Morphologie und Zusammensetzung des Cholesterins Partikel. Der Ansatz der Visualisierung und Quantifizierung der Morphologie der Lipid-Teilchen durch den Einsatz einer Konstellation von Bild-Analyse-Algorithmen kann helfen, die Diagnose der Atherosklerose und Ergebnisse der lipidsenkenden Therapie bei Patienten zu bewerten.
Disclosures
Dr. Madasamy erhielt Zuschüsse von Plaxgen, Inc. und hat ein konkurrierendes finanzielles Interesse. Die anderen Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte offenlegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch eine Plaxgen Forschung finanziert Stipendium an SM (PLX-1008). Wir danken für das Sammeln von Serumproben von Atherosklerose Untertanen unter Zustimmung der IRB Palo Alto Medical Research Foundation Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TopFluor fluorescent cholesterol | Avanti Polar lipids | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| simvastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| lovastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| rosuvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| atorvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| fluvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| ezetimibe (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| Niacin | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| fibrate | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| omega-3 fatty acid | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| purified VLDL proteins/particles | Lee Bio | ||
| purified LDL proteins/particles | Lee Bio | ||
| purified HDL proteins/particles | Lee Bio | ||
| Human age-matched serum | Dx Biosamples | ||
| Human atherosclerosis serum | Bioserve | ||
| Human normal serum | Stanford Blood center | ||
| LDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
| HDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
| Total cholesterol measurment | Roche Diangostics | ||
| 96-well microtitre plates | |||
| Triglycerides measurement | Roche Diangostics | ||
| Amnis Imaging Flow cytometer | Amnis Inc | ||
| IDEAS image analysing software | Amnis Inc | ||
| Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 | Awarness Technology | ||
| Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 | Roche Diangostics |
References
- Pahan, K. Lipid-lowering drugs. Cell Mol Life Sci. 63, 1165-1178 (2006).
- Laforest, L., et al. Prevalence of low high-density lipoprotein cholesterol and hypertriglyceridaemia in patients treated with hypolipidaemic drugs. Arch Cardiovasc Dis. 102, 43-50 (2009).
- Roberts, W. C. Preventing and arresting coronary atherosclerosis. Am Heart J. 130, 580-600 (1995).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. A century of cholesterol and coronaries: from plaques to genes to statins. Cell. 16, 161-172 (2015).
- Drexel, H. Statins, fibrates, nicotinic acid, cholesterol absorption inhibitors, anion-exchange resins, omega-3 fatty acids: which drugs for which patients? Fundam Clin Pharmacol. 23, 687-692 (2009).
- Camelia, S., Anca, S. Statins: Mechanism of action and effects. J.Cell.Mol.Med. 5, 378-387 (2001).
- Schaefer, E. J., et al. Comparisons of effects of statins (atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, and simvastatin) on fasting and postprandial lipoproteins in patients with coronary heart disease versus control subjects. Am J Cardiol. 93, 31-39 (2004).
- Meyers, C. D., Kamanna, V. S., Kashyap, M. L. Niacin therapy in atherosclerosis. Curr Opin in Lipid. 15, 659-665 (2004).
- Phan, B. A., Dayspringm, T. D., Toth, P. P. Ezetimibe therapy: mechanism of action and clinical update. Vasc Health Risk Mana. 8, 415-427 (2012).
- Leitersdorf, E., Fruchart, J. C. Mechanism of action of fibrates on lipid and lipoprotein metabolism. Circulation. 98, 2088-2093 (1998).
- Backes, J., Anzalone, D., Hilleman, D., Catini, J. The clinical relevance of omega-3 fatty acids in the management of hypertriglyceridemia. Lipids Health Dis. 15, 118 (2016).
- Davidson, M. H. Clinical Significance of Statin Pleiotropic Effects Hypotheses Versus Evidence. Circulation. 111, 2280-2281 (2005).
- Chinetti-Gbaguidi, G., Fruchart, J. C., Staels, B. Pleiotropic effects of fibrates. Curr Atheroscler Rep. 7, 396-401 (2005).
- McTaggart, F., Jones, P. Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit. CardiovascDrugs Ther. 22, 321-338 (2008).
- Quehenberger, O., et al. The Human Plasma Lipidome. N Engl J Med. 365, 1812-1823 (2011).
- Lund-Katz, S., et al. Mechanisms responsible for the compositional heterogeneity of nascent high density lipoprotein. J. Biol Chem. 288, 23150-23160 (2013).
- Krauss, R. M. Lipoprotein subfractions and cardiovascular disease risk. Curr Opin Lipidol. 21, 305-311 (2010).
- Krauss, R. M., Burke, D. J. Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteins in normal humans. J Lipid Res. 23, 97-104 (1982).
- Rosenson, R. S., et al. HDL measures, particle heterogeneity, proposed nomenclature, and relation to atherosclerotic cardiovascular Events. Clinic Chemi. 57, 392-410 (2011).
- Madasamy, S., et al. Plaque array method and proteomics-based identification of biomarkers from Alzheimer's disease serum. Clin Chim Acta. 441, 79-85 (2015).
- Madasamy, S., et al. Nonenzymatic Mechanism of Statins in Modulating Cholesterol Particles Formation. Am J Cardiol. 118, 1187-1191 (2016).
- Peter, O. K. Clinical relevance of the biochemical, metabolic, and genetic factors that influence low-density lipoprotein heterogeneity. Am J Cardiol. 90, 30-47 (2002).
- Weissglas-Volkov, D., Pajukanta, P. Genetic causes of high and low serum HDL-cholesterol. J Lipid Res. 51, 2032-2057 (2010).
- Abela, G. S. Effect of statins on cholesterol crystallization and atherosclerotic plaque stabilization. Am J Cardiol. 107, 1710-1717 (2011).
- Nidorf, S. M., Eikelboom, J. W., Thompson, P. L. Targeting cholesterol crystal-induced inflammation for the secondary prevention of cardiovascular disease. Cardiovasc Pharmacol Ther. 19, 45-52 (2014).
- Thacker, S. G., Zarzour, A., Chen,, et al. High density lipoprotein reduces inflammation from cholesterol crystals by inhibiting inflammasome activation. Immunol. 149, 306-319 (2016).
- Kim, S. H., Lee, E. S., Lee, J. Y., et al. Multiplex coherent anti-stokes Raman Spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids. Circ Res. 106, 1332-1341 (2010).
- Lim, R. S., Suhalim, J. L., Miyazaki-Anzai, S., et al. Identification of cholesterol crystals in plaques of atherosclerotic mice using hyperspectral CARS imaging. J Lipid Res. 52, 2177-2186 (2011).
- Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Curr Opin Lipidol. 21, 229-238 (2011).
- Kontush, A. HDL particle number and size as predictors of cardiovascular disease. Front in Pharmacol. , (2015).
- Karathanasis, S. K., Freeman, L. A., Gordon, S. M., Remaley, A. T. The changing face of HDL and the best way to measure it. Clin. Chem. 63, 196-210 (2017).
