Summary
이 연구의 목적은 약물 효과 콜레스테롤 입자의 형태를 변조에 지질을 낮추는 생체 외에서 평가 했다. 지질 저하 약물의 비교 콜레스테롤 입자의 형태학 적 기능 변조에 그들의 효과에서 변화를 밝혔다.
Abstract
치료 dyslipidemia 환자 지질 저하 약물의 중요 한 감소 저밀도 지 단백질 (LDL) 수준 및 플라즈마의 고밀도 지단백 (HDL) 콜레스테롤에 있는 증가의 적당 한 수준 낮은 이끌어 낸다. 그러나, 형태학 및 콜레스테롤 입자의 배포 변경에 이러한 약물의 가능한 역할 제대로 이해 된다. 여기, cytometry 이미징 함께 패 배열 메서드를 사용 하면 콜레스테롤 입자의 형태학 적 기능 변조에 지질 저하 약물 효과의 평가 체 외에서 설명 합니다. 콜레스테롤 입자의 이미지 분석 표시로 바 스타 틴, simvastatin, ezetimibe, atorvastatin 구형 및 선형 가닥 모양 입자의 형성을 유발, 피 브 레이트 류, 심, 신과 rosuvastatin 유도 하는 반면에 만 구형 모양 입자의 형성입니다. 다음, 매우 순화 된 저밀도 지 단백질 (VLDL)과이 약물과 incubated LDL 입자 변화에서에서 보여주었다 콜레스테롤의 형태학 및 이미지 텍스처 입자 모집단. 또한, 혈 청 샘플 50의 심사 dyslipidemia (18.3%의 평균)이 일치 하는 정상 (11.1%의 평균) 샘플에 비해 과목에서 선형 모양의 HDL 콜레스테롤 입자의 높은 수준의 존재를 밝혔다. 우리는 또한 선형 감소에 지질 저하 약물 효과에 상당한 변화 모양 혈 청 샘플에서 LDL과 HDL 콜레스테롤 입자 형성을 관찰. 이러한 연구 결과 지질 저하 약물, 그들의 세포 중재 낮추는 효과 뿐만 아니라 행동의 비 효소 메커니즘에 의해 콜레스테롤 입자의 형태를 조절 직접 수 있습니다 나타냅니다. 이러한 결과의 결과 동맥 경화 증의 진단 정보를 최적의 지질을 낮추는 치료 예측 가능성이 있다.
Introduction
고밀도 지단백 (HDL) 콜레스테롤에 있는 증가의 온건한 수준에 저밀도 지 단백질 (LDL) 콜레스테롤의 낮은 플라스마 수준을 감소 시키는 지질 저하 약물의 효능을 증명 하는 수많은 임상 연구는 동맥 경화 관련 심장 혈관 부작용1,2,3,,45의 기본 및 보조 부각을 방지할 수 있습니다. 스타 틴, HMG-CoA reductase 효소 저 해제, 그룹 낮은 회전 리드 순환 혈액6,7에서 LDL 콜레스테롤의 수준에에서 내 인 성 콜레스테롤 합성을 차단 합니다. 마찬가지로, 니코틴산의 효과 낮추는 지질 hepatocyte diacylglycerol acyltransferase-2, triglyceride 합성8에 관련 된 주요 간 효소의 그것의 직접 적이 고 및 회장 저해에 의해 중재 됩니다. 비교적, ezetimibe 소장9의 상피 세포에 위치한 Niemann 선택 C1-Like 1 (NPC1L1) 단백질에 바인딩하여 exogenous 콜레스테롤의 흡수를 제한 하 여 플라즈마 정도를 LDL 감소 시킨다. Fenofibrate, 다른 지질 저하 약물, 실질적으로 플라스마 트리 글리세라이드의 농도 감소 하 고 또한 알맞게 peroxisome proliferator 활성화 수용 체 통로10통해 LDL 콜레스테롤을 감소. 게다가, 오메가-3 지방산은 LDL11의 플라즈마 저수준에 그것의 능력 때문 항 동맥 경 화성 효과를 보고.
지질 낮추는 약물 LDL 콜레스테롤을 낮추는에 그들의 기본 효과 외에 HDL 수준 향상, 내 피 기능을 개선, 염증, 및 감소 혈소판 억제를 포함 하 여 유익한 다 면 발현 성 효과의 번호가 집계12,,1314. 그러나, HDL 콜레스테롤 입자를 증가 하 고 그들의 구조 기능 수정에 이러한 약물의 기본 메커니즘 완전히 이해 되지 않는다. 이러한 의약품 심혈 관계 질환 동맥 경화 관련 (CVDs) 치료를 널리 처방 됩니다, 이후 더 그들의 가능한 역할에 형태학 기능 및 지질 입자의 분포 확인 조사 필수적입니다. 인간의 플라즈마 lipidome 약 600 독특한 지질과 다양 한 크기, 모양, 밀도, 및 작곡15,16,17에 있는 cholesterols의 종류 분자 22의 구성 . 울트라-원심 분리, NMR, 그라데이션 젤 전기 이동 법 등 분석 방법 LDL과 HDL 입자와 그들의 subfractions18,19를 특성화 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 이러한 방법의 응용 형태 및 지질 입자의 변조에서 약물의 효과 결정 하기 위한 연구에 제한 됩니다. 교류 cytometer 기반된 패 배열 기능 생화학 분석 결과 검색에 대 한 개발 이며 혈 청의 지질 및 아 밀 로이드 플 라크 입자20파생. 체 외에 이미징이 연구에서 설명 하는 방법의 장점은 변경 형태 및 버퍼 및 혈 청 샘플에서 콜레스테롤 입자의 분포에 지질 조절 약물 효과의 식별 가능
Protocol
1. 준비의 형광 표시 된 콜레스테롤과 지질 저하 약물
참고: 형광 표시 된 콜레스테롤 집계 및 스타 틴 우리의 이전 기사에서 설명한 대로 준비 했다 21. 시 약, 교류 cytometer, 화학 분석기 및 데이터 분석 소프트웨어를이 연구에 사용 된 이미지의 세부 정보에 대 한 테이블의 자료를 참조 하시기 바랍니다.
- 형광 표시 된 동결 건조 된 콜레스테롤을 solubilize (1mg, 전 / Em = 495 nm/507 nm) 100% 알코올의 1 mL에 가루.
- 2,040 x g에서 3 분을 위한 견본을 원심 고 성 형광 표시 된 콜레스테롤 집계 패 배열 분석 결과에서 포함 된 supernatants 사용.
- 약물 준비에 대 한 개별적으로 simvastatin로 바 스타 틴, atorvastatin, ezetimibe, 및 100% 알코올의 1 ml에 오메가-3 지방산의 분말 (2 mg)를 solubilize.
- 2,040 x g에서 3 분 동안 원심 분리 후 사용 마약 분석 결과에 포함 된 supernatants.
- 마찬가지로 solubilize 개별적으로 분말 (2mg) 심, rosuvastatin, 니 아 신, 그리고 이온된 물 2 mg/mL의 재고 솔루션을 만들고의 1 mL에 fibrate.
- 2,040 x g에서 3 분 동안 원심 분리 후 사용 마약 패 배열 분석 결과에 포함 된 supernatants.
2. 패 배열 분석 결과 검토에 시험관 콜레스테롤 입자 형성을 위한
- 사용 화학 분석기-1 (재료의 표 참조) 패 배열 분석 결과 콜레스테롤 입자 형성에 대 한 설정. 둥근 바닥, 낮은 단백질 바인딩 96 잘 접시 섹션 1에서 준비 하는 시 약을 사용 하 여 분석 결과 수행 합니다. 200 µ L에서 각 잘에서 최종 반응 볼륨을 유지 하 고 3 중에 모든 분석을 수행.
- 먼저, 부하 194.5 µ L 인산의 염 분 (PBS) 각 음을 버퍼링.
- 각 잘 각 지질 저하 약물 솔루션의 2.5 µ L (5 µ g)를 추가 하 고 흔들어 30 접시를 균일 하 게 솔루션으로 약물을 섞어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s. 약 부정적인 컨트롤 샘플에 추가 됩니다.
- 마지막으로, 각 음을 2 µ L (2 µ g) 형광 표시 된 콜레스테롤 집계 솔루션을 추가 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.
- 2 h 37 ° C와 200 rpm에서 설정에 대 한 실험실 셰이 커에 접시를 품 어.
- Cytometry 이미징 하 여 입자의 이미지를 수집 부 화, 후.
3. 캡처 이미지의 콜레스테롤 입자를 사용 하 여 이미징 Flow Cytometry
- 열기 데이터 수집 템플릿 올바른 악기 설정을 로드를. 클릭 " 파일 ", 다음 선택 " 오픈 템플릿 … " 하 고 서식 파일을 선택 합니다.
- 클릭 " 플러시, 잠금, 부하 " 샘플 로드에 대 한 악기를 준비 하.
- 때는 " 로드 샘플 " 대화 상자가 열립니다, 클릭 " 확인 " 이미징 교류 cytometer로 제 2에서 준비 각 샘플의 50 µ L 로드.
- 클릭 " 실행 | 설치 " 실시간에서 이미징 영역에서 입자를 볼.
- 이미징 영역에서 입자 좋은 초점에 있을 때 클릭 " 실행 | 취득 " 다크 필드 (사이드 분산형/SSC), 밝은 (BF), 녹색 형광와 노란색 형광에 대 한 높은 처리 방식으로 각 개체의 이미지를 동시에 취득 하.
- 반복 단계 각 샘플에서 5000-10000 입자를 얻으려고 3.2-3.5.
- 개체 형광 강도 및 형태학 상 변이 결정 하기 위한 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 모든 raw 이미지 파일을 분석.
- 클릭는 " 도구 " 선택 후 이미지 분석 소프트웨어의 상단에 버튼 " 일괄 처리 데이터 파일 " 드롭-다운 메뉴에서을 열 것 이다는 " 배치 " 창.
- 에 " 배치 " 창 클릭는 " 추가 배치 " 열립니다 단추는 " 일괄 처리 정의 " 창.
- 에는 " 일괄 처리 정의 " 창 클릭는 " 파일 추가 " 버튼 및 raw 이미지 파일을 선택, 클릭는 " 서식 파일 " 버튼 적절 한 데이터 분석 템플릿 파일을 선택한 후 선택 " 확인 " 및 " 일괄 처리 제출 " 처리 및 raw 이미지 파일의 분석을 시작 하려면.
4. 배열 분석 결과 기반 평가의 지질-저하 약물 효과 플 라크 콜레스테롤 입자 정화
- 단계 2.1에에서 설명 된 대로 수행 콜레스테롤 입자 형성 분석 결과 정화 VLDL, LDL 및 HDL 지방 단백질/입자를 사용 하 여. 96 잘 접시에 패 배열 분석을 수행.
- 첫째, PBS 가진 모든 우물을 로드; 200 µ L 최종 볼륨을 사용 하 여 각 잘.
- 부정적인 제어를 위한 4 µ g VLDL, LDL, 추가 또는 HDL 단백질/입자 각각에 개별적으로 약 없이 고 30 접시를 흔들어 s.
- 지질 저하 약물 효과 조사, 추가 4 µ g VLDL, LDL, 또는 HDL 단백질/입자 각각을 개별적으로 잘 흔들어 30 접시 s.
- 우물 4 µ g VLDL, LDL, 또는 HDL 추가, 2.5 µ (5 µ g) L ezetimibe로 바 스타 틴, simvastatin, 또는 니 아 신 솔루션을 추가 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1에 그것을 배치 하 여 s.
- 마지막으로, 모든 우물을 2 µ L (2 µ g) 형광 표시 된 콜레스테롤 집계 솔루션을 추가 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.
- 37 ° C와 200 rpm에서 설정 실험실 셰이 커에 2 h에 대 한 접시를 품 어.
- 이미징 cytometry 다음 단계 3.1-3.5를 사용 하 여 샘플을 수집.
- 단계 3.7에서에서 설명한 대로 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 raw 이미지 파일을 분석.
- 분석 서식 파일에서 콜레스테롤 입자 모집단의 식별을 위해 다음 제어 체계 사용.
- 녹색 채널 포화 픽셀 수 (x 축)와 어두운 필드 채널의 음모에 포화 픽셀 수 (y 축), 어느 채널에서 하나 이상의 포화 픽셀 개체 거부.
- 녹색 채널 강도 (x 축) 및 SSC 강도 (y 축)을 사용 하 여 포화 픽셀 없이 개체/입자 플롯: 개체가 그들의 녹색 채널 및 SSC 농도에 따라 세 영역 (VLDL, LDL, HDL) 중 하나에 속합니다.
참고: 이러한 게이츠 순화 VLDL, LDL 및 HDL 입자/단백질 약물 없이 사용 하 여 실시 하는 제어 실험에서 생성 된 데이터에 따라 만들어졌습니다.
- 각 샘플에 대 한 지질 저하 약물 효과 확인 하려면 계산 각 부분 모집단 (VLDL, LDL, HDL)의 비율 뿐만 아니라 총 단백 입자 농도에 설명 된 단계 6.5.
다음 수식을 사용 하 여
- 계산 입자 농도 (입자/mL):
참고:는 VLDL, LDL 및 HDL 게이팅 형광 도트-음모에서 영역 검출 ~ 그들의 각각 부분 모집단, 및 나머지의 80% ~ 20%는 입자의 다른 제어 영역 중복.
- 계산 입자 농도 (입자/mL):
5. 혈 청 샘플에서 지질 농도의 측정
- 화학 분석기-2에 의해 LDL, HDL, 콜레스테롤 및 트리 글 리세 리드의 농도 결정 하는 데 사용 나이 일치 하는 정상 및 dyslipidemia 과목에서 얻은 혈 청 샘플.
- LDL, HDL, 콜레스테롤, 고 중성 지방 혈 청 샘플에서 상위 및 하위 참조 값을 넘어 식별 하는 그들의 농도에 따라의 비정상적인 농도 정의.
- 따라 일반적인 참조 값 recommen시 약 제조 업체에 의해 공격 한: 콜레스테롤 (4-200 mg/dL), HDL (3.0-65 mg/dL), (4-100 mg/dL), LDL 및 트리 글 리세 리드 (9-200 mg/dL).
- 낮은 참조 값 아래 또는 더 높은 참조 콜레스테롤 및 트리 글리세라이드에 대 한 가치와 존재 및 지질 저하 약물의 부재에 심사에 대 한 그들을 사용 된 비정상적인 값 있는 혈 청 샘플 식별.
6. 혈 청 샘플에서 콜레스테롤 입자 형성에 대 한 약물의 효과 분석
- 사용 화학 분석기-패 배열 분석 결과 혈 청 샘플에서 콜레스테롤 입자 형성에 대 한 설정 1. 둥근 바닥, 낮은 단백질 바인딩 96 잘 접시에에서 분석 결과 수행 합니다. 최종 반응 양의 200 µ L/잘 사용 하 고 3 중에 모든 분석을 수행.
- Stepwise 방식에서 시 약을 로드 하 여 접시를 준비.
- 제어 웰 스 준비.
- 각 잘을 PBS의 부하 193 µ L.
- 2.5% (v/v) 환자 혈 청 (잘 당 하나의 혈 청 샘플)을 추가 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.
- 추가 2 µ L (2 µ g) 형광 표시 된 콜레스테롤의 각 음에 솔루션을 집계 및 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.
- 약물과 웰 스 준비.
- 각 잘을 PBS의 부하 191 µ L.
- 2.5% (v/v) 환자 혈 청 (잘 당 하나의 혈 청 샘플)을 추가 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.
- 추가 2 µ L ezetimibe로 바 스타 틴, simvastatin 또는 니 아 신 솔루션 (4 µ g) 부정적인 제어 웰 스 제외 하 고 모든 우물. 잘 당 하나의 약물을 추가 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.
- 형광 표시 된 콜레스테롤의 추가 2 µ L 각 우물에 솔루션 (2 µ g)를 집계 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.
- 마약 모든 우물만 로드 (제어 및 약물 치료) 그들의 각각 혈 청 샘플 로드 되었습니다 및 형광 표시 된 콜레스테롤이이 단계 끝에 추가.
- 37 ° C와 200 rpm에서 설정 실험실 셰이 커에 2 h에 대 한 접시를 품 어.
- 교류 cytometer 다음 단계 3.1-3.6에서에서 설명한 설정을 이미지에 의해 샘플을 취득.
- 단계 3.7에서에서 설명한 대로 동일한 서식 파일을 사용 하 여 모든 이미지 파일을 처리 하는 일괄 처리에 대 한 소프트웨어를 분석 하는 이미지를 사용 하 여.
- 4.5와 4.6 단계에 설명 된 대로 플롯 게이츠를 그려서 데이터 분석을 수행.
- 지질 저하 약물 효과/응답 (낮음, 중간, 및 높은) 각 샘플에 대 한 결정, VLDL, LDL과 HDL의 총 입자 구성의 비율 뿐만 아니라 총 단백 입자 농도 계산 부분 모집단.
- 플롯 개체의 히스토그램에 VLDL, LDL 및 HDL 인구 ' s 밝은 필드 이미지, 구형 또는 선형 영역으로 길이 (길이-폭), 그리고 게이트에서 뺀 폭: 개체 (길이-폭) ≤ 2 µ m으로가 구형 및 선형 비율 계산에 대 한 구형 영역 모양 입자.
- 구형 및 선형 모양의 LDL과 HDL 콜레스테롤 입자와 각 약물 없이 incubated 각 혈 청 샘플에 대 한 식별의 백분율을 비교 합니다. 각 혈 청 샘플에 대 한 가져온 triplicate 값, 중 동의 구형 및 선형 비율 LDL과 HDL 입자는 약물 효과의 결정에 대 한 SD ± 2 범위 내에 속하는 모양.
Representative Results
패 배열 분석 결과 콜레스테롤 입자 형성에 지질-저하 약물 효과의 분석을 기반으로:
콜레스테롤 입자의 형태를 변조에서 스타 틴의 효과 평가, 형광 표시 된 콜레스테롤 집계로 바 스타 틴와 simvastatin, atorvastatin, rosuvastatin, 버퍼에 심 incubated 개별적으로 했다. 이러한 모든 샘플 이미징 cytometry 그림 1 과 그림 2에서 같이 형태 분석 콜레스테롤 입자의 이미지를 사용 하 여 인수 했다. 흥미롭게도,로 바 스타 틴, simvastatin, 및 틴이 콜레스테롤 입자 다양 한 크기와 모양, 표시의 이질적인 인구의 형성 유도 표시 버퍼에 콜레스테롤 입자 형성에 약물 효과 분석 그림 3a -c. 반대로, rosuvastatin, 심, 존재 콜레스테롤 입자 형성 하 고 (마약) 없이 부정적인 컨트롤 모양 및 형태학 그림 3d-f와 같이 균질 했다. 또한, 그것은 그로 바 스타 틴, simvastatin, atorvastatin 유도 콜레스테롤 입자 모두 구형 및 선형 가닥 형태학, 전시의 형성 rosuvastatin과 심 콜레스테롤의 형성을 유도 하는 반면 관찰 되었다 만 구형 형태를 입자입니다. 선형 가닥 형성 유도에 스타 틴 효과 바 스타 틴에 대 한 16%, simvastatin, 2%, 0.2% 틴이 순서 발견 되었다.
더 입자 형성에 지질 저하 약물의 효과 평가 하려면 형광 표시 된 콜레스테롤 집계 했다 개별적으로 인 큐베이 팅 ezetimibe, fibrate, 함께 신과 오메가-3 지방산. 스타 틴과 관찰이 약 유형이 다른 크기 및 모양 그림 4a-d에 표시 된 콜레스테롤 입자의 형성을 유도 한다. 그 중, ezetimibe 형성 유도 모두 구형 및 선형 가닥 형태학을 전시 하는 반면 콜레스테롤 입자의 fibrate, 니 아 신, 그리고 오메가-3 지방산 유도 구형 모양의 콜레스테롤 입자의 형성. 따라서 콜레스테롤 입자 형성 모양의 선형 가닥에 약물의 효과 ezetimibe, 0% 대 3% 순서는 fibrate, 오메가-3 지방산에 대 한 0%와 니 아 신, 0%.
형태소 분석 각 모양의 구형 또는 선형 가닥 콜레스테롤 입자 서로 연결 된 많은 작은 입자의 구성 되어 있습니다 밝혔다. 식별 하는 형광 긍정적인 구형 콜레스테롤 입자의 크기 ~ 2-60 µ m2의 범위에서 선형 모양된 입자의 크기는 2 ~ 30 µ m2의 범위에 있습니다.
순화 VLDL과 LDL 입자에 지질 저하 약물의 효과 분석:
더 지 단백질의 존재 콜레스테롤 입자 형성 검사, 형광 표시 된 콜레스테롤 집계 했다 개별적으로 알을 품을 순화 VLDL, LDL 및 HDL 단백질/입자. LDL과 HDL 입자, 콜레스테롤 집계 incubated VLDL 단백질 콜레스테롤 입자, 그림 5의 더 높은 수의 형성 발생과 부 화에 비해 결과 나타났다. 또한, 콜레스테롤 입자의 두 주요 분수 콜레스테롤 형광 표시 된 집계를 가진 외피 동안 LDL 분수에 그들의 부분적인 변화를 제안 하는 VLDL 인구에서 관찰 되었다. 입자의 이미지 분석 구형 (~ 97%)과 VLDL, LDL 및 HDL 인구 가운데 선형 모양된 (3%) 입자의 존재를 표시. 구형 입자의 크기 범위는 2 ~ 30 µ m2, 반면 선형 입자 크기 범위는 2 ~ 60 µ m2.
순화 된 입자의 지질-저하 약물 효과 조사, VLDL과 LDL 입자 ezetimibe로 바 스타 틴, simvastatin와 니 아 신 incubated 개별적으로 했다. 그 결과, 약물 없이 제어 실험에 비해 VLDL 입자 형성에 관찰 약물 효과가 높았다 ezetimibe, simvastatin로 바 스타 틴, 니 아 신에서. LDL 입자 약물 incubated 주요 단일 분수 그리고 입자 형성에 약물 유발 영향 ezetimibe, simvastatin로 바 스타 틴, 니 아 신, 그림 6에서 높았다.
혈 청 샘플에서 콜레스테롤 입자의 분포를 변경에 지질 저하 약물 효과의 변화:
위의 실험 약물 효과 평가 하기 위한 순화 된 단백질의 버퍼 솔루션에서 수행 했다. 따라서, 다음 단계에서 콜레스테롤 입자 형성에 지질 저하 약물의 효과 dyslipidemia 25 과목 및 25 나이 일치 하는 정상적인 과목에서 수집 된 50 혈 청 샘플을 사용 하 여 시험 되었다. 각 혈 청 샘플에서 마약 응답 존재 및 약물의 부재에 콜레스테롤 입자 형성의 프로필에 변화에 따라 측정 되었다. 패 배열 분석 결과에서 각 혈 청 샘플 ezetimibe로 바 스타 틴, 니 아 신 약물 simvastatin, 및에 대 한 상영 되었다. 결과 이러한 약물 중 변조 LDL을 줄이고 HDL 콜레스테롤 입자 형성을 증가에 미치는 영향에 특히 혈 청 샘플, VLDL, LDL 및 HDL 입자의 분포에 차이가 나타났다. 지질 저하 약물에 대 한 독특한 응답 전시 dyslipidemia 혈 청 샘플의 3 명의 대표자는 그림 7에 표시 됩니다.
혈 청의 변조 형태에 약물 효과의 식별에는 LDL과 HDL 콜레스테롤 입자 파생 된:
혈 청에서 파생 된 콜레스테롤 입자의 표현 형 분석 선형 영역과 구형 모양의 VLDL, LDL, 모두의 존재 그리고 HDL 모집단, 유사한 형태학 실험에서 확인 된 확인 모두는 버퍼에서 수행 하 고 와 그림 8과 같이 순화 된 지 단백질 입자. 그러나, 구형 및 선형 모양의 콜레스테롤 입자 모집단의 분포는 널리 dyslipidemia와 일치 하는 나이 정상적인 과목 다양합니다. 특히, 약물 없이 수행 제어 분석 선형 가닥의 분포에 차이가 모양의 LDL 콜레스테롤 입자 dyslipidemia (2.0%의 평균) 및 나이 일치 하는 정상 (1.3%의 평균) 사이의 혈 청 샘플을 보여주었다. 마찬가지로, HDL 콜레스테롤 입자 모양의 선형 가닥의 증가 수준 나이 일치에 비해 dyslipidemia 샘플 (18.3%의 평균)에서 관찰 되었다 (11.1%의 평균) 혈 청 샘플. 상관 관계, dyslipidemia 혈 청 샘플 선형 모양의 HDL 콜레스테롤 입자 형성 simvastatin (8.3%의 평균), ezetimibe (11.5%의 평균),로 바 스타 틴 (11.7%의 평균)에 상당한 감소를 보여주었다에 약물의 존재는 분석 실험 수행 그리고 니코틴산 (18.3%의 평균)에 대 한 감소. 또한, 선형 모양의 LDL 콜레스테롤 입자의 형성에 있는 감소는 dyslipidemia 혈 청 샘플 표 1에 표시 된 약물으로 알을 품을 때에 관찰 되었다.
나이 일치 하는 컨트롤 세럼 samp에 약물의 존재는 분석 수행 하는 또한,레는 simvastatin (5.0%의 평균), ezetimibe (평균 8.2%)로 바 스타 틴 (평균 8.7%), 및 표 2에 표시로 니코틴산 (평균 10.8%)에 HDL 콜레스테롤 입자 모양의 선형에 상당한 감소를 보여주었다. Dyslipidemia와 나이 일치 하는 정상 혈 청 약물 유발 감소 선형 모양의 LDL과 HDL 콜레스테롤 입자 구형 모양의 콜레스테롤 입자 (데이터 표시 되지 않음) 상대 높아졌습니다 전시 샘플링 합니다.
그림 1: 콜레스테롤 입자 형태학의 생체 외에서 시각화 하는 과정을 보여주는 다이어그램. (a, b) 버퍼 또는 혈 청 샘플에서 지질 저하 약물의 추가. (c) 형광 표시 된 수용 성 콜레스테롤의 추가 샘플을 집계합니다. (d) 이미징 cytometry 사용 하 여 불용 성 콜레스테롤 입자의 형태소 분석에 대 한 결과 샘플을 취득. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 콜레스테롤 입자 이미징 cytometry 사용의 두 가지 형태학의. (a) 입자는 밝은 필드 이미지의 텍스처 분석 기반 선형 또는 구형 인구에 차별 있다 특히, 의미 H 동질성 (x 축)과 의미 H 엔트로피 (y 축)의 도트 플롯 영역이 두 문이 구형 (빨간색)을 탐지 하기 위한 고 선형 스트랜드 (파란색) 콜레스테롤 입자 모양. (b) 이미지 인구 1에서에서 확인 된 구형 모양의 입자의 형태를 표시 합니다. (c) 선형 가닥의 이미지 입자 인구 2에서에서 확인 된 모양. (d) 그들의 집중력과 모집단을 결정 하는 데 사용 하는 모든 형광 긍정적인 콜레스테롤 입자의 분포를 표시 하는 히스토그램. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 콜레스테롤 입자 형성을 변조에서 스타 틴의 효과 표시 하는 갤러리 이미지. 밝은 필드 기존의 교류 cytometer FSC와 비슷한 영역을 말합니다. 녹색 채널 형광 방출 505-560 nm에서 발견을 말합니다 그리고 노란색 채널 형광 방출 560-595 nm에서 발견. (a-e) 콜레스테롤 입자의 형태를 표시 하는 이미지 갤러리 존재로 바 스타 틴, simvastatin, atorvastatin, rosuvastatin, 그리고 심, 각각 형성. (f) 스타 틴 (부정적인 제어)의 부재에 콜레스테롤 입자 형성. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 차동 변조 콜레스테롤 입자 형성에 지질 저하 약물 효과 보여주는. (-d) 콜레스테롤 입자의 형태를 표시 하는 이미지 갤러리 각각 ezetimibe, 니 아 신, fibrate, 그리고 오메가-3 지방산의 존재 형성. 녹색 채널 형광 방출 505-560 nm에서 발견을 말합니다 그리고 노란색 채널 형광 방출 560-595 nm에서 발견. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: VLDL, LDL 및 HDL 콜레스테롤 입자의 대형의 부재에서 마약 분석. 도트-그래프: x 축 표시 녹색 형광 채널 (505-560 nm)에서 감지 콜레스테롤 입자의 스펙트럼 하 고 y 축 표시 측면 분산형. 게이팅 형광 도트-플롯에서 감지 하는 VLDL, LDL 및 HDL 입자의 영역을 보여 줍니다. (한) 존재 정화 VLDL 콜레스테롤 입자 형성. VLDL 입자의 (b) 대표 이미지. (c) 순화 된 LDL의 콜레스테롤 입자 형성. LDL 입자의 (d) 대표 이미지. (e) 순화 된 HDL의 존재 콜레스테롤 입자 형성. HDL 입자의 (f) 대표 이미지. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 지질에 낮추는 약물의 효과 보여주는 VLDL과 LDL 콜레스테롤 입자 정화. 약물 없이 (한) VLDL 입자. (b) VLDL 입자 ezetimibe와 인 큐베이 팅. (c) VLDL 입자로 바 스타 틴으로 인 큐베이 팅. (d) VLDL 입자 simvastatin으로 인 큐베이 팅. (e) VLDL 입자 니 아 신으로 인 큐베이 팅. (f) LDL 입자는 약물 없이 알을 품을. (g) LDL 입자 ezetimibe와 인 큐베이 팅. (h) LDL 입자는로 바 스타 틴으로 인 큐베이 팅. (나) LDL 입자 simvastatin으로 인 큐베이 팅. (j) LDL 입자는 니코틴산과 인 큐베이 팅. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 형광 도트-플롯 지질 낮추는 약물 혈 청 샘플의 VLDL, LDL 및 HDL 콜레스테롤 입자 형성을 변조에서 차동 효과 보여주는. 맨 위 행, 세럼 1 표시 낮은 수준의 마약 응답 증가 15 %HDL 입자 형성; 0의 심사 가운데 행, 증가 50 %HDL 입자; 16에 세럼 2 보여주는 적당 한 수준의 약물 응답의 심사 맨 아래 행, 세럼 3 표시 51 100 %HDL 입자에 증가에 높은 수준의 약물 응답의 심사. (a, f, k) 약 없이 혈 청 샘플. (b, g, l) 혈 청 샘플 ezetimibe와 인 큐베이 팅. (c, h, m) 혈 청 샘플으로 바 스타 틴으로 인 큐베이 팅. (d, i, n) 혈 청 샘플 simvastatin으로 인 큐베이 팅. (e, j, o) 혈 청 샘플 니코틴산과 인 큐베이 팅. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 혈 청에서 확인 된 콜레스테롤 입자의 형태를 표시 하는 이미지 갤러리 샘플 1. 녹색 채널이 보여줍니다; 입자에서 형광 방출의 이미지 사이드 분산형 (녹청 채널) 보여줍니다 여기 레이저의 빛은 입자에 의해 흩어져. (한) 구형 및 선형 모양의 콜레스테롤 입자는 약물 없이 형성. (b, c, d, e) 콜레스테롤 입자 각각 ezetimibe로 바 스타 틴, simvastatin와 니 아 신의 형성. 스케일 바= 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 혈 청 ID | 약물 (통제) 없이 | Ezetimibe와 | 로 바 스타 틴과 | Simvastatin으로 | 니 아 신으로 | |||||
| % 선형, LDL 입자 | % 선형, HDL 입자 | % 선형, LDL 입자 | % 선형, HDL 입자 | % 선형, LDL 입자 | % 선형, HDL 입자 | % 선형, LDL 입자 | % 선형, HDL 입자 | % 선형, LDL 입자 | % 선형, HDL 입자 | |
| PNDS-01 | 1.73 | 45.2 | 0.81 | 18.1 | 0.61 | 16.1 | 0.59 | 13.9 | 2.26 | 33.6 |
| PNDS-02 | 2.86 | 35.9 | 1.26 | 30.9 | 1.27 | 22.7 | 0.73 | 15.2 | 3.03 | 37.7 |
| PNDS-03 | 2.04 | 35.8 | 0.87 | 4.82 | 1.02 | 4.14 | 0.36 | 3.06 | 0.45 | 9.57 |
| PNDS-04 | 2.56 | 32.9 | 1.15 | 21.8 | 1.12 | 18.6 | 0.77 | 17.2 | 3.37 | 36.5 |
| PNDS-05 | 0.42 | 29.2 | 0.24 | 5.62 | 0.22 | 8.72 | 0.16 | 9.91 | 0.35 | 22.2 |
| PNDS-06 | 1.8 | 28.1 | 0.4 | 16.8 | 0.62 | 15 | 0.42 | 9.27 | 2.28 | 38.4 |
| PNDS-07 | 1.8 | 26.5 | 0.85 | 10.5 | 1.18 | 19.9 | 0.62 | 7.32 | 1.29 | 23.4 |
| PNDS-08 | 0.98 | 22.8 | 0.86 | 7.28 | 1.55 | 10.2 | 0.14 | 5.98 | 0.59 | 13.3 |
| PNDS-09 | 3.87 | 22.1 | 1.98 | 9.56 | 1.87 | 10.3 | 1.46 | 7.96 | 2.86 | 9.88 |
| PNDS-10 | 4.46 | 21.9 | 2.57 | 13.6 | 4.04 | 17.1 | 2.28 | 11.9 | 0.71 | 25.7 |
| PNDS-11 | 1.57 | 19.2 | 1.15 | 9.24 | 1.37 | 6.98 | 0.74 | 5.03 | 1.37 | 16 |
| PNDS-12 | 1.06 | 16.7 | 0.66 | 4.38 | 0.7 | 4.74 | 0.99 | 6.36 | 1.14 | 4.73 |
| PNDS-13 | 4.85 | 16.6 | 1.28 | 30.4 | 1.4 | 32.6 | 0.8 | 16.6 | 4.02 | 31 |
| PNDS-14 | 2.08 | 16 | 0.68 | 15.4 | 0.64 | 16.5 | 1.97 | 10.2 | 1.25 | 20.11 |
| PNDS-15 | 1.5 | 11.9 | 1.14 | 13.3 | 1.21 | 11.4 | 0.8 | 6.12 | 1.38 | 4.59 |
| PNDS-16 | 1.82 | 10.4 | 2.04 | 9.59 | 1.24 | 5.62 | 0.91 | 5.38 | 1.31 | 7.61 |
| PNDS-17 | 1.05 | 10.3 | 1.02 | 4.7 | 1.78 | 15.1 | 0.93 | 7.81 | 1.27 | 13 |
| PNDS-18 | 1.11 | 8.76 | 0.54 | 3.68 | 0.61 | 3.51 | 1.01 | 5.03 | 1.02 | 6.69 |
| PNDS-19 | 1 | 8.52 | 0.75 | 6.67 | 0.76 | 5.86 | 0.91 | 8.36 | 1.22 | 11.9 |
| PNDS-20 | 3.54 | 7.92 | 3.78 | 12 | 3.56 | 5.81 | 3.28 | 8.28 | 3.44 | 12.3 |
| PNDS-21 | 1.88 | 7.69 | 2.12 | 11.4 | 1.73 | 9.54 | 1.77 | 8.34 | 2.32 | 16.7 |
| PNDS-22 | 1.64 | 7.17 | 0.35 | 5.75 | 0.56 | 13.2 | 0.14 | 4.33 | 1.23 | 17.8 |
| PNDS-23 | 1.54 | 6.27 | 1.25 | 7.24 | 1.02 | 6.12 | 0.73 | 3.58 | 1.42 | 6.69 |
| PNDS-24 | 0.53 | 6.22 | 0.52 | 4.49 | 0.91 | 5.57 | 0.54 | 4.01 | 0.65 | 10.5 |
| PNDS-25 | 2.97 | 5.1 | 1.59 | 11 | 1.88 | 9 | 1.03 | 6.54 | 2.61 | 29.1 |
표 1: dyslipidemia의 상영 패 배열 분석 결과에서 혈 청 샘플 보여 지질 저하 약물의 차동 효과. 약물 (열 2, 3) 없이 컨트롤에 비해, 혈 청 샘플 incubated ezetimibe (열 4, 5)로 바 스타 틴 (열 6, 7), 함께 simvastatin (열 8, 9), 고 선형 모양 LDL과 HDL 콜레스테롤 유도에 보여준 니코틴산 (열 10, 11) 입자 형성입니다.
| 혈 청 ID | 마약 없이 | Ezetimibe와 | 로 바 스타 틴과 | Simvastatin으로 | 니 아 신으로 | |||||
| % 선형, LDL 입자 | % 선형, HDL 입자 | % 선형, LDL 입자 | % 선형, HDL 입자 | % 선형, LDL 입자 | % 선형, HDL 입자 | % 선형, LDL 입자 | % 선형, HDL 입자 | % 선형, LDL 입자 | % 선형, HDL 입자 | |
| PNAN-01 | 2.05 | 26.8 | 0.62 | 11.9 | 0.56 | 16.9 | 0.52 | 9.28 | 1.4 | 11.9 |
| PNAN-02 | 1.35 | 26.3 | 1.68 | 21.8 | 2.59 | 23.6 | 0.79 | 6.92 | 2.16 | 29.7 |
| PNAN-03 | 2.4 | |||||||||
표 2: 패 배열 분석 결과에서 나이 일치 하는 제어 혈 청 샘플의 지질 저하 약물의 차동 효과 보여. 약물 (열 2, 3) 없이 컨트롤에 비해, 혈 청 샘플 incubated ezetimibe (열 4, 5)로 바 스타 틴 (열 6, 7), 함께 simvastatin (열 8, 9), 고 선형 모양 LDL과 HDL 콜레스테롤 유도에 보여준 니코틴산 (열 10, 11) 입자 형성입니다.
Discussion
일반적으로, 배포 및 혈액 순환에 VLDL, LDL 및 HDL 콜레스테롤 입자의 기능 특성 주로 대사, 유전 역학, 세포, 및 플라즈마 요인22,23에 의해 결정 됩니다. 현재 연구에서 지질 변경의 효과 검사 버퍼에 마약 밝혀 ezetimibe로 바 스타 틴, simvastatin, atorvastatin 등 높은 질 성 약 콜레스테롤 입자의 형태에 더 높은 수준의 복잡성을 유도 높은 친수성 rosuvastatin 심 약으로 관찰 된 낮은 수준의 효과에 비해. 이러한 결과 좋은 계약에 우리의 이전 연구 버퍼 및 혈 청 샘플21에서 LDL과 HDL 콜레스테롤 입자 형성을 변조에서 스타 틴의 효과 기반으로 하는 비 효소 메커니즘을 설명 하. 따라서, 현재 연구에서 결과 ezetimibe, 니 아 신, fibrate, 그리고 오메가-3 지방산 마약 변조 콜레스테롤 입자 형성에 직접적인 역할을 할 수 있는 행동의 비 효소 메커니즘 밝혀. 약물 및 콜레스테롤 집계 사이 상호 작용 구형 및 선형 가닥 형태학 전시 대형 콜레스테롤 입자 들 2-60 µ m2의 어셈블리에 연결 가능 하다.
게다가, 순화 된 지단백 입자를 사용 하 여 얻은 결과 콜레스테롤 집계와 작곡과 콜레스테롤의 형태학 속성을 변경할 수 있습니다 VLDL, LDL 및 HDL 단백질을 포함 한 플라즈마 요소 간의 상호 작용을 제안 입자입니다. 순화 된 지 단백질 입자와 관련 된 약물 치료 결과 LDL 콜레스테롤 입자 형성에 관찰 하는 그들의 효과에 비해 VLDL 입자 형성에 더 높은 수준의 마약 효과를 나타냅니다. 로 바 스타 틴, simvastatin, ezetimibe 약 프로 약으로 사용 되었다 하 고 그들의 복용량은 분석 실험에서 생리 적 농도 보다 높을 수 있습니다.
흥미롭게도, 선형의 형성에 미치는 영향에 특히 LDL과 HDL 입자를 형성 VLDL, LDL 및 HDL 콜레스테롤 입자 형성의 프로필 변경에 약물 효과의 변이 보여주었다 혈 청 샘플의 심사. 이러한 약물 LDL과 HDL 콜레스테롤 입자 형성 dyslipidemia에 나이 일치 하는 정상 혈 청 샘플 모양의 선형에 감소 유도. 선형 모양된 입자 형성을 감소에 관찰 약물 효과 simvastatin, ezetimibe로 바 스타 틴, 니 아 신에서 높았다. 정상 및 dyslipidemia 혈 청 샘플에서 구형 및 선형 스트랜드 형태학과 콜레스테롤 입자의 식별 vivo에서 조건에서 유사한 형태학을 가진 입자 형성 수 있습니다 제안 합니다. 이전 연구는 디스크와 인간과 ApoE-/- LDLR-/- 생쥐 모델24,,2526 의 동맥 경 화성 플 라크에 바늘 모양의 콜레스테롤 결정의 존재를 확인 ,2728.
이질적인 혼합물 및 기능 활동 함께 소형 및 대형 크기 HDL 입자의 수준 반전 콜레스테롤 수송을 통해 그들의 심장 보호 효과 발휘 하는 중요 한 요소는 존재 하는 혈액에서 회람 하는 HDL 입자 통로29,30. HDL 콜레스테롤 입자 subfractions elucidating31 콜레스테롤 경과, 안티-염증, 안티 thrombotic 및 안티 산화 등 여러 생물학적 기능에 그들의 역할에 대 한 식별의 중요성을 강조 하는 최근 연구 . 또한, 연구의 숫자는 플라즈마1,5,21에서 HDL의 수준을 알 맞도록 하는 낮은 증가에 지질을 낮추는 치료의 효과 보고 있다. 따라서, 본 연구에서 결과 콜레스테롤 입자의 형태학 적 특징에 새로운 통찰력을 제공합니다. 특히, dyslipidemia 주제의 혈 청 샘플에서 선형 모양의 HDL 콜레스테롤 입자의 높은 수준의 검색 제안 그들은 모두 진단 및 지질 변경의 효과 평가 대 한 신뢰할 수 있는 biomarker를 있을 수 있습니다 마약 환자에. 그러나, 추가 조사는 명료한 형태학 및 CVD에 그들의 협회와 콜레스테롤 입자를 더 잘 이해 하는 큰 임상 샘플을 사용 하 여 필요 합니다.
콜레스테롤 입자의 조립에 약물 효과 조사 분석 한 패 결과 배열, 표시 된 콜레스테롤 집계 및 5 µgof 마약 때문에 형광의 2 µ g 사용 했습니다: (1) 약물은 콜레스테롤을 표시 두 형광 경쟁적으로 바인딩할 및 내 인 성 지질 혈 청 샘플;에 (2) 각 샘플에서에서 큰 크기와 ~ 2-60 μ2;에서 배열 하는 모양으로 조립 하는 5000 ~ 10000 콜레스테롤 입자를 획득 (3) 약물 (5 µ g 복용 300 ng)와 콜레스테롤 입자 형성;의 프로필에 감지 변경 했다 높은 복용량으로 알을 품을 그들의 1 ~ 5% 인 큐베이 팅 세럼 샘플 중 약물 반응의 다양 한 변화 관찰 (4) 콜레스테롤 집계와 지질 저하 약물 간의 상호 작용은 비 효소 과정에 의해 중재. 따라서, 분석 결과에 사용 된 시 약의 농도 그들의 생리 적인 수준 보다 더 높은 수 있습니다.
결론적으로, 우리는 성공적으로 증명 하고있다는 생체 외에서 이미징 형태학과 콜레스테롤의 조절에 광범위 한 지질 저하 약물의 효과 결정 하기 위한이 연구에서 설명 하는 방법의 장점 입자입니다. 시각화 및 이미지 분석 알고리즘의 별자리를 채용 하 여 지질 입자의 형태를 측정의 접근 환자에서 지질을 낮추는 치료의 결과 평가 하 고 동맥 경화 증의 두 진단을 도움이 됩니다.
Disclosures
박사 Madasamy Plaxgen, Inc에서 보조금 지원을 받고 있으며 경쟁 금융 관심 있습니다. 다른 작성자 공개 경쟁 금융 관심 없습니다 있어야 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 Plaxgen의 연구에 의해 투자 되었다 SM (PLX-1008)에 게 수 여 하는 그랜트. 우리는 IRB 승인 아래 동맥 경화 과목에서 혈 청 샘플을 수집 하기 위해 팔로 알토 의학 연구 재단 연구소를 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TopFluor fluorescent cholesterol | Avanti Polar lipids | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| simvastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| lovastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| rosuvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| atorvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| fluvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| ezetimibe (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| Niacin | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| fibrate | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| omega-3 fatty acid | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| purified VLDL proteins/particles | Lee Bio | ||
| purified LDL proteins/particles | Lee Bio | ||
| purified HDL proteins/particles | Lee Bio | ||
| Human age-matched serum | Dx Biosamples | ||
| Human atherosclerosis serum | Bioserve | ||
| Human normal serum | Stanford Blood center | ||
| LDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
| HDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
| Total cholesterol measurment | Roche Diangostics | ||
| 96-well microtitre plates | |||
| Triglycerides measurement | Roche Diangostics | ||
| Amnis Imaging Flow cytometer | Amnis Inc | ||
| IDEAS image analysing software | Amnis Inc | ||
| Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 | Awarness Technology | ||
| Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 | Roche Diangostics |
References
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