Summary
本研究的目的是评价体外降血脂药物对胆固醇颗粒形态的调节作用。对降血脂药物的比较表明, 它们在调节胆固醇颗粒的形态特征上有不同的作用。
Abstract
治疗血脂异常患者降脂药物导致低密度脂蛋白 (LDL) 水平的显著降低, 并在血浆高密度脂蛋白胆固醇 (HDL) 中降低到中等程度的增加。然而, 这些药物在改变胆固醇颗粒的形态和分布方面可能发挥的作用是不清楚的。在这里, 我们描述了体外应用斑块阵列法结合成像流式细胞仪对胆固醇颗粒的形态特征进行降血脂作用的评价。对胆固醇微粒的图像分析表明, 洛伐他汀、辛伐他丁、替和阿托伐他汀诱导球状和线形颗粒的形成, 而烟酸、类、氟伐他汀和他诱导只形成球状形状的微粒。其次, 纯化的非常低密度脂蛋白 (脂蛋白) 和 LDL 粒子与这些药物的培养表明, 胆固醇微粒亚群的形态学和图像纹理的变化。此外, 对50血清样本的筛选显示, 与年龄匹配的正常 (平均为 11.1%) 样本相比, 血脂异常 (平均为 18.3%) 的患者存在较高的线性型高密度脂蛋白胆固醇颗粒。我们还观察到, 降血脂药物对减少血清样品中的线性型 LDL 和高密度脂蛋白胆固醇颗粒的影响有相当大的变化。这些结果表明, 降脂药物, 除了其细胞介导的降效应, 可以直接调节胆固醇颗粒的形态的酶机制的行动。这些结果有可能通知动脉粥样硬化的诊断和预测最佳降脂治疗。
Introduction
大量的临床研究表明, 降脂药物在降低低密度脂蛋白胆固醇的血浆水平和高密度脂蛋白 (HDL) 胆固醇的低水平到中等程度的增加中有有益的作用, 这防止动脉粥样硬化相关不良心血管事件的主要和第二次发生1,2,3,4,5。他汀类, 一组的英国女王陛下的还原酶抑制剂, 阻断内源性胆固醇合成在肝脏, 反过来导致低密度脂蛋白胆固醇在血液中的循环水平6,7。同样, 烟酸的降脂作用是介导其直接和非抑制肝细胞甘油 acyltransferase-2, 一个关键的肝酶参与甘油三酯合成8。相比之下, 替通过限制外源性胆固醇的吸收, 通过在小肠上皮细胞中的尼曼 C1-Like 1 (NPC1L1) 蛋白的结合来降低血浆 LDL 的水平.9。非诺贝特, 另一个降脂药物, 大大降低了血浆甘油三酯的浓度, 也适度降低 LDL 胆固醇通过过氧化物扩散激活受体通路10。此外, omega-3 脂肪酸报告有抗的影响, 因为它的能力, 以降低血浆 LDL 水平的低密度脂蛋白11。
降脂药物除了对降低 LDL 胆固醇的主要作用外, 还有许多有益的效效应, 包括提高 HDL 水平, 改善内皮功能, 减少炎症, 抑制血小板聚合12,13,14。然而, 这些药物在增加高密度脂蛋白胆固醇颗粒和改变其结构特征方面的基本机制还没有得到充分的了解。由于这些药物被广泛用于治疗动脉粥样硬化相关的心血管疾病 (心血管), 因此必须进一步研究它们在确定脂质颗粒的形态特征和分布方面可能发挥的作用。人血浆 lipidome 包括大约600不同的脂质和22各种各样的分子类型胆固醇存在于各种各样的大小、形状、密度和构成15,16,17.分析方法, 如 ultra-centrifugation, 核磁共振, 梯度凝胶电泳用于表征 LDL 和高密度脂蛋白粒子及其亚18,19。然而, 这些方法的应用仅限于研究药物在调节脂质颗粒的形态和组装中的作用。流式细胞仪基斑块阵列是一种功能生化检测和可视化血清衍生脂质和淀粉样菌斑块颗粒20。本研究中所述的体外成像方法的优点, 可在缓冲液和血清样品中改变胆固醇颗粒的形态和分布, 从而识别出脂质调节药物的作用。
Protocol
1. 荧光标记的胆固醇和降脂药物的制备
注: 荧光标记的胆固醇聚集物和他汀类制剂, 如我们前文所述 21 . 有关试剂、成像流式细胞仪、化学分析仪和本研究中使用的数据分析软件的详细信息, 请参阅 材料表 。
- 溶解荧光标记的冻干胆固醇 (1 毫克, 前/Em = 495 nm/507 纳米) 粉末在1毫升100% 酒精.
- 离心样品3分钟在 2040 x g, 并使用清含有可溶性荧光标记的胆固醇聚集在斑块阵列的检测.
- 用于药物的制备, 分别溶解辛伐他汀、洛伐他汀、阿托伐他替和 omega-3 脂肪酸的粉末 (2 毫克), 1 毫升100% 乙醇.
- 在离心后3分钟在 2040 x g, 使用清含有药物的化验.
- 同样地, 溶解在1毫升的去离子水中单独地将氟伐他汀、他、烟酸和贝特的粉末 (2 毫克) 制作成2毫克/毫升的股票溶液.
- 在 2040 x g 离心3分钟后, 在斑块检测中使用含有药物的清.
2。斑块阵列法检测 体外 胆固醇颗粒形成
- 使用化学 analyzer-1 (见材料表) 建立斑块阵列法测定胆固醇颗粒的形成。使用1节所制备的试剂, 在圆底、低蛋白结合96好的板上进行化验。在200和 #181 中保持每一个井的最终反应量; L 和执行所有的化验三份.
- 首先, 将194.5 和 #181 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 放到每个井中.
- 每一个井, 添加2.5 和 #181; L (5 和 #181; g) 每个降脂药物溶液和震动板三十年代通过放置在化学 analyzer-1 反应板, 以均匀混合药物成溶液。阴性对照样品中不添加任何药物.
- 最后, 添加2和 #181; L (2 和 #181; g) 用荧光标记的胆固醇骨料溶液对每一个井, 并动摇板三十年代通过放置在化学 analyzer-1 反应板.
- 在实验室的振动筛上孵育2小时37和 #176; C 和 200 rpm.
- 孵化后, 通过成像流式细胞仪获取颗粒图像.
3。利用成像流式细胞仪采集胆固醇颗粒图像
- 打开数据获取模板以加载正确的仪器设置。单击和 #34; 文件和 #34;, 然后选择和 #34; 打开模板和 #8230; #34; 选择模板文件.
- 单击和 #34; 冲洗、锁定、加载和 #34; 准备样品装载的仪器.
- 当和 #34; 加载示例和 #34; 对话框打开, 单击并 #34; 确定和 #34; 加载50和 #181; 在2节中的每一个井中准备的样品进入成像流式细胞仪.
- 单击并 #34; 运行 |设置和 #34; 实时查看成像区域中的粒子.
- 当成像区域中的粒子处于良好焦点时, 单击并 #34; 运行 |获取和 #34; 以高通量的方式同时获取每个对象的图像 (侧面散射/SSC)、亮场 (BF)、绿色荧光和黄色荧光.
- 重复步骤 3.2-3.5, 从每个样本中获取 5000-1万粒子.
- 使用图像分析软件分析所有原始图像文件, 以确定对象的荧光强度和形态学变化.
- 单击 "#34; 工具和 #34; 在图像分析软件顶部的按钮, 然后选择和 #34; 批处理数据文件和 #34; 从下拉菜单中, 将打开和 #34; 批次和 #34; 窗口.
- 在 #34; 批处理和 #34; 窗口中, 单击并 #34; 添加批处理和 #34; 按钮, 它将打开和 #34;D efine 批次和 #34; 窗口.
- #34;D efine 批处理 #34; 窗口中, 单击和 #34; 添加文件和 #34; 按钮并选择原始图像文件, 单击 #34; 模板和 #34; 按钮, 然后选择相应的数据分析模板文件, 然后选择和 #34; 确定和 #34; #34; 提交批次和 #34;开始处理和分析原始图像文件.
4。基于斑块阵列法的降脂药物对纯化胆固醇颗粒影响的评价
- 如步骤2.1 所述, 使用纯化的脂蛋白、LDL 和高密度脂蛋白/微粒来进行胆固醇颗粒的形成试验。在96井板上进行斑块阵列检测.
- 首先, 用 PBS 加载所有井; 使用200和 #181; 每个井的最终音量.
- 用于负控制, 添加4和 #181; g 脂蛋白、LDL 或高密度脂蛋白蛋白/微粒单独地在每个井没有药物并且震动板材三十年代.
- 用于检查降脂药物的效果, 添加4和 #181; g 脂蛋白, LDL, 或高密度脂蛋白蛋白/颗粒单独到每一个井和动摇板三十年代.
- 为4和 #181 添加的水井; g 脂蛋白, LDL, 或高密度脂蛋白, 增加2.5 和 #181; L (5 和 #181; g) 替, 洛伐他汀, 辛伐他丁, 或烟酸溶液, 并动摇板三十年代通过放置在化学 analyzer-1.
- 最后, 添加2和 #181; L (2 和 #181; g) 荧光标记的胆固醇聚合溶液, 所有水井和动摇板三十年代通过放置在化学 analyzer-1 反应板.
- 在37和 #176 的实验室振动台中孵育2小时的板; C 和 200 rpm.
- 在步骤 3.1-3.5 中使用成像流式细胞仪获取样本.
- 如步骤3.7 所述, 使用图像分析软件分析原始图像文件.
- 在分析模板中, 使用以下浇口方案来识别胆固醇粒子亚群.
- 在绿色通道饱和像素计数 (x 轴) 和暗域通道饱和像素计数 (y-axis) 的绘图上, 在任一通道中拒绝具有一个或多个饱和像素的对象.
- 使用绿色通道强度 (x 轴) 和 ssc 强度 (y-axis) 绘制没有饱和像素的对象/粒子: 根据其绿色通道和 ssc 强度, 对象属于三个区域 (脂蛋白、LDL、高密度脂蛋白).
注意: 这些门是根据通过使用纯化的脂蛋白、LDL 和高密度脂蛋白粒子/蛋白质的控制实验所产生的数据而建立的.
- 以确定每个样本的降脂药物效果, 计算总脂蛋白颗粒浓度, 以及步骤6.5 中描述的每个亚群 (脂蛋白、LDL、高密度脂蛋白) 的百分比.
- 使用以下公式计算粒子浓度 (粒子/mL):
注意: 脂蛋白、LDL 和高密度脂蛋白浇注区在荧光点-情节检测 ~80% 他们各自的亚人口, 并且剩余的20% 微粒与其他门控区重叠.
- 使用以下公式计算粒子浓度 (粒子/mL):
5。血清样品中脂质浓度的测定
- 用于通过化学 analyzer-2 测定 LDL、高密度脂蛋白、胆固醇和甘油三酯的浓度, 使用与年龄匹配的正常和血脂紊乱患者获得的血清样本.
- 定义 LDL、高密度脂蛋白、胆固醇和甘油三酯的异常浓度, 其依据是血清样本中的上、下参考值之外的浓度.
- 遵循正常参考值建议ded 由试剂制造商: 胆固醇 (4-200 毫克/dl), 高密度脂蛋白 (3.0-65 毫克/dl), LDL (4-100 毫克/dl), 和甘油三酯 (9-200 毫克/dl).
- 将具有异常值的血清样本识别为低于较低的参考值或高于胆固醇和甘油三酯的较高参考值, 并在存在和无降脂药物的情况下使用它们进行筛选.
6。药物对血清样品中胆固醇颗粒形成的影响分析
- 使用化学 analyzer-1 建立血清样品中胆固醇颗粒形成的斑块阵列法。在一个圆底, 低蛋白结合 96-井板进行化验。使用200和 #181 的最终反应量; L/良好, 并执行所有的化验三份.
- 通过逐步地加载试剂来准备板材.
- 准备控制井.
- 加载193和 #181; PBS 的每个井.
- 添加 2.5% (v/v) 患者血清 (每井仅一个血清样本), 并将其放在化学分析仪反应板上, 在三十年代摇动钢板.
- 添加2和 #181; L (2 和 #181; g) 将荧光标记的胆固醇聚合溶液放入每一个井中, 并将其放在化学 analyzer-1 反应板上, 使其在三十年代震动板块.
- 使用药物准备水井.
- 加载191和 #181; PBS 对每个井.
- 添加 2.5% (v/v) 患者血清 (每井只有一个血清样本), 并将其放在化学 analyzer-1 反应板上, 将其摇动到三十年代.
- 添加2和 #181; 替、洛伐他汀或烟酸溶液 (4 和 #181; g) 除负控井外, 全部井。每井只添加一种药物, 并将其放在化学 analyzer-1 反应板上, 从而在三十年代摇动盘.
- 添加2和 #181; 荧光标记的胆固醇骨料溶液 (2 和 #181; g) 进入每一个井和动摇板三十年代通过放置在化学 analyzer-1 反应板.
- 仅在所有水井 (控制和药物治疗) 加载了其各自的血清样本后才加载药物, 并在本步骤末尾添加荧光标记的胆固醇.
- 在37和 #176 的实验室振动台中孵育2小时的板; C 和 200 rpm.
- 在步骤 3.1-3.6 中描述的设置后, 通过成像流式细胞仪获取样本.
- 使用图像分析软件对所有图像文件进行批处理, 使用与步骤3.7 中所述相同的模板.
- 执行数据分析, 方法是在步骤4.5 和4.6 中所述的绘图上绘制门.
- 用于确定每个样本的降脂药物效果/反应 (低、中、高), 计算总脂蛋白颗粒浓度, 以及包含脂蛋白、LDL 和高密度脂蛋白的总粒子的百分比亚人口.
- 绘制脂蛋白, 低密度脂蛋白和高密度脂蛋白在物体和 #39 的直方图上的分布, 从长度 (长度-宽度) 和门到球状或线性区域中减去的宽度 (长度-宽度) 和 #8804; 2 和 #160; #181; 我落入球状区域, 用于计算球状和线性形状粒子的百分比.
- 比较每种药物培养的血清样品中球状和线性型 LDL 和 HDL 胆固醇颗粒的百分比。在每个血清样本中获得的三个值中, 接受在 SD 和 #177 中的球状和线性型 LDL 和高密度脂蛋白粒子的百分比; 2 范围为药物作用的决心.
Representative Results
基于斑块阵列法的降脂药物对胆固醇颗粒形成的影响分析:
所有这些样本都是利用成像流式细胞仪捕获的图像的胆固醇颗粒的形态学分析, 如图 1和图 2。有趣的是, 分析药物对胆固醇颗粒形成的缓冲作用表明, 洛伐他汀, 辛伐他汀和阿托伐他汀诱导形成不同大小和形状的胆固醇颗粒的非均匀群体,图 3a-c。相反, 在他、氟伐他汀和阴性对照 (无药物) 的情况下形成的胆固醇颗粒在形态和形态上均是均匀的, 如图 3d-f所示。此外, 还观察到, 洛伐他汀、辛伐他汀和阿托伐他汀诱发了胆固醇颗粒的形成, 表现为球状和线性链形态, 而他和氟伐他汀诱导胆固醇的形成只有球状形态的粒子。他汀类药物对诱导线性股形成的作用在16% 的洛伐他汀, 2% 为辛伐他汀, 0.2% 为阿托伐他汀。
为了进一步评价降脂药物对颗粒形成的影响, 用替、贝特、烟酸和 omega-3 脂肪酸分别孵育荧光标记的胆固醇集料。正如他汀类药物所观察到的, 这些药诱导了不同大小和形状的胆固醇颗粒的形成, 如图 4a-d所示。其中, 替诱导的胆固醇颗粒的形成, 表现为球状和线性链形态, 而贝特, 烟酸, 和 omega-3 脂肪酸诱导形成的只有球状状的胆固醇颗粒。因此, 药物对线性链状胆固醇颗粒形成的影响是在3% 的顺序为替, 0% 为贝特, 0% 为烟酸, 0% 为 omega-3 脂肪酸。
形态学分析显示每个球状或线形的胆固醇颗粒是由许多小颗粒组成的。所确定的荧光阳性球状胆固醇粒子的大小在 ~ 2-30 µm2的范围内, 而线性形状粒子的大小在 ~ 2-60 µm2范围内。
分析降脂药物对纯化脂蛋白和低密度脂蛋白颗粒的影响:
为了进一步检查胆固醇颗粒的形成, 在脂蛋白的存在, 荧光标记的胆固醇聚合体单独孵育与纯化脂蛋白, LDL, 高密度脂蛋白蛋白/颗粒。结果显示, 与低密度脂蛋白和高密度脂蛋白粒子的培养相比, 与脂蛋白蛋白一起孵化的胆固醇聚集物导致了高胆固醇颗粒的形成,图 5。此外, 在脂蛋白的人群中, 两个主要的胆固醇颗粒被观察到, 在与荧光标记的胆固醇聚合体的孵化过程中, 它们的部分转化为 LDL 分数。粒子的图像分析表明, 在脂蛋白、LDL 和高密度脂蛋白种群中存在球状 (~ 97%) 和线性形状 (约 3%) 粒子。球状粒子的大小范围是 ~ 2-30 µm2, 而线性粒子的大小范围是 ~ 2-60 µm2。
为了检测对纯化颗粒的降脂药物作用, 脂蛋白和低密度脂蛋白颗粒分别与替、洛伐他汀、辛伐他丁和烟酸一起孵育。结果表明, 替、辛伐他汀、洛伐他汀和烟酸对脂蛋白颗粒形成的药物效应与对照试验相比, 无药物效果更高。替、辛伐他汀、洛伐他汀和烟酸等药物与药物一起培养的低密度脂蛋白颗粒呈主要的单组分, 对颗粒形成的影响更大,图 6。
血脂降低药物对血清样品中胆固醇颗粒分布影响的变化:
前面的实验是在缓冲液中用纯化的脂蛋白进行的, 用于评价药物的效果。因此, 在接下来的步骤中, 用25个血脂异常和25年龄匹配的正常人收集的50血清样本对降血脂药物对胆固醇颗粒形成的有效性进行了检查。在药物存在和缺失的情况下, 根据胆固醇颗粒形成的变化情况, 测定每个血清样品中的药物反应。在斑块阵列检测中, 对替、洛伐他汀、辛伐他丁和烟酸类药物进行了筛选。结果显示, 这些药物在调节脂蛋白、ldl 和高密度脂蛋白颗粒在血清样本中的分布方面存在差异, 特别是它们对降低 ldl 和增加高密度脂蛋白胆固醇颗粒的影响。三代表的血脂异常血清样本表现出独特的反应, 降脂药物显示在图 7。
药物对血清中 LDL 和高密度脂蛋白胆固醇颗粒的调节作用的鉴定:
血清衍生胆固醇颗粒的表型分析显示了线性股和球状脂蛋白、LDL 和高密度脂蛋白亚群的存在, 从而确认了在缓冲和与纯化的脂蛋白颗粒, 如图 8所示。然而, 球状和线性形状的胆固醇微粒亚群的分布在血脂异常和年龄匹配的正常人群中广泛变化。值得注意的是, 在没有药物的情况下进行的对照分析显示, 在血脂异常 (平均为 2.0%) 和年龄匹配的正常 (平均为 1.3%) 血清样本的线性股型 LDL 胆固醇颗粒分布上存在差异。与年龄匹配 (平均为 11.1%) 血清样品相比, 在血脂异常样本中观察到的线性链状高密度脂蛋白胆固醇颗粒的含量增加 (平均 18.3%)。与此相关的是, 在血脂异常血清样本中存在药物的化验结果显示, 辛伐他汀 (平均为 8.3%)、替 (平均为 11.5%)、洛伐他汀 (平均为 11.7%) 的线性型高密度脂蛋白胆固醇颗粒形成显著降低,不减少烟酸 (平均 18.3%)。此外, 在与表 1中显示的药物一起孵育时, 在血脂异常血清样本中观察到了线性型 LDL 胆固醇颗粒形成的减少。
此外, 在药物存在的年龄匹配控制血清桑普进行的化验les 显示, 在辛伐他汀 (平均 5.0%), 替 (平均 8.2%), 洛伐他汀 (平均 8.7%) 和烟酸 (平均 10.8%) 的线性形状 HDL 胆固醇颗粒显著减少, 如表 2所示。血脂异常和年龄匹配的正常血清样本显示药物诱导减少的线性型 LDL 和高密度脂蛋白胆固醇颗粒表明, 球状形状的胆固醇颗粒相对增加 (数据没有显示)。
图 1: 图示说明了体外过程中胆固醇颗粒形态的可视化.(a, b)在缓冲液或血清样品中添加降脂药物。(c) 在样品中加入荧光标记的可溶性胆固醇聚集物。(d) 获取使用成像流式细胞仪对不溶性胆固醇颗粒进行形态学分析的结果样本。缩放栏 = 10 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 使用成像流式细胞仪识别两种不同的胆固醇颗粒形态.(a) 根据明亮场图像的纹理分析, 将粒子分隔成线性或球状种群。具体来说, 平均 h 同质性 (x 轴) 和平均 h 熵 (y-axis) 的点积包含两个封闭区域, 用于检测球状 (红色) 和线性链状 (蓝色) 胆固醇颗粒。(b) 图像显示在1人口中发现的球状形状粒子的形貌。(c) 在2人口中识别出的线性线状粒子的图像。(d) 直方图, 显示用于确定其浓度和亚群的所有荧光阳性胆固醇颗粒的分布情况。缩放栏 = 10 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 显示他汀类药物在调节胆固醇颗粒形成中的作用的图像库.明亮的领域是指在传统的流式细胞仪中类似 FSC 的区域。绿色通道是指在 505-560 nm 检测到的荧光发射, 而黄色通道是指在 560-595 nm 检测到的荧光发射。(a-e)图像库显示了在洛伐他汀, 辛伐他汀, 阿托伐他丁, 他和氟伐他汀的存在下形成的胆固醇颗粒的形态。(f) 胆固醇颗粒在没有他汀 (阴性对照) 的情况下形成。缩放栏 = 10 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 演示降脂药物在调节胆固醇颗粒形成中的差异作用.(a-d)在替、烟酸、贝特和 omega-3 脂肪酸的存在下形成的胆固醇颗粒形态的图像库。绿色通道是指在 505-560 nm 检测到的荧光发射, 而黄色通道是指在 560-595 nm 检测到的荧光发射。缩放栏 = 10 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 分析脂蛋白、LDL 和高密度脂蛋白胆固醇颗粒在没有药物的情况下的形成。点阵图: X 轴显示了在绿色荧光通道 (505-560 nm) 和 Y 轴显示的一光谱胆固醇颗粒的侧面散射。浇注显示在荧光点图中检测到的脂蛋白、LDL 和高密度脂蛋白粒子的区域。(a) 胆固醇颗粒在纯化脂蛋白的存在下形成。(b) 脂蛋白粒子的代表性图像。(c) 胆固醇颗粒在纯化 LDL 的存在下形成。(d) 低密度脂蛋白粒子的代表性图像。(e) 胆固醇颗粒在纯化 HDL 的存在下形成。(f) 高密度脂蛋白粒子的代表性图像。缩放栏 = 10 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 演示降脂药物对纯化的脂蛋白和 LDL 胆固醇颗粒的影响.(a) 脂蛋白没有药物的微粒。(b) 脂蛋白颗粒与替一起孵化。(c) 脂蛋白颗粒与洛伐他汀一起孵化。(d) 脂蛋白与辛伐他汀一起孵化的微粒。(e) 脂蛋白与烟酸一起孵化的微粒。(f) 低密度脂蛋白粒子在没有药物的情况下孵化。(g) 与替一起孵育的 LDL 粒子。(h) 与洛伐他汀一起孵化的 LDL 颗粒。(i) 与辛伐他汀一起孵育的 LDL 颗粒。(j) 与烟酸一起孵化的 LDL 粒子。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: 荧光斑点-图形显示了降脂药物在调节脂蛋白、LDL 和高密度脂蛋白胆固醇颗粒在血清样品中形成的差异作用.顶排, 筛选血清1显示低浓度的药物反应, 增加0至15% 高密度脂蛋白粒子的形成;中间排, 筛查血清2显示中等水平的药物反应, 增加16至50% 高密度脂蛋白颗粒;底部排, 筛选血清3显示更高层次的药物反应, 增加51至100% 高密度脂蛋白粒子。(a, f, k)没有药物的血清样本。(b, g, l)用替孵育的血清样品。(c、h、m)血清样品与洛伐他汀一起孵化。(d, i, n)用辛伐他汀孵育血清标本。(e, j, o)血清样品与烟酸一起孵化。请单击此处查看此图的较大版本.
图 8: 显示血清样品中胆固醇颗粒形态的图像库 1.绿色通道显示粒子的荧光发射图像;侧面散射 (青色通道) 显示由粒子散射的激发激光光的图像。(a) 球状和线性形状的胆固醇颗粒, 无药物形成。(b、c、d、e)胆固醇颗粒分别存在于替、洛伐他汀、辛伐他丁和烟酸中。缩放条形图= 10 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
| 血清 ID | 没有药物 (控制) | 与替 | 与洛伐他汀 | 与辛伐他汀 | 与烟酸 | |||||
| % 线性, LDL 微粒 | % 线性, 高密度脂蛋白粒子 | % 线性, LDL 微粒 | % 线性, 高密度脂蛋白粒子 | % 线性, LDL 微粒 | % 线性, 高密度脂蛋白粒子 | % 线性, LDL 微粒 | % 线性, 高密度脂蛋白粒子 | % 线性, LDL 微粒 | % 线性, 高密度脂蛋白粒子 | |
| PNDS-01 | 1.73 | 45。2 | 0.81 | 18。1 | 0.61 | 16。1 | 0.59 | 13。9 | 2.26 | 33。6 |
| PNDS-02 | 2.86 | 35。9 | 1.26 | 30。9 | 1.27 | 22。7 | 0.73 | 15。2 | 3.03 | 37。7 |
| PNDS-03 | 2.04 | 35。8 | 0.87 | 4.82 | 1.02 | 4.14 | 0.36 | 3.06 | 0.45 | 9.57 |
| PNDS-04 | 2.56 | 32。9 | 1.15 | 21。8 | 1.12 | 18。6 | 0.77 | 17。2 | 3.37 | 36。5 |
| PNDS-05 | 0.42 | 29。2 | 0.24 | 5.62 | 0.22 | 8.72 | 0.16 | 9.91 | 0.35 | 22。2 |
| PNDS-06 | 1。8 | 28。1 | 0。4 | 16。8 | 0.62 | 15 | 0.42 | 9.27 | 2.28 | 38。4 |
| PNDS-07 | 1。8 | 26。5 | 0.85 | 10。5 | 1.18 | 19。9 | 0.62 | 7.32 | 1.29 | 23。4 |
| PNDS-08 | 0.98 | 22。8 | 0.86 | 7.28 | 1.55 | 10。2 | 0.14 | 5.98 | 0.59 | 13。3 |
| PNDS-09 | 3.87 | 22。1 | 1.98 | 9.56 | 1.87 | 10。3 | 1.46 | 7.96 | 2.86 | 9.88 |
| PNDS-10 | 4.46 | 21。9 | 2.57 | 13。6 | 4.04 | 17。1 | 2.28 | 11。9 | 0.71 | 25。7 |
| PNDS-11 | 1.57 | 19。2 | 1.15 | 9.24 | 1.37 | 6.98 | 0.74 | 5.03 | 1.37 | 16 |
| PNDS-12 | 1.06 | 16。7 | 0.66 | 4.38 | 0。7 | 4.74 | 0.99 | 6.36 | 1.14 | 4.73 |
| PNDS-13 | 4.85 | 16。6 | 1.28 | 30。4 | 1。4 | 32。6 | 0。8 | 16。6 | 4.02 | 31 |
| PNDS-14 | 2.08 | 16 | 0.68 | 15。4 | 0.64 | 16。5 | 1.97 | 10。2 | 1.25 | 20.11 |
| PNDS-15 | 1。5 | 11。9 | 1.14 | 13。3 | 1.21 | 11。4 | 0。8 | 6.12 | 1.38 | 4.59 |
| PNDS-16 | 1.82 | 10。4 | 2.04 | 9.59 | 1.24 | 5.62 | 0.91 | 5.38 | 1.31 | 7.61 |
| PNDS-17 | 1.05 | 10。3 | 1.02 | 4。7 | 1.78 | 15。1 | 0.93 | 7.81 | 1.27 | 13 |
| PNDS-18 | 1.11 | 8.76 | 0.54 | 3.68 | 0.61 | 3.51 | 1.01 | 5.03 | 1.02 | 6.69 |
| PNDS-19 | 1 | 8.52 | 0.75 | 6.67 | 0.76 | 5.86 | 0.91 | 8.36 | 1.22 | 11。9 |
| PNDS-20 | 3.54 | 7.92 | 3.78 | 12 | 3.56 | 5.81 | 3.28 | 8.28 | 3.44 | 12。3 |
| PNDS-21 | 1.88 | 7.69 | 2.12 | 11。4 | 1.73 | 9.54 | 1.77 | 8.34 | 2.32 | 16。7 |
| PNDS-22 | 1.64 | 7.17 | 0.35 | 5.75 | 0.56 | 13。2 | 0.14 | 4.33 | 1.23 | 17。8 |
| PNDS-23 | 1.54 | 6.27 | 1.25 | 7.24 | 1.02 | 6.12 | 0.73 | 3.58 | 1.42 | 6.69 |
| PNDS-24 | 0.53 | 6.22 | 0.52 | 4.49 | 0.91 | 5.57 | 0.54 | 4.01 | 0.65 | 10。5 |
| PNDS-25 | 2.97 | 5。1 | 1.59 | 11 | 1.88 | 9 | 1.03 | 6.54 | 2.61 | 29。1 |
表 1: 在斑块阵列检测中血脂异常血清样本的筛选显示降脂药物的差异作用.与没有药物的控制 (专栏 2, 3), 血清样品孵育与替 (专栏 4, 5), 洛伐他汀 (专栏 6, 7), 辛伐他汀 (专栏 8, 9) 和烟酸 (专栏 10, 11) 显示了变化在诱导线性型 LDL 和高密度脂蛋白胆固醇粒子形成。
| 血清 ID | 无药 | 与替 | 与洛伐他汀 | 与辛伐他汀 | 与烟酸 | |||||
| % 线性, LDL 微粒 | % 线性, 高密度脂蛋白粒子 | % 线性, LDL 微粒 | % 线性, 高密度脂蛋白粒子 | % 线性, LDL 微粒 | % 线性, 高密度脂蛋白粒子 | % 线性, LDL 微粒 | % 线性, 高密度脂蛋白粒子 | % 线性, LDL 微粒 | % 线性, 高密度脂蛋白粒子 | |
| PNAN-01 | 2.05 | 26。8 | 0.62 | 11。9 | 0.56 | 16。9 | 0.52 | 9.28 | 1。4 | 11。9 |
| PNAN-02 | 1.35 | 26。3 | 1.68 | 21。8 | 2.59 | 23。6 | 0.79 | 6.92 | 2.16 | 29。7 |
| PNAN-03 | 2。4 | |||||||||
表 2: 在斑块阵列检测中筛选年龄匹配的对照血清样本, 显示了降血脂药物的差异作用.与没有药物的控制 (专栏 2, 3), 血清样品孵育与替 (专栏 4, 5), 洛伐他汀 (专栏 6, 7), 辛伐他汀 (专栏 8, 9) 和烟酸 (专栏 10, 11) 显示了变化在诱导线性型 LDL 和高密度脂蛋白胆固醇粒子形成。
Discussion
一般而言, 血液循环中脂蛋白、LDL 和高密度脂蛋白胆固醇颗粒的分布和功能特性主要由代谢、遗传、流行病学、细胞和血浆因素决定22,23。在本研究中, 观察脂质修饰药物在缓冲液中的作用, 发现高脂溶性药物如替、洛伐他汀、辛伐他丁、阿托伐他汀等对胆固醇颗粒的形态具有较高的复杂性。与高亲水性他和氟伐他汀药物的低水平效果比较。这些结果与我们以前的研究很好地一致, 描述了酶机制的作用, 他汀类药物在调节 LDL 和高密度脂蛋白胆固醇颗粒形成的缓冲和血清样本21。因此, 本研究的结果揭示了替、烟酸、贝特和 omega-3 脂肪酸药物的酶作用机制, 可能在调节胆固醇颗粒的形成中起直接影响。药物和胆固醇聚合体之间的相互作用可能导致大尺寸胆固醇颗粒的组装, 这些微粒是 2-60 µm2, 表现出球状和线性的链状形态。
此外, 使用纯化的脂蛋白粒子的结果表明, 胆固醇聚集物与血浆因子之间的相互作用, 包括脂蛋白、LDL 和高密度脂蛋白蛋白, 可能改变胆固醇的组成和形态特征。粒子.与纯化的脂蛋白微粒有关的药物治疗结果表明, 脂蛋白颗粒形成的药物效应与其对 LDL 胆固醇颗粒形成的效果相比有较高的水平。以洛伐他汀、辛伐他丁和替药物作为 pro-drugs, 其在测定中的用量可能高于生理浓度。
有趣的是, 血清样本的筛选显示, 药物对改变脂蛋白、ldl 和高密度脂蛋白胆固醇颗粒形成的影响不同, 特别是对线性型 ldl 和高密度脂蛋白粒子的影响。这些药物诱导减少的线性型 LDL 和高密度脂蛋白胆固醇颗粒形成的血脂异常和年龄匹配的正常血清样本。在辛伐他汀、替、洛伐他汀和烟酸中, 对减少线状颗粒形成的药物效应较高。在正常和血脂异常血清样品中, 用球状和线性链状形态识别胆固醇颗粒, 表明具有相似形貌的颗粒可能在体内条件下形成。先前的研究已经确定了在人的动脉粥样硬化斑块和载脂蛋白- -和 LDLR-小鼠模型24,25,26的存在椎间盘和针状胆固醇晶体,27,28。
血液中的高密度脂蛋白粒子作为一种非均质混合物存在, 且体积小、体积大的高密度脂蛋白粒子随着功能活动的进行, 是通过逆向胆固醇转运发挥其心保护作用的重要因素路径29,30。最近的研究强调了确定高密度脂蛋白胆固醇颗粒亚的重要性, 以阐明它们在多种生物功能中的作用, 如胆固醇外流、抗炎、血栓和抗氧化性31.此外, 一些研究报告了降脂治疗在血浆中增加低至中度高密度脂蛋白的作用1,5,21。因此, 本研究的结果为胆固醇颗粒的形态特征提供了新的见解。值得注意的是, 在血脂异常患者的血清样本中检测到更高水平的线性形状的高密度脂蛋白胆固醇颗粒, 表明它们可能是诊断和评价脂质修饰药物的可靠的生物标志物。然而, 需要进一步的调查, 使用大型临床标本, 以更好地了解不同形态的胆固醇颗粒和它们的关联与 CVD。
在检测药物对胆固醇颗粒组装的影响的斑块检测中, 我们使用了2µg 的荧光标记的胆固醇总量和5µgof 每种药物, 因为: (1) 药物具有竞争性的结合荧光标记的胆固醇和血清样品中的内源性脂质;(2) 从每个样本, 我们获得5000到1万的胆固醇微粒组装成大尺寸和形状范围从〜 2-60 µ2;(3) 我们观察到与药物一起孵育的血清样本 (剂量 300 ng 至5µg) 和 ~ 1-5% 的药物反应在高剂量孵育的情况下有很大的变化, 在胆固醇颗粒形成的剖面上没有发现可检测的变化;(4) 胆固醇聚集物与降脂药物的相互作用由酶过程介导。因此, 测定试剂的浓度可能高于其生理水平。
总之, 我们已经成功地证明了一个体外成像方法的优点, 这项研究中描述了广泛的降脂药物对胆固醇的调节形态和组成的影响。粒子.利用图像分析算法对脂质颗粒的形态进行可视化和定量化的方法, 可能有助于动脉粥样硬化的诊断和评价降脂治疗的效果。
Disclosures
Dr. Madasamy 获得了 Plaxgen 公司的赠款支持, 并具有竞争性的财务利益。其他作者没有任何竞争的金融利益透露。
Acknowledgments
这项工作是由一个 Plaxgen 研究补助金授予 SM (PLX-1008)。我们感谢帕洛阿尔托医学研究基金会研究机构在 IRB 的批准下收集动脉粥样硬化患者的血清样本。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TopFluor fluorescent cholesterol | Avanti Polar lipids | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| simvastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| lovastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| rosuvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| atorvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| fluvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| ezetimibe (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| Niacin | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| fibrate | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| omega-3 fatty acid | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
| purified VLDL proteins/particles | Lee Bio | ||
| purified LDL proteins/particles | Lee Bio | ||
| purified HDL proteins/particles | Lee Bio | ||
| Human age-matched serum | Dx Biosamples | ||
| Human atherosclerosis serum | Bioserve | ||
| Human normal serum | Stanford Blood center | ||
| LDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
| HDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
| Total cholesterol measurment | Roche Diangostics | ||
| 96-well microtitre plates | |||
| Triglycerides measurement | Roche Diangostics | ||
| Amnis Imaging Flow cytometer | Amnis Inc | ||
| IDEAS image analysing software | Amnis Inc | ||
| Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 | Awarness Technology | ||
| Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 | Roche Diangostics |
References
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