Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren zur Kennzeichnung einzelner Boten-RNA (mRNA) Abschriften mit Fluoreszent-markierten DNA-Sonden für den Einsatz in Einzelmolekül-Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SmFISH) Experimente in E. Coli. SmFISH ist eine Visualisierungsmethode, die erlaubt die simultane Detektion, Lokalisierung und Quantifizierung der einzelnen mRNA-Moleküle in festen Einzelzellen.
Abstract
Eine Methode wird zur Kennzeichnung einzelner Boten-RNA (mRNA) Transkripte in festen Bakterien für den Einsatz in Einzelmolekül-Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SmFISH) Experimente in E. Colibeschrieben. SmFISH ermöglicht die Messung von Zelle zu Zelle Variabilität mRNA Kopie Zahl der Gene von Interesse, sowie die subzelluläre Lage der Transkripte. Die wichtigsten Schritte sind Fixierung der Bakterienzelle Kultur, Permeabilisierung von Zellmembranen und Hybridisierung der Ziel-Abschriften mit Sätzen von im Handel erhältlichen kurzen Eindringmittel beschriftet Oligonukleotid Sonden. SmFISH können die Bildgebung der Abschriften von mehreren Genen in der gleichen Zelle mit Beschränkungen durch die spektrale Überlappung zwischen verschiedenen fluoreszierenden Marker. Nach Abschluss des Protokolls unten dargestellt können Zellen leicht unter Verwendung eines Mikroskops, gekoppelt mit einer Kamera geeignet für niedrigen Fluoreszenz abgebildet werden. Diese Bilder, zusammen mit der Zelle Konturen aus Segmentierung der Phase Kontrast Frames oder dem Zellmembran beflecken, erlauben die Berechnung der mRNA Kopie Nummer Verteilung einer Stichprobe von Zellen unter Verwendung von Open-Source oder individuell geschriebenen Software. Die hier beschriebene Kennzeichnung Methode kann auch auf Bild-Protokolle mit stochastischen optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm) angewendet werden.
Introduction
SCND ist ein grundlegender und unvermeidbare Aspekt der Genexpression und gibt Anlass zu Zellezelle Heterogenität1, sowohl auf der Ebene der Transkripte und Proteine,2,3. Quantifizierung der Variabilität zwischen den Zellen unter genau definierten Bedingungen bietet ein einzigartiges Fenster in die grundlegenden Prozesse, die Genexpression und seine Verordnung zugrunde liegen. Eine wichtige Quelle von Zell-Zell-Heterogenität in Bakterien erfolgt auf transkriptioneller Ebene. Transkript Zahlen variieren nicht nur durch SCND der Transkription, aber auch posttranskriptionale Prozesse wie Verordnung durch kleine RNAs und RNAases2. Eine Möglichkeit der direkten Zugriff auf diese Heterogenität quantitativ ist durch das Eindringmittel markieren einzelner Protokolle eines bestimmten Gens in SmFISH. Diese Methodik ermöglicht die Erkennung und subzelluläre Lokalisierung von bestimmten RNA-Moleküle in fix, einzelne bakterielle Zellen4. mRNAs sind mit einer Reihe von Eindringmittel beschriftet ~ 20 Basis-lange Oligonukleotide hybridisiert, die entworfen sind, um selektiv binden, Abschriften von Interesse5,6. Erkennung über Hintergrundfluoreszenz gewährleistet mehrere Kennzeichnung und einzelner mRNA-Moleküle erscheinen als Beugung begrenzte Flecken unter einem Fluoreszenz-Mikroskop7 (Siehe Abbildung 1). Es gibt weitere Ansätze für die Kennzeichnung von mRNA-Moleküle, in denen die ergänzenden Oligomer-Sonden konjugierte Haptens (z.B., Biotin oder Digoxigenin) tragen, die mit sekundären Eindringmittel beschriftet Reporter Techniken8erkannt werden.
Es gibt andere Methoden, die quantitative Informationen über Transkripte, neben SmFISH. Einige, wie die Northern blot oder quantitative PCR, Sonde die Masse und damit weder die Anzahl der Kopien der mRNA noch ihre Position in den einzelnen Zellen messen können. Diese Methoden eignen sich daher nicht zur Quantifizierung von Zelle zu Zelle Variabilität. Eine aktuelle Image-basierte Technik, die erlaubt die Quantifizierung der Kopienzahl des RNAs in den Zellen sowie deren intrazelluläre Ort namens gemultiplext Fehler-robuste Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (MERFISHS) wurde entwickelt. MERFISHS basiert auf der Zuordnung der einen eindeutigen Barcode, bestehend aus einer definierten Kombination aus einer festen Anzahl von Eindringmittel-markierten Oligonukleotid Sonden. Diese Barcodes werden in sequentiellen runden SmFISH Messungen ausgelesen, mit Immunofluoreszenz Runde nach jedem der Hybridisierung, dadurch Erhöhung des Durchsatzes um zwei Größenordnungen9,10. Diese Technik erfordert eine automatisierte Fluid handling System und die richtige Gestaltung der eingestellten Sonde.
Die Kombination von mehreren Fluoreszenz Kennzeichnung der einzelnen Transkripte, zusammen mit neuartigen Höchstauflösung Techniken wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm)11, ermöglicht eine zehnfache Erhöhung der Auflösung in der subzelluläre Lokalisation der Transkripte. Im Sturm kann eine geeignete Kombination von fluoreszierenden Sonden und bildgebenden Puffer für mehrere Zyklen der Fluoreszenzemission pro Sondenmolekül (blinkend). Sturm kann auch verwendet werden, Bild E. Coli Transkriptoms und Genom-weite räumliche Organisation der RNA, indem Sie gleichzeitig alle Transkripte von Interesse12beschriften zu beobachten.
Die einzelligen Methoden überprüft oben basieren auf imaging-Transkripte in festen Zellen. Daher bieten sie keine Informationen bezüglich der kinetischen Eigenschaften der Transkripte in den Zellen. Transkripte in lebenden Zellen13folgen, können die mRNAs durch die Fusion des Gens von Interesse auf ein Array von Bindungsstellen beschriftet werden. Letztere werden dann durch eine RNA-bindende Protein, wie den Bakteriophagen MS2 Hüllprotein, die zu einem fluoreszierenden Protein wie das grün fluoreszierende Protein (GFP)10,14,15verschmolzen ist erkannt.
Hier beschreiben wir eine Methode zur Kennzeichnung einzelner mRNAs mit einer Reihe von Eindringmittel-markierten DNA-Sonden für SmFISH Experimente, insbesondere in E. Coli. Darüber hinaus zeigen wir, dass die gleiche Kennzeichnung Schema für Sturm Messungen mit geringfügigen Modifikationen verwendet werden kann.
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Protocol
1. Probe Design
Hinweis: Dieses Protokoll verwendet handelsübliche Oligonukleotid Sonden bereits mit dem Stichwort Fluorophore. Die Sonden bestehen aus einer Reihe von spezifischen Sequenzen komplementär zu einem Ziel mRNA, jede Sonde, fluoreszierendes Molekül konjugiert wird. Alternativ ist es möglich, Sonden, fluoreszierenden Marker beimessen, wie an anderer Stelle beschrieben,5,16.
- Design SmFISH Sonden mit Hilfe der Sonde Designer16 Algorithmus entwickelt von Arjun Raj (van Oudenaarden Lab, Massachusetts Institute of Technology); Sequenzen von SmFISH Sonden verwendet in dieser Handschrift sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.
Hinweis: Die minimale Anzahl von Proben in einem Satz für ein nachweisbares Signal ist ~ 30. Die genaue Anzahl variieren je nach das gen des Interesses, insbesondere dann, wenn sehr kurze Transkripte gemessen werden. - Wählen Sie einen Farbstoff, der der optische Aufbau passt (siehe Tabelle der Materialien).
Hinweis: Der Cy3 Farbstoff oder ein optisch gleichwertig Farbstoff mit einer geringen Anfälligkeit für Foto-bleaching wird dringend empfohlen. Ein Kandidat für die doppelte Beschriftung ist Cy5 oder ein optisch entspricht (siehe Tabelle der Materialien) zu färben. Geeigneter Farbstoffe für Sturm Bildgebung der beschrifteten mRNA zeichnen sich durch ihre Kapazität für mehrere Zyklen der Fluoreszenzemission. Einige SmFISH Farbstoffe können verwendet werden für die Sturm-Bildgebung (siehe Tabelle der Materialien). Um zwei (oder mehr) Abschriften verschiedener Gene in der gleichen Zelle entsprechend Bild, sollte man Oligonukleotid Sonden konjugiert, Farbstoffe, deren Spektren wenig oder gar keine Überlappung haben, wählen.
2. Reagenz Vorbereitung
Hinweis: Es ist wichtig, die RNAse-freie Proben zu halten mit RNase-freie Verbrauchsmaterialien wie gefilterte Pipettenspitzen und Röhren und jede Arbeitsumgebung sauber zu halten. Zur Vermeidung von Abbau der Ziel-Transkripte müssen alle Reagenzien nach Zelle Fixierung Nuklease-frei sein (siehe Tabelle der Materialien) oder Diethylpyrocarbonate (DEPC)-behandelt und sterilisiert.
- Puffer für smFISH
- RNase-freie 1 X PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, Lösung mit einem Phosphat-Puffer-Konzentration von 0,01 M und eine Natrium-Chlorid-Konzentration von 0,154 M, (pH-Wert 7,4)) vorzubereiten. RNase-freie 10 X PBS verdünnen (siehe Tabelle der Materialien) in Nuklease-freie Wasser (siehe Tabelle der Materialien), bei einem 01:10 V/V-Verhältnis.
- Alternativ bereiten DEPC-behandeltem 1 x PBS.
- Bereiten Sie RNase-freie 2 X SSC (Kochsalzlösung Natriumcitrat Puffer, 0,3 M NaCl in 0,03 M Natriumcitrat (pH 7,0)). Verdünnen Sie RNase-freie 20 X SSC (siehe Tabelle der Materialien) in Nuklease-freies Wasser bei einem 01:10 V/V-Verhältnis.
- Alternativ bereiten DEPC-behandeltem 2 X SSC.
- RNase-freie 1 X PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, Lösung mit einem Phosphat-Puffer-Konzentration von 0,01 M und eine Natrium-Chlorid-Konzentration von 0,154 M, (pH-Wert 7,4)) vorzubereiten. RNase-freie 10 X PBS verdünnen (siehe Tabelle der Materialien) in Nuklease-freie Wasser (siehe Tabelle der Materialien), bei einem 01:10 V/V-Verhältnis.
- Oligonukleotid-Sonde-Stammlösung.
- Wieder lösen sich die getrockneten Oligonukleotid Sonde Mischung in 200 µL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) erstelle ich einen Sonde bestand von 25 µM. Mix gut durch Pipettieren rauf und runter und dann Wirbel und Zentrifuge kurz.
- Einfrieren und Auftauen der Stammlösung Röhre damit nicht, mehrere Aliquote der Vorratslösung, entsprechend dem Betrag voraussichtlich in einem einzigen experimentellen laufen verwendet werden. Die Stammlösung bei-20 ° C oder darunter lagern und vor Licht schützen.
Hinweis: Eine Sonde 5 Nmol können bis zu 250 Hybridisierung Reaktionen bereitstellen.
- Hybridisierung Puffer (nach Skinner Et al. ( 7 ):
- Eine 50 mL Polypropylen konischen Boden Tube 5 mL Nuklease-freies Wasser hinzufügen. 1 g Dextran Sulfat, das Wasser und durch kräftig aufschütteln auflösen. Mischen Sie den Inhalt in einem Orbitalschüttler, bis Bläschen verschwinden (~ 30 min).
- Fügen Sie zu der Lösung 3.530 µL deionisiertes Formamid, 10 mg von E. Coli tRNA, 1 mL 20 x SSC, 100 µL 200 mM Vanadyl-Ribonucleoside komplex und 40 µL von 50 mg/mL BSA. Bringen Sie dem Endvolumen bis 10 mL durch Zugabe von DEPC-behandeltem Wasser oder Nuklease-freies Wasser und Wirbel die Lösung bis sie homogen ist.
Hinweis: Zur Vermeidung von Einfrieren und Auftauen der Lösung stellen Sie mehrere Aliquote der Vorratslösung, entsprechend dem Betrag voraussichtlich in einem einzigen experimentellen laufen verwendet werden. Speichern der Stammlösung bei-20 ° C. Achten Sie darauf, die warme Raumtemperatur Formamid lassen vor dem Öffnen der Flaschenhals. Um den Hintergrund zu reduzieren, wird empfohlen, um die optimale Formamid-Konzentration (10-40 % V/V-Verhältnis) zu kalibrieren.
Vorsicht: WARNUNG! Formamid ist hochgiftig und bekannten Teratogen. Vermeiden Sie den Kontakt mit Augen oder Haut, Einatmen oder Verschlucken. Behandeln Sie es unter einem Abzug während des Tragens ein Laborkittel und Schutzhandschuhe. - Sterilisieren Sie die Lösung, indem man es durch einen 0,22-µm-Filter. Halten Sie in Aliquote und bei-20 ° C bis zu einem Jahr speichern.
- Fixierung-Puffer (4,6 % Formaldehyd in 1 X PBS) durch Zugabe von Formaldehyd 37 % (V/V), 1 X PBS vorzubereiten (siehe 2.1.1) zu einem 1:8 V/V-Verhältnis und Wirbel.
ACHTUNG: WARNUNG! Formaldehyd ist hochgiftig und ein bekanntes Karzinogen. Behandeln Sie es unter einem Abzug während des Tragens ein Laborkittel und Schutzhandschuhe. - SmFISH Waschpuffer vorbereiten (20 % Formamid in 2 X SSC) durch Zugabe von entionisiertem Formamid, 2 X SSC (siehe 2.1.2) eine 1:4 V/V-Verhältnis und Wirbel.
- SmFISH imaging Puffer vorbereiten, durch Zugabe von 5 mM Cysteamin und Sauerstoff Radikalfänger (7 µM Glukose-Oxidase, 56 nM Katalase und 10 % Glukose (w/V)) Puffer zu waschen (20 % Formamid in 2 X SSC)
- Puffer für Sturm
- Bereiten Sie Puffer A Nuklease-freies Wasser 50 mM Tris-HCl und 10 mM NaCl hinzufügen.
Hinweis: Shop bei RT seit Jahren. - Bereiten Sie Puffer B durch Zugabe von 50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl und 10 % w/V Glukose Nuklease-freies Wasser.
Hinweis: Shop bei 4 ° C bis zu einem Jahr. - Bereiten Sie MEA-Puffer durch Auflösen von Cysteamin 77 mg in 1 mL Puffer A (macht eine 1 M Lösung vor).
Hinweis: Es kann bei 4 ° C für 1 Monat gespeichert werden. - Gloxy Puffer durch Zugabe von 8.440 AU (willkürliche Einheiten) Glukose-Oxidase vorzubereiten und 70.200 AU Katalase zu 1 mL Puffer A.
Hinweis: Macht 50 x-Stammlösung, es kann 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden. - Bereiten Sie imaging Puffer für Sturm durch Zugabe von 50 mM von MEA Puffer und 1 x Gloxy Puffer an Puffer B.
Hinweis: Der bildgebende Puffer für Sturm besteht aus 5 mM Cysteamin Sauerstofffänger (7 µM-Glukose-Oxidase und 56 nM Katalase) in 50 mM Tris mit 10 mM NaCl und Glukose 10 % bei pH 8,0. Bereiten Sie kurz vor Bildgebung, gespeichert und für ca. 2 h bei RT verwendet werden können.
- Bereiten Sie Puffer A Nuklease-freies Wasser 50 mM Tris-HCl und 10 mM NaCl hinzufügen.
3. Probe Fixierung
- Wachsen Sie (z.B. E. Bakterienzellen
Hinweis: Um den Hintergrund aufgrund der unspezifischen Bindung der Sonden zu bestimmen, sollten Messungen in einem Stamm, in dem das gen des Interesses gelöscht wurde, durchgeführt werden nach den gleichen Verfahren (siehe ΔGalk in Abbildung 1 und ΔSodB in, ( Abbildung 2).
Hinweis: Wenn die gewählte Mikroskop keine Phasenkontrast oder differential Interferenz Kontrast Fähigkeiten aufweist, E. Coli äußeren Membranen können beschriftet werden mit 2 μM lipophilen fluoreszierenden Marker (siehe Tabelle der Materialien), die sollte hinzugefügt werden, um die Bakteriensuspension 20 min vor der Fixierung17. Fixierung und weitere Behandlung erfolgt wie unten beschrieben. Darauf muss geachtet werden, wählen einen fluoreszierenden Marker haben eine unterschiedliche Emissionsspektrum der spektrale Überlappung mit dem Satz mit der Bezeichnung Sonde zu minimieren.
4. Probe Permeabilisierung
- Entfernen Sie überstand vorsichtig. Verwenden Sie kleinvolumige Pipetten, falls erforderlich, um die Flüssigkeit außerhalb der Pellets zu entfernen.
- In 300 µL DEPC-behandeltem Wasser oder Nuklease-freies Wasser Aufschwemmen. Fügen Sie 350 µL hochwertige absoluten Ethanol (99 %) und durch invertieren das Rohr mischen Sie vorsichtig. Fügen Sie eine weitere 350 µL Ethanol und Mischung wieder, um eine endgültige Ethanolkonzentration von 70 % (V/V-Verhältnis) zu erreichen.
ACHTUNG: WARNUNG! Ethanol ist leicht entflammbar. - Drehen Sie die Probe mit einem Rohr-Rotator bei 20 u/min für 1 h bei Raumtemperatur (RT), oder über Nacht bei 4 ° C. Proben können bis zu einer Woche bei 4 ° C gelagert werden.
(5) Hybridisierung
- Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 750 X g, 7 min, 4 ° C. Entfernen Sie überstand.
- Fügen Sie 1 mL 20 % Puffer, um die Proben zu waschen und lassen stehen für mehrere Minuten oder Pipette das Pellet vollständig auflösen.
- Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 7 min. 750 X g, 4 ° C.
- Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren sehr vorsichtig. Verwenden Sie kleinvolumigen Pipetten, wenn notwendig, die Flüssigkeit außerhalb der Pellets zu entfernen.
- Fügen Sie die Oligonukleotid-Sonde Stammlösung auf die Hybridisierung Puffer aliquoten so einstellen, dass die endgültige Oligonukleotid-Konzentration 250 beträgt nM; Vortex kräftig.
Hinweis: Man kann zwei oder mehr unterschiedliche Zielgruppen mRNAs gleichzeitig in derselben Zelle beschriften. Die Hybridisierung Puffer Sonde Sätze der beiden Ziele hinzufügen. Vorsicht ist geboten, Farbstoffe mit unterschiedlichen Emissionsspektren zur Minimierung der spektralen Überlappung (z.B., Cy3 und Cy5) zu wählen. Stellen Sie sicher, dass Proben für den Sturm Bildgebung mit ein set für Sturm (z.B.in Tabelle Materialien) mit einem geeigneten Farbstoff konjugierte Oligonukleotid-Sonde hybridisiert sind. - Aussetzen Sie Proben (siehe Punkt 5.4) in 50 µL-Hybridisierung-Puffer, enthält die Oligonukleotid Sonden unter Vermeidung der Generation Blasen (die Lösung ist ziemlich viskos).
- Lassen Sie Proben über Nacht auf einem heißen Block bei 30 ° C im Dunkeln.
Hinweis: Im Anschluss daran können Proben für bis zu 6 Monate bei 4 ° c gelagert werden
6. Waschen
- Verwenden Sie eine neue Microcentrifuge Schlauch für jede Probe Bild. Fügen Sie 1 mL Waschpuffer.
- Die neue Röhre, die Waschpuffer und Mix/Wirbel enthält, fügen Sie 10-15 µL aus der hybridisierten Proben hinzu.
- Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 7 min., 750 X g bei 4 ° C. Entfernen Sie überstand.
Hinweis: Um Hintergrund zu verringern, Inkubation für 1 h bei 30 ° C. - Waschen zweimal mehr (in 1 mL Waschpuffer aufzuwirbeln, Zentrifugieren und Pellet zu entfernen).
- In 25 µL Waschpuffer aufzuwirbeln.
Hinweis: Um Foto-bleichen reduzieren kann die Waschpuffer einen Sauerstoff Aufräumvorgang System (2.6) zur Verbesserung der Stabilität der Farbstoff in Einzelmolekül-Fluoreszenz Experimente6hinzufügen.
7. Vorbereitung der Proben für die Bildgebung
Hinweis: Zellen müssen immobilisiert werden, um angemessene Bildgebung unter dem Fluoreszenz und Phasenkontrast-Mikroskop zu ermöglichen. Die folgenden Methoden können Proben vorzubereiten, in denen verschiedene Gesichtsfelder bei verschiedenen fokalen Ebenen abgebildet werden können.
- Agarose-Gel-Vorbereitung
- 10 mL 2 X SSC Puffer 150 mg Agarose hinzufügen. Fügen Sie 2 X SSC, Agarose, oder aber es wird nicht richtig auflösen.
- Mikrowelle für 10-15 s jedes Mal bis zum großen Luftblasen zu bilden beginnen. Beiseite stellen und für ein paar Minuten abkühlen lassen.
- Platzieren Sie einen trennenden Silikon-Rahmen auf der Folie, so dass das Dia Center ausgesetzt bleibt.
- Platzieren Sie eine 10 mm Breite (1-2 mm dick) starren Ring in der Mitte der Folie und hinterlegen Sie eine kleine Menge des Gels, zur Abdichtung zu. Warten Sie ein paar Minuten aushärten lassen.
- Fügen Sie mehr Gel, bis eine hohe Kuppel-Form gebildet wird. Warten Sie 10 Minuten dafür zu verhärten, und entfernen Sie den Ring (mit feinen Pinzette oder einer anderen Methode).
- Hinterlegen Sie ~ 10 μL der gewaschenen Bakterienzellen (siehe 6.5) auf das Gel und die Dichtung mit einer #0 Deckglas Folie.
- Kammer-Probenvorbereitung für die smFISH
- Alternativ (zum Schritt 7.1) Proben für die Bildgebung durch Immobilisierung der gewaschenen Bakterienzellen (siehe 6.5) auf Poly-D-Lysin-beschichtete Glas unten Einweg Kunststoff Petrischalen vorbereiten.
- Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln bei Raumtemperatur über Nacht vor Visualisierung Adhäsion der Zellen an der Oberfläche zu ermöglichen. Vor Visualisierung einmal waschen mit Waschpuffer (. 5); halten Sie die Probe nass mit buffer(2.5) oder Bildgebung Waschpuffer für SmFISH (2.6).
- Kammer-Probenvorbereitung für Sturm
- Proben für die Bildgebung auf Poly-D-Lysin-beschichtete Glas unten Einweg Kunststoff Petrischalen für Sturm vorbereiten.
- Inkubieren Sie die Proben in der Dunkelheit, bei RT, über Nacht. Vor dem Visualisierung Waschen einmal mit Waschpuffer für SmFISH (2,5); und bildgebenden Puffer für Sturm (2.7.5) hinzufügen.
8.Transkript-Visualisierung
- Bild-Zellen mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit einer motorisierten Bühne ausgestattet (siehe Tabelle der Materialien).
Hinweis: Verwenden Sie für Sturm Modifikation, Zellen mit einem Farbstoff in der Lage, mehrere Zyklen der Fluoreszenzemission beschriftet. Bild der Probe mittels 3D Super-Resolution imaging-System (z.B., siehe Tabelle der Materialien). - Einsatz (empfohlen) ein 60-100 x N.A > 1.3 Öl eintauchen Phase Kontrast Objektiv mit einer starken Lichtquelle, z. B. Quecksilber oder Metalldampflampen Lampe; LED-basierte Lichtquellen sind ebenfalls empfehlenswert.
- Verwendung eine Norm CCD-Kamera, ideal für Low-Light Level Bildgebung statt Geschwindigkeit gekühlte (wir verwenden eine Kamera mit 16 µm Pixelgröße) optimiert (siehe Tabelle der Materialien).
Hinweis: Die Verwendung von einem gekühlten EMCCD (Elektron Multiplikation Ladegerät gekoppelt) Kamera CCD Kamera ist notwendig, thermisches Rauschen zu reduzieren, die Erkennung, insbesondere von einzelnen Molekülen verhindert. - Filter verwenden setzt für die Fluorophore gewählt.
- Um Zellengrenzen richtig zu bestimmen, Abrufen von Bildern von verschiedenen Gesichtsfelder in jeder Probe mit Phase Kontrast-Optik oder durch Kennzeichnung Eindringmittel der äußeren Zellmembran. Abrufen von Bildern zu verschiedenen fokalen Ebenen (Z-Stack) für alle Kanäle (in der Regel 13 Scheiben getrennt von 250 nm stammen).
Hinweis: Sollte der motorisierte Teil das Mikroskop und die Filtersätze von kommerziellen gesteuert werden (siehe Tabelle der Materialien) oder interne Software, die einen Stapel Bilder nacheinander erfasst werden kann.
9. die Datenanalyse
- Konvertieren Sie die Bild-Stacks in ein geeignetes Format für die Datenanalyse.
- Schätzen Sie die Kopienzahl des Ziels mRNA aus die Gesamtintensität der fluoreszierenden Brennpunkte in der Zelle und nicht aus diskrete "Flecken" wie in anderen derzeit verfügbaren Protokolle zu zählen.
- Bildanalyse mit Open-Source-Software18 oder mit einem maßgeschneiderten Programm durchführen. Zur Datensicherung und Analyse siehe Skinner Et al. 7
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Representative Results
Wir durchgeführt, SmFISH Messungen der GalK und SodB Transkripte in E. Coli Zellen. Die Transkripte wurden mit einer Reihe von spezifischen Sequenzen ergänzen die Zielsequenz, jede Sonde wird konjugiert, fluoreszierendes Molekül hybridisiert (siehe Tabelle der Materialien). Fluoreszenz und Phase Kontrast Bilder von Wildtyp-MG1655 E. Coli -Stamm (WT) oder eine JW0740 (Keio Sammlung)19 GalK gelöscht Belastung (ΔGalK) ausgesetzt waren, bis 2 mM D-Fucose sind in Abbildung 1A und 1 bdargestellt. Zellen wurden mindestens 3 h nach Exposition gegenüber D-Fucose fixiert. Die Paneele in Figur 1A (oben) zeigen einen Frame aus 13, entspricht die Höhe bei der Zelle Konturen im Fokus, was dem Niveau der GalK Induktion als Reaktion auf Variablen extrazelluläre D-Fucose Konzentrationen sind. Flecken innerhalb der Zellen in den Fluoreszenz-Bildern entsprechen entweder einzelne oder wenige Galk-Transkripte und der Bestimmung der Abschrift Anzahl in jeder Zelle erfolgt durch lokalisierte Fluoreszenz zu quantifizieren. Zahlreiche Orte sind in den meisten Zellen gesehen, wenn die Bakterienkultur 2 mM D-Fucose hinzugefügt wird, während ein paar Flecken in der Abwesenheit von extrazellulären D-Fucose gesehen werden. In der ΔGalK Belastung sind keine Flecken über dem Hintergrund wie erwartet beobachtet. Oberfläche mit lipophilen fluoreszierenden Marker beschriften ist in Abbildung 1 b (unten) dargestellt.
Darüber hinaus abgebildet wir SodB Transkripte in E. Coli Bakterienkultur in LB-Medium in der logarithmischen Wachstumsphase gewachsen. Fluoreszenz und Phase kontrastreiche Bilder von SmFISH in WT oder eine JW1648 (Keio Sammlung)19 SodB gelöscht Stamm (ΔSodB) sind in Abbildung 2Adargestellt. Die Paneele in Abbildung 2A (oben) zeigen einen Frame aus 13, entspricht der Höhe, in welcher, die Zelle Konturen im Fokus, was dem Niveau der SodBsind. In der ΔSodB Belastung sind keine Flecken über dem Hintergrund wie erwartet beobachtet.
Die gleichen Kulturen wurden im Sturm (oben) abgebildet und die Umfänge der Zellen wurden mit Oberfläche Kennzeichnung mit einem lipophilen fluoreszierenden Marker um die Lokalisierung von SodB innerhalb der Zellen zu veranschaulichen bestimmt. Färbung der Membran ermöglicht die genaue Positionierung der Transkripte in der Zelle (Abb. 2 b). ΔSodB Stamm wurde aufgenommen, als das Hintergrundsignal und die minimale Clustergröße zu bestimmen (siehe Abbildung 2 b). Die mittlere Transkript-Anzahl der SmFISH2 und Sturm ist vergleichbar.
Abb. 1: Auswirkungen von D-Fucose auf GalK Transkripte visualisiert mit SmFISH. (A) Top: SmFISH Bilder der Fluoreszenz von GalK mRNA in einzelnen E. Coli Zellen. Ein MG1655 Wildtyp Stamm (WT) oder eine JW0740 (Keio Sammlung) GalK -geschnittene Stamm (ΔGalK)19 wurden gezüchtet, mit oder ohne 2 mM D-Fucose. Der GalK-Transkripte wurden zu komplementären Sonden konjugiert mit einem Farbstoff optisch gleichwertig Cy3 hybridisiert (siehe Tabelle der Materialien). Unten: gleiche Sichtfelder im Phasenkontrast. (B) WT-Zellen wurden gezüchtet, mit oder ohne 2 mM D-Fucose als oben und beschriftet mit 2 μM einer lipophile Membran färben (siehe Tabelle der Materialien) für 20 min vor der Fixierung. Oben: Fluoreszenzbilder der GalK mRNA mit SmFISH. Bilder wurden mit einem Mikroskop durch eine kommerzielle Software, die mit einem 100 × N.A 1,45 Öl eintauchen Phase Kontrast Objektiv gesteuert (siehe Tabelle der Materialien) und einer EMCCD Kamera (siehe Tabelle der Materialien). Die Filter verwendet wurden wie in der Tabelle der Materialien beschrieben. Eine Phase Kontrast Bild wurde aufgenommen, gefolgt von einem Z-Stapel von 13 Scheiben und 250 nm Abstand der fluoreszierenden Bilder mit 2 s Integrationszeit für jedes Segment. Mitte: gleiche Gesichtsfelder mit Phasenkontrast-Bildgebung. Unten: Zellen mit lipophilen fluoreszierenden Marker mit entsprechenden Filtern beschrieben in der Materialtabelle beschriftet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: der SodB Imaging Transkripte beschriftet mit der gleichen Sonde inmitten SmFISH und Sturm. (A) Top: SmFISH Bilder der Fluoreszenz von SodB mRNA in einzelnen E. Coli Zellen. Ein MG1655 Wildtyp Stamm (WT) oder eine JW1648 (Keio Sammlung) SodB -geschnittene Stamm (ΔSodB)19 wurden in LB-Medium angebaut. SodB Transkripte wurden hybridisiert zu komplementären Sonden konjugiert mit einem Farbstoff Cy5 optisch entspricht (siehe Tabelle der Materialien). Unten: gleiche Sichtfelder im Phasenkontrast. (B) Überlagerung von fluoreszierenden Molekülen (einzelne farbige Punkte) lokalisiert im Sturm (670 nm Emission) und eine Momentaufnahme der Zellmembranen im gleichen Sichtfeld. Die Zellen wurden beschriftet mit einem lipophile Farbstoff, begeistert mit einem Argonlaser bei 488 nm bei 1 % der maximalen Leistung (0,05 kW/cm2) mit einer Emission Peak bei 510 nm und mit den entsprechenden Filtern (siehe Tabelle der Materialien). WT und SodB Zellen waren gewachsen, wie oben beschrieben und beschriftet mit 2 μM lipophile Membran färben (siehe Tabelle der Materialien) für 20 min vor der Fixierung. Super-Resolution-Bilder wurden mit einem kommerziellen Mikroskop aufgenommen (siehe Tabelle der Materialien). Transkripte, gekennzeichnet mit einem Farbstoff optisch gleichwertig Cy5 wurden lokalisiert, mit einem Laser Erregung bei 647 nm in einem bildgebenden Puffer für Sturm. Bilder wurden aufgenommen mit einer 60 X, NA 1.2 Wasser eintauchen Ziel (siehe Tabelle der Materialien) und einer EMCCD Kamera (siehe Tabelle der Materialien) mit Gewinn auf 50 gesetzt, Bildrate bei 50Hz und maximale Leistung 647 und 405 nm-Laser, die am 5 und 0,05 kW/cm2 , beziehungsweise. Die Gesamtzahl der Frames erworben wurde 8.000. Daten wurde mit Hilfe kommerziellen Software analysiert (siehe Materialtabelle). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Wir haben in unserem Labor die Abschrift Anzahl verschiedener Gene in E. Coli Zellen mittels der SmFISH Methode2gemessen. Kurz gesagt, dieses Verfahren besteht aus den folgenden Schritten: Zelle Fixierung, Permeabilisierung der Membranen für Sonde eindringen ermöglichen Sonde Hybridisierung und Bildgebung mit einem standard Fluoreszenzmikroskop zu probieren. Dieses Verfahren beruht auf früher veröffentlichte, mit einigen Modifikationen6,7,16. Es wurde zuvor berichtet, dass das SmFISH erfordert, dass die Anzahl der Oligonukleotid Sonden im Bereich von 48-72, liegen, um ein Signal liegen deutlich über dem Hintergrund7zu erreichen. Wir haben gezeigt, dass diese Zahl tatsächlich kleiner20, abhängig von der Gensequenz der Zinsen, der optische Aufbau und bestimmten experimentellen Bedingungen sein kann.
Jede Sonde sollte 17-22 Nukleotide lang, mit einer inter-Sonde Trennung von mindestens zwei Nukleotide und einem GC-Gehalt von ~ 45 %, um die Auswirkungen von unspezifischen, Ziel verbindlich. Einige Sonden können fehlschlagen, um ein Ziel zu binden, und die Gesamteffizienz der Bindung kann durch Änderungen der experimentellen Verfahren wie die Bedingungen der Fixierung und Hybridisierung21optimiert werden. Ein wichtiger Faktor, der berücksichtigt werden muss ist die Wahl des Fluorophore. Es wird dringend empfohlen, die Sonden mit einem Farbstoff mit geringer Anfälligkeit für Foto-bleaching zu kennzeichnen. Foto-bleichen Minimierung kann durch Optimierung der Belichtungszeiten, Beleuchtung Quellen und Integrationszeiten der Bildaufnahme und durch die Zugabe von einem Sauerstoff Aufräumvorgang System erreicht werden.
Das Ausmaß der unspezifischen Bindung Ereignisse sollten SmFISH Experimente mit Zellen von Stämmen in welches, die, die Ziel Gene, zum Beispiel von der Keio Sammlung19 gelöscht werdenbeurteilt. Wenn das Hintergrundsignal hoch ist, die Anzahl und Dauer von Waschschritten sollte erhöht werden, oder Zellen in Waschpuffer bei 30 ° C für 1 h inkubiert und dann zweimal gewaschen werden sollte. Um den Hintergrund zu verringern, wird darüber hinaus vorgeschlagen, um die Formamid-Konzentration (10-40 % V/V-Verhältnis) in der Hybridisierung und die Wäsche-Puffer zu optimieren. Erhöhung der Konzentration von Formamid unspezifische Bindung reduziert, sondern kann auch eine Verringerung die Bindung der Sonden zum Ziel mRNA. Bei der Hybridisierung Schritt ist es wichtig, den Überstand vollständig zu entfernen; ein verdünnte Hybridisierung Puffer führt zu verringerte Effizienz Kennzeichnung. Darüber hinaus muss Ziel RNAs lang genug, um einen gut lokalisierten Platz über dem Hintergrund zu erhalten. Jüngsten Verbesserungen in der Signal-Rausch Verhältnis und verbindliche Spezifität durch Rückgrat Modifikation der Sonden jetzt machen es möglich, kürzere RNA zu erkennen Fragmente, wie eukaryotischen MicroRNAs oder bakterielle kleine nicht-kodierende RNAs2, 10. es wird empfohlen, dass die mittleren Kopienzahl erhalten durch SmFISH mit quantitativen PCR-7,16überprüft werden soll.
Wir haben in diesem Manuskript gezeigt, dass diese Methode mit geringfügigen Änderungen, die Lokalisierung der Transkripte in E. Coli mit höheren optischen Auflösung mit stochastischen optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm)11studieren geändert werden kann.
Zusammenfassend lässt sich sagen ist SmFISH eine vielseitige Methode für RNA-Beleuchtung, die die direkte Messung der Zell-Zell-Variabilität im Transkript Nummer und die Lokalisierung der Ziel-Transkripte in der Zelle, in Eukaryoten und Prokaryoten ermöglicht. Es liefert quantitative Informationen über grundlegende Prozesse der Genexpression und kann leicht für Sturm Bildgebung umgesetzt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch eine Israel Science Foundation Stipendium 514415 (j.s.) und eine BSF-NSF (MCB) Stipendium 2016707 (j.s.) unterstützt. Unterstützung von einem Siegfried und Irma Ullman Lehrstuhl (, j.s.) auch anerkannt wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker - Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen - Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 - 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24x60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
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| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
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References
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