Summary
Questo manoscritto descrive un metodo per l'etichettatura individuale RNA messaggero (mRNA) trascrizioni con sonde di DNA fluorescente etichettati, per l'uso in singola molecola fluorescenza in situ (smFISH) gli esperimenti di ibridazione in Escherichia coli. smFISH è un metodo di visualizzazione che permette la rilevazione simultanea, la localizzazione e quantificazione delle singole molecole di mRNA in singole celle fisse.
Abstract
Un metodo è descritto per l'etichettatura individuale RNA messaggero (mRNA) trascrizioni nei batteri fissi per l'utilizzo in singola molecola fluorescenza in situ (smFISH) gli esperimenti di ibridazione in Escherichia coli. smFISH permette la misura della cellula--cellula variabilità nel numero di copie di mRNA di geni di interesse, come pure la posizione subcellulare delle trascrizioni. I passi principali coinvolti sono fissazione di coltura delle cellule batteriche, la permeabilizzazione delle membrane cellulari e l'ibridazione delle trascrizioni destinazione con set di sonde del oligonucleotide fluorescente-etichetta breve disponibile in commercio. smFISH può consentire l'imaging delle trascrizioni di geni multipli nella stessa cella, con limitazioni imposte dalla sovrapposizione spettrale tra diversi marcatori fluorescenti. Dopo il completamento del protocollo illustrato di seguito, le cellule possono essere imaged prontamente usando un microscopio accoppiato con una macchina fotografica adatta a bassa intensità di fluorescenza. Queste immagini, insieme ai contorni delle cellule ottenute dalla segmentazione dei telai di contrasto di fase, o dalla colorazione della membrana cellulare, permettono il calcolo della distribuzione numerica mRNA copia di un campione di cellule utilizzando software open-source o personalizzato. Il metodo d'etichettatura descritto qui può essere applicato anche alle trascrizioni di immagine con microscopia di ricostruzione ottica stocastica (tempesta).
Introduction
Stocasticità è un aspetto fondamentale e inevitabile dell'espressione genica e dà luogo a cellula-cellula eterogeneità1, sia a livello di trascrizioni e proteine2,3. Quantificare la variabilità fra le cellule in condizioni ben definite offre una finestra unica i processi di base che sottendono l'espressione genica e sua regolazione. Una fonte importante di eterogeneità cellulare nei batteri avviene al livello trascrizionale. I numeri di trascrizione variano non solo dovuto la variabilità stocastica della trascrizione, ma anche ai processi post-trascrizionali come regolamento da piccolo RNAs e RNAases2. Un modo per accedere direttamente a questa eterogeneità in modo quantitativo è da fluorescente tagging trascrizioni individuale di un dato gene in smFISH. Questa metodologia consente il rilevamento e la localizzazione subcellulare di particolari molecole di RNA in fisso, singole cellule batteriche4. mRNAs sono ibridati con un insieme dei oligonucleotides base-lungo di ~ 20 fluorescente contrassegnati che sono progettato per legarsi selettivamente alle trascrizioni di interesse5,6. Etichettatura più assicura la rilevazione sopra fluorescenza di fondo, e singole molecole di mRNA appaiono come macchie di diffrazione limitata sotto un microscopio di fluorescenza7 (vedere Figura 1). Ci sono altri approcci per l'etichettatura di molecole di mRNA, in cui le sonde complementari oligomero trasportano apteni coniugati (ad es., biotina o digossigenina) che vengono rilevati utilizzando reporter fluorescente-etichetta secondaria tecniche8.
Ci sono altri metodi che forniscono informazioni quantitative sulla trascrizioni, oltre a smFISH. Alcuni, come la Northern blot o PCR quantitativa, la maggior parte della sonda e quindi in grado di misurare il numero di copie di mRNA né loro posizione in singole celle. Di conseguenza questi metodi non sono adatti per quantificare la variabilità della cellula--cellula. Una recente tecnica basata su immagine che permette per la quantificazione di sia il numero di copie di RNA all'interno delle cellule, nonché la loro posizione intracellulare, chiamato multiplexed errore-robusto fluorescenza in situ di ibridazione (MERFISH) è stata sviluppata. MERFISH è basato sull'assegnazione di un codice a barre univoco composto da una combinazione definita da un numero fisso di sonde del oligonucleotide fluorescente etichettati. Questi codici a barre vengono lette in turni sequenziale delle misure smFISH, con photobleaching dopo ogni turno di ibridazione, aumentando la velocità effettiva di due ordini di grandezza9,10. Questa tecnica richiede un fluidi automatizzato sistema e la corretta progettazione del set di sonda.
La combinazione di più fluorescenza etichettatura delle trascrizioni individuali, insieme alle tecniche di Super-risoluzione romanzo come stocastico ricostruzione ottica microscopia (tempesta)11, permette un aumento di dieci volte nella risoluzione nella localizzazione subcellulare delle trascrizioni. In tempesta, una combinazione adatta di sonde fluorescenti e imaging buffer consente cicli multipli di emissione di fluorescenza per molecola sonda (lampeggiante). TEMPESTA può essere utilizzato anche per immagine il trascrittoma di e. coli e osservare il genoma organizzazione spaziale del RNA, etichettando contemporaneamente tutte le trascrizioni di interesse12.
Tutti i metodi di cella singola recensione sopra si basano su trascrizioni in celle fisse di imaging. Quindi, non forniscono tutte le informazioni riguardanti le proprietà cinetiche di trascrizioni all'interno delle cellule. Per seguire le trascrizioni in cellule vive13, mRNAs possono essere contrassegnati tramite la fusione del gene di interesse in una matrice di siti di legame. Questi ultimi vengono poi riconosciuti da una RNA-proteina, quali il batteriofago MS2 proteina di cappotto, che si fonde ad una proteina fluorescente come ad esempio la proteina fluorescente verde (GFP)10,14,15.
Qui descriviamo un metodo per l'etichettatura di singoli mRNA con un set di sonde di DNA fluorescente contrassegnate, per uso negli esperimenti di smFISH, in particolare in e. coli. Inoltre, mostriamo che lo stesso schema di etichettatura può essere utilizzato per misure di tempesta con modifiche minori.
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Protocol
1. Design della sonda
Nota: Questo protocollo utilizza sonde del oligonucleotide disponibili in commercio già contrassegnati con fluorofori. Le sonde sono costituiti da un insieme di specifiche sequenze complementari ad un target mRNA, ogni sonda viene coniugato ad una singola molecola fluorescente. In alternativa, è possibile allegare marcatori fluorescenti per sonde, come descritto altrove5,16.
- Sonde di smFISH di progettazione utilizzando l'algoritmo di16 sonda Designer sviluppato da Rosasco (van Oudenaarden Lab, Massachusetts Institute of Technology); sequenze di smFISH sonde utilizzate in questo manoscritto sono elencati nella tabella dei materiali.
Nota: Il numero minimo di sonde in un set per un segnale rilevabile è ~ 30. Il numero esatto può variare secondo il gene di interesse, specialmente se molto breve trascrizioni sono misurate. - Scegliere un colorante che si adatta la configurazione ottica (Vedi tabella dei materiali).
Nota: La tintura di Cy3 o un colorante otticamente equivalente con una bassa sensibilità alle foto-candeggio è altamente consigliato. È un candidato per l'etichettatura dual Cy5 o un otticamente equivalente tingere (Vedi tabella dei materiali). Coloranti adatti per l'imaging di tempesta di mRNA con etichetta sono caratterizzati dalla loro capacità di cicli multipli di emissione di fluorescenza. Alcuni coloranti smFISH possono essere utilizzati per l'imaging di tempesta (Vedi tabella dei materiali). Per due (o più) trascrizioni corrispondenti ai diversi geni nella stessa cella di immagine, uno dovrebbe scegliere sonde del oligonucleotide coniugati a coloranti cui spettri hanno poca o nessuna sovrapposizione.
2. preparazione del reagente
Nota: È importante per mantenere i campioni RNAsi-libera utilizzando RNAsi-libera di materiali di consumo quali tubi e puntali filtrata e per mantenere qualsiasi ambiente di lavoro pulito. Al fine di evitare il degrado delle trascrizioni destinazione, tutti i reagenti utilizzati a seguito di fissazione delle cellule devono essere privo di nucleasi (Vedi tabella materiali) o dietilpirocarbonato (DEPC)-trattati e sterilizzati.
- Buffer per smFISH
- Preparare la RNAsi-libera 1X PBS (tamponato fosfato salino, soluzione con una concentrazione di tampone fosfato 0,01 m e una concentrazione di cloruro di sodio di 0,154 M, (pH 7.4)). Diluire la RNAsi-libera 10X PBS (Vedi tabella materiali) nucleasi-free acqua (Vedi tabella materiali) presso un 01:10 rapporto di v/v.
- In alternativa preparare trattata DEPC 1 x PBS.
- Preparare la RNAsi-libera 2 x SSC (buffer di salino-sodio citrato, 0,3 M di NaCl in citrato di sodio 0,03 M, (pH 7.0)). Diluire la RNAsi-libera 20 x SSC (Vedi tabella materiali) in acqua privo di nucleasi a un 01:10 rapporto di v/v.
- In alternativa, preparare 2 DEPC-trattati x SSC.
- Preparare la RNAsi-libera 1X PBS (tamponato fosfato salino, soluzione con una concentrazione di tampone fosfato 0,01 m e una concentrazione di cloruro di sodio di 0,154 M, (pH 7.4)). Diluire la RNAsi-libera 10X PBS (Vedi tabella materiali) nucleasi-free acqua (Vedi tabella materiali) presso un 01:10 rapporto di v/v.
- Soluzione madre di oligonucleotide sonda.
- Ri-sciogliere la miscela di sonda oligonucleotide essiccate in 200 µ l di buffer di TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) per creare uno stock di sonda di 25 µM. Mix bene di pipettaggio su e giù e poi vortex e centrifugare brevemente.
- Per evitare il congelamento e scongelamento del tubo soluzione di riserva, fare diverse aliquote della soluzione stock, corrispondente all'importo previsto per essere utilizzato in un singolo sperimentale eseguito. Conservare la soluzione di riserva a-20 ° C o inferiore e proteggerlo dalla luce.
Nota: Un set di sonda di nmol 5 può fornire fino a 250 reazioni di ibridazione.
- Tampone di ibridazione (a seguito di Skinner et al. 7 ):
- Aggiungere 5 mL di acqua privo di nucleasi a una provetta fondo conico in polipropilene da 50 mL. Aggiungere 1 g di solfato di destrano all'acqua e scioglierla nel Vortex vigorosa. Mescolare il contenuto in un agitatore orbitale fino a quando le bolle scompaiono (~ 30 min).
- Aggiungere la soluzione 3.530 µ l di formamide deionizzata, 10 mg di tRNA e. coli , 1 mL di 20x SSC, 100 µ l del complesso di vanadyl-ribonucleoside 200 mM e 40 µ l di 50 mg/mL BSA. Portare il volume finale di 10 mL con aggiunta di acqua trattata con DEPC o acqua priva di nucleasi e vortex la soluzione fino a quando è omogenea.
Nota: Per evitare di congelare e scongelare della soluzione, fare diverse aliquote della soluzione stock, corrispondente all'importo previsto per essere utilizzato in un singolo sperimentale eseguito. Conservare la soluzione di riserva a-20 ° C. Assicuratevi di lasciare la formammide calda a temperatura ambiente prima di aprire la bottiglia. Per ridurre lo sfondo, è suggerito per calibrare la concentrazione ottimale formammide (rapporto di 10-40% v/v).
Attenzione: ATTENZIONE! Formammide è altamente tossica e un noto teratogeno. Evitare il contatto con occhi o pelle, inalazione o ingestione. Gestirlo sotto cappa aspirante mentre indossa un camice da laboratorio e guanti protettivi. - Sterilizzare la soluzione facendolo passare attraverso un filtro da 0,22 µm. Tenere in aliquote e conservare a-20 ° C ad un anno.
- Preparare il tampone di fissazione (4,6% formaldeide in PBS 1X) con l'aggiunta di formaldeide al 37% (v/v) di PBS 1X (Vedi 2.1.1) a un rapporto v/v di 1:8 e vortexare.
ATTENZIONE: AVVISO! La formaldeide è altamente tossica e un noto cancerogeno. Gestirlo sotto cappa aspirante mentre indossa un camice da laboratorio e guanti protettivi. - Preparare il tampone di lavaggio per smFISH (20% formammide in 2 x SSC) aggiungendo formammide deionizzata a 2 x SSC (Vedi 2.1.2) per un rapporto v/v di 1:4 e vortice.
- Preparare il tampone di imaging per smFISH con l'aggiunta di 5 mM cisteamina e ossigeno spazzini (7 µM glucosio ossidasi, catalasi nM 56 e glucosio 10% (p/v)) per tampone di lavaggio (20% formammide in 2 x SSC)
- Buffer per la tempesta
- Preparare il tampone A aggiungendo 50 mM Tris-HCl e 10 millimetri di NaCl all'acqua priva di nucleasi.
Nota: Conservare a RT per anni. - Preparare tampone B aggiungendo 50 mM Tris-HCl 10 mM NaCl e 10% p/v al glucosio di acqua priva di nucleasi.
Nota: Conservare a 4 ° C per fino a un anno. - Preparare il tampone di MEA sciogliendo cisteamina 77 mg in 1 mL di tampone A (rende una soluzione 1 M).
Nota: Esso può essere conservato a 4 ° C per 1 mese. - Preparare il tampone di Gloxy aggiungendo 8.440 ossidasi di glucosio (unità arbitrarie) AU e 70.200 catalasi AU a 1 mL tampone A.
Nota: Rende 50 x soluzione di riserva, esso può essere conservato a 4 ° C per 1 mese. - Preparare il tampone di imaging per la tempesta con l'aggiunta di 50 mM di buffer di MEA e 1x Gloxy buffer a tampone B.
Nota: Il buffer di imaging per la tempesta è composto da 5 mM cisteamina, organismi saprofagi dell'ossigeno (56 nM della catalasi e ossidasi di glucosio 7 µM) in 50 mM Tris con 10 millimetri di NaCl e del glucosio 10% pH 8.0. Preparare appena prima di formazione immagine, possono essere archiviato ed utilizzato a temperatura ambiente per circa 2 h.
- Preparare il tampone A aggiungendo 50 mM Tris-HCl e 10 millimetri di NaCl all'acqua priva di nucleasi.
3. il campione fissazione
- Crescere le cellule batteriche (ad es., E.
Nota: Per determinare la priorità bassa a causa del legame non specifico delle sonde, misurazioni in un ceppo in cui è stato eliminato il gene di interesse dovrebbero essere condotta, seguendo le stesse procedure (Vedi Δgalk in Figura 1 e ΔsodB in Figura 2).
Nota: Se il microscopio selezionato non dispone di contrasto di fase o capacità di contrasto differenziale di interferenza, membrane esterne di e. coli possono essere etichettate con marcatore fluorescente lipofilico di 2 μM (Vedi tabella dei materiali), che deve essere aggiunto il sospensione batterica 20 min prima fissazione17. Fissazione e ulteriore trattamento vengono eseguite come descritto di seguito. Deve prestare attenzione a scegliere un marcatore fluorescente avendo un diverso spettro di emissione, per ridurre al minimo la sovrapposizione spettrale con il set di sonda marcata con.
4. campione permeabilizzazione
- Rimuovere il surnatante con molta attenzione. Utilizzo di pipette di piccolo volume, se necessario, rimuovere tutto il liquido fuori il pellet.
- Risospendere in 300 µ l acqua trattata DEPC o nucleasi-free. Aggiungere 350 µ l alto grado etanolo assoluto (99%) e mescolare delicatamente capovolgendo la provetta. Aggiungere un altro 350 µ l di etanolo e mescolare ancora una volta, per raggiungere una concentrazione di etanolo finale del 70% (v/v rapporto).
ATTENZIONE: AVVISO! L'etanolo è infiammabile. - Ruotare il campione con un rotatore tubo 20 giri/min per 1 h a temperatura ambiente (TA), o a 4 ° C durante la notte. Campioni possono essere conservati a 4 ° C fino a una settimana.
5. l'ibridazione
- Pellet di cellule mediante centrifugazione per 7 min, 750 x g, 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 1 mL 20% tampone ai campioni di lavaggio e lasciare riposare per alcuni minuti, o pipetta per sciogliere completamente il pellet.
- Pellet di cellule mediante centrifugazione per 7 min, a 750 x g, 4 ° C.
- Rimuovere il surnatante molto dolcemente pipettando. Utilizzo di pipette di piccolo volume se necessario rimuovere tutto il liquido fuori il pellet.
- Aggiungere la sonda oligonucleotide impostata soluzione di riserva per l'aliquota di tampone di ibridazione in modo che la concentrazione finale del oligonucleotide è 250 nM; vortice vigorosamente.
Nota: Uno può etichettare due o più diversi target mRNAs contemporaneamente nella stessa cella. Aggiungere insiemi di sonda di entrambi gli obiettivi per il tampone di ibridazione. Deve prestare attenzione a scegliere tinture avendo diversi spettri di emissione per minimizzare la sovrapposizione spettrale (ad es., Cy3 e Cy5). Assicurarsi che i campioni destinati a formazione immagine tempesta sono ibridati con una sonda oligonucleotide impostata coniugata con un colorante adatto per STORM (ad esempio, nella tabella dei materiali). - Sospendere i campioni (Vedi punto 5.4) in 50 µ l di tampone di ibridazione contenente le sonde del oligonucleotide, evitando la generazione di bolle (la soluzione è abbastanza viscosa).
- Lasciare i campioni durante la notte su un blocco di caldo a 30 ° C in buio.
Nota: In seguito, campioni possono essere conservati fino a 6 mesi a 4 ° C.
6. lavaggio
- Utilizzare un tubo del microcentrifuge nuovo per ogni campione di immagine. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio.
- Aggiungere 10-15 µ l dai campioni ibridati per il nuovo tubo contenente il tampone di lavaggio e mix/vortex.
- Pellet di cellule di centrifugazione per 7 min, 750 x g a 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
Nota: Per ridurre la priorità bassa, incubare per 1 h a 30 ° C. - Lavare due volte più (risospendere in 1 mL di tampone di lavaggio, centrifuga e rimuovere pellet).
- Risospendere in 25 µ l di tampone di lavaggio.
Nota: Al fine di ridurre una foto-candeggio può aggiungere per il tampone di lavaggio un ossigeno lo scavenging sistema (2.6) per migliorare la stabilità del colorante in fluorescenza di singola molecola esperimenti6.
7. preparazione dei campioni per l'Imaging
Nota: Le cellule hanno bisogno per essere immobilizzato al fine di consentire la corretta formazione immagine al microscopio di fluorescenza e contrasto di fase. I seguenti metodi possono essere utilizzati per preparare campioni in cui diversi campi di vista può essere imaged in diversi piani focali.
- Preparazione del gel dell'agarosi
- Aggiungere 150 mg agarosio al buffer di x SSC 10 mL 2. Non aggiungere 2 x SSC di agarosio, altrimenti non si dissolvono correttamente.
- Forno a microonde per 10-15 s ogni volta fino a grandi bolle iniziano a formarsi. Lasciate raffreddare per qualche minuto.
- Posizionare una separazione cornice in silicone sulla diapositiva in modo che centro della diapositiva rimane esposta.
- Posizionare un anello rigido di 10 mm wide (1-2 mm di spessore) al centro della diapositiva e depositare una piccola quantità di gel in esso, per la sigillatura. Attendere qualche minuto per esso per indurire.
- Aggiungere più gel fino a formare una forma a cupola alta. Aspettare 10 min per esso ad indurirsi e rimuovere l'anello (con una pinzetta bene o qualsiasi altro metodo).
- Cassetta di ~ 10 μL di cellule batteriche lavate (vedere 6.5) sul gel e la guarnizione con un vetrino coprioggetto #0.
- Preparazione del campione di camera per smFISH
- In alternativa (al punto 7.1) preparare i campioni per l'imaging di immobilizzare le cellule batteriche lavate (vedere 6.5) su vetro rivestiti con poli-D-lisina fondo plastica petri piatti usa e getta.
- Incubare i campioni al buio, a temperatura ambiente, una notte prima di visualizzazione per consentire l'adesione delle cellule alla superficie. Prima visualizzazione lavare una volta con tampone di lavaggio (. 5); mantenere il campione bagnato con tampone di lavaggio di imaging o buffer(2.5) per smFISH (2,6).
- Sezione preparazione del campione per la tempesta
- Preparare i campioni per tempesta per imaging su vetro rivestiti con poli-D-lisina fondo plastica petri piatti usa e getta.
- Incubare i campioni al buio, a RT, durante la notte. Prima del lavaggio di visualizzazione in una volta con tampone di lavaggio per smFISH (2.5); e aggiungere buffer di imaging per la tempesta (2.7.5).
8.Visualizzazione di trascrizione
- L'immagine di cellule con un microscopio a fluorescenza largo campo attrezzato con un tavolino motorizzato (Vedi tabella dei materiali).
Nota: Per la modifica di tempesta, utilizzare cellule marcate con un colorante capace di cicli multipli di emissione di fluorescenza. L'esempio utilizzando il sistema di imaging 3D Super-risoluzione di immagine (ad esempio, vedere la tabella dei materiali). - Uso (consigliato) un 60-100x Nardi > 1,3 olio immersione fase contrasto obiettivo con una forte sorgente luminosa, ad esempio un mercurio o lampada di alogenuro di metallo; Fonti di luce LED-based sono anche raccomandati.
- Uso standard raffreddato telecamera CCD, idealmente ottimizzata per formazione immagine di livello basso-luce piuttosto che velocità (usiamo una macchina fotografica con dimensione dei pixel 16 µm) (Vedi tabella dei materiali).
Nota: L'uso di un EMCCD raffreddata (elettrone moltiplicando dispositivo a carica accoppiata) telecamera CCD telecamera è necessario ridurre il rumore termico che impedisce il rilevamento, in particolare di singole molecole. - Usa filtro imposta appropriato per i fluorophores scelto.
- Per determinare correttamente i bordi della cella, acquisire immagini di diversi campi di vista in ogni campione con ottica di contrasto di fase, o di etichettatura fluorescente membrana cellulare esterna. Acquisire immagini a diversi piani focali (z-stack) per tutti i canali (solitamente 13 fette separate da 250 nm sono presi).
Nota: La fase motorizzata del microscopio e il set di filtri dovrebbe essere controllata da commerciali (Vedi tabella materiali) o software in-House che può catturare una pila di immagini in sequenza.
9. analisi dei dati
- Convertire le serie di immagini in un formato adatto per l'analisi dei dati.
- Stimare il numero di copie del target mRNA dall'intensità totale dei fuochi fluorescenti nella cella, piuttosto che dal conteggio discreti 'punti' come in altri protocolli attualmente disponibili.
- Effettuare analisi di immagine con software open-source18 o con un programma personalizzato. Per informazioni dettagliate dei dati di imaging e l'analisi vedere Skinner et al. 7
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Representative Results
Abbiamo effettuato misurazioni smFISH delle trascrizioni galK e sodB in cellule di Escherichia coli . Le trascrizioni sono state ibridate con un set di specifiche sequenze complementari alla sequenza di destinazione, ogni sonda viene coniugato ad una singola molecola fluorescente (Vedi tabella dei materiali). Fluorescenza e fase contrasto immagini di selvaggio-tipo MG1655 ceppo di e. coli (WT) o di un ceppo di galK-eliminato JW0740 (raccolta di Keio)19 (ΔgalK) sono stati esposti a 2 mM D-fucosio sono mostrati in Figura 1A e 1B. Le cellule erano fissate almeno 3 h dopo l'esposizione al D-fucosio. I pannelli in Figura 1A (in alto) mostrano un fotogramma su 13, corrispondente all'altezza alla quale cella contorni sono a fuoco, che rappresenta il livello di induzione galK in risposta a concentrazioni extracellulari di D-fucosio variabile. Punti all'interno delle cellule nelle immagini di fluorescenza corrispondono a entrambi trascrizioni galk singolo o pochi, e la determinazione del numero di trascrizione in ogni cella è effettuata quantificando fluorescenza localizzata. Numerose macchie sono visibili nella maggior parte delle cellule, quando 2 mM D-fucosio è aggiunto per la coltura batterica, considerando che alcune macchie sono visti in assenza di D-fucose extracellulare. Nel ceppogalK Δ macchie non si osservano sopra lo sfondo come previsto. Superficie di etichettatura con marcatore fluorescente lipofilico è mostrato in Figura 1B (in basso).
Inoltre, abbiamo ripreso le trascrizioni di sodB in coltura batterica Escherichia coli coltivate in un terreno LB in fase di crescita logaritmica. Fluorescenza e immagini di contrasto di fase di smFISH in WT o un ceppo di sodB-eliminato JW1648 (raccolta di Keio)19 (ΔsodB) sono mostrati nella Figura 2A. I pannelli in Figura 2A (in alto) mostrano un fotogramma su 13, corrispondente all'altezza alla quale cellula contorni sono a fuoco, che rappresenta il livello di sodB. Nel ceppo ΔsodB , macchie non si osservano sopra lo sfondo, come anticipato.
Le stesse colture erano imaged dalla tempesta (in alto) e i perimetri delle cellule sono stati determinati con superficie etichettatura utilizzando un marcatore fluorescente lipofile per illustrare la localizzazione di sodB all'interno delle cellule. Colorazione della membrana permette un posizionamento accurato dei trascritti nella cella (Figura 2B). Il ceppo disodB Δ è stato preso come il segnale di fondo e per determinare la dimensione minima dei cluster (Vedi Figura 2B). Il numero medio di trascrizione di smFISH2 e STORM è paragonabile.
Figura 1: effetti di D-fucose su galK trascrizioni visualizzati utilizzando smFISH. Home Page (A) : smFISH immagini di fluorescenza di galK mRNA nei singoli Escherichia coli cellule. Un ceppo di MG1655 wild type (WT) o un JW0740 (raccolta di Keio) galK -eliminato ceppo (ΔgalK)19 sono state coltivate con o senza 2 mM D-fucosio. Le trascrizioni di galK sono state ibridate per sonde complementari coniugati con un colorante otticamente equivalente a Cy3 (Vedi tabella dei materiali). In basso: stesso campi di vista in contrasto di fase. (B) cellule WT sono state coltivate con o senza 2 mM D-fucose come sopra ed etichettati con 2 μM di una membrana lipofilica tingere (Vedi tabella materiali) per 20 min prima della fissazione. Top: fluorescenza immagini di galK mRNA utilizzando smFISH. Immagini sono state scattate con un microscopio controllato da un software commerciale utilizzando una lente obiettiva di 100 × 1,45 Nardi olio immersione fase contrasto (Vedi tabella dei materiali) e una fotocamera EMCCD (Vedi tabella dei materiali). I filtri utilizzati erano come descritto nella tabella dei materiali. Un'immagine di contrasto di fase è stata acquisita seguita da una z-pila di 13 fette e 250 nm spaziatura delle immagini fluorescenti con tempo d'integrazione 2 s per ogni fetta. Medio: stesso campi di vista con formazione immagine contrasto di fase. Fondo: cellule identificate con marcatori fluorescenti lipofili, con filtri appropriati descritti nella tabella materiali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Imaging di sodB trascrizioni etichettate con la stessa sonda impostata in tempesta e smFISH. Home Page (A) : smFISH immagini di fluorescenza di sodB mRNA nei singoli Escherichia coli cellule. Un ceppo di MG1655 wild type (WT) o un JW1648 (raccolta di Keio) sodB -eliminato ceppo (ΔsodB)19 sono state sviluppate in LB medium. Le trascrizioni di sodB sono state ibridate per sonde complementari coniugati con un colorante otticamente equivalente a Cy5 (Vedi tabella dei materiali). In basso: stesso campi di vista in contrasto di fase. (B) sovvrapposizione delle molecole fluorescenti (singoli punti colorati) localizzata da tempesta (670 nm emissione) e uno snapshot delle membrane cellulari nello stesso campo di vista. Le cellule sono stata marcate con un colorante lipofilico, eccitato con un laser ad argon a 488 nm a 1% della potenza massima (0,05 kW/cm2) con un picco di emissione a 510 nm ed imaged con l'appropriato filtro (Vedi tabella dei materiali). Cellule WT e sodB erano coltivate come descritto in precedenza ed etichettate con un 2 membrana lipofilico μM tingere (Vedi tabella materiali) per 20 min prima della fissazione. Immagini di Super-risoluzione sono state registrate con un microscopio commerciale (Vedi tabella dei materiali). Etichettato con un colorante otticamente equivalente a Cy5 trascrizioni sono state localizzate utilizzando un laser di eccitazione a 647 nm in un buffer di imaging per la tempesta. Immagini sono state registrate utilizzando un 60x, NA 1.2 obiettivo a immersione in acqua (Vedi tabella dei materiali) e una fotocamera EMCCD (Vedi tabella materiali) con guadagno fissato a 50, frame rate a 50 Hz e potenza massima di 647 e 405 nm laser impostato al 5 e 0,05 kW/cm2 , rispettivamente. Il numero totale di fotogrammi acquisiti era 8.000. I dati sono stati analizzati usando software commerciale (Vedi materiali tavolo). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nel nostro laboratorio abbiamo misurato il numero di trascrizione di diversi geni in cellule di Escherichia coli usando il smFISH metodo2. In breve, questa procedura prevede i passaggi seguenti: fissazione delle cellule, permeabilizzazione delle membrane per consentire la penetrazione della sonda, l'ibridazione della sonda e utilizzando un microscopio a fluorescenza standard di formazione immagine di esempio. Questa procedura si basa su quelli precedentemente pubblicati con alcune modifiche6,7,16. Precedentemente è stato segnalato che smFISH richiede che il numero di sonde del oligonucleotide si trovano nella gamma 48-72, al fine di realizzare un segnale che si trova ben di sopra la priorità bassa7. Abbiamo dimostrato che questo numero potrebbe essere in realtà più piccole20, a seconda della sequenza del gene di interesse, il programma di installazione di ottica e le specifiche condizioni sperimentali.
Ogni sonda dovrebbe essere 17-22 nucleotidi di lunghe, con una separazione di Inter-sonda di almeno due nucleotidi e un contenuto di GC di ~ 45%, al fine di ridurre gli effetti del non-specifici, fuori bersaglio associazione. Alcune sonde potrebbero non riuscire a legare un bersaglio, e l'efficienza complessiva dell'associazione può essere ottimizzato da modifiche delle procedure sperimentali come le condizioni di fissazione e l'ibridazione21. Un fattore importante che deve essere preso in considerazione è la scelta di fluorofori. Si consiglia vivamente di etichettare le sonde con un colorante con bassa sensibilità alle foto-candeggio. Foto-candeggio minimizzazione può essere raggiunto dall'ottimizzazione dei tempi di esposizione, fonti di illuminazione e tempi di integrazione di acquisizione di immagini e con l'aggiunta di un sistema di lavaggio di ossigeno.
La portata degli eventi di legame non specifico dovrebbe essere valutata effettuando esperimenti di smFISH con le cellule da ceppi in quale bersaglio geni vengono eliminati, ad esempio dalla Keio collezione19. Se il segnale di fondo è alto, il numero e la durata delle fasi di lavaggio deve essere aumentate, o cellule dovrebbero essere incubate in tampone di lavaggio a 30 ° C per 1 h e poi lavate due volte. Inoltre, per ridurre lo sfondo, è suggerito per ottimizzare la concentrazione di formammide (rapporto di 10-40% v/v) in ibridazione e i buffer di lavaggio. L'aumento della concentrazione di formammide riduce il legame non specifico, ma può anche ridurre il legame delle sonde al target mRNA. Durante la fase di ibridazione, è importante rimuovere il surnatante interamente; un tampone di ibridazione diluito può portare a diminuita efficienza di etichettatura. Inoltre, destinazione RNAs deve essere sufficientemente lungo per ottenere un posto ben localizzato sopra priorità bassa. I recenti miglioramenti nel segnale-rumore rapporti e vincolante specificità attraverso la modifica di spina dorsale delle sonde ora rendono possibile rilevare più breve RNA frammenti, come microRNA eucariotici o batterica piccolo non-codificazione RNAs2, 10. è consigliabile che il numero di copia media ottenuto da smFISH deve essere convalidato con quantitativi PCR7,16.
In questo manoscritto abbiamo dimostrato che questo metodo può essere modificato con piccole modifiche per studiare la localizzazione delle trascrizioni in e. coli con una risoluzione ottica superiore usando stocastico ricostruzione ottica microscopia (tempesta)11.
In sintesi, smFISH è un metodo versatile per l'illuminazione di RNA che permette la misurazione diretta della variabilità nel numero di trascrizione cellula-cellula e della localizzazione delle trascrizioni di destinazione nella cella, in eucarioti e procarioti. Esso fornisce informazioni quantitative sui processi di base dell'espressione genica e può essere facilmente implementato per l'imaging di tempesta.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da un grant di Israel Science Foundation 514415 (a J.S.) e una sovvenzione di BSF-NSF (MCB) 2016707 (di J.S.). Supporto da un Siegfried e Irma Ullman cattedra (a J.S.) è anche riconosciuto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker - Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen - Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 - 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24x60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
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| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
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References
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