Summary
이 원고 붙일 표시 된 DNA 프로브, 대장균에 있는 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 실험에 사용 하기 위해 개별 메신저 RNA (mRNA) 성적표를 라벨에 대 한 방법을 설명 합니다. smFISH 동시 탐지, 지역화, 고 고정된 개별 셀에 단일 mRNA 분자의 정량화를 허용 하는 시각화 방법입니다.
Abstract
고정된 박테리아 대장균에 있는 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 실험에 사용 하기 위해 성적 증명서 개별 메신저 RNA (mRNA)를 라벨에 대 한 방법을 설명 합니다. smFISH는 성적 증명서의 subcellular 위치 뿐 아니라 관심의 유전자의 mRNA 사본 수에 셀 다양성의 측정을 허용 한다. 주요 단계는 세균성 세포 배양의 고정, 세포 막의 permeabilization 및 상업적으로 사용 가능한 짧은 붙일 레이블 oligonucleotide 조사 세트와 함께 대상 증명서의 교 잡. smFISH는 다른 형광 마커 사이의 스펙트럼 중복에 의해 부과 된 제한 같은 셀에 여러 유전자의 성적 이미지를 허용할 수 있습니다. 아래 설명 하는 프로토콜의 완료, 다음 셀 수 있을 쉽게 몇 군데 낮은 강도의 형광을 위해 적당 한 카메라와 함께 결합 하는 현미경을 사용 하 여. 셀 윤곽선 세분화 단계 대비 프레임, 또는 세포 막 얼룩에서 함께 이러한 이미지 오픈 소스 또는 사용자 작성 소프트웨어를 사용 하 여 셀의 샘플의 mRNA 사본 숫자 분포의 계산을 허용 한다. 여기 설명 하는 표기 방법은 확률적 광학 재건 현미경 (스톰)와 성적 증명서 이미지에 적용할 수 있습니다.
Introduction
Stochasticity는 유전자 발현의 근본적이 고 피할 수 없는 측면 이며 셀 셀이1, 성적 및 단백질2,3의 수준에서 모두 증가 제공 합니다. 잘 정의 된 조건 하에서 세포 사이 가변성을 측정 독특한 창 유전자 발현 및 그것의 규칙의 기반이 되는 기본 프로세스에 제공 합니다. 셀이 박테리아에의 한 중요 한 소스는 transcriptional 수준에서 일어난다. 사본 숫자 규정 등 post-transcriptional 프로세스 뿐만 아니라 전사의 stochasticity 때문에 뿐만 아니라 작은 RNAs 및 RNAases2마다 다릅니다. 양적 패션에서이 성분에 직접 액세스 하는 한 가지 방법은 붙일 smFISH에 주어진된 유전자의 개별 성적표를 태그입니다. 이 방법론 검색 및 특정 RNA 분자의 subcellular 지 방화, 개별 박테리아 세포4고정 수 있습니다. mRNAs는 붙일 표시 된 관심5,6의 성적표에 선택적으로 바인딩할 디자인 된 ~ 20 자료-긴 oligonucleotides의 세트로 때 교배. 여러 라벨 배경 형광, 위에 검출 및 개별 mRNA 분자 형광 현미경7 (참조 그림 1) 회절 제한 된 반점으로 나타납니다. MRNA 분자, 상호 보완적인 올리고 머 프로브 보조 붙일 레이블 기자 기법8을 사용 하 여 검색 된 활용된 haptens (예를 들어, biotin 또는 digoxigenin)를가지고 라벨에 대 한 다른 접근이 있다.
SmFISH 이외에 성적에 대 한 정량적 인 정보를 제공 하는 다른 방법이 있다. 북부 등 일부 오 점 또는 양이 많은 PCR 일괄 프로브 따라서 mRNA 사본의 수 없으며 개별 셀에서 그들의 위치를 측정할 수 있습니다. 따라서 이러한 방법은 셀 변화 척도를 적합 하지 않습니다. 최근 이미지 기반 기술은 모두 세포 내 RNAs의 복사본 수로 라는 그들의 세포내 위치의 정량화 다중화 오류 강력한 형광 제자리에서 교 잡 (MERFISH)에 대 한 수 있도록 개발 되었습니다. MERFISH 고정된 개수의 붙일 레이블 oligonucleotide 조사에서 정의 된 조합으로 구성 된 고유 바코드의 할당을 기반으로 합니다. 이러한 바코드는 smFISH 측정의 순차적 라운드에서 밖으로 읽힌다, photobleaching와 함께 다음 각 교 잡, 두 배나9,10처리량 증가의. 이 기술은 시스템 및 프로브 세트의 적절 한 디자인 처리는 자동화 된 유체를 필요로 합니다.
해상도에 ten-fold 증가 있습니다 여러 형광 라벨 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍)11, 같은 소설 슈퍼 해상도 기술 함께 개별 성적표의의 subcellular 국산화 성적 증명서 폭풍, 형광 프로브 및 이미징 버퍼의 적당 한 조합 당 (깜박이) 프로브 분자 형광 방출의 여러 사이클에 대 한 수 있습니다. 폭풍은 대장균 transcriptome 이미지 및 관심12의 동시에 모든 성적 증명서를 라벨에 의해 RNA의 게놈 넓은 공간 조직 관찰에 사용할 수 있습니다.
위에 검토 하는 모든 단일 셀 방법 고정된 셀에 녹취 록을 이미징 기반으로 합니다. 따라서, 그들은 세포 내에서 성적 운동 속성에 관한 모든 정보를 제공 하지 않습니다. 라이브 셀13에서 성적에 따라, mRNAs 사이트 바인딩 배열에 관심사의 유전자의 융합에 의해 표시 수 있습니다. 이 후자는 다음에 의해 인식 같은 살 균 소 MS2 외 투 단백질, 녹색 형광 단백질 (GFP)10,,1415등 형광 단백질을 융합 한 RNA 의무적인 단백질.
여기는 특히 대장균에 놓여있는지 표시 된 DNA 프로브, smFISH 실험에 사용 하기 위해 집합으로 개별 mRNAs를 라벨에 대 한 방법에 설명 합니다. 또한, 우리는 동일한 라벨 체계 사소한 수정 폭풍 측정을 위해 사용 될 수 있습니다 보여줍니다.
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Protocol
1. 조사 설계
참고:이 프로토콜 이미 fluorophores 태그로 상용 oligonucleotide 프로브를 사용 합니다. 프로브는 특정 시퀀스를 대상으로 보완 집합의 구성 mRNA, 단 하나 형광 성 분자를 활용 되 고 각 프로브. 또는,5,16설명 되어 있는 대로 프로브를 형광 마커를 연결 가능 하다.
- 디자인 smFISH 프로브 Arjun Raj (밴 Oudenaarden 연구소, 매사 추세 츠 공대);에 의해 개발 된 프로브 디자이너16 알고리즘을 사용 하 시퀀스 smFISH 프로브이 원고에 사용 되는 재료의 테이블에 나열 됩니다.
참고: 최소 감지 신호에 대 한 집합에 프로브 수 ~ 30입니다. 정확한 숫자는 매우 짧은 성적 측정 하는 경우에 특히 관심의 유전자에 따라 달라질 수 있습니다. - 광 설치에 맞는 염료를 선택 (재료의 표 참조).
참고: Cy3 염료 또는 사진 표백 낮은 민감도와 광학 동일한 염료가 좋습니다. 듀얼 라벨에 대 한 후보는 Cy5 또는 광학 동일한 염료 (재료의 표 참조). 레이블이 지정 된 mRNA의 폭풍 이미징에 대 한 적합 한 염료 형광 방출의 여러 사이클에 대 한 그들의 능력에 의해 특징. 일부 smFISH 염료를 사용할 수 있는 스톰 이미징 (재료의 표 참조). 두 가지 (또는 그 이상) 성적표 같은 셀에 서로 다른 유전자에 해당 이미지를 하나 그 스펙트럼이 거의 없거나 전혀 없는 중복 염료를 활용 하는 oligonucleotide 프로브를 선택 해야 합니다.
2. 시 약 준비
참고: 필터링 된 피 펫 팁 등 튜브, RNase 무료 소모품을 사용 하 여 샘플 RNAse 무료를 유지 하 고 모든 작업 환경을 깨끗 하 게 유지 하는 것이 중요입니다. 대상 성적 저하를 방지 하려면 셀 고정 다음 사용 하는 모든 시 약 nuclease 무료 되어야 합니다 (재료의 표 참조) 또는 diethylpyrocarbonate (DEPC)-치료 및 살 균.
- SmFISH에 대 한 버퍼
- 1 x PBS RNase 무료 (버퍼링 인산 염, 인산 염 버퍼 농도 0.01 M의와 염화 나트륨 농도 0.154 m, (pH 7.4) 솔루션)을 준비 합니다. 10 x PBS RNase 무료 희석 (재료의 표 참조) nuclease 무료 물 (재료의 표 참조)에 1시 10분 v/v 비율.
- DEPC 처리 1을 준비 또는 PBS x.
- RNase 무료 준비 2 x SSC (염 분 나트륨 구 연산 염 버퍼, 0.03 M 나트륨 시트르산, (pH 7.0)에 0.3 M NaCl). RNase 무료 희석 20 x SSC (재료의 표 참조) nuclease 무료 물 1:10 v/v 비율.
- DEPC 처리 2를 준비 하는 또는 x SSC.
- 1 x PBS RNase 무료 (버퍼링 인산 염, 인산 염 버퍼 농도 0.01 M의와 염화 나트륨 농도 0.154 m, (pH 7.4) 솔루션)을 준비 합니다. 10 x PBS RNase 무료 희석 (재료의 표 참조) nuclease 무료 물 (재료의 표 참조)에 1시 10분 v/v 비율.
- Oligonucleotide 조사 재고 솔루션입니다.
- 다시 25 µ M. 프로브 재고를 만들려고 테 버퍼 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)의 200 µ L에 말린된 oligonucleotide 조사 조화 분해를 위아래로 pipetting 다음 소용돌이 그리고 짧게 원심 분리기에 의해 잘 믹스.
- 동결 및 재고 솔루션 튜브의 해빙을 방지 하려면 단일 실험 실행에 사용 될 것으로 예상 하는 금액을 해당 재고 솔루션의 여러 aliquots를 확인 합니다. -20 ° C에 또는 아래 재고 솔루션을 저장 하 고 빛 으로부터 보호.
참고: 5 nmol의 프로브 세트 최대 250 교 잡 반응을 제공할 수 있습니다.
- 교 잡 버퍼 (다음 스키 너 외. 7 ):
- 50ml 폴 리 프로필 렌 원뿔 하단 튜브를 nuclease 무료 물 5 mL를 추가 합니다. 물 1 g dextran 황산의 추가 하 고 활발 한 vortexing에 의해 해산. 거품 (~ 30 분) 사라질 때까지 궤도 셰이 커에 내용을 혼합.
- 20x SSC의 1 mL, 200mm vanadyl ribonucleoside 복합물의 100 µ L, 50 mg/mL BSA의 40 µ L 이온된 formamide, 대장균 tRNA의 10 mg의 솔루션 3,530 µ L를 추가 합니다. 최종 볼륨을 가져올 10 mL DEPC 처리 물 또는 nuclease 무료 물, 그리고 소용돌이의 추가 의해 솔루션 동 질 때까지.
참고: 동결과 솔루션의 해빙을 방지 하려면 단일 실험 실행에 사용 될 것으로 예상 하는 금액을 해당 재고 솔루션의 여러 aliquots 확인 합니다. -20 ° c.에 재고 솔루션 저장 병을 열기 전에 formamide 실내 온도에 온난 하 게 해야 합니다. 백그라운드를 줄이기 위해, 그것은 최적의 formamide 농도 (10-40 %v / v 비율)을 보정 하기 위해 좋습니다.
주의: 경고! Formamide은 매우 독성이 고 알려진된 기형 발생 물질. 눈 또는 피부, 흡입 또는 섭취와 접촉을 하지 마십시오. 연기 후드 랩 코트와 보호 장갑을 착용 하는 동안 처리 합니다. - 0.22 μ m 필터를 통해 그것을 전달 하 여 솔루션을 소독. Aliquots에서 유지 하 고 1 년에-20 ° C에서 저장.
- 1 x PBS를 37% 포름알데히드 (v/v)을 추가 하 여 고정 버퍼 (1 x PBS에 4.6% 포름알데히드) 준비 (2.1.1 참조)는 1:8 비율 v/v와 소용돌이에.
주의: 경고! 포름알데히드는 매우 독성이 고 알려진된 발암 물질. 연기 후드 랩 코트와 보호 장갑을 착용 하는 동안 처리 합니다. - SmFISH 워시 버퍼 준비 (2에서 20% formamide x SSC) 2 하 이온된 formamide를 추가 하 여 x SSC (2.1.2 참조) 1:4 비율 v/v 및 소용돌이.
- 5mm 시스테 및 산소 청소부 (7 µ M 포도 당 산화 효소, 56 nM catalase 및 10% 포도 당 (w/v)) 워시 버퍼를 추가 하 여 이미지 버퍼 smFISH에 대 한 준비 (2에서 20% formamide x SSC)
- 폭풍에 대 한 버퍼
- 50 mM Tris HCl과 10 mM NaCl nuclease 무료 물에 추가 하 여 버퍼 A를 준비 합니다.
참고: 저장소 년 RT에서. - Nuclease 무료 물 포도 당 50 mM Tris HCl, 10 mM NaCl, 그리고 10 %w / v를 추가 하 여 버퍼 B을 준비 합니다.
참고: 저장소 최대 1 년에 4 ° C에서. - 77 mg 시스테 버퍼 A (은 1 M 솔루션)의 1 mL에 용 해 하 여 MEA 버퍼를 준비 합니다.
참고: 그것은 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 1 개월. - Gloxy 버퍼 8,440 AU (임의의 단위) 포도 당 산화 효소를 추가 하 여 준비 하 고 1 ml 70,200 AU catalase 버퍼 a.
참고: 재고 솔루션 x 50은 1 개월 4 ° C에서 저장 될 수 있다. - 50mm MEA 버퍼와 버퍼를 버퍼 B에 Gloxy x 1을 추가 하 여 이미지 버퍼 폭풍우를 위한 준비
참고: 폭풍에 대 한 이미징 버퍼 5mm 시스테, 10 mm NaCl, 50 mm Tris 산소 청소부 (7 µ M 포도 당 산화 효소와 56 nM catalase) 및 10% 포도 당 pH 8.0에서 구성 됩니다. 바로 영상 전에 준비, 저장 고 약 2 시간에 대 한 RT에 사용 될 수 있습니다.
- 50 mM Tris HCl과 10 mM NaCl nuclease 무료 물에 추가 하 여 버퍼 A를 준비 합니다.
3. 샘플 고정
- 세균성 세포 (예를들면, E. 성장
참고: 확인 하려면 조사의 일반적인 바인딩 인해 배경에 있는 관심사의 유전자 삭제 된 스트레인 측정 실시 해야, (Δgalk 에 그림 1 과 ΔsodB 에서 참조 하는 동일한 절차에 따라 그림 2)입니다.
참고: 선택한 현미경 단계 대조 또는 차동 간섭 콘트라스트 기능 없는 경우 대장균 외부 막 수 표시 2 μ M 닥터지 형광 표시와 함께 (재료의 표 참조)에 추가 해야 하는 세균 현 탁 액 고정17전에 20 분. 고정 및 추가 치료는 아래 설명 된 대로 수행 됩니다. 형광 마커 표시 프로브 세트와 스펙트럼 중복을 최소화 하기 위해 다른 방출 스펙트럼을 데 주의 해야 합니다.
4. 샘플 Permeabilization
- 매우 신중 하 게 상쾌한을 제거 합니다. 작은 볼륨 펫을 사용 하 여 펠 릿 밖에 서 모든 액체를 제거 하는 데 필요한 경우.
- 300 µ L DEPC 처리 물 또는 nuclease 무료 물 resuspend. 350 µ L 고급 절대 에탄올 (99%)를 추가 하 고 부드럽게 튜브를 거꾸로 하 여 혼합. 에탄올과 혼합 다시, 70% (v/v 비율)의 최종 에탄올 농도 도달의 또 다른 350 µ L를 추가 합니다.
주의: 경고! 에탄올은 가연성 이다. - (RT), 실 온에서 1 h 20 rpm에서 튜브 회전자와 함께 샘플을 회전 또는 4 ° C에서 하룻밤. 샘플 4 ° C에서 1 주일에 저장할 수 있습니다.
5입니다. 교 잡
- 7 분, 750 x g, 4 ° c.에 대 한 원심 분리 하 여 펠 릿 셀 상쾌한을 제거 합니다.
- 1 mL 20% 샘플에 버퍼를 세척 하 고 두고 서 몇 분, 또는 펠 릿을 완전히 해산 피 펫에 대 한 추가 합니다.
- 750 x g, 4 ° c.에 7 분 동안 원심 분리 하 여 펠 릿 셀
- 매우 부드럽게 pipetting 여는 상쾌한을 제거 합니다. 작은 볼륨 펫을 사용 하 여 펠 릿 밖에 서 모든 액체를 제거 하는 데 필요한 경우.
- Oligonucleotide 조사 최종 oligonucleotide 농도 250 교 잡 버퍼 약 수를 재고 솔루션 설정 추가 nM; 소용돌이 적극적으로.
참고: 하나의 동일한 셀에 한 번에 두 개 이상의 다른 대상 mRNAs 레이블을 수 있습니다. 교 잡 버퍼를 두 대상의 프로브 세트를 추가 합니다. 염료 (예를 들어, Cy3와 Cy5) 스펙트럼 오버랩을 최소화 하기 위해 다른 방출 스펙트럼을가지고 선택할 수 주의 해야 합니다. 폭풍 이미징을 위한 샘플 스톰 (예를 들면, 자료의 테이블에서)에 대 한 적합 한 염료와 활용을 설정 하는 oligonucleotide 프로브 때 교배는 다는 것을 확인 하십시오. - 거품 (솔루션은 아주 점성)의 생성을 피하는 동안 oligonucleotide 조사를 포함 하는 50 µ L 교 잡 버퍼에 샘플 (단계 5.4 참조)를 일시 중단 합니다.
- 어둠 속에서 30 ° C에서 뜨거운 블록에 샘플을 하룻밤 둡니다.
참고:이 다음 샘플 저장 될 수 있습니다 4 ° c.에서 최대 6 개월까지
6입니다. 세척
- 1 새로운 microcentrifuge 튜브를 사용 하 여 이미지에 각 샘플에 대 한. 1 mL 워시 버퍼를 추가 합니다.
- 워시 버퍼와 혼합/소용돌이 포함 하는 새 튜브를 교배 시킨된 견본에서 10-15 µ L를 추가 합니다.
- 7 분 동안 원심 분리, 4 ° c.에 750 x g 펠 릿 셀 상쾌한을 제거 합니다.
참고: 배경을 줄이기 위해, 품 어 1 h 30 ° c.에 대 한 - 두 번 더 세척 (1 mL 워시 버퍼에서 resuspend, 원심 및 펠 릿을 제거).
- 25 µ L 워시 버퍼에 resuspend.
참고: 사진 표백 한 줄이기 위해 추가할 수 워시 버퍼에 단일 분자 형광 실험6염료 안정성 향상을 위해 시스템 (2.6) 청소는 산소.
7입니다. 영상에 대 한 샘플의 준비
참고: 셀 형광 및 위상 대비 현미경 적절 한 이미징 할 수 있도록 움직일 필요가 있다. 다음 방법 다른 초점 비행기에서 보기의 다른 분야 수 군데 샘플 준비를 사용할 수 있습니다.
- Agarose 젤 준비
- 10 mL 2 x SSC 버퍼에 150mg agarose를 추가 합니다. 2를 추가 하지 마십시오 x SSC agarose, 아니면 그것을 제대로 분해 되지 것입니다.
- 10-15 s 큰 거품 형태로 시작 될 때까지 각 시간에 대 한 전자 렌지. 몇 분 동안 냉각을 정해.
- 슬라이드의 센터 노출 되도록 슬라이드에 분리 실리콘 프레임을 놓습니다.
- 슬라이드의 중심에서 10 m m 와이드 (1-2 m m 두께) 엄밀한 반지를 놓고 씰링에, 젤의 작은 금액을 입금 합니다. 강화에 그것에 대 일 분 정도 기다립니다.
- 높은 돔 모양 형성 될 때까지 더 많은 젤을 추가 합니다. 강화 하 고, 그것을 위해 10 분을 기다려 하 고 (를 사용 하 여 정밀한 핀셋 또는 다른 방법) 반지를 제거.
- 젤에 #0 coverslip 슬라이드 인감 (6.5 참조) 씻어 세균 세포의 ~ 10 μ를 입금.
- SmFISH에 대 한 챔버 샘플 준비
- 또는 (단계로 7.1) immobilizing 씻어 세균 세포 (6.5 참조) 폴 리 D-라이 신-코팅 유리 하단 일회용 플라스틱 접시에 의해 이미징에 대 한 샘플을 준비.
- 어둠 속에서, 실내 온도에, 하룻밤 시각화 표면에 세포의 접착을 허용 하기 전에 샘플을 품 어. 시각화 하기 전에 세척 한 번 워시 버퍼 (. 5); 예제 smFISH (2.6)에 대 한 세척 buffer(2.5) 또는 이미징 버퍼와 젖은 유지.
- 폭풍에 대 한 챔버 샘플 준비
- 폴 리 D-라이 신-코팅 유리 하단 일회용 플라스틱 접시에 이미징에 대 한 폭풍에 대 한 샘플을 준비 합니다.
- 하룻밤에 RT, 어둠 속에서 샘플을 품 어. 워시 버퍼 smFISH (2.5);에 대 한 시각화 세척 한 번 하기 전에 고 스톰 (2.7.5)에 대 한 이미징 버퍼를 추가 합니다.
8입니다.대 본 시각화
- 전동된 스테이지를 갖춘 넓은 필드 형광 현미경으로 세포를 이미지 (자료의 표 참조).
참고: 폭풍 수정에 대 한 염료 형광 방출의 여러 사이클의 가능으로 표시 하는 셀을 사용 합니다. 3D 슈퍼 해상도 이미징 시스템을 사용 하 여 샘플 이미지 (예를 들어, 재료의 표 참조). - 사용 (권장)를 한다 x 60-100 > 1.3 기름 침수 단계 대비 목표 렌즈는 강한 광원, 수은 또는 금속 할로겐 램프; 광원 LED 기반은 또한 것이 좋습니다.
- 사용 표준 냉각 CCD 카메라, 이상적으로 낮은 조명 수평 영상 보다는 속도 (우리 16 µ m 픽셀 크기와 카메라를 사용)에 대 한 최적화 (재료의 표 참조).
참고: 사용 냉각된 EMCCD (전자 멀티 충전 결합 장치)의 카메라 CCD 카메라는 특히 단일 분자의 검출을 방지 하는 열 잡음을 줄이기 위해 필요 하다. - 사용 필터 설정 선택한 fluorophores에 적합 합니다.
- 셀 경계를 제대로 확인 하려면 각 샘플 단계 대조 광학, 또는 라벨 붙일 외부 세포 막에서에서 보기의 다른 분야의 이미지를 취득 합니다. 모든 채널에 대 한 서로 다른 초점 평면 (z-스택)에서 이미지 (보통 13 조각 구분 기준: 250 nm 촬영).
참고: 필터 집합 및 현미경의 전동된 스테이지 상업에 의해 제어 해야한다 (재료의 표 참조) 또는 사내 소프트웨어를 순서 대로 스택 이미지를 캡처할 수 있습니다.
9. 데이터 분석
- 이미지 스택 데이터 분석에 대 한 적합 한 형식으로 변환 합니다.
- 대상의 복사본 수를 추정 mRNA 아닌 셀에 형광 foci의 총 강도에서 다른 현재 사용할 수 있는 프로토콜에서 이산 '관광 명소' 세.
- 오픈 소스 소프트웨어18 또는 사용자 프로그램 이미지 분석을 실시 합니다. 자세한 내용은 데이터의 이미징 및 분석 참조 스키 너 외. 7
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Representative Results
우리는 대장균 세포에 galK 및 sodB 내용은의 smFISH 측정에 실시 한다. 녹취 록은 특정 시퀀스 단 하나 형광 성 분자를 활용 되 고 각 조사 대상 시퀀스를 보완의 세트로 때 교배 (재료의 표 참조). 형광 및 위상 대비 MG1655 야생-타입의 이미지 E. 콜라이 긴장 (WT) 또는 JW0740 (게이오 컬렉션)19 galK 삭제 긴장 (ΔgalK) 2 m m D-fucose 그림 1A 및 1B에 표시 됩니다에 노출 됐다. 셀 D-fucose에 노출 후 적어도 3 시간을 고정 했다. 그림 1A (위)에 패널 표시 한 프레임에 해당 하는 셀 윤곽에 있는 초점, 가변 extracellular D-fucose 농도에 대 한 응답 galK 유도의 수준을 대표 하는 높이 13에서. 어느 하나 또는 몇 galk 성적표에 해당 하는 셀 형광 이미지에 내 관광 명소 그리고 각 셀에 사본 수의 결심 지역화 된 형광을 측정에 의해 수행 됩니다. 반면 몇 가지 관광 명소는 extracellular D-fucose의 부재에 볼 2mm D-fucose 세균성 문화에 추가 될 때 수많은 관광 명소 대부분의 세포에서 볼 수 있습니다. ΔgalK 긴장에 아무 반점 예상 대로 배경 위에 관찰 된다. 닥터지 형광 표식으로 표면 그림 1B (아래)에 표시 됩니다.
또한, 우리는 로그 성장 단계에 파운드 매체에서 자란 대장균 세균성 문화에 sodB 성적표 몇 군데. 형광과 위상 WT 또는 JW1648 (게이오 컬렉션)19 sodB 삭제 긴장 (ΔsodB)에 smFISH 이미지 그림 2A에 표시 됩니다. 그림 2A (위)에 패널 표시 한 프레임에 해당 하는 셀에 윤곽선 초점, sodB의 수준을 대표에 높이 13에서. ΔsodB 긴장에 아무 반점 예상 대로 배경 위에 관찰 된다.
같은 문화 된 폭풍 (위)에 의해 몇 군데와 셀의 경계 표면 닥터지 형광 마커를 사용 하 여 셀 내에서 sodB 의 지역화를 설명 하기 레이블 결정 했다. 막 얼룩 셀 (그림 2B)에 녹취 록의 정확한 위치 수 있습니다. ΔsodB 스트레인 찍은 배경 신호 및 최소 클러스터 크기를 결정 ( 그림 2B참조). SmFISH2 와 폭풍우의 평균 성적 수 비교입니다.
그림 1: galK 성적표에 D-fucose의 효과 smFISH를 사용 하 여 시각. (A) 탑: smFISH 이미지 galK의 형광의 개별 대장균 에 mRNA 세포. MG1655 야생-타입 스트레인 (WT) 또는 JW0740 (게이오 컬렉션) galK-삭제 스트레인 (ΔgalK)19 2mm D-fucose 없이 성장 했다. GalK 성적 증명서 보완 프로브 광학 Cy3에 해당 염료와 활용을 때 교배 했다 (자료의 표 참조). 아래: 단계 대조에 같은 필드의 보기. (B) WT 세포와 성장 했다 또는 2mm 없이 위의 고 질 성 막의 2 μ M로 레이블이 지정 된 D-fucose 염색 (재료의 표 참조) 정착 하기 전에 20 분. 상위: 형광 이미지 galK의 smFISH를 사용 하 여 mRNA. 이미지는 100 × 한다 1.45 기름 침수 단계 대비 대물 렌즈를 사용 하 여 상용 소프트웨어에 의해 제어 되는 현미경으로 찍은 (재료의 표 참조)와 EMCCD 카메라 (재료의 표 참조). 사용 되는 필터 재료의 표에 설명 된 대로 했다. 단계 대조 이미지 13 조각의 z 스택 및 250 nm 간격의 형광 이미지 2 각 조각에 대 한 통합 시간을 인수 했다. 중간: 위상 대비 영상 같은 필드의 보기. 아래: 셀 자료 테이블에 설명 된 적절 한 필터 닥터지 형광 표식으로 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: smFISH에 폭풍 같은 프로브와 함께 표시 하는 성적 설정 sodB의 이미징. (A) 탑: smFISH 이미지 sodB의 형광의 개별 대장균 에 mRNA 세포. MG1655 야생-타입 스트레인 (WT) 또는 JW1648 (게이오 컬렉션) sodB-삭제 스트레인 (ΔsodB)19 파운드 매체에서 성장 했다. SodB 성적 증명서 보완 프로브 광학 Cy5에 해당 염료와 활용을 때 교배 했다 (자료의 표 참조). 아래: 단계 대조에 같은 필드의 보기. (B) 형광 분자 (개별 색된 점) 폭풍에 의해 지역화의 오버레이 (670 nm 방출)와 보기의 동일한 필드에서 세포 막의 스냅샷. 셀 닥터지 염료, 488에는 아르곤 레이저와 흥분된으로 표시 했다 510에서 방출 피크와 최대 전력 (0.05 원/cm2)의 1%에 nm nm와 적절 한 군데와 필터 (재료의 표 참조). WT 및 sodB 세포 위에서 설명한 대로 성장 하 고는 2로 표시 했다 μ M 질 성 막 염료 (재료의 표 참조) 20 분에 대 한 고정 하기 전에. 최고 해상도 이미지는 상업 현미경으로 기록 되었다 (재료의 표 참조). 염료 광학 해당 Cy5 하와 이라는 성적표는 647에 여기 레이저를 사용 하 여 현지 했다 폭풍우를 위한 이미징 버퍼에 nm. 이미지는 60 x, 나 1.2 물 침수 목표를 사용 하 여 기록 된 (재료의 표 참조)와 EMCCD 카메라 (재료의 표 참조) 이득 50 설정, 프레임 속도 50 Hz에서, 그리고 647 405 nm 레이저 5 0.05 원/c m2 에서 설정의 최대 힘 각각. 인수 하는 프레임의 총 수는 8, 000 이었다. 상용 소프트웨어를 사용 하 여 분석 하는 데이터 (자료 표 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리 smFISH 방법2를 사용 하 여 대장균 세포에 다른 유전자의 사본 수 우리의 실험실에서 측정 했습니다. 간단히,이 절차는 다음 단계로 구성 됩니다: 셀 고정, 프로브 삽입을 허용 하는 세포 막의 permeabilization 교 잡, 프로브 및 영상 표준 형광 현미경을 사용 하 여 샘플. 이 절차는 일부 수정6,,716게시 했던 것 들을 기반으로 합니다. 그것은 이전 알려졌다 그 smFISH 필요 oligonucleotide 프로브 수 신호 배경7이상 거짓말을 달성 하기 위하여 범위 48-72에에서 거짓말. 우리는이 수 실제로 작은20, 유전자 시퀀스의 관심, 광학 설치, 및 특정 실험 조건에 따라 있을 수 있습니다 나타났습니다.
각 프로브는 17-22 뉴클레오티드 길이, 적어도 2의 간 프로브 분리 해야 ~ 45%, 비 특정의 효과 줄이기 위해 GC 내용과 뉴클레오티드 오프-대상 바인딩. 일부 조사 대상 바인딩할 실패할 수 있으며 고정 및 교 잡21의 조건 등 실험 절차의 수정에 의해 바인딩의 전반적인 효율성을 최적화할 수 있습니다. 고려 되어야 하는 중요 한 요소가 fluorophores의 선택입니다. 그것은 사진 표백 낮은 민감도와 염료와 프로브를 좋습니다. 사진 표백 최소화의 노출 시간과 조명 소스, 이미지 수집, 통합 시간 최적화 및 시스템을 청소 하는 산소의 추가 의해 얻을 수 있습니다.
일반적인 바인딩 이벤트의 범위는 대상에 유전자에서에서 삭제 됩니다, 예를 들면 게이오 컬렉션19긴장에서 세포와 smFISH 실험을 수행 하 여 부과 한다. 배경 신호가 높은 경우에, 수와 단계 세척 기간 증가 한다, 또는 셀 해야 1 시간에 30 ° C에 세척 버퍼에서 incubated 하 고 두 번 씻어. 또한, 백그라운드를 줄이기 위해, formamide 농도 (10-40 %v / v 비율)는 교 잡에 워시 버퍼를 최적화 하기 위해 제안입니다. Formamide 농도 증가 일반적인 바인딩 줄어들지만 또한 조사 대상의 바인딩을 줄일 수 있습니다 mRNA. 교 잡 단계에서 그것을 제거 하는 중요는 상쾌한입니다. 희석 교 잡 버퍼는 라벨 효율 감소 이어질 수 있습니다. 또한, 대상 RNAs 충분히 긴 배경 위에 잘 된 자리를 얻으려면 해야 합니다. 최근 개선 신호에 잡음 비율 및 바인딩 프로브의 백본 수정 지금 통해 특이성 확인 짧은 RNA 검출 수 조각, 진 핵 microRNAs 등 세균성 작은 비 코딩 RNAs2, 10. 정량 PCR7,16smFISH에 의해 얻은 평균 복사 번호를 확인 합니다 것이 좋습니다.
우리이 방법은 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍)11를 사용 하 여 더 높은 광학 해상도 대장균 에 증명서의 지역화를 사소한 변경 수정할 수 있습니다이 원고에 나타났습니다.
요약 하자면, smFISH 증명서 번호-셀의 직접 측정 및 진핵생물과 원핵생물에서 셀에 대상 증명서의 지역화를 허용 하는 RNA 조명에 대 한 다양 한 방법입니다. 그것은 유전자 발현의 기본 프로세스에 대 한 정량적 인 정보를 제공 하 고 쉽게 수 폭풍 이미징에 대 한 구현.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 이스라엘 과학 재단 부여 514415 (대표)와 BSF NSF (MCB) 그랜트 2016707 (대표)에 의해 지원 되었다. 지 그 프 리드와 Irma Ullman 교수의 자 (제) 또한 인정에서 지원 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker - Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen - Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 - 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24x60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
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| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
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References
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