Summary
Эта рукопись описывает метод для маркировки отдельных матричная РНК (мРНК) стенограммы датчиками дневно меченых ДНК, для использования в одной молекулы флуоресценции в situ гибридизация (smFISH) эксперименты в E. coli. smFISH — метод визуализации, который позволяет одновременного обнаружения, локализации и количественной оценки одной молекулы мРНК в фиксированных отдельных ячеек.
Abstract
Описан метод для маркировки отдельных матричная РНК (мРНК) стенограммы в фиксированных бактерий для использования в одной молекулы флуоресценции в situ гибридизация (smFISH) эксперименты в E. coli. smFISH позволяет измерение к ячейке изменчивости в мРНК копировать количество генов интерес, а также субцеллюлярные расположение стенограммы. Основные шаги, фиксация культуры бактериальных клеток, permeabilization клеточных мембран и гибридизации целевой стенограммы с наборами коммерчески доступных короткие дневно меченых олигонуклеотидных зондов. smFISH может позволить изображения стенограммы нескольких генов в той же ячейке, с ограничения, налагаемые спектральных дублирования между различными флуоресцентных маркеров. После завершения протокола, показанная ниже клетки может быть легко образы с помощью микроскопа, в сочетании с камерой для низк интенсивности флуоресценции. Эти изображения, а также контуры клеток, полученные от сегментации фазы контраст кадров, или от пятнать клеточных мембран, позволяют рассчитать мРНК копии номер распределения образец клеток с открытым исходным кодом или заказ программного обеспечения. Обозначая метод, описанный здесь может также применяться для изображения стенограммы с стохастических оптических реконструкции микроскопии (шторм).
Introduction
Stochasticity является фундаментальных и неизбежным аспектом экспрессии генов и приводит к ячейке неоднородность1, как на уровне стенограммы и белки2,3. Количественная оценка изменчивости между ячейками при четко определенных условиях открывает уникальный в основные процессы, которые лежат в основе экспрессии генов и его регулирования. Одним из важных источников неоднородности ячеек в бактерий происходит на уровне транскрипционный анализ. Стенограмма цифры варьируются не только благодаря stochasticity транскрипции, но и post-transcriptional процессы, такие как регулирование малых молекул РНК и RNAases2. Одним из способов прямого доступа к этой неоднородности в количественных моды является дневно пометки отдельных стенограммы данного гена в smFISH. Эта методология позволяет обнаружение и локализация внутриклеточных конкретных молекул РНК в фиксированной,4отдельных бактериальной клетки. мРНК гибридизированных с набором дневно меченых ~ 20 база Лонг олигонуклеотиды, которые предназначены для привязки выборочно стенограммы интерес5,6. Несколько маркировки обеспечивает обнаружение выше фона флуоресценции, и отдельные молекулы мРНК появляются как дифракционный пятна под флуоресцентным микроскопом7 (см. Рисунок 1). Существуют другие подходы для маркировки молекулы мРНК, в которых дополнительные олигомера зонды нести конъюгированных гаптенами (например, биотин или digoxigenin), которые обнаруживаются с помощью вторичных дневно меченых репортер методы8.
Существуют другие методы, которые обеспечивают количественной информации о стенограммы, в дополнение к smFISH. Некоторые, такие как Северная пятно или количественного PCR, зонд основная и таким образом можно измерить количество мРНК копий ни их позиции в отдельных клетках. Поэтому эти методы не подходят для количественного определения изменчивости к ячейке. Недавно на основе изображения метод, который позволяет для количественной оценки как копирование количество РНК в клетки, так и их внутриклеточного расположения, называется мультиплексированием ошибка надежные флуоресценции в situ гибридизация (MERFISH) был разработан. MERFISH основан на уступки уникальный штрих-код, состоящий из определенной комбинации из фиксированного числа дневно меченых олигонуклеотидных зондов. Эти штрих-коды зачитываются в последовательных раундов smFISH измерений, с Фотообесцвечивание ниже каждого раунда гибридизации, тем самым увеличивая пропускную способность на два порядка9,10. Эта техника требует автоматизированных жидкости, обработка системы и надлежащего дизайн набора зонд.
Сочетание нескольких флуоресценции маркировки отдельных стенограмм, а также Роман суперразрешением методы, такие как стохастические оптических реконструкции микроскопии (шторм)11, позволяет десятикратное увеличение в резолюции Локализация внутриклеточных стенограмм. В шторм подходящее сочетание флуоресцентных зондов и визуализации буфера позволяет несколько циклов флуоресценции выбросов на молекулу зонд (мигает). ШТОРМ может также использоваться для изображения транскриптом E. coli и наблюдать пространственной организации генома общесистемной РНК, путем маркировки одновременно все стенограммы интерес12.
Все методы одноклеточных, рассмотренных выше основаны на визуализации стенограммы в стационарных клетках. Следовательно они не обеспечивают никакой информации относительно кинетических свойств стенограммы внутри клетки. Чтобы следовать стенограммы в живые клетки13, мРНК могут быть помечены сплавливанием гена интереса к массиву привязки сайтов. Эти последние затем распознаются RNA-связывая протеин, например бактериофага MS2 пальто белка, который сливается с флуоресцентных белков, таких как Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП)10,14,15.
Здесь мы описываем метод для маркировки индивидуальных mRNAs с набором зондов дневно меченых ДНК, для использования в smFISH эксперименты, в частности в E. coli. Кроме того мы показываем, что та же схема маркировки могут быть использованы для измерения ШТОРМА с незначительными изменениями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. зонд дизайн
Примечание: Этот протокол использует коммерчески доступных олигонуклеотидных зондов, уже отмеченных флуорофоров. Датчики состоят из набора специфических последовательностей взаимодополняющие цели мРНК, каждый зонд конъюгированных к одной молекулы флуоресцентные. Кроме того это возможность прикрепления флуоресцентные маркеры зонды, как описано в других разделах5,16.
- Дизайн smFISH зонды с помощью зонда дизайнер16 алгоритм, разработанный Арджун рай (van Oudenaarden лаборатории, Массачусетский технологический институт); последовательности smFISH датчики, используемые в этой рукописи, перечислены в таблице материалов.
Примечание: Минимальное количество зондов в наборе для обнаруженный сигнал составляет ~ 30. Точное число может варьироваться в зависимости от гена интереса, особенно если очень краткое стенограммы измеряются. - Выберите краситель, который соответствует оптические установки (см. таблицу материалов).
Примечание: Cy3 красителя или оптически эквивалент краска с низкой восприимчивости к фото отбеливание, настоятельно рекомендуется. Кандидат в двойной маркировки является Cy5 или оптически эквивалент красителя (см. таблицу материалов). Подходящие красители для ШТОРМА изображений помечены мРНК характеризуются их потенциала для нескольких циклов флуоресценции выбросов. Некоторые smFISH красители могут быть использованы для ШТОРМА изображений (см. таблицу материалов). Чтобы изображение двух (или более) стенограммы, соответствующих различных генов в одной ячейке, следует выбрать зонды олигонуклеотида, конъюгированных красители, чьи спектры имеют мало или нет дублирования.
2. Реагент подготовка
Примечание: Важно хранить пробы, RNAse бесплатно с помощью свободной РНКазы расходных материалов например отфильтрованных наконечники и трубки и чтобы любой рабочей среды в чистоте. Во избежание деградации транскриптов целевой все реагенты используемые после фиксации клетки должна быть свободной от нуклеиназы (см. таблицу материалов) или Диэтилпирокарбонат (DEPC)-лечение и стерилизации.
- Буферы для smFISH
- Подготовьте свободный РНКазы ПБС (фосфатный буфер, решение с фосфатного буфера концентрации 0,01 М и концентрация хлорида натрия 0,154 М, (рН 7,4)). Разбавить бесплатно РНКазы PBS 10 x (см. таблицу материалов) в свободной от нуклеиназы воды (см. таблицу материалов) в 1:10 соотношение v/v.
- Можно также подготовить DEPC-лечение 1 x PBS.
- Подготовка, RNase бесплатно 2 x SSC (буфер солевой раствор натрия цитрата, 0.3 М NaCl в 0,03 М цитрат натрия, (рН 7,0)). Разбавить РНКазы бесплатно 20 x SSC (см. таблицу материалов) в свободной от нуклеиназы водой 1:10 соотношение v/v.
- Кроме того, готовить DEPC-лечение 2 x SSC.
- Подготовьте свободный РНКазы ПБС (фосфатный буфер, решение с фосфатного буфера концентрации 0,01 М и концентрация хлорида натрия 0,154 М, (рН 7,4)). Разбавить бесплатно РНКазы PBS 10 x (см. таблицу материалов) в свободной от нуклеиназы воды (см. таблицу материалов) в 1:10 соотношение v/v.
- Олигонуклеотидных зондов Стоковый раствор.
- Повторно растворить смесь сушеных олигонуклеотида зонд в 200 мкл буфера TE (10 мм трис-HCl, 1 ЭДТА, pH 8.0) для создания запаса зонд 25 мкм. смесь хорошо, закупорить вверх и вниз, а затем вихря и центрифуги кратко.
- Чтобы избежать замораживания и оттаивания Стоковый раствор трубки, сделайте несколько аликвоты Стоковый раствор, соответствующая сумма будет использоваться в один экспериментальный запуск. Хранят раствор при температуре-20 ° C или ниже и защищать от света.
Примечание: Зонд набор 5 нмоль может обеспечить до 250 реакций гибридизации.
- Гибридизация буфера (после Скиннер и др. 7 ):
- Добавьте 5 мл нуклеиназы свободной воды 50 мл полипропиленовые коническое дно трубки. Добавьте 1 g декстран сульфата в воде и растворить его в энергичной vortexing. Перемешайте содержимое в орбитальный шейкер, пока пузырьки исчезают (~ 30 мин).
- Добавьте в решение 3,530 мкл дейонизированной формамид, 10 мг E. coli tRNA, 1 мл 20 x SSC, 100 мкл, комплекса ванадила ribonucleoside 200 мм и 40 мкл 50 мг/мл BSA. Принесите окончательный объем до 10 мл добавлением DEPC-лечение водой или нуклеиназы свободной воды и вихревой решения до тех пор, пока это однородные.
Примечание: Чтобы избежать замораживания и оттаивания решения, сделать несколько аликвоты Стоковый раствор, соответствующая сумма будет использоваться в один экспериментальный запуск. Хранят раствор при температуре-20 ° C. Убедитесь в том позволить формамид нагреть до комнатной температуры перед открытием бутылки. Для уменьшения фона, предлагается для калибровки оптимальный формамид концентрации (10-40% v/v соотношение).
Осторожностью: ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Формамид высокотоксичных и известный систему или тератогеном. Избегайте контакта с глазами и кожей, вдыхания или проглатывания. Обрабатывать его под вытяжной шкаф при ношении лабораторный халат и защитные перчатки. - Стерилизуйте решение путем передачи его через фильтр 0,22 мкм. Оставайтесь на аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C до одного года.
- Подготовить фиксации буфера (4,6% формальдегида в однократном ПБС) путем добавления ПБС 37% формальдегида (v/v) (см. 2.1.1) v/v соотношение 1:8 и вихря.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Формальдегид является высокотоксичным и известный канцероген. Обрабатывать его под вытяжной шкаф при ношении лабораторный халат и защитные перчатки. - Подготовить мыть буфер для smFISH (20% формамида в 2 x SSC), добавив дейонизированной формамид 2 x SSC (см. 2.1.2) v/v соотношение 1:4 и вихря.
- Подготовка изображений буфер для smFISH, добавив 5 мм cysteamine и кислорода мусорщиков (7 мкм глюкозооксидаза, 56 Нм каталазы и 10% глюкозы (w/v)) мыть буфера (20% формамида в 2 x SSC)
- Буферы для ШТОРМА
- Подготовка буфера A, добавляя 50 мм трис-HCl и 10 мм NaCl нуклеиназы свободной воды.
Примечание: Магазин на RT лет. - Подготовка буфера B, добавляя 50 мм трис-HCl, 10 мм NaCl и 10% w/v глюкозы нуклеиназы свободной воды.
Примечание: Хранить при 4 ° C на срок до одного года. - Подготовьте МПС буфера путем растворения cysteamine 77 мг в 1 мл буфера A (делает решение 1 М).
Примечание: Он может храниться при температуре 4 ° C на 1 месяц. - Подготовка Gloxy буфера, добавив 8,440 AU (условные единицы) глюкозооксидазы и 70,200 AU каталазы в 1 мл буфера а.
Примечание: Делает 50 x Стоковый раствор, он может храниться при температуре 4 ° C на 1 месяц. - Подготовка изображений буфер для ШТОРМА, добавляя 50 мм МПС буфера и 1 x Gloxy буфера для буфера б.
Примечание: Изображения буфера для ШТОРМА состоит из 5 мм cysteamine, мусорщиков кислорода (7 мкм глюкозооксидазы и 56 Нм каталаза) 50 мм трис с 10 мм NaCl и 10% глюкозы при pH 8.0. Подготовка перед изображений, она может храниться и использоваться на RT для приблизительно 2Н.
- Подготовка буфера A, добавляя 50 мм трис-HCl и 10 мм NaCl нуклеиназы свободной воды.
3. образец фиксации
- Расти бактериальной клетки (например, е.
Примечание: Для определения фона из-за привязки неспецифической зондов, измерения в штамм, в котором был удален гена интереса должны проводиться, следуя тем же процедурам (см. Δgalk вsodB Рисунок 1 и Δ в Рисунок 2).
Примечание: Если выбранный Микроскоп не имеют Фазовый контраст или возможности контраст дифференциальной помехи, E. coli наружной мембраны могут быть помечены с 2 мкм липофильных флуоресцентных маркеров (см. таблицу материалов), который следует добавить в бактериальная суспензия 20 мин до фиксации17. Фиксация и дальнейшего лечения осуществляется, как описано ниже. Должны позаботиться о том, чтобы выбрать маркер флуоресцентные, имея другой спектр излучения, чтобы свести к минимуму спектральных совпадения с надписью зонд набором.
4. образец Permeabilization
- Очень тщательно удалите супернатант. Используйте небольшой объем пипетки, при необходимости удалить все жидкости вне гранулы.
- Ресуспензируйте в 300 мкл DEPC-лечение или нуклеиназы свободной воды. Добавить 350 мкл высококачественного абсолютного этанола (99%) и осторожно перемешать, инвертирование трубки. Мкл еще 350 этанола и смесь еще раз, чтобы достичь концентрации окончательный этанол 70% (v/v соотношение).
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Этанол является горючим. - Вращать образец с трубки ротатор на 20 об/мин в течение 1 ч при комнатной температуре (RT), или на 4 ° C на ночь. Образцы могут храниться при температуре 4 ° C до одной недели.
5. Гибридизация
- Пелле клетки центрифугированием 7 мин, 750 x g, 4 ° C. Удалите супернатант.
- Добавьте 1 мл 20% мыть буфер для образцов и оставить стоя за несколько минут, или пипетки для полного растворения гранул.
- Пелле клетки центрифугированием за 7 мин., на 750 x g, 4 ° C.
- Очень осторожно удалите супернатант, закупорить. При необходимости удалить все жидкости вне гранулы используйте малообъемной пипетки.
- Добавить зондов олигонуклеотида равным Алиготе буфера гибридизации Стоковый раствор таким образом, чтобы концентрация окончательный олигонуклеотида 250 Нм; вихревой энергично.
Примечание: Один можно пометить два или более различных целевых mRNAs сразу в той же ячейке. Добавление наборов зонд обеих целей в гибридизации буфер. Необходимо выбрать красители, имеющих различные спектры выбросов к минимуму спектральных дублирования (например, Cy3 и Cy5). Убедитесь, что образцы, предназначенные для ШТОРМА изображений гибридизированных с олигонуклеотида зонд, набор конъюгированные с подходящей краской для ШТОРМА (например, в таблице материалов). - Приостановите образцов (см. шаг 5.4) в 50 мкл гибридизации буфер, который содержит зонды олигонуклеотида, избегая поколения пузыри (решение довольно вязкий).
- Оставьте на ночь образцы на горячей блок при 30 ° C в темноте.
Примечание: После этого, образцы могут храниться на срок до 6 месяцев при 4 ° C.
6. мытье
- Используйте один новые пробки microcentrifuge для каждого образца изображения. Добавьте 1 мл мыть буфера.
- Мкл 10-15 от гибридизированные образцов новой трубы, содержащий буфер мыть и микс/Вортекс.
- Пелле клетки центрифугированием 7 мин, 750 x g при 4 ° C. Удалите супернатант.
Примечание: Для уменьшения фона, Инкубируйте 1 час при температуре 30 ° C. - Мыть два раза больше (Ресуспензируйте в 1 мл мыть буфера, центрифуги и удаление гранул).
- Ресуспензируйте 25 мкл буфера мытья.
Примечание: Для того, чтобы уменьшить фото Отбеливание одного можно добавить в буфер мыть кислородной очистки системы (2.6) для повышения стабильности красителя в одной молекулы флуоресценции эксперименты6.
7. подготовка проб для изображений
Примечание: Клетки должны быть иммобилизованным для обеспечения надлежащего изображений под микроскопом флуоресценции и фазово контрастной. Следующие методы могут использоваться для подготовки образцов, в которых различные поля зрения может отражаться на разные фокальной плоскости.
- Подготовка геля агарозы
- Добавьте агарозы 150 мг в 10 мл 2 x SSC буфер. Не добавляйте 2 x SSC агарозы, иначе он не будет правильно распустить.
- Микроволновая печь для 10-15 s каждый раз до тех пор, пока большие пузырьки начинают формироваться. Отложите остыть в течение нескольких минут.
- Место отделяя силиконовые рамка на слайде, так что центр слайд по-прежнему подвергаются.
- Место 10 мм широкий (толщиной 1-2 мм) жесткое кольцо в центре слайда и внесите небольшое количество геля в нем, для уплотнения. Подождите несколько минут для того чтобы затвердеть.
- Добавьте больше гель, пока не образуется высокой куполообразной формы. Подождите 10 минут для упрочнения для его и снимите кольцо (с помощью тонкой пинцета или любой другой метод).
- Депозит ~ 10 мкл промывают бактериальных клеток (см. 6.5) на гель и печать с coverslip слайд #0.
- Подготовка образца камеры для smFISH
- В качестве альтернативы (к шагу 7.1) подготовить образцы для изображений, иммобилизирующие промывают бактериальные клетки (см. 6.5) на поли D-лизин покрытием стекла дно одноразовые пластиковые Петри.
- Проинкубируйте образцы в темноте, при комнатной температуре, в ночь перед визуализацией, чтобы позволить адгезии клеток на поверхности. До визуализации раз промойте мыть буфера (. 5); Держите образец мокрые с мыть или buffer(2.5) или буфера для smFISH (2.6).
- Палата Пробоподготовка для ШТОРМА
- Подготовка образцов для ШТОРМА для изображений на поли D-лизин покрытием стекла дно одноразовые пластиковые Петри.
- Проинкубируйте образцы в темноте, на RT, на ночь. До визуализации мыть раз с мыть буфер для smFISH (2.5); и добавить изображения буфера для ШТОРМА (2.7.5).
8.Визуализация Стенограмма
- Изображение с оснащены моторизованного столика микроскопа-поля флуоресценции клеток (см. таблицу материалов).
Примечание: Для ШТОРМА модификации, используйте помечены краска способна несколько циклов эмиссии флуоресценции клеток. Изображение образца с помощью 3D супер резолюции съемочной системы (например, см. таблицу материалов). - Использование (рекомендуется) 60-100 x N.A > 1.3 масло погружения фазы контрастности объектива с мощным источником света, таких как ртуть или -металлогалогенные лампы; Также рекомендуются на основе Светодиодных источников света.
- Использование стандартного охлаждением ПЗС, идеально оптимизированный для уровня визуализации мычать свет, а не скорость (мы используем камеры с размером пикселя 16 мкм) (см. таблицу материалов).
Примечание: Использование из охлажденной EMCCD (электрон, умножая сочетании заряда устройства) камеры CCD камеры необходимо уменьшить тепловой шум, который предотвращает обнаружение, особенно одной молекулы. - Использовать фильтр задает для флуорофоров выбран.
- Чтобы правильно определить границы ячейки, получить изображения различных полей зрения каждого образца с фазы контраст оптики или маркировки дневно внешней клеточной мембраны. Получение изображений на различных фокальной плоскости (z стека) для всех каналов (обычно 13 фрагментов, разделенных 250 Нм принимаются).
Примечание: Моторизованного столика микроскопа и наборы фильтров должны управляться коммерческими (см. таблицу материалов) или собственного программного обеспечения, которое может захватить стек изображений в последовательности.
9. анализ данных
- Преобразуйте стеки изображений в подходящий формат для анализа данных.
- Оценить количество целевой копии mRNA от общей интенсивности флуоресцентные очагов в ячейке, а не от подсчета дискретных «места» как и других имеющихся в настоящее время протоколов.
- Провести анализ изображений с открытым исходным кодом18 или по плану программы. Подробная Визуализация данных и анализа Скиннер и др. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы провели измерения smFISH galK и sodB стенограмм в клетках E. coli . Стенограммы были гибридизированных с набором специфических последовательностей в дополнение к последовательности целевых объектов, каждый зонд конъюгированных к одной молекулы флуоресцентные (см. таблицу материалов). Флуоресценции и фазы контраст изображения MG1655 одичал типа штамм E. coli (WT) или JW0740 (Keio коллекции)19 galK исключить деформации (ΔgalK) подвергаются до 2 мм, D-Фукоза показаны на рисунке 1A и 1B. Клетки были зафиксированы по крайней мере 3 ч после воздействия D-Фукоза. Панели на рисунке 1A (вверху) показывают один кадр из 13, соответствующей высоты, на которой контуры клеток находятся в фокусе, представляющий уровень galK индукции в ответ на переменной внеклеточной концентрации D-Фукоза. Пятна в ячейках флуоресценции изображения соответствуют либо один или несколько galk стенограммы, и определение числа текст в каждой ячейке осуществляется путем определения количественных показателей локализованных флуоресценции. Многочисленные пятна видны в большинстве клеток, когда 2 мм D-Фукоза добавляется к бактериальной культуры, тогда как несколько пятна видны в отсутствие внеклеточного D-Фукоза. В ΔgalK штамм не пятна наблюдаются на фоне как ожидалось. Поверхности маркировки с липофильных флуоресцентных маркеров показано на рисунке 1B (внизу).
Кроме того мы образы sodB стенограммы в кишечной бактериальной культуры, выращенные в среде LB в фазе логарифмического роста. Флуоресценции и фаза контраст изображения smFISH в WT или JW1648 (Keio коллекции)19 sodB исключить деформации (ΔsodB) указаны на рисунке 2A. Панели в рисунок 2A (вверху) показывают один кадр из 13, соответствующей высоты, на которой ячейки контуры находятся в фокусе, представляющий уровень sodB. В ΔsodB деформации не пятна наблюдаются на фоне, как ожидалось.
Же культур были образы штурмом (вверху) и были определены периметры клеток с поверхности маркировки с помощью липофильных флуоресцентных маркер для иллюстрации локализации sodB внутри клетки. Окрашивание мембраны позволяет точное позиционирование стенограммы в ячейку (рис. 2B). ШтаммsodB Δ был взят в качестве фонового сигнала и определить размер минимальной кластера (см. рис. 2B). Средняя Стенограмма количество smFISH2 и шторм сопоставима.
Рисунок 1: воздействия на galK стенограмм D-Фукоза визуализируется с помощью smFISH. (A) топ: smFISH изображения флуоресценции galK мРНК в отдельных E. coli клетки. Штамм одичал типа MG1655 (WT) или JW0740 (Keio коллекция) galK -исключить деформации (ΔgalK)19 были выращены, с или без 2 мм D-Фукоза. GalK стенограммы были гибридизированных к дополнительных зондов, конъюгированных с оптически эквивалентно Cy3 красителя (см. таблицу материалов). Внизу: же поля зрения в фазово контрастной. (B) WT клетки были выращены с или без 2 мм D-Фукоза как выше и помечены с 2 мкм липофильных мембраны красителя (см. таблицу материалов) за 20 мин до фиксации. Вверху: флуоресценции образы galK мРНК, с помощью smFISH. Изображения были взяты с контролируемой коммерческого программного обеспечения с использованием 100 × N.A 1,45 нефти погружения фазы контрастности объектива микроскопа (см. таблицу материалов) и EMCCD камерой (см. таблицу материалов). Фильтры, используемые были, как описано в таблице материалов. Фаза контраст изображения была приобретена следуют z стек 13 ломтиками и 250 Нм интервал флуоресцентных изображений с 2 время интеграции s для каждого фрагмента. Средний: же поля зрения с фазово контрастной визуализации. Внизу: клетки помечены липофильных флуоресцентных маркеров, с соответствующими фильтрами, описанные в таблице материалы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Визуализация sodB стенограммы, помечены же зонд расположен в smFISH и шторм. (A) топ: smFISH изображения флуоресценции sodB мРНК в отдельных E. coli клетки. Штамм одичал типа MG1655 (WT) или JW1648 (Keio коллекция) sodB -исключить деформации (ΔsodB)19 были выращены в среде фунтов. SodB стенограммы были гибридизированных к дополнительных зондов, конъюгированных с красителем, оптически эквивалентно Cy5 (см. таблицу материалов). Внизу: же поля зрения в фазово контрастной. (B) наложение флуоресцентных молекул (отдельных цветных точек), локализованные штурмом (670 нм выбросов) и снимок клеточных мембран в том же поле зрения. Клетки были помечены липофильных краситель, возбужденных с Аргонового лазера на 488 Нм при 1% от максимальной мощности (0,05 kW/см2) с пик выбросов на 510 нм и образы с помощью фильтра (см. таблицу материалов). WT и sodB клетки были выросли как описано выше и обозначено с 2 мкм липофильных мембраны красителя (см. таблицу материалов) за 20 мин до фиксации. Супер-разрешение изображения были записаны с микроскопом коммерческой (см. таблицу материалов). Стенограммы, помечены с красителем, оптически эквивалентна Cy5 были локализованы, с помощью лазерного возбуждения в 647 Нм в визуализации буфера для ШТОРМА. Изображения были записаны с использованием 60 x, NA 1.2 Цель погружения в воды (см. таблицу материалов) и EMCCD камерой (см. таблицу материалов) с увеличением на 50, частота 50 Гц, а максимальная мощность 647 и 405 нм лазеры на 5 и 0,05 kW/см2 , соответственно. Общее количество приобретенных кадров был 8000. Данные были проанализированы с использованием коммерческого программного обеспечения (см. таблицу материалов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы измерили в нашей лаборатории Стенограмма количество различных генов в клетках E. coli , с помощью метода smFISH2. Короче говоря, эта процедура состоит из следующих этапов: клетки фиксации, permeabilization мембран для проникновения щупа, зонд гибридизации и образцы изображений, используя стандартный флуоресцентным микроскопом. Эта процедура основана на ранее опубликованные те, с некоторыми изменениями по6,7,16. Ранее сообщалось, что smFISH требует, чтобы количество зондов олигонуклеотида лежат в диапазоне 48-72, для достижения сигнал лежа намного выше фона7. Мы показали, что это число может быть меньше, на самом деле20, в зависимости от последовательности гена интереса, оптические установки, и конкретных экспериментальных условиях.
Каждый зонд должен быть 17-22 нуклеотидов длиной, с разделением между зонд по крайней мере двух нуклеотидов и GC содержание ~ 45%, с тем чтобы уменьшить последствия неспецифической, мимо цели привязки. Некоторые датчики могут не привязывать целью, и общей эффективности привязки может быть оптимизирована путем модификации экспериментальных процедур, таких как условия фиксации и гибридизации21. Важным фактором, который должен приниматься во внимание является выбор флуорофоров. Настоятельно рекомендуется для обозначения зонды с краской с низкой восприимчивости к фото отбеливания. Фото отбеливание минимизации может быть достигнуто путем оптимизации времени экспозиции, освещения источников и интеграции времена захвата изображений и добавление кислорода, очистки системы.
Степени неспецифической привязки событий должны оцениваться путем проведения экспериментов smFISH с ячейками от штаммов, в котором целевой гены будут удалены, например из коллекции Keio19. Если фон сигнала высок, следует увеличить количество и продолжительность стирки шаги, или клетки должны быть инкубирован в буфере стирка при 30 ° C для 1 h и затем промывают дважды. Кроме того для уменьшения фона, предлагается оптимизировать формамид концентрации (10-40% v/v соотношение) в гибридизации и мыть буферов. Повышение концентрации формамид уменьшает неспецифического связывания, но также может уменьшить привязки зондов к целевому мРНК. Во время шага гибридизации важно удалить супернатант полностью; разбавить гибридизации буфер может привести к снижение эффективности маркировки. Кроме того целевой RNAs должен быть достаточно продолжительным для того, чтобы получить пятно хорошо локализованных выше фона. Недавние усовершенствования в сигнал-шум коэффициенты и привязки специфика через позвоночник модификации зондов теперь сделать это можно определить более короткие РНК фрагменты, например эукариотических микроРНК или бактериальной малых некодирующих RNAs2, 10. Мы рекомендуем, что означает копирование число, полученное путем smFISH должны быть проверены с количественного PCR7,16.
В этой рукописи мы показали, что этот метод может быть изменен с незначительными изменениями для изучения локализации стенограммы в E. coli с оптическим разрешением с помощью стохастических оптических реконструкции микроскопии (шторм)11.
В целом smFISH является универсальным методом, для освещения РНК, который позволяет прямое измерение ячеек изменчивость числа Стенограмма и локализации целевого стенограммы в ячейке, прокариот и эукариот. Она обеспечивает количественную информацию об основных процессов экспрессии генов и может быть легко реализовано для ШТОРМА изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Израиль научного фонда Грант 514415 (и.с.) и BSF-NSF (MCB) Грант 2016707 (и.с.). Поддержка Зигфрид и Ирма Ульман, также признается профессорской кафедры (чтобы и.с.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker - Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen - Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 - 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24x60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa | |||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa |
References
- Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601 (2014).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
- van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523 (2016).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), Elsevier Inc. (2010).
- Skinner, S. O., La Sepúlveda,, Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628 (2014).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
- van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
- Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
- Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence "Turn-On" Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
- Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), Elsevier Inc. (2008).
- So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
- Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
- Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8 (2006).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).
