Summary
Detta manuskript beskriver en metod för märkning enskilda budbärar-RNA (mRNA) avskrifter med fluorescently-märkt DNA sonder, för användning i singel-molekyl fluorescens i situ hybridisering (smFISH) experiment i E. coli. smFISH är en visualisering metod som tillåter den samtidiga upptäckt, lokalisering och kvantifiering av enstaka mRNA-molekyler i fast enskilda celler.
Abstract
En metod som beskrivs för märkning enskilda budbärar-RNA (mRNA) avskrifter i fasta bakterier för användning i singel-molekyl fluorescens i situ hybridisering (smFISH) experiment i E. coli. smFISH tillåter mätning av cell-till-cell variabilitet i mRNA kopia antal gener av intresse, liksom subcellulär platsen för utskrifter. De viktigaste stegen är fixering av bakteriell cellkultur, vilket av cellmembran och hybridisering av målet avskrifter med uppsättningar av kommersiellt tillgängliga kort fluorescently-märkta oligonukleotiden sonder. smFISH kan tillåta avbildning av avskrifter av flera gener i samma cell, med begränsningar av spektral överlappningen mellan olika fluorescerande markörer. Efter slutförandet av det protokoll som illustreras nedan, celler kan lätt avbildas med ett mikroskop som tillsammans med en kamera som är lämplig för låg intensitet fluorescens. Dessa bilder, tillsammans med cell konturer erhållits från segmentering av fas kontrast ramar eller från cellmembranet färgning, tillåta beräkning av mRNA kopia nummer fördelningen av ett urval av celler använder öppen källkod eller custom skrivna programvara. Märkning metoden som beskrivs här kan också tillämpas på bilden avskrifter med stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi (STORM).
Introduction
Stochasticity är en grundläggande och oundviklig aspekt av genuttryck och ger upphov till cell-cell heterogenitet1, både på nivån av avskrifter och proteiner2,3. Kvantifiering av variabiliteten mellan celler under väl definierade förhållanden erbjuder ett unikt fönster i de grundläggande processer som ligger bakom genuttryck och dess reglering. En viktig källa till cell-cell heterogenitet i bakterier sker på transkriptionell nivå. Avskrift varierar inte bara på grund av stochasticity av transkription, men också att post-transcriptional processer såsom förordning av små RNAs och RNAases2. Ett sätt att direkt åtkomst till denna heterogenitet i en kvantitativ mode är av fluorescently märka enskilda avskrifter av en viss gen i smFISH. Denna metod tillåter att upptäcka och subcellulär lokalisering av viss RNA-molekyler i fast, enskilda bakterieceller4. mRNA är hybridiseras med en uppsättning av fluorescently-märkta ~ 20 base-långa oligonukleotider som är utformade för att binda selektivt till avskrifter av intresse5,6. Flera märkning säkerställer upptäckt över bakgrunden fluorescens, och enskilda mRNA-molekyler som diffraktion begränsad ställen under en fluorescens Mikroskop7 (Se figur 1). Det finns andra metoder för märkning mRNA-molekyler, som kompletterande oligomer sonderna bär konjugerade haptener (t.ex., biotin eller digoxigenin) som identifieras med hjälp av sekundära fluorescently-märkt reporter tekniker8.
Det finns andra metoder som ger kvantitativ information om utskrifter, förutom smFISH. Vissa, såsom nordligt blot eller kvantitativ PCR, sond huvuddelen och således kan mäta varken antalet mRNA kopior eller deras position i enskilda celler. Dessa metoder är därför inte lämpliga att kvantifiera cell till cell variabilitet. En senaste image-baserad teknik som möjliggör kvantifiering av både kopia antalet RNAs inom celler samt deras intracellulära läge, kallas multiplexed fel-robust fluorescens i situ hybridisering (MERFISH) har utvecklats. MERFISH baseras på tilldelningen av en unik streckkod som består av en definierad kombination från ett fast antal fluorescently-märkta oligonukleotiden sonder. Dessa streckkoder läses i sekventiella rundor av smFISH mätningar, med fotoblekning efter varje omgång av hybridisering, vilket ökar genomströmningen av två tiopotenser9,10. Denna teknik kräver en automatiserad vätskehantering system och ordentlig designen av sonden.
Kombinationen av flera fluorescens märkning av enskilda avskrifter, tillsammans med nya super-upplösning tekniker såsom stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi (STORM)11, möjliggör en tiofaldig ökning av upplösningen i den subcellulär lokalisering av avskrifter. I STORM möjliggör en lämplig kombination av fluorescerande sonder och imaging buffert flera cykler av fluorescens utsläpp per sonden molekyl (blinkande). STORMEN kan också användas för att bilden av E. coli transkriptom och respektera genome-wide rumsliga organisationen av RNA, genom märkning samtidigt alla avskrifter av intresse12.
Alla encellig metoder granskas ovan baseras på imaging avskrifter i fasta celler. De ger därför inte någon information om kinetiska egenskaper av avskrifter inom celler. För att följa avskrifter i levande celler13, kan mRNA märkas av fusion av genen av intresse för en rad bindande platser. Dessa sistnämnda redovisas sedan av en RNA-bindande protein, såsom bacteriophage MS2 coat protein, som smälts samman till en fluorescerande protein såsom grönt fluorescerande protein (GFP)10,14,15.
Här beskriver vi en metod för märkning enskilda mRNA med en uppsättning fluorescently-märkt DNA sonder, för användning i smFISH experiment, särskilt i E. coli. Vi visar dessutom att den samma etikettschema får användas för STORM mätningar med mindre modifieringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sonden Design
Obs: Detta protokoll använder kommersiellt tillgängliga oligonukleotiden sonder redan märkta med fluorophores. Sonderna består av en uppsättning specifika sekvenser komplement till måltavla mRNA, varje sond som konjugerat till en enstaka fluorescerande molekyl. Alternativt är det möjligt att fästa fluorescerande markörer sonder, som beskrivs på andra ställen5,16.
- Design smFISH sonder med Probe Designer16 algoritm utvecklad av Arjun Raj (van Oudenaarden Lab, Massachusetts Institute of Technology); sekvenser av smFISH sonder används i detta manuskript listas i tabellen av material.
Obs: Minsta antal sonder i en uppsättning för en detekterbara signal är ~ 30. Exakta antalet kan variera beroende på genen av intresse, särskilt om mycket korta avskrifter mäts. - Välja en färg som passar den optiska setup (se tabell material).
Obs: Cy3 färgämnet eller ett optiskt motsvarande färgämne med en låg känslighet för foto-blekning rekommenderas starkt. En kandidat för dubbel märkning är Cy5 eller ett optiskt motsvarande färga (se tabell material). Lämpliga färgämnen för STORM imaging märkt mRNA kännetecknas av sin kapacitet för flera cykler av fluorescens utsläpp. Vissa smFISH färgämnen kan användas för avbildning av STORM (se tabell material). För att bild två (eller fler) avskrifter som motsvarar olika gener i samma cell, bör man välja oligonukleotiden sonder konjugerat till färgämnen vars spectra har liten eller ingen överlappning.
2. REAGENSBEREDNING
Obs: Det är viktigt att hålla proverna RNAse-fri med hjälp av RNase-fri förbrukningsvaror såsom filtrerade pipettspetsar och rören, och att hålla någon arbetsmiljö ren. För att undvika nedbrytning av målet avskrifter, måste alla reagenser som används efter cell fixering nuclease-fri (se tabell material) eller diethylpyrocarbonate (DEPC)-behandlade och steriliseras.
- Buffertar för smFISH
- Förbereda RNase-fri 1 x PBS (fosfatbuffrad saltlösning, lösning med en fosfat buffert koncentration på 0,01 M och en natriumklorid koncentration av 0.154 M, (pH 7,4)). Späd RNase-fri 10 x PBS (se tabell material) i nuclease-fritt vatten (se tabell material) på en 1:10 baserat på v/v.
- Alternativt förbereda DEPC-behandlad 1 x PBS.
- Förbereda RNase-fri 2 x SSC (saltlösning-natriumcitrat buffert, 0.3 M NaCl i 0,03 M natriumcitrat, (pH 7,0)). Späd RNase-fri 20 x SSC (se tabell material) i nuclease-fritt vatten vid en 1:10 baserat på v/v.
- Du laga DEPC-behandlad 2 x SSC.
- Förbereda RNase-fri 1 x PBS (fosfatbuffrad saltlösning, lösning med en fosfat buffert koncentration på 0,01 M och en natriumklorid koncentration av 0.154 M, (pH 7,4)). Späd RNase-fri 10 x PBS (se tabell material) i nuclease-fritt vatten (se tabell material) på en 1:10 baserat på v/v.
- Oligonukleotid sonden stamlösning.
- Lös åter upp torkade oligonukleotiden sonden blandningen i 200 µL TE buffert (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) till skapa en sond lager av 25 µM. Blanda väl genom pipettering upp och ner, och sedan vortex och centrifugera kort.
- För att undvika frysning och tining av stamlösning röret, göra flera portioner av stamlösningen, motsvarar det belopp som förväntas användas i en enda experimentella kör. Lagra stamlösning vid-20 ° C eller lägre och ljuskänsligt.
Obs: En sond uppsättning 5 nmol kan ge upp till 250 hybridisering reaktioner.
- Hybridisering buffert (efter Skinner et al. ( 7 ):
- Tillsätt 5 mL nuclease-fritt vatten till en 50 mL polypropylen konisk botten röret. Tillsätt 1 g dextran sulfat till vattnet och lös upp det genom kraftig skakning. Blanda innehållet i orbitalskak tills bubblor försvinna (~ 30 min).
- Lägg till den lösning 3,530 µL avjoniserat formamid, 10 mg av E. coli tRNA, 1 mL 20 x SSC, 100 µL av 200 mM vanadyl-ribonucleoside komplex och 40 µL av 50 mg/mL BSA. Få 10 mL den slutliga volymen genom tillsats av DEPC-behandlad vatten eller nuclease-gratis vatten och vortex lösningen tills den är homogen.
Obs: För att undvika frysning och tining av lösningen, göra flera portioner av stamlösningen, motsvarar det belopp som förväntas användas i en enda experimentella kör. Lagra stamlösning vid-20 ° C. Var noga med att låta formamid varm rumstemperatur innan du öppnar flaskan. För att minska bakgrunden, föreslås det för att kalibrera den optimala formamid koncentrationen (baserat på 10-40% v/v).
Varning: VARNING! Formamid är mycket giftigt och en känd teratogen. Undvik kontakt med ögon eller hud, inandning eller förtäring. Hantera det under ett dragskåp iklädd en labbrock och skyddshandskar. - Sterilisera lösningen genom passering genom ett 0,22 µm filter. Håll i alikvoter och förvaras vid-20 ° C till ett år.
- Förbereda fixering buffert (4,6% formaldehyd i 1 x PBS) genom att lägga till 37% formaldehyd (v/v) 1 x PBS (se 2.1.1) på en 1:8 baserat på v/v och vortex.
FÖRSIKTIGHET: VARNING! Formaldehyd är mycket giftigt och cancerframkallande. Hantera det under ett dragskåp iklädd en labbrock och skyddshandskar. - Förbereda tvättbuffert för smFISH (20% formamid i 2 x SSC) genom att lägga till avjoniserat formamid 2 x SSC (se 2.1.2) till en 1:4 baserat på v/v och vortex.
- Förbereda imaging buffert för smFISH genom att lägga till 5 mM cysteamin och syre asätare (7 µM glukosoxidas, 56 nM katalas och 10% glukos (w/v)) för att tvätta buffert (20% formamid i 2 x SSC)
- Buffertar för STORM
- Förbereda buffert A genom att lägga 50 mM Tris-HCl och 10 mM NaCl nuclease-fria vattnet.
Obs: Förvara vid RT i år. - Förbereda buffert B genom att lägga till 50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl och 10% w/v glukos till nuclease-gratis vatten.
Obs: Förvara vid 4 ° C i upp till ett år. - Förbereda MEA buffert genom upplösning 77 mg cysteamin i 1 mL buffert A (gör en 1 M lösning).
Obs: Det kan lagras vid 4 ° C i 1 månad. - Förbereda Gloxy buffert genom att lägga till 8,440 AU (godtyckliga enheter) glukosoxidas och 70,200 AU katalas 1 ml buffert A.
Obs: Gör 50 x stamlösning, det kan lagras vid 4 ° C i 1 månad. - Förbereda imaging buffert för STORM genom att lägga till 50 mM av MEA buffert och 1 x Gloxy buffert till buffert B.
Obs: Imaging bufferten för STORM består av 5 mM cysteamin, syre rengöringsmedel (7 µM glukosoxidas och 56 nM katalas) i 50 mM Tris med 10 mM NaCl och 10% glukos vid pH 8,0. Förbereda strax före imaging, det kan lagras och användas vid RT för ca 2 h.
- Förbereda buffert A genom att lägga 50 mM Tris-HCl och 10 mM NaCl nuclease-fria vattnet.
3. prov fixering
- Växa bakterieceller (t.ex., E.
Obs: Kontrollera bakgrunden på grund av icke-specifik bindning av sonderna genom mätningar i en stam där genen av intresse har raderats bör genomföras, efter samma förfaranden (se Δgalk i figur 1 och ΔsodB i (Se figur 2).
Obs: Om mikroskopet valt inte har faskontrast eller differentiell störningar kontrast funktioner, E. coli yttre membran kan märkas med 2 μM lipofila fluorescerande markör (se tabell material), som bör läggas till de bakteriesuspensionen 20 min före fixering17. Fixering och ytterligare behandling är fulländade som beskrivs nedan. Var noga med att välja en fluorescerande markör med en annan emissionsspektrum, att minimera spektrala överlappningen med märkt-probe set.
4. prov permeabilisering
- Ta bort supernatanten mycket noggrant. Använd liten volym pipetter, om nödvändigt, att ta bort all vätska utanför pelleten.
- Återsuspendera i 300 μl DEPC-behandlad vatten eller nuclease-gratis vatten. Tillsätt 350 µL höggradig absolut etanol (99%) och blanda försiktigt genom att invertera röret. Lägga till en annan 350 µL etanol och blanda igen, för att nå en slutlig etanol koncentrationen av 70% (v/v-förhållandet).
FÖRSIKTIGHET: VARNING! Etanol är brandfarlig. - Rotera provet med en tube rotator på 20 rpm för 1 h i rumstemperatur (RT), eller vid 4 ° C över natten. Prover kan lagras vid 4 ° C till en vecka.
5. hybridisering
- Pellet celler genom centrifugering i 7 min, 750 x g, 4 ° C. Ta bort supernatanten.
- Tillsätt 1 mL 20% tvätta buffert till proverna och låt stå i flera minuter, eller pipetten att upplösa pelleten helt.
- Pellet celler genom centrifugering i 7 min, 750 x g 4 ° C.
- Ta bort supernatanten mycket försiktigt genom pipettering. Använd små volymer pipetter om nödvändigt att ta bort all vätska utanför pelleten.
- Lägg till oligonukleotiden sonden inställd stamlösning hybridisering buffert alikvoten så att den slutliga oligonukleotid koncentrationen är 250 nM. Vortex kraftigt.
Obs: Man kan märka två eller flera olika mål mRNA samtidigt i samma cell. Lägga till sonden uppsättningar av båda målen hybridisering bufferten. Var noga med att välja färgämnen med olika utsläpp spectra att minimera spektrala överlappningen (t.ex., Cy3 och Cy5). Se till att prover för STORM imaging är hybridiseras med en oligonukleotid sond som konjugerad med ett lämpligt färgämne för STORM (t.ex., i tabell material). - Avbryta prover (se steg 5,4) i 50 µL hybridisering buffert som innehåller oligonukleotiden sonderna, samtidigt undvika generationen av bubblor (lösningen är ganska trögflytande).
- Lämna prover över natten på en het block vid 30 ° C i mörker.
Obs: Efter detta prov kan förvaras i upp till 6 månader vid 4 ° C.
6. tvätt
- Använd ett nytt mikrocentrifug rör för varje prov till bild. Tillsätt 1 mL tvättbuffert.
- Tillsätt 10-15 µL hybridiserade prover till nya röret som innehåller tvättbuffert och mix/vortex.
- Pellet celler av centrifugering i 7 min, 750 x g vid 4 ° C. Ta bort supernatanten.
Obs: För att minska bakgrunden, inkubera i 1 h vid 30 ° C. - Tvätta två gånger mer (Återsuspendera i 1 mL tvättbuffert, Centrifugera och ta bort pellets).
- Återsuspendera i 25 µL tvättlösning.
Obs: För att minska foto-blekning en kan lägga till tvättbuffert en syre rensning system (2,6) för att förbättra dye stabilitet i singel-molekyl fluorescens experiment6.
7. beredning av prover för Imaging
Obs: Celler behöver vara orörlig för att möjliggöra korrekt imaging i fluorescens och faskontrast Mikroskop. Följande metoder kan användas för att förbereda prover där olika synfält kan avbildas på olika focal plan.
- Agaros gel förberedelse
- Lägg till agaros som 150 mg i 10 mL 2 x SSC buffert. Lägg inte till 2 x SSC till agaros, annars om det inte löser sig ordentligt.
- Mikrovågsugn för 10-15 s varje gång tills stora bubblor börjar bildas. Ställ åt sidan för att svalna några minuter.
- Placera en separerande silikon ram i bilden så att bildens centrum är exponerade.
- Placera en 10 mm bred (1-2 mm tjock) styv ring i mitten av bilden och sätta in en liten mängd gel i den, för tätning. Vänta några minuter för den att stelna.
- Lägg till mer gel tills en hög kupol form bildas. Vänta 10 min för den att stelna, och ta bort ringen (med fin pincett eller någon annan metod).
- Deponera ~ 10 μL av tvättade bakterieceller (se 6.5) på gel och tätning med en #0 täckglas bild.
- Kammaren provberedning för smFISH
- Alternativt (till steg 7,1) förbereda prover för avbildning av immobilisera de tvättade bakterieceller (se 6.5) på poly-D-lysin-belagda glas botten disponibla petriskålar av plast.
- Inkubera proverna i mörker vid rumstemperatur, över natten innan visualisering att möjliggöra vidhäftning av cellerna på ytan. Innan visualisering tvätta en gång med tvättbuffert (. 5); Förvara provet våt med buffer(2.5) eller imaging tvättbuffert för smFISH (2,6).
- Kammaren provberedning för STORM
- Förbereda prover för STORM för avbildning på poly-D-lysin-belagda glas botten disponibla petriskålar av plast.
- Inkubera proverna i mörker, vid RT, över natten. Innan visualisering tvätten en gång med tvättbuffert för smFISH (2,5); och Lägg till avbildning buffert för STORM (2.7.5).
8.Avskrift visualisering
- Bild celler med ett wide-fältet fluorescens Mikroskop utrustad med motoriserad steg (se tabell material).
Obs: För STORM modifiering, använda celler märkta med ett färgämne som är kapabel av flera cykler av fluorescens utsläpp. Bild provet med hjälp av 3D super-upplösning imaging system (t.ex., se tabell material). - Användning (rekommenderas) en 60-100 x Norlin > 1.3 olja nedsänkning fas kontrast objektiv med en stark ljuskälla, till exempel kvicksilver eller metallhalogen lampa; LED-baserade ljuskällor rekommenderas också.
- Använd en standard kylda CCD-kamera, idealiskt optimerad för låg-ljus nivå imaging snarare än hastighet (vi använda en kamera med 16 µm pixelstorlek) (se tabell material).
Obs: Användning av en kyld elektrisk (electron att multiplicera kostnad kopplad enhet) kamera CCD kamera är nödvändigt att minska termiska bruset som förhindrar identifiering, särskilt av enstaka molekyler. - Använd filtret anger lämpliga för den fluorophores som valts.
- För att avgöra korrekt cellgränserna, förvärva bilder av olika synfält i varje prov antingen med fas kontrast optik eller genom märkning fluorescently yttre cellmembranet. Skaffa bilder på olika focal planes (z-stack) för alla kanaler (vanligtvis 13 skivor åtskilda av 250 nm tas).
Obs: Motoriserad scenen för mikroskopet och filter bör styras av kommersiella (se tabell material) eller egen programvara som kan fånga en bunt med bilder i sekvens.
9. dataanalys
- Konvertera bildstaplar till ett lämpligt format för dataanalys.
- Uppskatta kopia antalet målet mRNA från totala intensiteten av fluorescerande foci i cellen, snarare än räknar diskret 'fläckar' som i andra tillgängliga protokoll.
- Utföra bildanalys med programvara med öppen källkod18 eller med en specialbyggd program. För Detaljer för data se imaging och analys Skinner et al. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi genomförde smFISH mätningar av galK och sodB avskrifter i E. coli celler. Avskrifter var hybridiseras med en uppsättning specifika sekvenser komplement till mål sekvensen, varje sond som konjugerat till en enstaka fluorescerande molekyl (se tabell material). Fluorescens och fas kontrast bilder av MG1655 vildtyp E. coli -stam (WT) eller en JW0740 (Keio samling)19 galK-bort stam (ΔgalK) utsattes för 2 mM D-fukos visas i figur 1A och 1B. Celler har korrigerats minst 3 h efter exponering för D-fukos. Panelerna i figur 1A (överst) visar en bildruta ur 13, motsvarar höjden där cellen konturer är i fokus, vilket motsvarar nivån på galK induktion svar på variabel extracellulära D-fukos koncentrationer. Ställen inom celler i fluorescens bilderna motsvarar antingen enkel eller några galk avskrifter och bestämning av antalet avskrift i varje cell utförs av kvantifiera lokaliserade fluorescens. Många ställen ses i de flesta celler, när 2 mM D-fukos läggs till den bakteriella kulturen, medan några ställen ses i avsaknad av extracellulära D-fukos. I ΔgalK stam observeras utan fläckar över bakgrunden som förväntad. Ytan som märkning med lipofila fluorescerande markör visas i figur 1B (nederst).
Dessutom avbildas vi sodB avskrifter i E. coli bakterie kultur vuxit i LB medium i logaritmisk tillväxtfasen. Fluorescens och fas kontrast bilder av smFISH i WT eller en JW1648 (Keio samling)19 sodB-bort stam (ΔsodB) visas i figur 2A. Panelerna i figur 2A (överst) visar en bildruta ur 13, motsvarar den höjd på vilken cell konturer är i fokus, vilket motsvarar nivån på sodB. I ΔsodB stam observeras utan fläckar över bakgrunden, som förväntade.
Ramen för cellerna bestämdes med yta märkning med en lipofil fluorescerande markör för att illustrera localizationen av sodB i cellerna och de samma kulturerna var fotograferad av STORM (överst). Färgning membranet tillåter exakt positionering av avskrifter i cellen (figur 2B). ΔsodB stammen togs som bakgrund signal och att bestämma den minsta klusterstorleken (se figur 2B). Genomsnittlig avskrift antalet smFISH2 och STORM är jämförbara.
Figur 1: effekter av D-fukos på galK avskrifter visualiseras med hjälp av smFISH. (A) topp: smFISH bilder av fluorescens av galK mRNA i enskilda E. coli celler. En MG1655 vildtyp stam (WT) eller en JW0740 (Keio samling) galK -bort stam (ΔgalK)19 har vuxit med eller utan 2 mM D-fukos. GalK avskrifter var hybridiseras till kompletterande sonder konjugerat med ett färgämne som är optiskt motsvarande Cy3 (se tabell material). Botten: samma synfält i fas-kontrast. (B) WT celler odlades med eller utan 2 mM D-fukos som ovan och märkta med 2 μM av en lipofila membran färga (se tabell material) för 20 min före fixering. Överst: fluorescens bilder av galK mRNA som använder smFISH. Bilder är tagna med ett mikroskop som kontrolleras av en kommersiell programvara som använder en 100 × N.A 1,45 olja nedsänkning fas kontrast objektiv (se tabell av material) och en elektrisk kamera (se tabell material). De filter som används var som beskrivs i tabellen av material. En fas kontrast bild förvärvades följt av en z-stack av 13 skivor och 250 nm avstånd fluorescerande bilder med 2 s integration tid för varje skiva. Mitten: samma synfält med faskontrast imaging. Botten: celler märkta med lipofila fluorescerande markörer, med lämpliga filter som beskrivs i tabellen material. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: avbildning av sodB avskrifter märkt med samma sond som i smFISH och STORM. (A) topp: smFISH bilder av fluorescens av sodB mRNA i enskilda E. coli celler. En MG1655 vildtyp stam (WT) eller en JW1648 (Keio samling) sodB -bort stam (ΔsodB)19 odlades i LB medium. SodB avskrifter var hybridiseras till kompletterande sonder konjugerat med ett färgämne som är optiskt motsvarande Cy5 (se tabell material). Botten: samma synfält i fas-kontrast. (B) överlagring av fluorescerande molekyler (enskilda färgade prickar) lokaliserade med STORM (670 nm utsläpp) och en ögonblicksbild av cellmembranen i samma synfält. Cellerna var märkt med ett lipofila färgämne, glada med en argon laser på 488 nm vid 1% av maximal effekt (0,05 kW/cm2) med ett utsläpp peak på 510 nm och avbildas med lämpliga filter (se tabell material). WT och sodB celler var odlas som beskrivs ovan och märkt med en 2 μM lipofila membran färga (se tabell material) för 20 min före fixering. Super-upplösning bilder var tagna med kommersiella Mikroskop (se tabell material). Avskrifter märkas med ett färgämne som är optiskt motsvarande Cy5 var lokaliserade med hjälp av en magnetisering laser på 647 nm i en tänkbar buffert för STORM. Bilder spelades med en 60 x, NA 1.2 vatten nedsänkning mål (se tabell av material) och en elektrisk kamera (se tabell material) med vinst på 50, bildhastighet på 50 Hz, och maximal kraft av 647 och 405 nm Laser vid 5 och 0,05 kW/cm2 , respektive. Det totala antalet ramar som förvärvade var 8000. Data analyserades med hjälp av kommersiell programvara (se material tabell). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vårt laboratorium har vi mätt avskrift antalet olika gener i E. coli celler med smFISH metod2. I korthet, detta förfarande består av följande steg: cell fixering, permeabilisering membran för sonden penetration, sond hybridisering och prova imaging med standard fluorescens Mikroskop. Detta förfarande bygger på tidigare publicerade de med vissa modifieringar6,7,16. Det har tidigare rapporterats att smFISH kräver att antalet oligonukleotiden sonder ligga i intervallet 48-72, för att uppnå en signal ligger väl över den bakgrund7. Vi har visat att detta antal kan faktiskt mindre20, beroende på gensekvensen intresse, den optiska setup och de särskilda villkor som experimentell.
Varje sond bör vara 17-22 nukleotider långa, med en mellan sonden separation av minst två nukleotider och GC innehåller ~ 45%, för att minska effekterna av icke-specifik, off-target bindande. Några sonder kan misslyckas att binda ett mål, och den övergripande effektiviteten i bindande kan optimeras genom ändringar av experimentella rutiner såsom villkoren för fixering och hybridisering21. En viktig faktor som måste beaktas är valet av fluorophores. Det rekommenderas starkt att märka sonderna med ett färgämne med låg känslighet för foto-blekning. Foto-blekning minimering kan uppnås genom optimering av exponeringstider, belysning källor och integration tider av bild förvärv och genom tillägg av en syre rensning system.
Omfattningen av icke-specifik bindning händelser bör bedömas genom att utföra smFISH experiment med celler från stammar i vilka mål gener raderas, till exempel från Keio samling19. Om bakgrunden signalen är hög, antalet och varaktighet av tvätt steg bör ökas, eller celler bör inkuberas i tvättbuffert vid 30 ° C i 1 h och sedan tvättas två gånger. Dessutom för att minska bakgrunden, föreslås det för att optimera koncentrationen av formamid (baserat på 10-40% v/v) i hybridisering och tvätta buffertar. Öka formamid koncentrationen minskar ospecifik bindning, men kan också minska bindningen av sonder till målet mRNA. Under hybridisering steg är det viktigt att avlägsna supernatanten helt; en utspädd hybridisering buffert kan leda till minskade märkning effektivitet. Målet RNAs måste dessutom vara tillräckligt lång för att få en väl lokaliserade platsen ovanför bakgrund. Senaste förbättringar i signal-brus nyckeltal och bindande specificitet genom ryggraden ändring av sonderna nu gör det möjligt att upptäcka kortare RNA fragment, såsom eukaryota mikroRNA eller bakteriell små icke-kodande RNAs2, 10. Vi rekommenderar att antalet genomsnittliga kopia erhållits genom smFISH ska valideras med kvantitativ PCR-7,16.
Detta manuskript har vi visat att denna metod kan ändras med smärre ändringar att studera localizationen av avskrifter i E. coli med högre optisk upplösning använder stokastisk optiska återuppbyggnad mikroskopi (STORM)11.
I sammandrag är smFISH en mångsidig metod för RNA belysning som tillåter direkt mätning av cell-cell variabiliteten i avskrift antal och lokalisering av målet avskrifter i cellen, i både Eukaryoter och prokaryoter. Det ger kvantitativ information om grundläggande processer av genuttryck och kan enkelt implementeras för STORM avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av en Israel Science Foundation grant 514415 (att J.S.) och BSF-NSF (MCB) bidrag 2016707 (att J.S.). Stöd från en Siegfried och Irma Ullman professur (att J.S.) är också erkänt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker - Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen - Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 - 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24x60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa | |||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa |
References
- Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601 (2014).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
- van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523 (2016).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), Elsevier Inc. (2010).
- Skinner, S. O., La Sepúlveda,, Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628 (2014).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
- van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
- Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
- Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence "Turn-On" Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
- Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), Elsevier Inc. (2008).
- So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
- Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
- Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8 (2006).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).
