Summary
Denne manuskriptet beskrives en metode til mærkning individuelle messenger RNA (mRNA) udskrifter med fluorescently mærket DNA-sonder, til brug i enkelt-molekyle fluorescens i situ hybridisering (smFISH) eksperimenter i E. coli. smFISH er en visualisering metode, der giver mulighed for samtidige påvisning, lokalisering og kvantificering af enkelt mRNA molekyler i faste individuelle celler.
Abstract
En metode er beskrevet for mærkning individuelle messenger RNA (mRNA) udskrifter i faste bakterier til brug i enkelt-molekyle fluorescens i situ hybridisering (smFISH) eksperimenter i E. coli. smFISH tillader måling af celle til celle variabilitet i mRNA kopi antal gener af interesse, samt subcellulært placeringen af udskrifter. De vigtigste trin involveret er fiksering af den bakterielle cellekultur, permeabilization af cellemembraner, og hybridisering af target udskrifter med sæt af kommercielt tilgængelige kort fluorescently mærket oligonukleotid sonder. smFISH kan tillade billeddannelse af udskrifter af flere gener i den samme celle, med begrænsninger af den spektrale overlapning mellem forskellige fluorescerende markører. Efter afslutningen af den protokol, der er illustreret nedenfor, celler kan let afbildning ved hjælp af et mikroskop, kombineret med et kamera, der er egnet til simpel-heftighed fluorescens. Disse billeder, sammen med celle konturer fremstillet af segmentering af fase kontrast billeder eller af cellemembranen farvning, tillade beregningen af mRNA kopi nummer distribution af en stikprøve af celler ved hjælp af open source eller brugerdefinerede-skrevet software. Den mærkning metode beskrevet her kan også anvendes på billedet udskrifter med stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM).
Introduction
Stochasticity er en grundlæggende og uundgåelige aspekt af genekspression og giver anledning til celle-celle heterogenitet1, både på niveauet af udskrifter og proteiner2,3. Kvantificere variabiliteten mellem celler under veldefinerede betingelser tilbyder et enestående vindue ind i de grundlæggende processer, der ligger til grund for genekspression og dets forordning. En vigtig kilde til celle-celle heterogenitet i bakterier finder sted på transkriptionel niveau. Udskrift tal varierer ikke kun på grund af stochasticity af transskription, men også at post-transcriptional processer såsom regulering af små RNA'er og RNAases2. En måde direkte adgang til denne heterogenitet i en kvantitativ mode er af fluorescently kodning enkelte afskrifter af et bestemt gen i smFISH. Denne metode giver mulighed for påvisning og subcellulært lokalisering af bestemt RNA molekyler i faste, individuelle bakterieceller4. mRNAs er udvidet med et sæt af fluorescently mærket ~ 20 base-lange oligonukleotider, der er designet til at binde selektivt at udskrifter af renter5,6. Flere mærkning sikrer opdagelse over baggrunden fluorescens, og enkelte mRNA molekyler vises som diffraktion-begrænset steder under et fluorescens mikroskop7 (Se figur 1). Der er andre tilgange til mærkning mRNA molekyler, som de supplerende oligomer sonder udføre konjugeret habtener (fx, biotin og digoxigenin), der er opdaget ved hjælp af sekundære fluorescently mærket reporter teknikker8.
Der er andre metoder, der giver kvantitative oplysninger om afskrifter, ud over smFISH. Nogle, såsom nordlige duppes eller kvantitativ PCR, sonde hovedparten og dermed kan måle hverken antallet af mRNA kopier eller deres position i de enkelte celler. Disse metoder er derfor ikke egnet til at kvantificere celle til celle variabilitet. En nylig image-baseret teknik, der giver mulighed for kvantificering af både antal kopier RNA'er i celler samt deres intracellulære placering, kaldet multipleksede fejl-robust fluorescens i situ hybridisering (MERFISH) er blevet udviklet. MERFISH er baseret på tildeling af en entydig stregkode bestående af en defineret kombination fra et fast antal fluorescently mærket oligonukleotid sonder. Disse stregkoder læses i sekventielle runder af smFISH målinger, med photobleaching følgende hver runde af hybridisering, hvorved overførselshastighed ved at to størrelsesordener9,10. Denne teknik kræver en automatiseret væske håndtering system og den passende design af sonden sæt.
Kombinationen af flere fluorescens mærkning af enkelte afskrifter, sammen med romanen super-resolution teknikker såsom stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM)11, muliggør en billeddetaljerne stigning i opløsning i den subcellulært lokalisering af udskrifter. I STORM, en passende kombination af fluorescerende sonder og billedbehandling buffer giver mulighed for flere cyklusser af fluorescens emission pr. sonde molekyle (blinker). STORM kan også bruges til billede E. coli transkriptom og observere genome-wide rumlige organisering af RNA, ved mærkning samtidig alle udskrifter af interesse12.
Alle de encellede metoder gennemgået ovenfor er baseret på imaging udskrifter i faste celler. De giver derfor ikke nogen oplysninger om de kinetiske egenskaber af udskrifter i celler. For at følge udskrifter i levende celler13, kan mRNAs mærkes ved fusion af gen af interesse for en række bindende websteder. Disse sidstnævnte er derefter genkendes af et RNA-bindende protein, som bacteriophage MS2 frakke protein, som er sammenvoksede til en fluorescerende proteiner såsom grøn fluorescerende proteiner (NGL)10,14,15.
Her beskriver vi en metode til mærkning individuelle mRNAs med et sæt af fluorescently mærket DNA-sonder, til brug i smFISH eksperimenter, især i E. coli. Vi viser desuden, at samme mærkning ordningen kan anvendes til STORM målinger med mindre ændringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sonden Design
Bemærk: Denne protokol bruger kommercielt tilgængelige oligonukleotid sonder allerede markeret med fluorophores. Sonderne består af et sæt af specifikke sekvenser supplement til et mål mRNA, hver sonden er konjugeret med et enkelt fluorescerende molekyle. Alternativt er det muligt at tilknytte fluorescerende markører til sonder, som beskrevet andetsteds5,16.
- Design smFISH sonder bruge sonden Designer16 algoritme udviklet af Arjun Raj (van Oudenaarden Lab, Massachusetts Institute of Technology); sekvenser af smFISH sonder anvendes i dette håndskrift er angivet i tabellen i materialer.
Bemærk: Det mindste antal sonder i et sæt for en påviselig signal er ~ 30. Det præcise antal kan variere ifølge gen af interesse, især hvis meget korte udskrifter er målt. - Vælg en farve, der passer til den optiske setup (se tabel over materialer).
Bemærk: Cy3 farvestoffet eller en optisk tilsvarende farvestof med en lav modtagelighed for foto-blegning er stærkt anbefales. En kandidat til dobbelt mærkning er Cy5 eller en optisk tilsvarende farve (se tabel over materialer). Egnet farvestoffer til STORM billeddannelse af mærket mRNA er kendetegnet ved deres kapacitet for flere cyklusser af fluorescens emission. Nogle smFISH farvestoffer kan bruges til STORM imaging (se tabel over materialer). For at billede to (eller flere) udskrifter svarende til forskellige gener i den samme celle, bør man vælge oligonukleotid sonder konjugeret med farvestoffer hvis spektre har ringe eller ingen overlapning.
2. reagens
Bemærk: Det er vigtigt at holde prøver RNAse-fri ved hjælp af RNase-fri forbrugsvarer som filtreret pipette tips og rør og holde nogen arbejdsmiljø ren. For at undgå nedbrydning af target udskrifter, skal alle reagenser, der anvendes efter celle fiksation nukleasen-fri (se tabel over materialer) eller diethylpyrocarbonate (DEPC)-behandlet og steriliseret.
- Buffere til smFISH
- Forberede RNase-fri 1 x PBS (fosfatbufferet saltopløsning, løsning med en fosfat buffer koncentration i 0,01 M og en natriumchlorid koncentrationen af 0.154 M, (pH 7,4)). Fortynd RNase-fri 10 x PBS (se tabel over materialer) i nukleasen-gratis vand (se tabel af materialer) på en 1:10 v/v ratio.
- Alternativt udarbejde DEPC-behandlet 1 x PBS.
- Forberede RNase-fri 2 x SSC (saltvand-natrium citratbuffer, 0,3 M NaCl i 0,03 M natriumcitrat, (pH 7,0)). Fortynd RNase-fri 20 x SSC (se tabel over materialer) i nukleasen-gratis vand på en 1:10 v/v ratio.
- Alternativt, forberede DEPC-behandlet 2 x SSC.
- Forberede RNase-fri 1 x PBS (fosfatbufferet saltopløsning, løsning med en fosfat buffer koncentration i 0,01 M og en natriumchlorid koncentrationen af 0.154 M, (pH 7,4)). Fortynd RNase-fri 10 x PBS (se tabel over materialer) i nukleasen-gratis vand (se tabel af materialer) på en 1:10 v/v ratio.
- Oligonukleotid sonde stamopløsning.
- Re opløses de tørrede oligonukleotid sonde blanding i 200 µL af TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) til at oprette en sonde bestand af 25 µM. Mix godt af pipettering op og ned og derefter vortex og centrifugeres kort.
- For at undgå frysning og optøning af stamopløsningen tube, gøre flere delprøver af stamopløsning, svarende til det beløb, der forventes at blive brugt i en enkelt eksperimentelle køre. Gemme stamopløsning ved-20 ° C eller derunder og beskytte mod lys.
Bemærk: En sonde sæt af 5 nmol kan give op til 250 hybridisering reaktioner.
- Hybridisering buffer (efter Skinner et al. 7 ):
- Tilsættes 5 mL nukleasen-gratis vand til en 50 mL polypropylen konisk bund tube. Tilføje 1 g af dextran sulfat til vandet og opløse den ved kraftig vortexing. Bland indholdet i en orbitalryster indtil boblerne forsvinder (~ 30 min).
- Tilføje til løsning 3,530 µL med deioniseret formamid, 10 mg af E. coli tRNA, 1 mL af 20 x SSC, 100 µL af 200 mM vanadyl-ribonucleoside kompleks og 40 µL af 50 mg/mL BSA. Bringe det endelige rumfang på 10 mL ved tilsætning af DEPC-behandlet vand eller nukleasen-gratis vand, og vortex løsning indtil det er homogen.
Bemærk: For at undgå frysning og optøning af løsningen, skal flere delprøver af stamopløsning, svarende til det beløb, der forventes at blive brugt i en enkelt eksperimentelle køre. Butik stamopløsning ved-20 ° C. Sørg for at lade formamid varm til stuetemperatur før åbning af flasken. For at reducere baggrunden, foreslås det for at kalibrere den optimale formamid koncentration (10-40% v/v ratio).
Forsigtighed: ADVARSEL! Formamid er yderst giftigt og en kendt teratogent. Undgå kontakt med øjne eller hud, ved indånding eller indtagelse. Håndtere det under et stinkskab mens iført en lab coat og beskyttelseshandsker. - Sterilisere løsningen ved, at det gennem et 0,22 µm filter. Holde i delprøver og opbevares ved-20 ° C til et år.
- Forberede fiksering buffer (4,6% formaldehyd i 1 x PBS) ved at tilføje 37% formaldehyd (v/v) 1 x PBS (Se 2.1.1) på 1:8 v/v ratio og vortex.
ADVARSEL: ADVARSEL! Formaldehyd er yderst giftigt og et kendt carcinogen. Håndtere det under et stinkskab mens iført en lab coat og beskyttelseshandsker. - Forberede smFISH vaskebuffer (20% formamid i 2 x SSC) ved at tilføje deioniseret formamid 2 x SSC (jf. 2.1.2) til et 1:4 v/v ratio og vortex.
- Forbered imaging buffer for smFISH ved at tilføje 5 mM cysteamine og ilt skyllevæsker (7 µM glucose stavbakterier, 56 nM katalase og 10% glukose (w/v)) for at vaske buffer (20% formamid i 2 x SSC)
- Buffere for STORM
- Forberede Buffer A ved at tilføje 50 mM Tris-HCl og 10 mM NaCl nukleasen-gratis vand.
Bemærk: Butikken på RT for år. - Forbered Buffer B ved at tilføje 50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl og 10% w/v glukose til nukleasen-gratis vand.
Bemærk: Opbevares ved 4 ° C i op til et år. - Forberede MEA buffer ved at opløse 77 mg cysteamine i 1 mL buffer A (gør en 1 M-opløsning).
Bemærk: Det kan opbevares ved 4 ° C i 1 måned. - Forbered Gloxy buffer ved at tilføje 8,440 AU (arbitrære enheder) glucose stavbakterier og 70,200 AU katalase til 1 mL buffer A.
Bemærk: Gør 50 x stamopløsning, den kan opbevares ved 4 ° C i 1 måned. - Forberede STORM imaging buffer ved at tilføje 50 mM af MEA buffer og 1 x Gloxy buffer til buffer B.
Bemærk: Imaging bufferen for STORM er sammensat af 5 mM cysteamine, ilt skyllevæsker (7 µM glucose stavbakterier og 56 nM katalase) i 50 mM Tris med 10 mM NaCl og 10% glucose ved pH 8,0. Forberede lige før imaging, det kan gemmes og bruges på RT for ca 2 h.
- Forberede Buffer A ved at tilføje 50 mM Tris-HCl og 10 mM NaCl nukleasen-gratis vand.
3. prøven fiksation
- Vokse bakterieceller (f.eks. E.
Bemærk: For at bestemme baggrunden på grund af ikke-specifik binding af sonderne, målinger i en stamme, hvor gen af interesse er blevet slettet skal foretages efter de samme procedurer (Se Δgalk i figur 1 og ΔsodB i Figur 2).
Bemærk: Hvis den valgte mikroskop ikke har fasekontrast eller differential interferens kontrast kapaciteter, E. coli ydre membraner kan være mærket med 2 μM lipofile fluorescerende markør (se tabel over materialer), som skal føjes til den bakteriel suspension 20 min før fiksering17. Fiksering og yderligere behandling er udført som beskrevet nedenfor. Skal sørges for at vælge en fluorescerende markør at have en anden emission spektrum, at minimere den spektrale overlapning med mærket-sonde sæt.
4. prøven Permeabilization
- Fjern supernatanten meget omhyggeligt. Bruge lille volumen pipetter, hvis det er nødvendigt, at fjerne al væsken udenfor pelleten.
- Resuspend i 300 µL DEPC-behandlet vand eller nukleasen-gratis vand. Tilføje 350 µL høj kvalitet absolut ethanol (99%) og blandes forsigtigt ved at vende røret. Tilføje en anden 350 µL af ethanol og blandes igen, at nå frem til en endelig ethanol koncentrationen af 70% (v/v ratio).
ADVARSEL: ADVARSEL! Ethanol er brandfarligt. - Rotere prøve med en tube rotator på 20 rpm i 1 time ved stuetemperatur (RT), eller ved 4 ° C natten over. Prøverne opbevares ved 4 ° C til en uge.
5. hybridisering
- Pellet celler ved centrifugering i 7 min, 750 x g, 4 ° C. Fjern supernatanten.
- Tilsæt 1 mL 20% vaske buffer til prøverne og forlade stående i flere minutter, eller pipette til at opløse pelleten helt.
- Pellet celler ved centrifugering i 7 min. ved 750 x g, 4 ° C.
- Fjern supernatanten meget forsigtigt af pipettering. Bruge små-volumen pipetter, hvis det er nødvendigt at fjerne al væsken udenfor pelleten.
- Tilføje oligonukleotid sonden angive stamopløsning til hybridisering buffer delprøve, så den endelige oligonukleotid koncentration er 250 nM; vortex kraftigt.
Bemærk: Man kan mærke to eller flere forskellige mål mRNAs på én gang i den samme celle. Tilføje sonden sæt af begge mål til hybridisering buffer. Skal sørges for at vælge farvestoffer har forskellige emission spectra at minimere den spektrale overlapning (f.eks.Cy3 og Cy5). Sørg for, at prøverne til STORM imaging er hybridiseret med en oligonukleotid sonde indstille konjugeret med et egnet farvestof til STORM (f.eks.i tabel af materialer). - Suspendere prøver (Se trin 5.4) i 50 µL hybridisering buffer, som indeholder oligonukleotid sonder, samtidig undgå generation af bobler (løsningen er meget tyktflydende).
- Lad prøver natten over på et varmt blok ved 30 ° C i mørke.
Bemærk: Efter dette, prøver kan opbevares i op til 6 måneder ved 4 ° C.
6. vask
- Bruge en ny microcentrifuge tube for hver prøve til billedet. Tilsæt 1 mL wash buffer.
- Tilføje 10-15 µL fra hybridiserede prøverne til de nye rør, der indeholder wash buffer og mix/vortex.
- Pellet celler ved centrifugering i 7 min, 750 x g ved 4 ° C. Fjern supernatanten.
Bemærk: For at reducere baggrund, Inkuber i 1 time ved 30 ° C. - Vaskes to gange mere (resuspend i 1 mL vaskebuffer, centrifugeres og fjerne pellet).
- Resuspend i 25 µL wash buffer.
Bemærk: For at reducere foto-blegning én kan tilføje til wash buffer en ilt scavenging system (2.6) for at forbedre farvestof stabilitet i enkelt-molekyle fluorescens eksperimenter6.
7. forberedelse af prøver til billedbehandling
Bemærk: Celler skal være immobiliseret for at give ordentlig imaging under et fluorescens og fase-kontrast mikroskop. Følgende metoder kan bruges til at forberede prøverne, hvor forskellige felter synspunkt kan være afbildet på forskellige fokale planer.
- Agarosen gel forberedelse
- Tilføj 150 mg Agarosen til 10 mL 2 x SSC buffer. Tilføjer ikke 2 x SSC til Agarosen, ellers det vil ikke opløses ordentligt.
- Mikrobølgeovn til 10-15 s hver gang, indtil store bobler begynder at danne. Braklægning til afkøling i et par minutter.
- Placer et adskillende silikone ramme på diaset, så diasets center forbliver synlige.
- Placere en 10 mm bred (1-2 mm tyk) stiv ring i midten af diaset og deponere en lille mængde af gel i det, for forsegling. Vent et par minutter for det til at hærde.
- Tilføje flere gel, indtil en høj kuppel form er dannet. Vente 10 min for det til at hærde, og fjerne ringen (ved hjælp af fine pincet eller enhver anden metode).
- Deponere ~ 10 μL af vasket bakterieceller (Se 6.5) på gel og segl med en #0 coverslip dias.
- Salen prøveforberedelse til smFISH
- Alternativt (til trin 7.1) forberede prøverne til billeddannelse af immobilisere de vasket bakterieceller (Se 6.5) på poly-D-lysin-belagt glas bund engangs plast petriskåle.
- Inkuber prøver i mørke ved stuetemperatur, natten før visualisering at tillade vedhæftning af celler på overfladen. Før visualisering vask en gang med vaskebuffer (. 5); holde prøven våd med buffer(2.5) eller billeddannelse vaskebuffer for smFISH (2,6).
- Salen prøveforberedelse til STORM
- Forberede prøverne for STORM for billedbehandling på poly-D-lysin-belagt glas bund engangs plast petriskåle.
- Inkuber prøver i mørke på RT, natten over. Før visualisering vask en gang med wash buffer for smFISH (2.5). og tilføje imaging buffer for STORM (2.7.5).
8.Udskrift visualisering
- Billede celler med en wide-felt fluorescens mikroskop udstyret med en motoriseret fase (se tabel over materialer).
Bemærk: For STORM modifikation, bruge celler mærket med et farvestof i stand til at flere cyklusser af fluorescens emission. Billede prøven ved hjælp af 3D super-resolution imaging system (f.eks., se tabel over materialer). - Brug (anbefales) en 60-100 x Nielsen > 1,3 olie fordybelse fase kontrast mål linse med en kraftig lyskilde, såsom en kviksølv eller metal-metalhalogenlamper lampe; LED-baserede lyskilder er også anbefales.
- Brug en standard nedkølede CCD kamera, ideelt optimeret til lav-lys niveau tænkelig snarere end hastighed (vi bruger et kamera med 16 µm pixelstørrelse) (se tabel over materialer).
Bemærk: Brugen af en kølet EMCCD (elektron at multiplicere afgift kombineret enhed) kamera CCD kamera er nødvendigt at reducere termiske støj, der forhindrer opdagelse, især af enkelt molekyler. - Brug filter indstiller passende til fluorophores valgt.
- For at bestemme korrekt cellegrænserne, erhverve billeder af forskellige felter i visningen i hver enkelt prøve med fase kontrast optik, eller ved mærkning fluorescently ydre cellemembranen. Erhverve billeder med forskellige fokale planer (z-stak) for alle kanaler (normalt 13 skiver adskilt af 250 nm er taget).
Bemærk: Den motoriserede stadium af mikroskopet og filter sæt skal styres af kommercielle (se tabel over materialer) eller internt software, der kan fange en stak billeder i rækkefølge.
9. dataanalyse
- Konvertere billedstakke til et passende format til dataanalyse.
- Anslå kopi antallet af målet mRNA fra den samlede intensiteten af fluorescerende foci i cellen i stedet for fra tælle diskrete 'steder' som i andre i øjeblikket tilgængelige protokoller.
- Udføre billedanalyse med open source software18 eller et skræddersyet program. Oplysninger om data finder imaging og analyse Skinner et al. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi foretog smFISH målinger af galK og sodB udskrifter i E. coli celler. Afskrifter blev udvidet med en række specifikke sekvenser supplerer målet sekvens, hver sonden er konjugeret med et enkelt fluorescerende molekyle (se tabel over materialer). Fluorescens og fase kontrast billeder af MG1655 wild-type E. coli stamme (WT) eller en JW0740 (Keio samling)19 galK-slettet stamme (ΔgalK) blev udsat for 2 mM D-fucose er vist i figur 1A og 1B. Celler var fast mindst 3 timer efter eksponering for D-fucose. Panelerne i figur 1A (top) viser et billede ud af 13, svarende til den højde, som cellen konturer er i fokus, der repræsenterer niveauet af galK induktion svar for variable ekstracellulære koncentrationer, D-fucose. Steder inden for celler i fluorescens billeder svarer til enten enkelt eller få galk udskrifter, og bestemmelse af udskrift nummer i hver celle er udført af kvantificere lokaliserede fluorescens. Mange steder er set i de fleste celler, når 2 mM D-fucose føjes til bakteriekulturen, mens et par steder er set i mangel af ekstracellulære D-fucose. ΔgalK stamme observeres ingen steder over baggrunden som forventet. Overfladen mærkning med lipofile fluorescerende markør er vist i figur 1B (nederst).
Derudover filmede vi sodB udskrifter i E. coli bakterie kultur dyrket i LB medium i den logaritmiske vækstfase. Fluorescens og fase kontrast billeder af smFISH i WT eller en JW1648 (Keio samling)19 sodB-slettet stamme (ΔsodB) er vist i figur 2A. Panelerne i figur 2A (top) viser et billede ud af 13, svarende til den højde, som cellen konturer er i fokus, der repræsenterer niveauet af sodB. I ΔsodB stamme, er ingen steder observeret over baggrunden, som forventet.
De samme kulturer blev afbildet med STORM (øverst) og bander af celler blev fastsat med overflade mærkning ved hjælp af en lipofile fluorescerende markør til at illustrere lokalisering af sodB i cellerne. Farvning membranen giver mulighed for nøjagtig positionsbestemmelse af udskrifter i cellen (figur 2B). ΔsodB stamme blev taget som baggrund signal og til at bestemme den minimale klyngestørrelse (Se figur 2B). Det gennemsnitlige udskrift antal smFISH2 og STORM er sammenlignelige.
Figur 1: effekter af D-fucose på galK afskrifter visualiseres ved hjælp af smFISH. (A) Top: smFISH billeder af fluorescens af galK mRNA i individuelle E. coli celler. En MG1655 vildtype stamme (WT) eller en JW0740 (Keio samling) galK -slettet stamme (ΔgalK)19 blev dyrket med eller uden 2 mM D-fucose. GalK afskrifter blev hybridiseret at supplerende sonder konjugeret med et farvestof optisk svarende til Cy3 (se tabel over materialer). Bund: samme felter synspunkt i fase-kontrast. (B) WT celler blev dyrket med eller uden 2 mM D-fucose som ovenfor og mærket med 2 μM af en lipofile membran farvestof (se tabel over materialer) i 20 min. før fiksering. Top: fluorescens billeder af galK mRNA ved hjælp af smFISH. Billeder blev taget med et mikroskop, der kontrolleres af en kommerciel software ved hjælp af en 100 × Nielsen 1,45 olie fordybelse fase kontrast mål linse (se tabel over materialer) og en EMCCD kamera (se tabel over materialer). De anvendte filtre var som beskrevet i tabellen med materialer. En fase kontrast billede blev erhvervet, efterfulgt af en z-stak af 13 skiver og 250 nm afstand af fluorescerende billeder med 2 s integration tid for hver skive. Midten: samme felter i visningen med fasekontrast billeddannelse. Bund: celler mærket med lipofile fluorescerende markører, med passende filtre er beskrevet i tabellen materialer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Imaging af sodB udskrifter mærket med samme sonden ligger i smFISH og STORM. (A) Top: smFISH billeder af fluorescens af sodB mRNA i individuelle E. coli celler. En MG1655 vildtype stamme (WT) eller en JW1648 (Keio samling) sodB -slettet stamme (ΔsodB)19 blev dyrket i LB medium. SodB afskrifter blev hybridiseret at supplerende sonder konjugeret med et farvestof optisk svarende til Cy5 (se tabel over materialer). Bund: samme felter synspunkt i fase-kontrast. (B) overlejring af fluorescerende molekyler (enkelte farvede prikker) lokaliseret af STORM (670 nm emission) og et øjebliksbillede af cellemembraner i samme synsfelt. Cellerne var mærket med en lipofile farvestof, ophidset med en argon laser på 488 nm ved 1% af maksimal effekt (0,05 kW/cm2) ved en emission på 510 nm og afbildet med passende filter (se tabel over materialer). WT og sodB celler blev dyrket som beskrevet ovenfor og markeret med en 2 μM lipofile membran farvestof (se tabel over materialer) i 20 min. før fiksering. Super-opløsning billeder blev registreret med en kommerciel mikroskop (se tabel over materialer). Udskrifter mærkes med et farvestof optisk svarende til Cy5 blev lokaliseret ved hjælp af en excitation laser på 647 nm i en billeddannelse buffer til STORM. Billeder blev registreret ved hjælp af en 60 x, NA 1.2 vand fordybelse mål (se tabel over materialer) og en EMCCD kamera (se tabel over materialer) med gevinst på 50, indramme sats på 50 Hz og maksimal effekt af 647 og 405 nm lasere på 5 og 0,05 kW/cm2 , henholdsvis. Det samlede antal rammer erhvervet var 8.000. Data blev analyseret ved hjælp af kommerciel software (Se materialer tabel). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har målt i vores laboratorium udskrift antallet af forskellige gener i E. coli celler ved hjælp af den smFISH metode2. Kort sagt, denne procedure består af følgende trin: celle fiksering, permeabilization membraner til sonde penetration, sonde hybridisering, og prøve imaging ved hjælp af en standard fluorescens mikroskop. Denne procedure er baseret på tidligere publicerede dem med nogle ændringer6,7,16. Det har været tidligere rapporteret, at smFISH kræver, at antallet af oligonukleotid sonder ligge i intervallet 48-72, for at opnå et signal liggende godt over baggrunden7. Vi har vist, at dette nummer kan være faktisk mindre20, afhængigt af gensekvens interesse, den optiske installationen, og de specifikke forsøgsbetingelser.
Hver sonde skal være 17-22 nukleotider lange, med en Inter sonde adskillelse af mindst to nukleotider og en GC indhold af ~ 45%, for at mindske virkningerne af ikke-specifik, off-mål-bindende. Nogle sonder kan undlade at binde et mål, og den samlede effektivitet af bindende kan optimeres ved ændringer af eksperimentelle procedurer såsom betingelserne for fiksering og hybridisering21. En vigtig faktor, der skal tages i betragtning er valget af fluorophores. Det anbefales at mærke sonder med et farvestof med lav modtagelighed for foto-blegning. Foto-blegning minimering kan opnås ved optimering af eksponeringstider, belysning kilder og integration gange af image erhvervelse og ved tilsætning af en ilt scavenging system.
Omfanget af ikke-specifik binding begivenheder bør vurderes ved at udføre smFISH eksperimenter med celler fra stammer i hvilke mål gener er slettet, for eksempel fra Keio collection19. Hvis baggrunden signal er højt, antallet og varigheden af vaske trin bør forhøjes, eller celler skal inkuberes i wash buffer ved 30 ° C i 1 time og derefter vaskes to gange. Desuden, for at reducere baggrunden, foreslås det for at optimere formamid koncentration (10-40% v/v ratio) i hybridisering og vask buffere. Stigende formamid koncentration reducerer uspecifik bindende, men kan også mindske bindingen af sonder til målet mRNA. Under trinnet hybridisering er det vigtigt at fjerne supernatanten helt; en fortyndet hybridisering buffer kan føre til nedsat mærkning effektivitet. Derudover skal target RNA'er være tilstrækkelig lange for at opnå et godt lokaliseret spot over baggrunden. Nylige forbedringer i signal til støj forhold og bindende specificitet gennem rygraden ændring af sonderne nu gør det muligt at påvise kortere RNA fragmenter, som eukaryote MicroRNA eller bakteriel små ikke-kodende RNA'er2, 10. vi anbefaler, at den gennemsnitlige eksemplarnummer fremstillet ved smFISH skal valideres med kvantitativ PCR7,16.
I dette manuskript har vi vist, at denne metode kan ændres med mindre ændringer at studere lokalisering af udskrifter i E. coli med højere optisk opløsning ved hjælp af stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM)11.
I Resumé er smFISH en alsidig metode til RNA belysning, der giver mulighed for direkte måling af den celle-celle variation i afskriften antallet og lokaliseringen af target udskrifter i cellen i både eukaryoter og prokaryoter. Det giver kvantitative oplysninger om grundlæggende processer af genekspression og kan nemt implementeres for STORM billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en Israel Science Foundation grant 514415 (til J.S.) og BSF-NSF (MCB) tilskud 2016707 (til J.S.). Støtte fra en Siegfried og Irma Ullman professortitel stol (til J.S.) er også anerkendt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker - Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen - Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 - 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24x60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa | |||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa |
References
- Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601 (2014).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
- van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523 (2016).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), Elsevier Inc. (2010).
- Skinner, S. O., La Sepúlveda,, Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628 (2014).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
- van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
- Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
- Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence "Turn-On" Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
- Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), Elsevier Inc. (2008).
- So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
- Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
- Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8 (2006).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).
