Summary
No passado, pequena animal irradiação geralmente foi realizada sem a capacidade de direcionar um volume de tumor bem delineados. O objetivo era imitar o tratamento do glioblastoma humano em ratos. Utilizando uma plataforma de irradiação de animais pequenos, realizamos guiada por MRI irradiação conformal 3D com secundário-volume baseados em PET impulsionando em um ajuste pré-clínicos.
Abstract
Há décadas, pesquisa de radiação animal pequeno principalmente foi realizada usando configurações experimentais bastante cruel, aplicando técnicas simples de feixe único sem a capacidade para atingir um volume de tumor específico ou bem delineados. A entrega de radiação foi conseguida usando fontes de radiação fixo ou aceleradores lineares produzindo raios-x megavoltage (MV). Estes dispositivos são incapazes de alcançar precisão sub mm necessário para pequenos animais. Além disso, as altas doses entregue para avaliação saudável de resposta cesto tecido circundante. Para aumentar a tradução entre pequenos estudos animais e humanos, nosso objetivo era imitar o tratamento do glioblastoma humano em um modelo do rato. Para habilitar uma irradiação mais precisa em uma configuração pré-clínicos, recentemente, plataformas de pesquisa guiada por imagem pequeno animal radiação precisão foram desenvolvidas. Semelhante ao planejamento de sistemas humanos, planejando essas micro-irradiators de tratamento baseia-se na tomografia computadorizada (CT). No entanto, baixo contraste de tecidos moles na CT torna muito difícil de localizar alvos em determinados tecidos, como o cérebro. Portanto, incorporando a ressonância magnética (MRI), que tem excelente contraste de tecidos moles em relação ao CT, permitiria uma delimitação mais precisa do alvo para irradiação. Na última década também biológica de imagens técnicas como tomografia por emissão de pósitrons (PET) ganharam interesse para orientação de tratamento de terapia de radiação. PET permite a visualização de , por exemplo, consumo de glicose, transporte de aminoácidos ou hipóxia, presente no tumor. Visando essas peças altamente proliferativas ou rádio-resistente do tumor com uma dose maior poderia dar um benefício de sobrevivência. Esta hipótese levou à introdução de tumor biológico volume (VFC), além do volume de destino bruto convencionais (GTV), volume de destino clínico (CTV) e volume de destino planejado (PTV).
No laboratório de imagem pré-clínicos da Universidade de Ghent, um microdifusora, um pequeno animal de estimação e um animal pequeno 7 T MRI estão disponíveis. O objetivo era incorporar irradiação guiada por MRI e PET-guiada secundário-volume aumentar em um modelo do rato de glioblastoma.
Introduction
Glioma de alto grau é o tumor cerebral maligno mais comum e mais agressivo em adultos com uma sobrevida média de 1 ano apesar de modalidades de tratamento atual. O tratamento padrão inclui máxima ressecção cirúrgica seguida de radioterapia de feixe externo combinado (RT) e temozolomide (TMZ), seguido de manutenção TMZ1,2,3. Desde a introdução do TMZ agora mais de 15 anos atrás, sem melhorias significativas foram feitas no tratamento destes tumores. Portanto, a implementação de novas estratégias terapêuticas é urgente, mas deve primeiro ser investigada em modelos de terapia do câncer animal pequeno (principalmente camundongos e ratos). Modelos de roedores de tumor-rolamento podem ser usados para investigar a eficácia dos protocolos de radiação nova e complexa, possivelmente combinado com outros agentes de tratamento (novo), para avaliar a resposta de radiação ou para investigar agentes de rádio-protetor. Uma grande vantagem da pesquisa pré-clínica radiação é a capacidade de trabalhar em condições experimentais controladas usando grandes coortes, resultando em dados acelerado rendimento devido a menor expectativa de vida de roedores. Os achados pré-clínicos, em seguida, devem ser traduzidos em um ensaio clínico de uma forma muito mais rápida e mais eficiente do que na atual prática4.
Experimentos de radiação de animais pequenos, nas últimas décadas normalmente alcançados usando fontes de radiação fixo a5,6,7, por exemplo, 137Cs e 60Co, isótopos, ou linear aceleradores se destina para uso clínico humano, aplicando um campo único de radiação com raios x MV6,8,9,10,11. No entanto, esses dispositivos não alcançar precisão sub milímetros, que é necessário para pequenos animais12. Além disso, MV radiografias têm características impróprias para irradiar pequenos alvos, tais como um acúmulo de dose na interface ar-tecido na região da entrada do feixe com uma extensão na ordem o animal em si tamanho4,6 ,8,9,10,11. Este último torna bastante desafiador para entregar uma dose uniforme para um tumor, poupando em torno de um cérebro normal tecido4,8,9,10,11. Portanto, não está claro para quais extensão atual estudos realizados com animais ainda são relevantes para a moderna RT prática12. A este respeito, recentemente desenvolvido tridimensional (3D) conformal pequenos animais micro-irradiators são promissores para colmatar o fosso tecnológico entre 3D guiada por imagem RT técnicas avançadas, tais como a terapia de radiação de intensidade modulada (IMRT) ou conformados arcos usados em humanos e atual irradiação animal pequeno4,13. Essas plataformas fazem uso de uma fonte de raios-x de quilovoltagem (kV) para obter penumbras afiadas e para evitar o acúmulo de dose. Essas plataformas incluem uma fase controlado por computador para animal, posicionamento, um kV fonte de raios-x para a imagem e o tratamento de radiação, um assembly de rotacional do pórtico para permitir a entrega de radiação de vários ângulos e um sistema collimating a moldar o feixe de radiação 4. em 2011, um microdifusora foi instalado no laboratório de imagem pré-clínicos da Universidade de Ghent (Figura 1). Este sistema é semelhante à prática de radioterapia humana moderna e permite uma grande variedade de experimentos pré-clínicos, tais como a sinergia de radiação com outras terapias, esquemas de radiação complexo e estudos de impulso guiada por imagem alvo secundário.
Tratamento a planear estas micro-irradiators é baseado em CT, que é equivalente a humana planejamento sistemas14,15. Para a imagem latente de CT, um detector de raios x a bordo é usado em combinação com o tubo de raios-x kV mesmo que é usado durante o tratamento. Imagem latente de CT é usado como permite o posicionamento exato do animal e fornece as informações necessárias para os cálculos de dose de radiação individual através de segmentação. No entanto, devido ao baixo contraste de tecidos moles no CT da imagem latente, tumores no cérebro dos animais pequenos, tais como glioma de alto grau, não podem ser facilmente delineados. A incorporação da imagem de várias modalidades, é necessária para uma delineação de volume alvo exato. Comparado ao CT, MRI fornece vastamente superior contraste de tecidos moles. Isso torna muito mais fácil de visualizar os limites de lesão que resultarão em uma muito melhor delineação do volume alvo, ajudando a melhor irradiar a lesão e evitar tecido, conforme ilustrado no Figura 24, 16. Uma vantagem adicional é que o MRI usa radiação não-ionizante, ao contrário do CT que está utilizando radiação ionizante. As principais desvantagens da RM são os tempos de aquisição relativamente longo e elevados custos operacionais. É importante notar que as ressonâncias não podem ser usadas para cálculos de dose, como eles não fornecem as informações de densidade de elétrons necessária, embora o progresso está sendo feito neste campo, também com o desenvolvimento recente do senhor-LINACS. Como tal, um conjunto de dados combinado CT/RM é o método de escolha para o planejamento da irradiação de glioma maligno, contendo ambas as informações necessárias para o direcionamento (volumes baseado em MRI) e para cálculos de dose (densidade de elétron CT-baseado).
Para diminuir o fosso entre a irradiação de animais pequena e rotina clínica, MRI claramente precisa integrar o fluxo de trabalho do microdifusora, que exigem um registo correcto entre MRI e CT, que está longe de ser trivial. Neste trabalho, o nosso protocolo para MRI guiadas irradiação conformal 3D do F98 glioblastoma em ratos é discutido, que tem sido recentemente publicado17.
Embora incorporando CT e ressonância magnética do fluxo de trabalho do microdifusora é um claro passo em frente na pesquisa de irradiação de animais pequenos, estas técnicas de imagens anatômicas não permite sempre uma definição completa do volume alvo. As alterações patológicas no cérebro no CT e MRI caracterizam-se pelo conteúdo de água aumentado (edema) e o escapamento da barreira hemato - encefálica ou realce de contraste. No entanto, tanto realce de contraste e áreas hipertenso em T2-weighted MRI não são sempre uma medida exata da extensão do tumor.Foram detectadas células tumorais muito além das margens do realce de contraste12. Além disso, nenhuma destas técnicas pode identificar as partes mais agressivas dentro do tumor, que pode ser responsável pela resistência terapêutica e recorrência do tumor. Portanto, informações adicionais de técnicas de imagem moleculares como animal de estimação pode ter um valor acrescentado para RT alvo definição do volume porque estas técnicas permitem visualizar vias biológicas na vivo12,18, 19.
Em 2000, Ling et al introduziu o conceito de volume alvo biológico (BTV) integrando o fluxo de trabalho de radioterapia, levando a que chamaram de radioterapia conformal multidimensional20imagens anatômicas e funcionais. Isto cria a possibilidade de melhorar a dose alvo entregando uma dose não-uniforme a uma região de destino usando, por exemplo, imagens de PET. O mais amplamente utilizado marcador de PET para estadiamento do tumor e para monitorar o tratamento resposta é fluor-18 (18F) rotulado fluorodeoxyglucose (FDG), que visualiza o metabolismo de glicose21. Em câncer de cabeça e pescoço, estudos anteriores mostraram que o uso de 18F-FDG PET levou a uma melhor estimativa do volume real de tumor, conforme definido por espécimes patológicos, em comparação com CT e MRI22. No cérebro primário, tumores, onde o FDG não é útil devido o sinal de fundo muito forte do cérebro normal, aminoácidos, tais como 11C-metionina e, mais recentemente, 18F-fluoroetthyltyrosine (FET), têm sido investigados para GTV delimitação com muitas vezes marcadas diferenças entre aminoácidos PET e MRI-baseado GTVs23. No entanto, sem julgamento em perspectiva, investigar o significado desse achado foi executado ainda. Neste estudo, nós selecionamos o palpador de aminoácidos 18F-FET e o palpador hipóxia 18F-fluoroazomycin-arabinoside (18F-Fernandes). 18 F-FET e 18F-Fernandes foram seleccionados por um aumento da absorção amino-ácido é fortemente correlacionado com a taxa de proliferação em tumores de GB, Considerando que a captação de uma hipóxia PET-tracer está correlacionada com resistência à de radioterapia (quimioterapia)18 , 23. volume sub impulsionando usando o microdifusora foi otimizado, dando uma dose de radiação adicional a uma parte definida pelo PET do F98 GB tumor em ratos.
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Protocol
O estudo foi aprovado pelo Comitê de ética para experimentação animal (ECD 23/09 e ECD 12/28). Todos os detalhes comerciais podem ser encontrados na Tabela de materiais.
1. F98 GB modelo de células de rato
- Cultura das células F98 GB, obtidas ATCC, em monocamadas usando de Dulbecco meio Eagle modificado, soro de vitelo de 10%, 1% penicilina, estreptomicina 1%, 1% L-glutamina e 0,1% anfotericina b e coloque numa incubadora de CO2 (5% de CO2 e 37 ° C).
- Inocule as células de glioma no cérebro de ratos de F344 Fischer femininos (170 g de peso corporal).
- Use instrumentos estéreis e luvas estéreis em todos os momentos.
- Anestesia os ratos injetando uma mistura de 74 mg/kg de ketamina e xilazina de 11 mg/kg intrapertioneally (IP) com uma seringa de insulina (1 mL, 29 G). Confirme o anesthetization pela ausência de resposta para o reflexo de retirada do membro. Imobilize os ratos em um dispositivo estereotáxico usando pontos de fixação para nariz e orelhas. Lugar um olho carbomer gel para evitar o ressecamento dos olhos enquanto sob anestesia.
- Raspar o rato do nível dos olhos na parte de trás do crânio e desinfectar a pele com iodo-povidona.
- Expor o crânio através de uma incisão de couro cabeludo de 2 cm e fazer um furo de 1 mm (broca de diamante) 2 mm posterior e 2,5 mm lateral para o bregma no hemisfério direito frontal.
- Inserir uma agulha de insulina Estereotaxia guiada (29 G) e injetar a suspensão de células de 5 µ l (20.000 F98 GB células) 3 mm de profundidade utilizando um controlador de bomba micro-seringa (configurações: injetar (I50), taxa de 1 nL/s (001 SDN)).
- Retirar a seringa lentamente e fechar a incisão com cera para osso. Suturar a pele e desinfectar com iodo-povidona.
- Estabilize a temperatura do corpo da pós cirurgia animal usando uma lâmpada vermelha. Monitore o despertar do rato até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Não retornam o animal para a companhia de outros animais até que se recuperou totalmente. Manter todos os animais sob condições ambientais controladas (ciclos de luz/escuro normal h 12, 20-24 ° C e 40-70% de humidade relativa) com comida e água ad libitum. Certifique-se de acompanhar de perto os animais através do acompanhamento de seu peso corporal, alimentar, ingestão de água e sua atividade e comportamento normal. Use uma dose letal de pentobarbital de sódio a eutanásia dos animais (160 mg/kg), se for observada uma diminuição do peso corporal 20% ou quando o comportamento normal severamente se deteriora (por exemplo, falta de higiene).
2. a confirmação do crescimento do Tumor
Nota: Avalie tumor crescimento 8 dias após inoculação usando contraste aprimorado T1-weighted MRI, MRI dinâmico de contraste aprimorado (DCE-MRI) e T2-weighted MRI. Quando o tumor atinge um tamanho de 2.5 x 2.5 x 2.5 mm3, seleccione o rato para a terapia.
- Primeiro, conecte uma agulha 30G para um tubo de 60 cm longo, que é colocado por via intravenosa na veia lateral da cauda. Anestesia os ratos através de um cone de nariz com 2% de isoflurano misturado com oxigênio (0,3 L/min). Confirme anesthetization quando os ratos não respondem para o reflexo de retirada do membro. Cobrir os ratos com um cobertor aquecido e colocá-los na cama MRI. Use um gel do olho carbomer para evitar ressecamento.
- Coloque a cama no suporte com uma bobina de superfície de cérebro de rato fixo e posicionar a cama em uma bobina de transmissor de corpo inteiro de rato 72 milímetros.
- Execute uma verificação de localizador, seguida por uma varredura de ponderação T2 spin-eco para avaliar o crescimento do tumor. Detalhes de sequência T2-MRI: TR/TE 3661/37,1 ms, 109 µm isotrópica no plano resolução, fatia µm de espessura 600, 4 médias e TA 9 min 45 s.
- Se o tumor for confirmada a aquisição de T2-weighted, injetar um agente de contraste contendo gadolínio o tubo colocado por via intravenosa (agente de contraste MRI; 0,4 mL/kg) 30 s após o início da aquisição DCE-MRI. Adquira o DCE-MRI durante 12 min usando um rápido-baixo ângulo atirou em sequência (FLASH) em uma única fatia (espessura da fatia de 1 mm). Usar uma resolução espacial no plano de (312 µm2) e uma resolução temporal de 1.34 s.
- Usando a ferramenta de análise de sequência de imagem, selecione uma região de interesse (ROI) dentro da região de suspeita de tumor para plotar a intensidade de sinal ao longo do tempo. Posteriormente, analise a forma da curva resultante DCE para confirmar a presença de glioblastoma (Figura 3).
- Finalmente, adquira uma sequência de contraste aprimorado ponderada T1 spin-eco. Detalhes de sequência T1-MRI: TR/TE 1539/9.7 ms, 117 µm isotrópica no plano resolução, fatia espessura 600 µm, 3 médias, TA 4 min 15 s. típico contraste aprimorado T1-weighted MR imagens são mostradas na Figura 2.
- Após finalizar a sequência ponderada em T1, o animal pode acordar sob supervisão contínua, até que recupere a consciência plena.
3. multimodalidade Imaging para seleção do Volume de destino
Nota: Para poder executar o MRI-interativa 3D irradiação conformal do rato F98 GB modelo com PET-guiada secundário-volume impulsionando, 3 imagem latente necessidade de modalidades a serem executadas. Primeiro, injetar o radiotracer, em seguida, executar o MRI durante a captação do traçador, posteriormente realizar uma aquisição de PET estática e um tratamento planejamento CT.
- Anestesia os animais usando um cone de nariz com 2% de isoflurano misturado com oxigênio (0,3 L/min). Confirme anesthetization quando os ratos não respondem para o reflexo de retirada do membro. Use um gel do olho carbomer para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
- Inserir um cateter (26 G) a veia da cauda, permitindo a injeção do traçador radioativo de 37 MBq de PET dissolvida em soro fisiológico a 200 µ l. Injete ou 18F-FET ou 18F-Fernandes, 30 min ou 2 h antes da aquisição do animal de estimação, respectivamente.
- Injete o agente de contraste MRI (0,4 mL/kg) por via intravenosa na veia de cauda usando o cateter 15 min antes da aquisição do animal de estimação.
- Coloque os ratos em um in-house fez cama de multimodalidade e fixá-lo com prendedores de gancho-e-laço, mantendo uma posição fixa durante a imagem latente e microirradiação (Figura 1).
- Corrigi três marcadores de multimodalidade (capilares preenchidos com água) por baixo, acima e no lado direito do crânio. Coloque o rato, ainda fixado na cama multimodalidade, no suporte do animal do scanner MRI, corrigir a bobina de superfície de cérebro de rato e posicionar este set-up em uma bobina de transmissor de corpo inteiro de rato de 72 mm. Execute uma verificação de localizador, seguida por uma sequência de contraste aprimorado ponderada T1 spin-eco.
- Transporte o animal para executar um 18F-FET ou 18aquisição PET Fernandes-F. Adquira um 30 min estático PET scan no modo de lista. Verificação deve ser adquirido ou 30 min após a injeção de 18F-FET ou 2 h após a injeção de 18F-Fernandes.
4. RT planejamento do tratamento
- Use o sistema (PCTPS) para o planejamento do tratamento de planeamento de tratamento pré-clínico. Importar o CT de planejamento para o PCTPS e segmentar manualmente esta imagem de CT em três classes de diferentes tecidos: ossos, tecidos moles e ar. Esta segmentação manual baseia-se na definição de três diferentes limiares de cinza-valor no CT planejamento. Estes limiares cinza-valor manualmente selecionadas devem ser escolhidos tal que o ar no cérebro está ausente e a espessura do osso do crânio é diferente de zero. Uma vez que estes limites são definidos, densidades de material são atribuídas pelo PCTPS para ossos, tecidos moles e ar (Figura 4).
- Se apenas é necessária a orientação de MRI, carregar a varredura de MRI e co registrar com o CT planejamento usando o PCTPS.
- Use as transformações de corpo rígido (três traduções e três rotações), os marcadores de multimodalidade e o crânio. Sobrescreve a intensidade do sinal de aumento do crânio no CT com sinal preto na RM, uma fusão de precisa pode ser alcançado (Figura 5).
- Selecione o destino para irradiação no centro do tumor melhoria de contraste em T1-weighted MRI, ver Figura 6 e Figura 7.
- Quando informações adicionais de PET devem ser incluídas, incluem um CT/MRI/PET co o registro usando o software de quantificação de imagem biomédica (BIQS).
- Use a ferramenta contorno no BIQS para fazer uma fusão de imagens de PET/RM (Figura 8). Após o registo co, selecione o destino no centro do aumento da absorção PET do traçador no BIQS (Figura 9) e introduzir as coordenadas manualmente no PCTPS usando as seguintes transformações: X → -X e Y → Z → Z -Y.
- Selecione a dose prescrita, o número de arcos, a posição de arco, a gama de rotação de arcos e o tamanho do colimador (Figura 10).
- Para RT MRI-guiada, use as seguintes configurações: uma dose prescrita de 20 Gy, 3 arcos, posicionados no sofá ângulos de 45 °, 0 ° e -45 ° com rotações do arco de 120 ° e um tamanho do colimador de 5 x 5 mm.
- Para PET-MRI-guiada RT, use as seguintes configurações: uma dose prescrita de 20 Gy usando 3 arcos e um colimador de 5 x 5 mm e extra 5 Gy para secundário-volume aumentar usando um colimador de 1 x 1 mm e 3 arcos não-coplanares. Selecione uma rotação de 120 ° para todos os arcos, enquanto mudando a posição do sofá (-45 °, 0 ° e 45 °).
- Calcule a distribuição de dose dentro do animal e os parâmetros de entrega do feixe para entregar a dose prescrita para o destino usando o PCTPS. Antes de irradiação real, teste as rotações do arco no sofá diferentes posições para evitar qualquer colisão durante a irradiação.
- Para a irradiação real, selecione um filtro de cobre 0,15 mm, definir a tensão de raio-x de 220 kV, defina o raio-x atual 13 mA, e a posição do colimador certo sobre o pórtico. Execute o RT transferindo os parâmetros de entrega do feixe apropriado do PCTPS para o microdifusora.
- Durante esses procedimentos, o rato é mantido sob anestesia contínua isoflurano (2% de isoflurano, misturado com oxigênio 0,3 L/min). Após a execução do último arco, o animal pode acordar sob supervisão contínua, até que recupere a consciência plena.
5. dose Volume histogramas (DVHs)
Nota: Para comparar a dose real entregada para os volumes de destino do tumor e o tecido cerebral normal circundante, calcule DVHs.
- Desenhe um volume de interesse (VOI) ao redor do tumor e o cérebro normal sobre as T1-contraste aprimorado senhor imagens ponderadas para calcular a dose média, máxima e mínima (Figura 11).
- Como um substituto para o máximo, média e a dose mínima para o volume do tumor e do volume de tecido cerebral normal, calcular a D2, D50e D90. D representa a dose recebida pelo x % do volume, denotado pelo subscrito e pode ser derivado o DVH resultante.
6. TMZ e quimioterapia de Souza
- Para simular o tratamento do glioblastoma em pacientes, administrar quimioterapia concomitante usando injeções de IP de 29 mg/kg, que TMZ dissolvido em solução salina com 25% de Dimetilsulfóxido (DMSO) uma vez por dia durante 5 dias, começando no dia da irradiação24, 25. uso 1 mL, seringa de insulina 29 G para administrar a injeção.
- Para o grupo de controle, administre injeção da etapa 6.1 sem TMZ.
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Representative Results
Para imitar a metodologia de tratamento humano para a irradiação do glioblastoma num modelo pré-clínico, a inclusão de radioterapia guiada por MRI foi necessário. Usando o PCTPS e a interface microdifusora, fomos capazes de irradiar F98 glioblastoma em ratos com vários arcos não-coplanares conformados direcionamento da região de contraste aprimorado em T1-weighted MRI17. Rigid-corpo transformações em combinação com uma cama de várias modalidades foram usadas para registro de imagem entre MRI e CT. de planejamento O isocentro para irradiação foi selecionado no centro da região de contraste aprimorado tumor na T1-weighted MRI (Figura 7).
Distribuições de dose e DVHs cumulativas da média, dose mínima e máxima de volume de destino e o volume de tecido cerebral normal foram calculados para cinco diferentes animais (Figura 12). Com base na similaridade com o protocolo clínico de irradiação e uma distribuição de dose ideal, um plano de dose usando três arcos não-coplanares foi selecionado. Aplicando-se o último, 90% do volume de destino recebeu a dose desejada, minimizando a dose de tecido cerebral normal17.
Depois de confirmar a viabilidade de irradiação MRI-guiado do modelo F98 rato glioblastoma, nós tentamos incorporar secundário baseado em PET-volume aumentar do fluxo de trabalho pré-clínicos para o planejamento de RT. Fomos capazes de combinar 3 modalidades de imagem, executar primeiro MRI e, em seguida, PET, e finalmente CT enquanto o rato é fixado sobre uma cama de multimodalidade feita in-house (Figura 1). Para co registro dessas modalidades, foi utilizado o BIQS, permitindo muito mais ferramentas para correspondência rígida (Figura 8). Aplicando uma transformação simples, tanto o senhor baseado e PET baseado isocentro (Figura 9) poderia ser transferido para o PCTPS. Na Figura 13, são mostrados a ressonância e o isocentro baseada em PET para irradiação após o cálculo da dose no PCTPS. Para irradiar todo o volume de melhoria de contraste, nós selecionamos um colimador de 5 x 5 e três arcos rotativa 120 °. Para impulsionar o tumor mais metabolicamente ativas identificadas em 18F-FET PET ou a mais hipóxico tumor parte identificadas em 18F-Fernandes PET, uma dose de 5 Gy foi selecionada e usando um colimador de 1 mm de diâmetro. Novamente, 3 arcos 120 ° de giro são aplicados.
Figura 1: um tubo de raios-x kV, um pórtico giratório, um estágio robótico controlado por computador, um sistema collimating a forma do feixe e um detector de CT plana integração Microdifusora. O animal é colocado em uma 4 mm espessura PVC multimodalidade cama para evitar movimentos entre várias aquisições de imagens, tais como uma varredura de MRI, seguido por um CT de planejamento, o que facilita a fusão de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: confirmação de Glioblastoma. T1-weighted MRI, T2-weighted MRI e DCE-MRI de um rato F98 GB. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: curva DCE. Usando a ferramenta de análise de sequência de imagem, pode ser selecionado um ROI sobre o DCE-ressonância para plotar a intensidade de sinal ao longo do tempo. Posteriormente, a análise da forma da curva resultante DCE é capaz de confirmar a presença do glioblastoma. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: segmentação de CT. Segmentação com base no CT é feita definindo manualmente um número de valores-limite para distinguir com precisão o ar do tecido pulmonar, tecido adiposo, osso e outros tecidos dentro da imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: fusão de MRI-CT. Sobrescreve a intensidade do sinal de aumento do crânio no CT com sinal preto na RM, é possível uma fusão precisa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Cone beam CT. O tumor não é visível no CT, tornando impossível para selecionar o isocentro no centro do tumor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: contraste aprimorado T1-weighted MRI. O contraste aprimorado T1-weighted MRI visualiza claramente um tumor de cérebro do rato F98. O centro do realce de contraste é selecionado como o isocentro para o planejamento de RT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: fusão de MRI-PET. Usando a ferramenta de contorno na BIQS, fusão de imagens de PET/RM é alcançado.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: seleção de alvo de MRI-PET. O alvo para irradiação é selecionado no centro de realce de contraste em T1-weighted MRI (à esquerda). O alvo para ampliar o volume secundário está selecionado no centro do sinal aumentado em 18F-FET PET (à direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: planejamento de radioterapia. Para calcular o planejamento de radioterapia, selecione o isocentro, prescrita a dose, o número de arcos, a posição de arco, a gama de rotação de arcos e o tamanho do colimador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: cálculo DVH. Basear as T1-contraste aprimorado senhor imagens ponderadas para calcular o DVH dentro deste volume, um volume de interesse (VOI) ao redor do tumor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12: plano de Dose usando contraste aprimorado T1-weighted MRI e três não-coplanares arcsto entregar o volume alvo 20 Gy. À direita, é dado o histograma de Volume da Dose cumulativa (DVH) do volume do tumor e o tecido normal do cérebro delineados em contraste aprimorado T1-weighted MRI. Esta figura foi modificada de Bolcaen et al . 20 por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 13: selecionado MRI e PET guiadas isocentro para irradiação. A imagem de CT em vista axial, coronal e sagital é visualizada com o plano de dose entregar 20 Gy do alvo (região amarela). O que foi identificado na melhoria de contraste MRI isocentro é visível (verde) e o isocentro localizado na parte de tumor metabolicamente ativas identificada em 18F-FET PET é também visível (vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Para atingir a precisa irradiação do alvo tumor glioblastoma no cérebro de ratos, orientação de CT on-Board do microdifusora não era suficiente. Tumores cerebrais são dificilmente visíveis devido ao contraste de tecidos moles insuficiente, mesmo se o realce de contraste seria usado. Como tal, MRI precisa ser incluído para permitir a irradiação mais precisa. Usando uma aquisição sequencial do senhor sobre um sistema de T 7 e uma aquisição de TC sobre o microdifusora, de que fomos capazes atingir a dose para a melhoria de contraste tecido de tumor no cérebro e calcular um plano de dose usando a tomografia de planejamento. Isto foi possível após os cálculos de fusão e dose de imagem usando o PCTPS17. No entanto, deve ser mantido em mente que a ressonância magnética é propensa a distorções geométricas que não são corrigidas neste protocolo. Além disso, antes de traduzir este protocolo de irradiação para outras partes do corpo, mais pesquisa é necessária. A importância de uma segmentação de tecido precisos devido ao uso de fótons de baixa energia kV deve ser considerada. Segmentação em três classes de tecido pode ser suficiente no cérebro de ratos, mais aulas de tecido precisam ser indicado na região torácica ou abdominal de ratos para fornecer cálculos precisos de dose. Para evitar movimento durante o transporte entre os diferentes sistemas de imagem, fizemos uso de uma cama de multimodalidade que minimiza o movimento da cabeça (Figura 1). No entanto, um esforço adicional é necessário durante a aplicação deste protocolo a outras partes do corpo, as regiões torácicas ou abdominais. Especialmente pequena animal irradiação dos órgãos influenciado pelo movimento respiratório ou trânsito intestinal é ainda um desafio.
A incorporação de PET-guiada secundário-volume aumentar também foi mostrada para ser viável, apesar de um protocolo de trabalho intensivo. Uma vantagem de técnicas de imagem nucleares, tais como PET, é a capacidade de imagem a heterogeneidade dentro de tumores, que permite a segmentação de peças altamente metabolicamente ativas ou resistente à radiação do tumor. Fomos capazes de aumentar a dose, destinada-se especificamente na região mais biologicamente ativo ou mais hipóxico do tumor usando 18F-FET PET ou 18F-Fernandes PET, respectivamente. O passo crítico no protocolo é co registro de imagem. Atualmente, nenhum software é capaz de automaticamente co registrar pré-clínica de ressonância magnética ou CT com imagens de PET com suficiente precisão e reprodutibilidade. Em geral, marcadores de PET em neuro-Oncologia mostram uma baixa absorção no cérebro normal, o que complica o processo de registro. Para a fusão das três modalidades de imagem (PET/CT/MRI), preferimos o BIQS em vez do PCTPS, que atualmente é desenvolvido não facilmente combinar múltiplas modalidades de imagem. Além disso, o BIQS tem mais ferramentas inteligentes para correspondência rígida. Uma grande ajuda também é o uso de uma cama de várias modalidades, impedindo o movimento do animal entre as diferentes aquisições de imagens. No entanto, o registo manual de co é demorado e aumenta o tempo de anestesia dos animais. Uma vez que o registro de imagem é alcançado, exportando as coordenadas da BIQS para a PCTPS era viável, aplicando uma transformação simples sobre as coordenadas do alvo.
Não é apenas importante segmentar com precisão o volume do tumor (biológica): poupadores do tecido cerebral normal circundante tem que ser levado em conta também. O último é muitas vezes negligenciada em experimentos de animais radioterapia atual mas muito importante para tornar o modelo também é clinicamente relevante. Isto foi conseguido através da aplicação de vários arcos não-coplanares. A nosso conhecimento, vários irradiação cranial do arco em pequenos animais nunca foi aplicada antes. No que respeita à utilização de feixe, esta metodologia é fechar a semelhança com o RT conformal guiada por imagem clínica e devido ao uso do tratamento de arco o destino finalmente recebe a dose prescrita, enquanto os tecidos normais recebem apenas uma fração. Como tal, um primeiro passo é feito para minimizar a lacuna entre pré-clínicos e clínicos de tecnologia RT17. Uma limitação deste microdifusora é que a rotação do pórtico é limitada a 120 °. Combinar as rotações de arco com uma mudança na posição do sofá aumentou ainda mais os poupadores de tecido normal do cérebro ao redor do alvo do tumor.
Esta metodologia é um passo importante para a inclusão de modalidades de imagiologia biológicas para orientação de radioterapia. No entanto, novos desenvolvimentos são necessários para simplificar a fusão de imagem pré-clínicos e incorporar dose pintura por números (DPBN) em aplicações pré-clínica. Usando o microdifusora atual, agora somos capazes de aplicar o reforço secundário-volume; no entanto, DPBN ainda não é possível devido a limitações no design de colimador, rotações do pórtico e cálculos de dose. Finalmente, o desenvolvimento do compacto pré-clínicos scanners de PET, oferecendo resolução espacial sub milímetros é promissor26 e estes dispositivos podem fornecer uma solução muito elegante para integrar uma plataforma pequena radiação animal PET.
Demonstrar a aplicabilidade deste modelo para MRI combinado e irradiação guiada por PET e quimioterapia do glioblastoma em ratos e para futuras pesquisas sobre novas terapias para glioblastoma. Além disso, a aplicação de PET-guiada secundário-volume aumentar é um primeiro passo para a incorporação de um BTV no planeamento de tratamento da radiação dos modelos de câncer animal pequeno.
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Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer a Stichting Luka Hemelaere e Soroptimista Internacional para apoiar este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GB RAT model | |||
| F98 Glioblastoma cell line | ATCC | CRL-2397 | |
| Fischer F344/Ico crl Rats | Charles River | N/A | http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-a-model/fischer-344-rat |
| Micropump system | World Precision Instruments | UMP3 | Micro 4: https://www.wpiinc.com/products/top-products/make-selection-ump3-ultramicropump/#tabs-1 |
| Stereotactic frame | Kopf | 902 | Model 902 Dual Small Animal Stereotaxic frame |
| diamant drill | Velleman | VTHD02 | https://www.velleman.eu/products/view/?id=370450 |
| Bone wax | Aesculap | 1029754 | https://www.aesculapusa.com/products/wound-closure/hemostatic-bone-wax |
| Insulin syringe Microfine | Beckton-Dickinson | 320924 | 1 mL, 29G |
| InfraPhil IR lamp | Philips | HP3616/01 | |
| Ethilon | Ethicon | 662G/662H | FS-2, 4-0, 3/8, 19 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| DMEM | Invitrogen | 14040-091 | |
| Penicilline-streptomycine | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-032 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-224 | |
| Falcons | Thermo Scientific | 178883 | 175 cm2 nunclon surface, disposables for cell culture with filter caps |
| Cell freezing medium | Sigma-aldrich | C6164 | Cell Freezing Medium-DMSO, sterile-filtered, suitable for cell culture, endotoxin tested |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal irradiation | |||
| Micro-irradiator | X-strahl | SARRP | |
| software for irradiation | X-strahl | MuriPlan | pre-clinical treatment planning system (PCTPS), version 2.0.5. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal PET | |||
| microPET system possibility 1 | Molecubes | B-Cube | http://www.molecubes.com/b-cube/ |
| microPET system possibility 2 | TriFoil Imaging, Northridge CA | FLEX Triumph II | http://www.trifoilimaging.com |
| PET tracers | In-house made | 18F-FDG, 18F-FET, 18F-FAZA, 18F-Choline | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal MRI | |||
| microMRI system | Bruker Biospin | Pharmascan 70/16 | https://www.bruker.com/products/mr/preclinical-mri/pharmascan/overview.html |
| Dotarem contrast agent | Guerbet | MRI contrast agent, Dotarem 0,5 mmol/ml | |
| rat whole body transmitter coil | Rapid Biomedical | V-HLS-070 | |
| rat brain surface coil | Rapid Biomedical | P-H02LE-070 | |
| Water-based heating unit | Bruker Biospin | MT0125 | |
| 30 G Needle for IV injection | Beckton-Dickinson | 305128 | 30 G |
| PE 10 tubing (60 cm/injection) | Instech laboratories, Inc | BTPE-10 | BTPE-10, polyethylene tubing 0.011 x .024 in (0.28 x 60 mm), non sterile, 30 m (98 ft) spool, Instech laboratories, Inc Plymouth meeting PA USA- (800) 443-4227- http://www.instechlabs.com |
| non-heparinised micro haematocrit capillaries | GMBH | 7493 21 | these capillaries are filled with water to create markers visible on MRI and CT |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| isoflurane: Isoflo | Zoetis | B506 | Anaesthesia |
| ketamine: Ketamidor | Ecuphar | Anaesthesia | |
| xylazine: Sedaxyl | Codifar NV | Anaesthesia | |
| catheter | Terumo | Versatus-W | 26G |
| Temozolomide | Sigma-aldrich | T2577-100MG | chemotherapy |
| DMSO | Sigma-aldrich | 276855-100ML | |
| Insulin syringe Microfine | Beckton-Dickinson | 320924 | 1 mL, 29G |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Image analysis | |||
| PMOD software | PMOD technologies LLC | PFUS (fusion tool) | biomedical image quantification software (BIQS), version 3.405, https://www.pmod.com/web/?portfolio=22-image-processing-pfus |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia-equipment | |||
| Anesthetic movabe unit | ASA LTD | ASA 0039 | ASA LTD, 5 valley road, Keighley, BD21 4LZ |
| Oxygen generator | Veterinary technics Int. | 7F-3 | BDO-Medipass, Ijmuiden |
References
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