Summary
En el pasado, irradiación de animales pequeños fue realizada generalmente sin la posibilidad de dirigir un volumen de tumor bien delineado. El objetivo era simular el tratamiento de glioblastoma humano en ratas. Utilizando una plataforma de irradiación de animales pequeños, se realiza irradiación conformal 3D MRI-dirigido con PET-volúmenes basado en el impulso en un entorno de preclínico.
Abstract
Durante décadas, investigación animal pequeño de la radiación sobre todo se realizó con bastante crudas configuraciones experimentales aplicando técnicas de una viga simple sin la posibilidad de tratar un volumen de tumor específico o bien delineado. La entrega de la radiación fue alcanzada usando fuentes de radiación fijo o aceleradores lineales que producen rayos x del megavoltage (MV). Estos dispositivos son capaces de lograr precisión submilimétrica para pequeños animales. Además, las elevadas dosis entregan al sano circundante tejido cesta respuesta evaluación de. Para aumentar la traducción entre pequeños estudios en animales y seres humanos, nuestro objetivo era imitar el tratamiento de glioblastoma humano en un modelo de rata. Para habilitar una irradiación más precisa en un entorno de preclínica, recientemente, plataformas de investigación guiada por la imagen pequeña animal radiación de precisión fueron desarrolladas. Similar a los sistemas de planificación humanos, planificación en estos micro-Irradiadores del tratamiento se basa en la tomografía computada (CT). Sin embargo, el bajo contraste de tejidos blandos en el CT hace muy difíciles de localizar objetivos en ciertos tejidos, como el cerebro. Por lo tanto, la incorporación de resonancia magnética (MRI), que cuenta con excelente contraste de tejidos blandos en comparación con la CT, permitiría una delimitación más precisa de la meta para la irradiación. En las últimas técnicas de imagen también biológica década, tales como la tomografía por emisión de positrones (PET) habían cobrado interés para guía de tratamiento de terapia de radiación. PET permite la visualización de p. ej., consumo de glucosa, transporte de aminoácidos o hipoxia, presente en el tumor. Dirigidas a las partes altamente proliferativas o radio-resistente del tumor con una dosis más alta podrían dar un beneficio de supervivencia. Esta hipótesis condujo a la introducción del volumen del tumor biológica (BTV), además el volumen bruto convencional (GTV), volumen blanco clínico (CTV) y volumen de destino planificado (PTV).
En el laboratorio de imagen preclínico de la Universidad de Gante, un irradiador de micro, un pequeño animal animal doméstico y un animal pequeño de T 7 MRI están disponibles. La meta era incorporar irradiación dirigida por MRI y PET guiado secundario-volumen aumentar en un modelo de rata de glioblastoma.
Introduction
Glioma de alto grado es el tumor cerebral maligno más común y más agresivo en adultos con una supervivencia mediana de 1 año a pesar de las modalidades de tratamiento actual. La norma del cuidado incluye máxima resección quirúrgica seguida de radioterapia de haz externo combinada (RT) y temozolomida (TMZ), seguido de mantenimiento TMZ1,2,3. Desde la introducción de TMZ ahora hace más de 15 años, no se han realizado ninguna mejora significativa en el tratamiento de estos tumores. Por lo tanto, la implementación de nuevas estrategias terapéuticas es urgente, pero debe investigarse primero en modelos de terapia de cáncer de animales pequeños (ratones y ratas). Modelos de roedores con tumores pueden utilizarse para investigar la eficacia de los protocolos de radiación nuevas y complejas, posiblemente combinado con otros agentes (nuevo) de tratamiento, para evaluar la respuesta de la radiación o para investigar a agentes protectores de radio. Una ventaja importante de la investigación preclínica de la radiación es la capacidad para trabajar bajo condiciones experimentales controladas utilizando a grandes cohortes resultante en el rendimiento de datos acelerada debido a la corta duración de la vida de roedores. Los resultados preclínicos deben traducirse entonces en un ensayo clínico de una manera mucho más rápida y más eficiente que en la actual práctica4.
Experimentos de radiación pequeña de animales en las últimas décadas se han logrado típicamente usando fuentes de radiación fijo5,6,7, p. ej., 137Cs y 60Co, isótopos, o lineal aceleradores de destinado a uso clínico humano, aplicación de un campo de solo radiación con rayos x MV6,8,9,10,11. Sin embargo, estos dispositivos no alcanzan la precisión submilimétrica, que se requiere para pequeños animales12. Además, MV radiografías con características inadecuadas para irradiar blancos pequeños, tales como la acumulación de dosis en la interfase aire-tejido en la región de entrada de la viga con un punto en el orden del animal sí mismo tamaño4,6 ,8,9,10,11. Este último es bastante difícil para entregar una dosis uniforme a un tumor mientras que ahorra alrededor de cerebro normal tejido4,8,9,10,11. Por lo tanto, no está claro en que medida actual los estudios en animales son todavía relevantes para moderno RT práctica12. En este sentido, recientemente desarrollados tridimensional (3D) conformal pequeños animales micro-bactericidas son prometedoras para reducir la brecha tecnológica entre 3D guiada por imagen RT técnicas avanzadas, como la radioterapia de intensidad modulada (IMRT) o arcos conformales en los seres humanos y actual irradiación animal pequeña4,13. Estas plataformas hacen uso de una fuente de radiografía del kilovoltage (kV) obtener penumbras agudos y evitar la acumulación de dosis. Estas plataformas incluyen una etapa controlada por ordenador para el posicionamiento, un kV de animal fuente de rayos x para la proyección de imagen y radioterapia, una Asamblea de pórtico rotatorio para permitir la administración de radiación desde varios ángulos y un sistema de colimación para formar el haz de radiación 4. en 2011, un micro-irradiador fue instalado en el laboratorio de imagen preclínico de la Universidad de Gante (figura 1). Este sistema es similar a la práctica de radioterapia humana moderna y permite una amplia variedad de experimentos preclínicos, tales como la sinergia de la radiación con otras terapias, sistemas de radiación compleja y guiada por la imagen objetivo secundario impulso estudios.
Planificación en estos micro-Irradiadores del tratamiento se basa en TC, que es equivalente a la de14,de sistemas de planificación humana15. Para la proyección de imagen de CT, un detector de rayos x a bordo se utiliza en combinación con el mismo tubo de rayos x de kV que se utiliza durante el tratamiento. Proyección de imagen de CT se utiliza ya que permite la colocación exacta del animal y proporciona la información necesaria para los cálculos de dosis de radiación individual mediante segmentación. Sin embargo, debido al bajo contraste de tejidos blandos en CT imágenes, tumores en el cerebro de pequeños animales, como el glioma de alto grado, no pueden ser delineados fácilmente. La incorporación de la imagen multimodalidad por lo tanto es necesaria una delineación de volumen exacto destino. En comparación con la CT, el MRI proporciona ampliamente superior contraste de tejidos blandos. Esto hace mucho más fácil visualizar los límites de la lesión que resultan en una mucho mejor delimitación del volumen blanco, ayudando a mejor irradiar la lesión y evitar el tejido circundante, como se muestra en figura 24, 16. Una ventaja adicional es que el MRI utiliza radiación no ionizante, a diferencia de los CT que utiliza radiación ionizante. Las principales desventajas de la RM son los tiempos de adquisición relativamente largos y altos costos operacionales. Es importante señalar que las exploraciones de MRI no se puede utilizar para los cálculos de dosis, que no proporcionan la información de densidad del electrón requiere, aunque se está avanzando en este campo, también con el desarrollo reciente del Señor LINACS. Como tal, un conjunto de datos de CT/MRI combinado es el método de elección para la planificación de la irradiación de glioma maligno, que contiene la información necesaria para apuntar (volúmenes basados en MRI) y para los cálculos de dosis (densidad del electrón basada en CT).
Para disminuir la brecha entre irradiación de animales pequeños y rutina clínica, MRI claramente debe integrarse en el flujo de trabajo de lo micro-Irradiador, que requieren un registro correcto entre RM y TC, que está lejos de ser trivial. En este trabajo, nuestro protocolo de irradiación conformal 3D MRI-dirigido de F98 glioblastoma en ratas se discute, que ha sido recientemente publicado17.
Aunque la incorporación de CT y MRI del flujo de trabajo de lo micro-irradiador es un claro paso adelante en la investigación de la irradiación de animales pequeños, estas técnicas de imagen anatómicas no siempre permiten una definición completa del volumen de destino. Cambios patológicos en el cerebro en el CT y MRI se caracterizan por aumento del contenido en agua (edema) y la salida de la barrera blood - brain o realce del contraste. Sin embargo, realce del contraste y zonas hiper intensa en T2-weighted MRI no son siempre una medida exacta del grado del tumor.Las células del tumor se han detectado más allá de los márgenes de realce del contraste12. Además, ninguna de estas técnicas puede identificar las partes más agresivas dentro del tumor, que puede ser responsable de la resistencia terapéutica y recurrencia del tumor. Por lo tanto, obtener información adicional de técnicas de imagen moleculares como mascota puede tener un valor añadido para RT objetivo definición del volumen porque estas técnicas permiten visualizar vías biológicas en vivo12,18, 19.
En el año 2000, Ling et al. introdujo el concepto de volumen de destino biológico (BTV) mediante la integración de imágenes anatómicas y funcionales en el flujo de trabajo de radioterapia, a lo que se llama radioterapia conformal multidimensional20. Esto crea la posibilidad de mejorar la dosis objetivo entregando una dosis no uniforme a una región de destino, usando por ejemplo imágenes PET. El más ampliamente utilizado trazadores PET para estadificación del tumor y para monitorear el tratamiento respuesta es fluor-18 (18F) etiquetado fluorodeoxyglucose (FDG), que visualiza la glucosa metabolismo21. En cáncer de cabeza y cuello, estudios anteriores han demostrado que el uso de 18F-FDG PET condujo a una mejor estimación del volumen real del tumor, según lo definido por los especímenes patológicos, en comparación con la CT y MRI22. En primario del cerebro, tumores, donde FDG no es útil debido a la señal de fondo muy fuerte en el cerebro normal, los aminoácidos, tales como 11C-metionina y, más recientemente, 18F-fluoroetthyltyrosine (FET), han sido investigados para GTV delineación con frecuencia marcadas diferencias entre aminoácidos PET y basados en la MRI GTVs23. Sin embargo, ningún ensayo prospectivo investigando el significado de este hallazgo se ha realizado todavía. En este estudio, se seleccionaron los aminoácidos tracer 18F-FET y la hipoxia tracer 18F-fluoroazomycin-arabinósido (18F-FAZA). 18 F-FET y 18F-FAZA fueron seleccionados debido a una mayor absorción de aminoácidos se correlaciona fuertemente con la tasa de proliferación en tumores de GB, mientras que la absorción de una hipoxia trazador PET está correlacionada con la resistencia a (quimio) radioterapia18 , 23. secundario-volumen aumentar utilizando micro-irradiador fue optimizado por dar una dosis adicional de radiación a una parte definida de PET del tumor F98 GB en ratas.
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Protocol
El estudio fue aprobado por el Comité de ética de experimentación animal (ECD 09/23 y ECD 12/28). Todos los datos comerciales se pueden encontrar en la Tabla de materiales.
1. F98 GB modelo de células de rata
- Las células F98 GB, obtenidas de la ATCC, en monocapas utilizando de Dulbecco medio Eagle modificado, suero de ternera 10%, 1% penicilina, estreptomicina de 1%, 1% L-glutamina y 0.1% anfotericina b, de la cultura y en un incubador de CO2 (5% CO2 y 37 ° C).
- Inocular las células de glioma en el cerebro de ratas F344 Fischer (170 g de peso corporal).
- Utilizar instrumentos estériles y usar guantes estériles en todo momento.
- Anestesiar las ratas inyectando una mezcla de 74 mg/kg ketamina y 11 mg/kg xilacina intrapertioneally (IP) con una jeringa de insulina (1 mL, 29 G). La anestesia para confirmar la ausencia de respuesta al reflejo de retirada de la extremidad. Inmovilizar las ratas en un aparato estereotáctico usando puntos de fijación para nariz y orejas. Lugar un ojo carbomer gel para prevenir la sequedad de los ojos bajo anestesia.
- Afeitarse la rata de nivel de los ojos en la parte posterior del cráneo y desinfectar la piel con povidona-yodo.
- Exponer el cráneo a través de una incisión de línea media del cuero cabelludo de 2 cm y una posterior de 2 mm 1 mm agujero (taladro de diamante) y 2,5 mm lateral a la bregma en el hemisferio frontal derecho.
- Inserte una aguja de insulina stereotactically guiada (29 G) e inyecte 5 suspensión de células μl (20.000 células de GB F98) 3 mm de profundidad, usando un controlador de bomba de microjeringa (configuración: inyectar (I50), frecuencia de 1 nL/s (001 SDN)).
- Retirar la jeringa lentamente y cerrar la incisión con cera de hueso. Sutura de la piel y desinfectar con povidona yodada.
- Estabilizar la temperatura corporal de los animales después de la cirugía con una luz roja. Monitorear el despertar de la rata hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. No devolver el animal a la compañía de otros animales hasta que se recuperó completamente. Mantenga todos los animales en condiciones ambientalmente controladas (ciclos normales de luz/oscuridad de 12 h, 20-24 ° C y humedad relativa 40-70%) con comida y agua ad libitum. Asegúrese de seguir de cerca los animales mediante el control de su peso corporal, alimentos, consumo de agua y su actividad y comportamiento normal. Utilice una dosis letal de pentobarbital sódico a la eutanasia de los animales (160 mg/kg) si se observa una disminución del peso corporal del 20% o cuando el comportamiento normal deteriora seriamente (p. ej., falta de aseo personal).
2. confirmación del crecimiento tumoral
Nota: Evaluar tumor crecimiento 8 días post inoculación mediante resonancia magnética de T2-weighted, MRI poner en contraste-realzado dinámico (DCE-MRI) y contraste-realzadas de T1-weighted MRI. Cuando el tumor alcanza un tamaño de 2.5 x 2.5 x 2.5 mm3, seleccionar la rata para la terapia.
- En primer lugar, conecte una aguja de 30 G a un tubo largo de 60 cm, que se coloca por vía intravenosa en la vena lateral de la cola. Anestesiar las ratas a través de un cono de nariz con isoflurano 2% mezclado con oxígeno (0.3 L/min). Confirmar la anestesia cuando las ratas no responden al reflejo de retirada de la extremidad. Cubrir las ratas con una manta caliente y colocarlos en la cama de MRI. Utilizar un gel de Carbómero ojo para evitar la sequedad.
- Coloque la cama en el soporte con una bobina de superficie de cerebro de rata fija y colocar la cama en una bobina del transmisor 72 mm rata todo el cuerpo.
- Realizar un análisis de localizador seguido de una exploración de la hacer girar-eco de T2-weighted para evaluar el crecimiento del tumor. Los datos de secuencia T2-MRI: TR/TE 3661/37,1 ms 109 μm de resolución de en el plano isotrópico, rebanada grueso 600 μm, 4 medias, TA 9 min 45 s.
- Si el tumor es confirmado en la adquisición de T2-weighted, inyectar un agente de contraste que contienen gadolinio intravenoso colocado tubo (medio de contraste MRI; 0,4 mL/kg) 30 s después del comienzo de la adquisición de DCE-MRI. Adquirir DCE-MRI durante 12 min con un ángulo bajo rápido tiro secuencia (FLASH) en una sola rebanada (grosor de corte de 1 mm). Utilizar una resolución espacial en el plano de (312 μm2) y una resolución temporal de 1.34 s.
- Con la herramienta de análisis de secuencia de imagen, seleccione una región de interés (ROI) dentro de la región del tumor sospechoso para representar la intensidad de señal en el tiempo. Posteriormente, analizar la forma de la curva resultante de la DCE para confirmar la presencia de glioblastoma (figura 3).
- Por último, adquirir una secuencia spin-echo T1-weighted de contraste. Los datos de secuencia T1-MRI: TR/TE 1539/9.7 ms, 117 μm isotrópicas en el plano resolución, rebanada grueso 600 μm, 3 medias, TA 4 min 15 s. contraste T1-weighted MR imágenes típicas se muestran en la figura 2.
- Después de finalizar la secuencia de T1-weighted, el animal puede despertar bajo supervisión continua, hasta que recupere conciencia completa.
3. multimodalidad imagen para la selección del volumen de destino
Nota: Para poder realizar guiada por MRI 3D irradiación conformal de la rata F98 GB modelo PET guiado secundario-volumen alzando, 3 necesidad de modalidades para realizar la proyección de imagen. En primer lugar, inyectar el radiotrazador, luego realizar MRI durante la captación del trazador, posteriormente realizar una adquisición estática de PET y un tratamiento planificación CT.
- Anestesiar los animales con un cono de nariz 2% isoflurano con oxígeno (0.3 L/min). Confirmar la anestesia cuando las ratas no responden al reflejo de retirada de la extremidad. Utilice un gel de Carbómero ojo para evitar sequedad mientras esté bajo anestesia.
- Insertar un catéter (26 G) en la vena de la cola, lo que permite la inyección del trazador radioactivo de 37 MBq de PET disuelto en solución salina 200 μl. Inyectar 18F-FET o 18F-FAZA, 30 min o 2 h antes de la adquisición de PET, respectivamente.
- Inyectar medio de contraste MRI (0,4 mL/kg) por vía intravenosa en la vena de la cola usando el catéter 15 min antes de la adquisición del animal doméstico.
- Coloca las ratas en una casa cama de multimodalidad y asegúrelo usando los sujetadores de gancho y lazo, manteniendo una posición fija durante la proyección de imagen y de la micro-irradiación (figura 1).
- Fijar tres marcadores de la multimodalidad (capilares llenados de agua) debajo, encima y en el lado derecho del cráneo. Lugar la rata, todavía fijada en la cama de la multimodalidad en el animal soporte del escáner MRI, fijar la bobina de superficie de cerebro de rata y colocar esta preparación en una bobina de transmisor de cuerpo entero de rata de 72 mm. Realizar un análisis de localizador seguido por una secuencia spin-echo T1-weighted de contraste.
- Transporte animal para realizar un 18F-FET o 18adquisición de PET F-FAZA. Adquirir 30 min PET estática en modo de lista. La exploración debe ser adquirido ya sea 30 min después de la inyección de 18F-FET o 2 h después de la inyección de 18F-FAZA.
4. planificación del tratamiento RT
- Utilice el tratamiento clínico previo planeamiento sistema (PCTPS) para la planificación del tratamiento. Importar el TAC de planificación en la PCTPS y segmentar manualmente esta imagen de CT en tres clases de diferentes tejidos: hueso, tejido blando y el aire. Esta segmentación manual se basa en definir tres diferentes umbrales de valor de gris en la TC de planificación. Estos umbrales de valor gris manualmente seleccionados deben ser elegidos que no existe aire en el cerebro y espesor de hueso del cráneo no es cero. Una vez definidos estos umbrales, densidades de material son asignadas por el PCTPS de hueso, tejidos blandos y aire (figura 4).
- Si sólo se necesita dirección de MRI, la exploración de MRI de la carga y registro conjuntamente con la planificación CT con el PCTPS.
- Uso de transformaciones de cuerpo rígido (tres traducciones y tres rotaciones), los marcadores de la multimodalidad y el cráneo. Al superponer la intensidad de la señal creciente del cráneo en el CT con negro señal en MRI, una fusión exacta puede ser alcanzada (figura 5).
- Seleccione el destino para la irradiación en el centro del tumor mejora el contraste en T1-weighted MRI, ver figura 6 y figura 7.
- Cuando debe incluirse información adicional de la PET, incluyen un co-registro PET/MRI/CT utilizando el software de cuantificación de imagen biomédica (BIQS).
- Utilice la herramienta de contorno en la BIQS para lograr la fusión de imágenes PET/MRI (figura 8). Después de co-registro, seleccione el destino en el centro de la absorción creciente de trazador PET en BIQS (figura 9) e introducir las coordenadas manualmente en el PCTPS mediante las siguientes transformaciones: X → -X, Y → Z y → Z -Y.
- Seleccionar la dosis prescrita, el número de arcos, la posición de arco, la gama de la rotación de los arcos y el tamaño del colimador (figura 10).
- Para la RT guiada por MRI, utilice la siguiente configuración: una dosis prescrita de 20 Gy, 3 arcos colocados en ángulos de sofá de-45 °, 0 ° y 45 ° con rotación de arco de 120 ° y un tamaño del colimador de 5 x 5 mm.
- Para la RT guiada por MRI PET, utilice la siguiente configuración: una dosis prescrita de 20 Gy con 3 arcos y un colimador de 5 x 5 mm y extra 5 Gy para alzar el volumen secundario usando 3 arcos no coplanares y un colimador de 1 x 1 mm. Seleccione una rotación de 120 ° para todos los arcos al cambiar la posición de la cama (-45 °, 0 ° y 45 °).
- Calcular la distribución de dosis dentro de los animales y los parámetros de entrega de la viga para suministrar la dosis prescrita a la blanco usando el PCTPS. Antes de la irradiación real, prueba las rotaciones de arco en el sofá diferentes posiciones para evitar cualquier colisión durante la irradiación.
- Para la irradiación real, seleccione un filtro de cobre de 0,15 mm, ajustar la tensión de rayos x a 220 kV, establecer la radiografía actual a 13 mA y posición del colimador adecuado en el pórtico. Ejecutar el RT al transferir los parámetros de entrega correspondiente de la viga de la PCTPS a micro-irradiador.
- Durante estos procedimientos, la rata se mantiene bajo anestesia isoflurano continua (isoflurano 2%, mezclado con oxígeno 0,3 L/min). Tras la ejecución del último arco, el animal puede despertar bajo supervisión continua, hasta que recupere el sentido completo.
5. dosis volumen histogramas (DVHs)
Nota: Para comparar la dosis real a los volúmenes de destino del tumor y el tejido cerebral normal circundante, calcular DVHs.
- Dibujar un volumen de interés (VOI) alrededor del tumor y el cerebro normal en T1-weighted contraste Sr. imágenes para calcular la media, máximo y mínimo de dosis (figura 11).
- Como un sustituto para la máxima, media y mínima dosis en el volumen del tumor y el volumen de tejido cerebral normal, calcular la D90, D2y D50. D representa la dosis recibida por el x % del volumen, denotado por el subíndice y se puede derivar el DVH resultante.
6. TMZ y Sham quimioterapia
- Para imitar el tratamiento del glioblastoma en pacientes, administrar quimioterapia concomitante con inyecciones de IP de TMZ de 29 mg/kg disuelta en solución salina con 25% de dimetilsulfóxido (DMSO) una vez al día durante 5 días a partir del día de la irradiación24, 25. uso 1 mL, jeringa de insulina 29 G para administrar la inyección.
- Para el grupo de control, administrar inyección de paso 6.1 sin TMZ.
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Representative Results
Para imitar la metodología de tratamiento humano para la irradiación de glioblastoma en un modelo preclínico, inserción de radioterapia guiada por MRI era necesario. Utilizando el PCTPS y la interfaz micro-irradiador fuimos capaces de irradiar F98 glioblastoma en ratas con múltiples arcos no coplanares conformales dirigida a la región de contraste en T1-weighted MRI17. Transformaciones del rígido-cuerpo en combinación con una cama de modalidad múltiple se utilizaron para el registro de la imagen entre planificación CT y MRI El isocentro de la irradiación fue seleccionado en el centro de la región del tumor de contraste en T1-weighted MRI (figura 7).
Se calcularon las distribuciones de dosis y DVHs acumulativos de la dosis media, mínimo y máximo de volumen de destino y el volumen de tejido normal del cerebro de cinco animales diferentes (figura 12). Basado en la semejanza con el protocolo clínico de irradiación y una distribución de dosis óptima, se seleccionó un plan de dosis mediante tres arcos no coplanares. Aplicando este último, el 90% del volumen de destino recibió la dosis deseada, minimizando la dosis a tejido de normal del cerebro17.
Después de confirmar la viabilidad de la irradiación MRI-dirigido de la modelo F98 rata glioblastoma, hemos intentado incorporar PET-volúmenes basado en el impulso del flujo de trabajo preclínico para la planificación de la RT. Hemos sido capaces de combinar las 3 modalidades de imágenes, primero realizar MRI y PET, y finalmente CT mientras la rata se fija en una cama de multimodalidad hecho interno (figura 1). Para co-registro de estas modalidades, se utilizó la BIQS, que permite mucho más herramientas de juego rígido (figura 8). Aplicar una transformación simple, tanto el Señor basado en PET basado isocentro (figura 9) podría ser transferido a la PCTPS. En la figura 13, se muestran el MRI y el isocentro basado en PET para irradiación después del cálculo de dosis en el PCTPS. Para irradiar el volumen entero de mejora de contraste seleccionamos un colimador de 5 x 5 y tres arcos de rotación 120 °. Para estimular la parte más metabólicamente activos del tumor identificado 18PET F-FET o en la parte más hipóxica de tumor identificado 18PET F-FAZA, una dosis de 5 Gy fue seleccionada y entregada utilizando un colimador de 1 mm de diámetro. Una vez más, se aplican 3 arcos de rotación 120 °.
Figura 1: Micro-irradiador integrando un tubo de rayos x de kV, un pórtico giratorio, una etapa robótica controlado por ordenador, un sistema de colimación que forma el rayo y un detector de panel plano CT. El animal se coloca en una cama de multimodalidad PVC espesor 4 mm para evitar movimientos entre adquisiciones de imágenes múltiples, como una exploración de MRI seguido de un TAC de planificación, que facilita la fusión de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: confirmación de Glioblastoma. T1-weighted MRI T2-weighted MRI y DCE-MRI de una rata F98 GB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: curva DCE. Utilizando la herramienta de análisis de secuencia de imagen, puede seleccionarse un retorno de la inversión en la exploración de MRI DCE para representar la intensidad de señal en el tiempo. Posteriormente, el análisis de la forma de la curva resultante de la DCE son capaz de confirmar la presencia de glioblastoma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: segmentación CT. Segmentación basada en el CT se realiza definiendo manualmente un número de valores de umbral para distinguir con precisión aire del tejido pulmonar, tejido adiposo, hueso y otros tejidos dentro de la imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: fusión de MRI CT. Al superponer la intensidad de la señal creciente del cráneo en el CT con negro señal en MRI, se puede lograr una fusión exacta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Cone beam CT. No es visible en la TC, lo que hace imposible seleccionar el isocentro en el centro del tumor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: contraste-realzadas de T1-weighted MRI. El T1-weighted MRI poner en contraste-realzada visualiza claramente un tumor de cerebro de rata F98. El centro del realce del contraste es seleccionado como el isocentro para la planificación de la RT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: fusión de MRI PET. Utilizando la herramienta de contorno en el BIQS, fusión de imágenes PET/MRI se logra.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: selección de destino de MRI PET. El objetivo de la irradiación es seleccionado en el centro de realce de contraste en T1-weighted MRI (izquierda). El objetivo de impulsar el volumen secundario está seleccionado en el centro de la señal creciente en 18PET F-FET (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: planificación de la radioterapia. Para calcular la planificación de radioterapia, seleccione el isocentro, dosis, número de arcos, la posición de arco, la gama de la rotación de los arcos y el tamaño del colimador prescrito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11: cálculo de DVH. Dibujar un volumen de interés (VOI) alrededor del tumor en T1-weighted contraste Sr. imágenes para calcular el DVH dentro de este volumen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 12: plan de dosis utilizando contraste-realzadas de T1-weighted MRI y tres arcsto no coplanares entregar 20 Gy al volumen de destino. A la derecha, se da el histograma de volumen de dosis acumulativa (DVH) el volumen del tumor y el tejido cerebral normal delineado en contraste-realzadas de T1-weighted MRI. Esta figura ha sido modificada de Bolcaen et al. 20 haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 13: MRI y guiada por PET isocentro para irradiación seleccionados. La imagen de CT en la vista axial, coronal y sagital se visualiza con el plan de dosis entrega 20 Gy a la región de destino (región amarilla). El isocentro que fue identificada en contraste-aumento MRI es visible (verde) y el isocentro localizada en la parte de tumor metabólicamente activos identificada 18PET F-FET también es visible (rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para conseguir irradiación precisa de la meta de tumor glioblastoma en el cerebro de la rata, dirección de CT a bordo del micro irradiador no era suficiente. Tumores cerebrales son apenas visibles debido al contraste de tejidos blandos insuficiente, aunque se utilizaría el realce del contraste. Como tal, MRI debe ser incluido para permitir la irradiación más precisa. Mediante una adquisición secuencial del Señor en un sistema de T 7 y una adquisición de la CT en la micro-irradiador que pudimos apuntar la dosis para el tejido del tumor mejora el contraste en el cerebro y calcular un plan de dosis utilizando la TC de planificación. Esto fue posible después de cálculos de dosis y fusión de imagen usando el PCTPS17. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la resonancia magnética es propenso a distorsiones geométricas que no se corrigen en este protocolo. Por otra parte, antes de traducir el presente Protocolo de irradiación a otras partes del cuerpo, más investigación es necesaria. Debe considerarse la importancia de una segmentación precisa de tejido debido a la utilización de fotones de energía menor kV. Mientras que segmentación en tres clases de tejido puede ser suficiente en el cerebro de la rata, más clases de tejido deben indicarse en la región torácica o abdominal de las ratas para proporcionar cálculos de dosis exacta. Para evitar el movimiento durante el transporte entre los diferentes sistemas de proyección de imagen, hicimos uso de una cama de multimodalidad que minimiza el movimiento de la cabeza (figura 1). Sin embargo, un esfuerzo adicional es necesario al aplicar este protocolo a otras partes del cuerpo, regiones torácicas o abdominales. Sobre todo pequeña animal irradiación de órganos influenciados por el movimiento respiratorio o tránsito intestinal es todavía un reto.
La incorporación de PET guiado secundario-volumen aumentar también fue demostrada para ser factible, a pesar de un protocolo de trabajo. Una ventaja de técnicas de imagen nucleares, tal como animal doméstico, es la capacidad a la imagen de la heterogeneidad dentro de los tumores, que permite la focalización partes metabólicamente muy activadas o resistente a la radiación del tumor. Hemos sido capaces de aumentar la dosis, específicamente en la región biológicamente más activa o más hipóxica del tumor usando 18PET F-FET o 18PET F-FAZA, respectivamente. El paso crítico en el protocolo es el registro Co imagen. Actualmente, ningún software puede automáticamente registrar Co preclínicos IRM o TC con imágenes PET con suficiente exactitud y reproducibilidad. En general, trazadores PET en neuro-Oncología demuestran una absorción baja en cerebro normal que complica el proceso de registro. Para la fusión de las tres modalidades de proyección de imagen (MRI/CT/PET), preferimos la BIQS en lugar de la PCTPS, que actualmente no se desarrolla fácilmente combinar múltiples modalidades de imágenes. Además, el BIQS tiene más herramientas de smart matching rígido. Una ayuda importante es también el uso de una cama de modalidad múltiple, prevención de movimiento de los animales entre las adquisiciones de imágenes diferentes. Sin embargo, co-registro manual es lento y aumenta el tiempo de anestesia de los animales. Una vez que se logra el registro de la imagen, exportar las coordenadas de la BIQS en el PCTPS era factible mediante la aplicación de una transformación simple en las coordenadas de destino.
No sólo es importante apuntar precisamente el volumen del tumor (biológico): preservación del tejido cerebral normal circundante ha de tenerse en cuenta también. El último es a menudo descuidado en experimentos animales radioterapia actual pero muy importante que el modelo también clínicamente relevantes. Esto se logró mediante la aplicación de múltiples arcos no coplanares. A nuestro conocimiento, múltiples arco craneal de la irradiación en animales pequeños nunca se aplicó antes. Con respecto a la utilización de la viga, esta metodología está en cercana semejanza con el RT conformal guiada por imágenes clínico y debido al uso de tratamiento por arco el objetivo en última instancia recibe la dosis prescrita, mientras que los tejidos normales reciben sólo una fracción de él. Así, un primer paso se hace para minimizar la brecha entre clínicos y preclínicos de tecnología RT17. Una limitación de este irradiador de micro es que la rotación de pórtico está limitada a 120 °. Combinar rotaciones de arco con un cambio de posición del sofá aumentó aún más la conservación de tejido cerebral normal que rodea el objetivo de tumor.
Esta metodología es un paso importante hacia la inclusión de modalidades de imágenes biológicas para la dirección de radioterapia. Sin embargo, novedades son necesarios para facilitar la fusión de imagen preclínica e incorporar dosis pintura por números (DPBN) en aplicaciones preclínicas. Con la corriente micro-Irradiador, somos ahora capaces de aplicar impulso secundario-volumen; sin embargo, DPBN todavía no es posible debido a limitaciones de cálculos de dosis, rotaciones de pórtico y diseño de colimador. Por último, el desarrollo de compacto preclínicos escáneres PET que ofrece resolución espacial submilimétrica es prometedor26 y estos dispositivos pueden proporcionar una solución muy elegante para integrar una plataforma pequeña radiación animal de PET.
Hemos demostrado la aplicabilidad de este modelo de MRI combinado y guiada por PET irradiación y quimioterapia de glioblastoma en ratas y para futuras investigaciones en nuevas terapias para el glioblastoma. Además, la aplicación de aumentar volumen sub guiada por PET es un primer paso hacia la incorporación de un BTV en la planificación de tratamiento de radiación de los modelos de cáncer animal pequeño.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de interés divulgar
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Stichting Luka Hemelaere y Asociación Internacional para apoyar este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GB RAT model | |||
| F98 Glioblastoma cell line | ATCC | CRL-2397 | |
| Fischer F344/Ico crl Rats | Charles River | N/A | http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-a-model/fischer-344-rat |
| Micropump system | World Precision Instruments | UMP3 | Micro 4: https://www.wpiinc.com/products/top-products/make-selection-ump3-ultramicropump/#tabs-1 |
| Stereotactic frame | Kopf | 902 | Model 902 Dual Small Animal Stereotaxic frame |
| diamant drill | Velleman | VTHD02 | https://www.velleman.eu/products/view/?id=370450 |
| Bone wax | Aesculap | 1029754 | https://www.aesculapusa.com/products/wound-closure/hemostatic-bone-wax |
| Insulin syringe Microfine | Beckton-Dickinson | 320924 | 1 mL, 29G |
| InfraPhil IR lamp | Philips | HP3616/01 | |
| Ethilon | Ethicon | 662G/662H | FS-2, 4-0, 3/8, 19 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| DMEM | Invitrogen | 14040-091 | |
| Penicilline-streptomycine | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-032 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-224 | |
| Falcons | Thermo Scientific | 178883 | 175 cm2 nunclon surface, disposables for cell culture with filter caps |
| Cell freezing medium | Sigma-aldrich | C6164 | Cell Freezing Medium-DMSO, sterile-filtered, suitable for cell culture, endotoxin tested |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal irradiation | |||
| Micro-irradiator | X-strahl | SARRP | |
| software for irradiation | X-strahl | MuriPlan | pre-clinical treatment planning system (PCTPS), version 2.0.5. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal PET | |||
| microPET system possibility 1 | Molecubes | B-Cube | http://www.molecubes.com/b-cube/ |
| microPET system possibility 2 | TriFoil Imaging, Northridge CA | FLEX Triumph II | http://www.trifoilimaging.com |
| PET tracers | In-house made | 18F-FDG, 18F-FET, 18F-FAZA, 18F-Choline | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal MRI | |||
| microMRI system | Bruker Biospin | Pharmascan 70/16 | https://www.bruker.com/products/mr/preclinical-mri/pharmascan/overview.html |
| Dotarem contrast agent | Guerbet | MRI contrast agent, Dotarem 0,5 mmol/ml | |
| rat whole body transmitter coil | Rapid Biomedical | V-HLS-070 | |
| rat brain surface coil | Rapid Biomedical | P-H02LE-070 | |
| Water-based heating unit | Bruker Biospin | MT0125 | |
| 30 G Needle for IV injection | Beckton-Dickinson | 305128 | 30 G |
| PE 10 tubing (60 cm/injection) | Instech laboratories, Inc | BTPE-10 | BTPE-10, polyethylene tubing 0.011 x .024 in (0.28 x 60 mm), non sterile, 30 m (98 ft) spool, Instech laboratories, Inc Plymouth meeting PA USA- (800) 443-4227- http://www.instechlabs.com |
| non-heparinised micro haematocrit capillaries | GMBH | 7493 21 | these capillaries are filled with water to create markers visible on MRI and CT |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| isoflurane: Isoflo | Zoetis | B506 | Anaesthesia |
| ketamine: Ketamidor | Ecuphar | Anaesthesia | |
| xylazine: Sedaxyl | Codifar NV | Anaesthesia | |
| catheter | Terumo | Versatus-W | 26G |
| Temozolomide | Sigma-aldrich | T2577-100MG | chemotherapy |
| DMSO | Sigma-aldrich | 276855-100ML | |
| Insulin syringe Microfine | Beckton-Dickinson | 320924 | 1 mL, 29G |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Image analysis | |||
| PMOD software | PMOD technologies LLC | PFUS (fusion tool) | biomedical image quantification software (BIQS), version 3.405, https://www.pmod.com/web/?portfolio=22-image-processing-pfus |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia-equipment | |||
| Anesthetic movabe unit | ASA LTD | ASA 0039 | ASA LTD, 5 valley road, Keighley, BD21 4LZ |
| Oxygen generator | Veterinary technics Int. | 7F-3 | BDO-Medipass, Ijmuiden |
References
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