Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Multipleksede immunofluorescens analyse og kvantificering af Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T celler

Published: February 8, 2018 doi: 10.3791/56606
Automatic Translation
1, 2,3,4, 2,3, 2,3, 2,3,5, 6, 7, 2, 2, 2, 2,3,6, 8, 2,3, 4, 2,6, *4, *2,4
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou
* These authors contributed equally

Summary

At studere tumor mikromiljø kan identificere prognostiske eller intelligent biomarkører for klinisk respons på immunterapi. Præsenteres her, er en nyskabende metode baseret på i situ fluorescens multispektrale imaging for at analysere og regne automatisk forskellige delpopulationer af CD8+ T celler. Denne reproducerbare og pålidelige teknik egner sig til stor kohorte analyser.

Abstract

Immunceller er vigtige komponenter i tumor mikromiljø og påvirke tumorvækst og udvikling på alle stadier af carcinogenese. Især, er det nu veletableret at den immun infiltrere i humane tumorer kan korrelere med prognose og respons på terapi. Analysen af den immun infiltrere i tumor mikromiljø er blevet en stor udfordring for klassificering af patienter og respons på behandlingen.

Fælles udtryk for hæmmende receptorer som Program celle død Protein 1 (PD1; også kendt som CD279), cytotoksiske T-lymfocytter forbundet Protein 4 (CTLA-4), T-celle Immunoglobulin og Mucin indeholdende Protein-3 (Tim-3; også kendt som CD366) og lymfocytter Aktivering gen 3 (Lag-3; også kendt som CD223), er kendetegnende for T-celle udmattelse. Vi udviklede en multiparametric i situ immunofluorescens farvning for at identificere og kvantificere på cellulært niveau Co udtryk for disse hæmmende receptorer. På en retrospektiv serie af frossen væv af renal celle carcinomer (RCC), ved hjælp af et fluorescens multispektrale imaging-teknologi kombineret med et billede analyse software, det blev fundet at co udtryk for PD-1 og Tim-3 på tumor infiltrerer CD8+ T celler er korreleret med en dårlig prognose hos RCC. Til vores viden, dette repræsenterer den første undersøgelse viser, at denne automatiserede multiplex in situ teknologi kan have nogle kliniske relevans.

Introduction

I de seneste år opstået immunterapi som en meget lovende behandling af mange typer af kræft, herunder RCC. Især, immunterapi baseret på hæmning af hæmmende checkpoints som PD-1 og CTLA-4 er blevet rapporteret at være klinisk effektiv1,2,3,4,5, 6. monoklonale antistoffer mod CTLA-4, PD-1 eller Program død Ligand 1 (PD-L1) er allerede godkendt i flere kræftformer og føre til langvarige kliniske svar i mere end 20% af patienterne7. Dog ikke alle patienter er respondere, omkostningerne ved behandlingen er høj, og disse behandlinger er giftige, fører til potentiel alvorlig autoimmun-lignende bivirkninger. Derfor, den aktuelle udfordring er at identificere prædiktive markører til disse nye immunoterapi. Satsen for mutationer i tumor, udtryk for PD-L1 eller niveauer af intratumoral CD8+ T-celle infiltration er blevet rapporteret til at korrelere med klinisk respons. Denne forening er dog stadig for svag til at anbefale brugen af disse kliniske biomarkører i klinisk praksis undtagen følgesvend test for PD-L1 før administration af Pembrolizumab i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) kræft patienter8 ,9,1011,12. Det er blevet påvist, at fælles udtryk for mange hæmmende receptorer som PD-1, Tim-3, Lag-3, og CTLA-4, inducerer en celle udmattelse fænotype og modstand mod terapi13,14,15. Da perifert blod ikke er repræsentativ for tumor mikromiljø, er det af stor interesse at analysere de fænotypiske egenskaber af celler in situ. PD-1 og Tim-3 Co udtrykker T celler er kendt for at være funktionelt nedsat celler i flere sammenhænge13,16,17. I denne undersøgelse, prognostiske virkningen af det fælles udtryk for de to hæmmende receptorer PD-1 og Tim-3 på CD8+ T celler blev vurderet.

Op indtil nu studerer fælles udtryk for flere markører på tumor infiltrerer lymfocytter (TILs) er hovedsagelig blevet udført ved flowcytometri analyse, hvilket gør det nødvendigt at arbejde på frisk tumorer og derfor udelukkelse retrospektive analyser. Med konventionelle i situ farvning, kun én farvning ad gangen kan udføres og karakterisering af celletype, der samtidig udtrykker markørerne er ikke muligt. For eksempel, er PD-L1 udtrykt af mange celletyper af tumorsygdomme mikromiljø gør det vanskeligt at definere ved konventionelle Immunhistokemi analyse hvilke celler udtrykker PD-L1 er mere relevante for korrelationsmaalinger undersøgelser. I dette arbejde, vi udviklet en nyskabende i situ multiparametric immunofluorescens metode med computer-optælling for at korrelere fælles udtryk for PD-1 og Tim-3 af tumor infiltrerer CD8+ T-celler med kliniske resultater i RCC. Denne teknik har flere fordele, herunder mulighed for at analysere på en enkelt celle og flere mærker samtidig ved hjælp af en multispektrale kamera, der kan fange begrænset intervaller > 10 nm gennem flydende krystal filtre18. Proceduren er desuden automatisk som muliggør en indbyrdes operatør reproducerbarhed og en forkortet analyse i forhold til manuelle teknikker19. I feltet kræft rapporterede adskillige undersøgelser overbevisende flere stainings af immun molekyler som PD-1, PD-L1 og CD8 i Merkel-celle karcinom, lungekræft og hoved og hals kræft20,21,22, 23. den automatiserede celletal er muligt med uddannelse af bruger (fænotyper trin). Fluorescens er målt i forskellige celle rum (kerner, cytoplasma og membran).

Her, forskellige delgrupper af tumor infiltrerer CD8-+ T celler udtrykker PD-1 og/eller Tim-3 i en stor kohorte af RCC blev talt og resultaterne var korreleret med klinisk tyngdekraften scores og overlevelse parametre. Det var også muligt at analysere membran fluorescens intensitet på det cellulære opløsning med betyde fluorescens intensitet (MFI) data som i flowcytometri. Så vidt vi ved, er det de første undersøgelse rapportering prognostiske resultater ved hjælp af denne multispektrale imaging baseret tælle teknik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen og blev godkendt af det lokale etiske udvalg (CPP Ile de France nr. 2012-05-04). Blev indhentet informeret samtykke fra den deltager, der er inkluderet i kohorter.

1. Vævscentre materiale

  1. Indsamle RCC vævsprøver på dagen for operationen. Håndtere kirurgisk modellen ved stuetemperatur (patologi afdeling).
  2. Indsamle en tumor prøve af ca 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm størrelse i et tørt reagensglas. Snap fryse i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C.
  3. Coat prøver i optimal opskæring temperatur sammensatte. Afsnit prøverne med en kryostaten ved-20 ° C i 4-6 µm tykt sektioner. Lad prøver lufttørre på dias til 12 h og direkte gemme dem på-80 ° C for at undgå udtørring.
  4. Kontrollere kvaliteten af prøven af gennemsyn en hæmatoxylin og Eosin farves sektion.

2. in Situ immunofluorescens farvning af TILs

  1. Proceduremæssige retningslinjer
    1. Udfør alle eksperimenterende trin ved stuetemperatur.
    2. For alle trin, udføre fortyndinger med Tris Buffer saltvand (TBS; Se Tabel af materialer).
    3. Udføre vask i TBS til alle foranstaltninger undtagen efter primære antistof inkubation. For sidstnævnte, bruge Tris Buffer saltvand Tween20 (TBST, se Tabel af materialer). Buffer sammensætning og rekonstitution Se supplerende tabel 1.
    4. Brug et fugtigt kammer for antistof inkubationer og en farvning krukke til vask.
    5. Lad ikke afsnittet tørre ud under proceduren.
  2. Forbehandling
    1. Tø det dias, der indeholder vævsprøve og forsigtigt tørre dias omkring modellen med et stykke køkkenrulle. Afgrænser området reaktion indeholdende væv med en hydrofobe barriere pen (Se Tabel af materialer). Tør i 2 min.
    2. Lave prøverne i 100% acetone i 5 min, tørre i 2 min., og vask med TBS i 10 min.
  3. Mætning og blokade
    1. Forbehandle dias i 10 min med 3 dråber af begærlighed 0,1%, tap og/eller svirp diaset for at fjerne luftbobler distribuere begærlighed, og derefter behandle i 10 min med 3 dråber af biotin 0,01% (Se Tabel af materialer), tryk på, og/eller svip. Vask med TBS.
    2. Udføre en Fc-receptorer blokade. Anvende 100 µL af en 5% volumen/bind af normale serum fortyndet i TBS. Brug serum fra den samme vært arter som den mærket sekundær eller tertiær antistof (Se Tabel af materialer); her, blev æsel serum brugt. Inkuber i 30 min.
    3. Under inkubation, spin kortvarigt anti-CD8, PD-1 og Tim-3 antistoffer (Tabel af materialer). Forberede blanding af primære antistoffer i TBS, som beskrevet i supplerende tabel 2.
  4. Immuno-farvning for CD8, PD-1, og Tim-3
    1. Forbered primære antistof blanding. Henvises til Tabel af materialer og supplerende tabel 2 hvor antistofferne anvendes (anti-CD8, PD-1, Tim-3, og deres tilsvarende sekundære antistoffer) og deres koncentrationer.
    2. Tryk på og/eller svirp det resterende æsel serum (tilføjede taktfast 2.3.2). Glassene inkuberes med 100 µL af de ikke-mærket primære antistoffer mix for 1 h i en fugtig kammer.
    3. Under inkubation, kort spin anti-kanin Cyanine 5, AF488-anti-ged og biotinylated mod museantistoffer, og forberede blanding af sekundære antistoffer, som beskrevet i supplerende tabel 2.
    4. Vask dias i TBST i 5 min. tør dias.
    5. Glassene inkuberes med 100 µL af de sekundære antistoffer i 30 min. i en fugtig kammer.
    6. Forbered en blanding af tertiære antistof indeholdende Cy3-streptavidin som beskrevet i supplerende tabel 2.
    7. Vask dias i TBS for 10 min. tør dias.
    8. Glassene inkuberes med 100 µL af den tertiære antistof blandingen i 30 min.
    9. Vask dias i TBS for 10 min. tør dias.
  5. Celle montering
    1. Montere dias i en 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochlorid DAPI-holdige montering medium (1,5 g/mL DAPI) med en coverslip kompatibel til fluorescens mikroskopi (Se Tabel af materialer).
      Bemærk: Som en negativ kontrol til hvert eksperiment, ét dias med isotype-matchede antistoffer blev brugt i den samme koncentration som tilsvarende antistoffer. For denne farvning brugte vi mus IgG1, kanin IgG og ged IgG negativ kontrol antistoffer (Se Tabel af materialer). Som positiv kontrol brugte vi menneskelige hyperplasic tonsil, som vides at være positiv for de testede markører for hvert forsøg. En typisk farvning er beskrevet i resultater (figur 1). Mono-farvning af CD8, PD-1, og Tim-3 bør udføres individuelt (én farvning pr. slide) med den samme forbehandling og uden DAPI. Et dias i de samme forsøgsbetingelser uden antistof og kun DAPI montering medium bør også udføres. Et dias skal være afbildet ved hjælp af identiske forsøgsbetingelser uden nogen antistof og uden DAPI.

3. fluorescens analyse og automatiseret celletal

  1. Billede erhvervelse med automatiseret mikroskopet
    1. Oprette en protokol.
      1. Slå den automatiserede mikroskop software og af fluorescens-belysningen.
      2. I menulinjen, klik på "File", "Opret protokol," vælge "DAPI," "FITC" og "TRITC."
      3. Klik på "Næste", "Tissue afsnit," og klik på "Næste", "protokolnavn." Vælg et navn, for eksempel, "CD8-PD-1-Tim-3," Klik "Næste", og "Gem".
      4. Manuelt placere et dias på scenen.
      5. I menulinjen, klik på "setup", "indstillinger". Klik på "Opret hjem Z" i det nye vindue.
      6. Justere eksponeringstiden med en positiv kontrol Skub dvs en CD8, PD-1 og Tim-3 triple-farves med DAPI prøve.
      7. I betjeningspanelet skal du klikke på "Indstil eksponering".
      8. Justere eksponeringstiden for hvert filter indtil en tilstrækkelig men ikke mætte signal er opnået.
      9. For monokrome imaging, Udfør følgende:
      10. Vælg erhvervelse, og under 'autofokus' Vælg DAPI filter.
      11. I "scan område grænse", flytte den objektive øverste til det øverste venstre hjørne af diaset. Klik på "Mark". Gør det samme for det nederste højre hjørne.
        Bemærk: Dette trin delimitates område med lavt strømforbrug imaging (LP imaging) på 4 X; Vær opmærksom på at markere godt så, omgiver alle prøver af serien.
      12. For høj effekt (HK) imaging, skal du udføre følgende:
      13. Under 'Autofokus', vælge "DAPI".
      14. Under 'Køb' band, vælge "DAPI", "FITC", "Cy3" og "Cy5". Klik på "OK". Klik på "File", "Gem protokol" på menu advokatstanden.
    2. Scanne dias.
      1. Indlæse protokollen ved at klikke på "File", "load protokol" fra menu advokatstanden. Klik på "Start".
      2. Angiv 'Lab ID' (mappeplacering for billede opbevaring). Angiv dias-ID for at identificere diasset. Klik på "Næste".
      3. Klik på "Monokrom Imaging" (for at scanne hele diaset under lysfelt lys og erhverve sekventielle billeder ved hjælp af en 4 x mål).
        Bemærk: Dette producerer en gråtone oversigt over diaset.
      4. Klik på "Find modellen". Vælg område af væv skal scannes ved lav opløsning (4 x): hold "Ctrl"-tasten nede og klik på et felt ved hjælp af markøren til at vælge eller fravælge felter (figur 2A).
      5. Klik på "LP Imaging" (4 x imaging) til fluorescerende rød blågrøn billede erhvervelse af hvert felt.
      6. For HP feltmarkering, holde 'Ctrl' tasten nede og klik på et felt ved hjælp af markøren til at vælge eller fravælge de felter, der svarer til området af væv, der vil blive scannet med høj opløsning (20 x). Vælg 5 områder (figur 2B).
      7. Klik på "HP Imaging" (20 x imaging) for en multispektrale billede erhvervelse af hvert felt (figur 2 c).
      8. Klik på "Data opbevaring" for at gemme billeder i mappen, der blev valgt i begyndelsen i Ole Larsen.
        Bemærk: Processen er sammenfattet og illustreret i figur 2. For hvert trin (væv afsløring, feltmarkering) kan en algoritme forøges og uddannet af brugeren til en helhed-automatiseret scanning processen.
  2. Fluorescens billedanalyse og automatiseret celle tælle med koblede analyse software
    1. Opbygge den spektrale bibliotek.
      1. Åbn billede analyse software.
      2. På venstre panel, åbne "Bygge biblioteker". Under 'load billedet', klik på "Gennemse" og vælg en mono-farvede billede (f.eks.CD8/Cyanine 5).
      3. Vælg fluorophore, (f.eks.Cyanine 5). Klik på "extract". Klik på "Gem" til at lagre i biblioteket. Klik på "Gem".
      4. Gentag den samme proces for PD-1, Tim-3 og DAPI mono-farvede dias for at integrere spektret af hver fluorophore af interesse.
        Bemærk: Bygge biblioteket spektrale integrerer spektrum for hver fluorophore, der anvendes til den specifikke væv (her, nyre), men "syntetisk" biblioteker, der allerede findes kan bruges. Autofluorescence spektrum er strengt i forhold til væv, er det vigtigt at udføre en auto-fluorescens og spektral bibliotek pr. projekt.
    2. Oprette et nyt projekt.
      1. Fra menulinjen, skal du klikke på "File", "Nyt projekt". Vælg "celle segmentering" i fanen 'Find funktionen'. Vælg "fænotyper" i fanen 'Fænotyper'. Klik på "Opret".
      2. Integrere de repræsentative billeder i projektet.
        1. I fanen "Filer" Klik på "Åbn billede". Vælg 10 til 30 repræsentative billeder af hele serien. Tilføje ikke-farvede diaset for at fjerne autofluorescence. På det højre panel: Vælg bibliotek kilde. Vælg fluorophore og vælge dem, der svarer til den spektrale bibliotek tidligere bygget.
      3. For at fjerne væv autofluorescence, klik på knappen"AF" og derefter markere området af autofluorescence på den tomme dias.
      4. Billede behandling og sammensat billede generation.
        1. Klik på "Prepare alle" for at integrere biblioteket fluorescens og autofluorescence spektrene til at generere det sammensatte billede (figur 3). Klik på øjeikonet at åbne panelet 'Se editor' og vælg de data, der vises: Vælg markører CD8, PD-1, Tim-3 og DAPI. Fjerne autofluorescence. Følg vejledningen præsenteres af softwaren.
      5. Segmentere cellerne.
        1. Du kan opdele celler, i 'Rum', Vælg "Kerner" og "Membran". Angiv DAPI den nukleare kontrastfarve i fanen "Kerner".
        2. I fanen "Maksimum og minimumsstørrelse (px)" Indtast "40" og "176" som minimale og maksimale størrelser, henholdsvis. For 'Minimum' signal, indstille "0,13". I "Split" fanen, skal du angive "2,60". I "Kerner" fanen, skal du angive "0,81". Vælg "Brug membran signal til støtte segmentering".
        3. Klik på "Segment celler" på den nederste del af skærmen. Kontrollere segmenteringen af kerner og membraner af celler og prøv med forskellige parametre, hvis det ikke svarer til DAPI og membran fluorescens af celler.
          Bemærk: Softwaren genkender cellerne med den nukleare DAPI farvning og baseret på Cellestørrelse. Justere parametrene celle (størrelse, split, pixel) overensstemmelse med projektet.
      6. Fænotype cellerne.
        1. Klik på "Tilføj" under fanen "Fænotype". Oprette celle fænotype kategorier: CD8 (blå prik) / CD8-PD-1 (rød prik) / CD8-PD-1-Tim-3 (grøn prik) / andre (sort prik) (figur 4).
        2. Vælg mere end 5 eksempler på cellerne i hver kategori. Klik på "Træne klassificering".
          Bemærk: Dette genererer en statistisk klassificering algoritmen af softwaren.
        3. Klik på "Fænotype alle" for at få Fænotypen af hver celle.
          Bemærk: Softwaren giver Fænotypen af en celle med et konfidensinterval (CI) af nøjagtighed.
        4. Forbedre algoritmen af uddannelse software, indtil forskellen mellem øjet og automatiseret count er overensstemmende (fejl < 5%). Vælg et CI, der er acceptabel for celler af interesse.
          Bemærk: Vi valgte at gøre uddannelse på grundlag af 55% CI som acceptabel.
      7. Gemme algoritme og projekt.
      8. Under "Filer' skal du vælge"projekt". Name it og klik på "Gem".
    3. Udføre batchanalyse af serien.
      1. Vælg "Batch-analyse". Vælg projektet. Tilføj billeder til at analysere. Vælg en mappe med opbevaring af data. Klik på "Kør". Kontrollere kvaliteten af det sammensatte billede. Kontrollere fænotyper for alle billederne i serien.
        Bemærk: Den koblede billede analyse software integrerer alle celle rum (membran/cytoplasma/kerner) signaler. Trinnet fænotyper er afgørende, om end uddannelsen af algoritmen, der kan være en tidskrævende trin. Alle data på hvert billede er i en .txt-fil. Alle data i én celle (især sin fænotype givet med sin CI) er i én linje. For hvert dias, blev image erhvervelse og efterfølgende tæller udført på 5 felter.
  3. Integration af rådata og generation af automatiserede celletal
    1. Beregne data med et statistisk program.
      1. Beregne alle data fra 5 billeder svarer til felterne 5 analyseres for 1 patient. Bruge en statistisk platform, og har en erfaren statistiker, data manager eller data videnskabsmand foretage analysen. Opbygge et script, der automatisk tæller celler afhængigt af deres fænotype, vælge CI > 55%.
      2. Sætte alle .txt filer af serien i den samme mappe.
    2. Uddrag data.
      1. Sætte alle .txt-filer i én mappe. Kør scriptet automatisk indbygget i trin 3.3.1. Åbn filen .csv genereret af scriptet Rasmussen. Opspare nemlig .xl format. Output samler antallet af celler for hver fænotype (dvs.CD8 alene, CD8-PD-1, CD8-PD-1-Tim-3) for hver patient.
      2. Beregne det gennemsnitlige antal celler for hver patient pr. felt: opdele antallet af celler pr. antallet af felter (dvs.5) til at normalisere antallet af celler for hver patient pr. felt.
      3. Beregne procentdelen af PD-1+ celler blandt samlede CD8+ T celler og PD-1+ Tim-3+ celler blandt samlede CD8+ T celler. Se figur 5 oversigt over dette trin.
        Bemærk: R sprog (eller andre programmeringssoftware valg) er forpligtet til at oprette og udføre kommandoerne korrekt, og så en erfaren bruger eller statistiker/data videnskabsmand er afgørende. R-programmet kan beregne data af den samme patient, men navnet på de 5 .txt filer af en patient skal have en identisk begyndelsen, svarende til et entydigt patient id.
  4. Statistisk analyse
    1. Bruge statistisk software for den statistiske analyse af resultaterne.
    2. Udføre passende statistiske analyser ved hjælp af en statistiker.
      1. Brug af ikke-parametrisk Wilcoxon underskrevet rank test for sammenligning af PD-1-MFI mellem to celle fænotyper (figur 6). Korrelere covariate og histologiske karakteristika med en Pearson chi2-test.
      2. Bruge en Kaplan-Meier metode til at anslå den progression gratis overlevelse, og Cox regression modeller til at estimere covariate virkninger på tid til begivenhed resultater, som samlet overlevelse og sygdomsfri overlevelse.
      3. Overveje p-værdier lavere end 0,05 som væsentlige.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af generelle protokollen beskrevet ovenfor, vi havde til formål at kvantificere intratumoral CD8+ T-celler Co udtrykker de hæmmende receptorer PD-1 og Tim-3 i frossen væv fra patienter med RCC og at sammenholde resultaterne med kliniske resultater25.

Optimering af CD8/PD-1/Tim-3 farvning:

Forskellige arter af antistoffer (mus, kaniner og geder, se Tabel af materiale) blev valgt for at undgå kryds reaktion mellem de forskellige antistoffer. Protokollen blev godkendt på en tonsil, som er en organiseret lymfoide væv. PD-1 farvning, kunne findes i Kimcentre (figur 1), mens CD8 og Tim-3 farvning er til stede omkring de Kimcentrene. Observation af denne typiske farvning valideret denne protokol. Farvning blev også godkendt på væv af interesse (nyre).

Manglen signal af det primære antistof inkuberes med deres ikke-tilsvarende sekundær antistof (data ikke vist) blev bekræftet. At analysere præcist fluorescens farvning og gøre specifikke spektrale biblioteker enkelte dias var enkeltvis farves med hver markør (CD8, PD-1, Tim-3 eller DAPI) i væv af interesse (nyre). En ikke-farvede dias i de samme betingelser er nødvendige at ekstrapolere autofluorescence af vævet. Farvning blev analyseret af den automatiserede mikroskop, som integreret spectrums af de forskellige fluorophores; hver markør var godt differentieret og ingen overlapning af markører blev observeret (figur 3).

Kvantitative og kvalitative Karakteristik af CD8 + Infiltrere i 87 RCC patienter:

Resultaterne viste, at omkring halvdelen af CD8+ T celler udtrykker PD-1 (gennemsnitlig 53,9%; SE: 30.49%) og omkring en tredjedel var dobbelt positive PD-1+ Tim-3+ (mean 38.16%; SE: 28.11%). Tim-3 udtryk uden PD-1 udtryk blev opdaget i mindre end 3% af CD8+ T-celler (data ikke vist). Det gennemsnitlige antal CD8+ T-celle delpopulationer var: total CD8+ T celler 116.5 (SE: 216), PD-1+ CD8+T celler 89.32 (SE: 191.8), PD-1+ Tim-3+ 66,9 (SE: 143), og PD-1+ Tim-3- CD8 + T celler 22.38 (SE: 57,5) pr. felt. Det samlede antal intratumoral CD8+ T celler var positivt korreleret med procentdelen af PD-1+ Tim-3+ på CD8+ T celler.

Funktionelle karakterisering af CD8 + T-celler afhængigt af deres fænotype PD-1 og Tim-3:

PD-1 udtryk niveau er kendt for at være korreleret med T-celle udmattelse så vi dernæst havde til formål at måle PD-1 udtryk på CD8+ T celler efter Tim-3 udtryk status. Som betyder fluorescens-intensiteten af de forskellige fluorokromer er rapporteret på cellulært niveau, en lille række patienter manuelt blev analyseret for den cellular data: Resultaterne viste en korrelation på PD-1 membran MFI med celle undertype. PD-1 fluorescerende intensitet blev målt (figur 6) på cellulært niveau på PD-1+ Tim-3+ versus PD-1+ Tim-3- CD8+ T-celler (et panel) og på den enkelte patient niveau efter integrere disse forskellige celle signaler på en væv sektion. I en serie af 9 patienter fandt en sammenligning med Wilcoxon parrede test, at PD-1-MFI er højere, når Tim-3 udtrykkes Co, styrkelse af den funktionelle relevansen af Tim-3 udtryk (B panel).

Udtryk for PD-1 og Tim-3 ligander på overfladen af tumorcellerne fra flere Co farvning:

Som T-celle udmattelse er medieret gennem receptor/ligand samspil, vi vurderet udtryk for PD-1 og Tim-3 ligander (PD-L1 og Galectin-9 (Gal-9), henholdsvis) om renal tumorceller identificeret af pan-Keratin farvning. Positivitet er defineret som en cut-off af 10% af tumorceller, der udtrykker markøren: (i) 58 ud af 87 patienter (66%) var positive for PD-L1; (ii) alle 15 tumorer analyseret var positive for Gal-9 (figur 7A, B).

Kliniske konsekvenser af fælles udtryk for Tim-3 + PD-1 + på CD8 + T-celler:

Tumor Node metastaser (TNM) scoring, Fuhrman grade, tumorstørrelse og UISS score er histologiske karakteristika (kombineret med kliniske score for UISS) bruges til at definere værdien prognose af primære RCC. En positiv korrelation blev observeret mellem tal og/eller procentdelen af tumor infiltrerer CD8+ T celler udtrykker PD-1 og Tim-3 (men ikke udtrykker kun PD-1 uden Tim-3) med alle disse parametre (tabel 1). I overensstemmelse med denne mere nedsættende fænotype, RCC patienter med CD8-+ T celler Co udtrykker PD-1 og Tim-3 ovenfor den mediane procentdel (34.7) var mere tilbøjelige til at tilbagefald (p = 0.046; HR 2.9; 95% CI: 1,02-8.21). Denne korrelation blev ikke observeret med procentdelen af PD-1 på CD8+ T celler uafhængigt af Tim-3 status (tabel 2). En korrelation blev også påvist mellem procentdelen af CD8+ T celler Co udtrykker PD-1 og Tim-3 og 36-måneders samlede overlevelsesraten (data ikke vist). Vi godkendte også den tredobbelte immunfarvning på tonsil paraffin væv (figur 1).

Figure 1
Figur 1: CD8-PD-1-Tim-3 immunfarvning på en tonsil paraffin-embedded væv. Paraffin indlejrede væv sektioner i stedet for befrugtede sektioner blev udvalgt til tredobbelt immunfarvning. Efter dewaxing og rehydrering anvendtes den samme protokol af farvning tidligere udviklet for befrugtede sektioner. CD8+ T-cellerne er placeret uden for den germinale centrum og ikke-CD8+ T celler udtrykker PD-1 er grupperet i germinale centrum. Mikroskop forstørrelse er 20 x og skalalinjen repræsenterer 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: automatiseret analyse af renal celle karcinom væv enheder. Efter væv anerkendelse i lysfelt billede (A, skala bar 1 mm), 4 x mikroskop forstørrelse lav opløsning imaging i RGB (rød blå grøn konventionelle fluorescens) bruges til at vælge felterne (B, skala bar 500 µm. Den fulde røde firkant repræsenterer et felt. En høj opløsning billede (multispektrale cube fluorescens billede specifikt for denne teknologi) med ved 20 x forstørrelse udført af multispektrale mikroskop er vist (C, skala bar 100 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: multispektral mikroskopi og software kombineret analyse for generation af et sammensat billede af en renalcellecarcinom (20 x mikroskop forstørrelse). Høj opløsning raw-billede (A) er en fluorescerende billedet i feltet efter multispektrale scanning af fluorescens filter kuber. Blå signal er AF488 og rød er Cyanine 5 grøn er Cyanin3. Fletningen viser forskellige farver for eksempel gul er en sammenfletning af de tre fluorophores. Dette billede er indarbejdet i billed analyse software. Spektrale bibliotek integration giver en nøjagtig spektrum adskillelse af hver fluorophore og autofluorescence fører til en fluorescerende sammensat billede (B). Repræsentative farver er valgt af operatoren: blå illustrerer Cyanine 5 (CD8), Red Cyanine 3 (PD-1), grøn AF488 (Tim-3). Fletning mix farve som lilla bruges til CD8-PD-1 dobbelt positive. Skalalinjen repræsenterer 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: PD-1 og Tim-3 udtryk på tumor infiltrerer CD8+ T-celler på en klart celle renal celle karcinom prøven analyseres af fluorescens multispektrale imaging-teknologi (20 x mikroskop forstørrelse). (A) CD8 (blå), PD-1 (rød), og Tim-3 (grøn) var plettet på frossen væv sektioner afledt af RCC patienter. Colocalization af disse tre markører kan påvises ved en sammenlægning af de mono-farvning billeder. Isotype kontrollen blev udført i hvert forsøg. Skalalinjen repræsenterer 20 µm. gule bokse identificere Co farvede celler: en Tim-3- PD-1+ CD8 celle og en Tim-3+ PD-1+ CD8 celle. (B) Triple Co farvning for CD8, PD-1, og Tim-3 (fusioneret) er vist til venstre med den boks, der angiver det grønne er CD8+ T celler Co udtrykker PD-1 og/eller Tim-3. Til automatiseret optælling med billede analyse software, identifikation af cellerne er afhængig af tilstedeværelsen af en nuklear farvning (DAPI); celle segmentering er også baseret på morfometrisk karakteristika repræsenteret som røde grænser (midterste panel). En algoritme, der er uddannet af brugeren indtil konkordans med visuelle tæller udføres (højre) og efter automatiseret fænotyper, identificerer grønne prikker som CD8+ T-celler Co udtrykker PD-1 og Tim-3, røde prikker som CD8+ T celler udtrykker PD-1 uden Tim-3, og blå prikker som CD8+ T celler ikke udtrykker PD-1 eller Tim-3. Skalalinjen repræsenterer 20 µm. gul boks viser PD-1 og/eller Tim-3 udtrykker CD8+ T celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Computing multispektrale analyse rådata. Der indsamles data i Greven af hver celle kategori i hvert felt (dvs.5 felter/patienten, dvs., 5 .txt filer) efter billedanalyse. En R script kombinerer 5 felter data, kun overvejer celler phenotyped med et konfidensinterval > 55%. Mikroskop forstørrelse er 20 x og skalalinjen repræsenterer 100 µm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: PD-1+ Tim-3+ CD8+ T celler udtrykker højere niveauer af PD-1 i forhold til PD-1+ Tim-3- CD8+ T-celler i renalcellecarcinom. Intensiteten af PD-1 registreres på cellulært niveau (venstre panel) af in situ immunofluorescens analyse på PD-1+ Tim-3+ og PD-1+ Tim-3- CD8+ T celler. På det individuelle niveau (midterste panel): resultater er vist for den hele CD8+ T celle subsets PD-1+ Tim-3+ versus PD-1+ Tim-3- findes på en væv afsnit (dvs., én patient; Mann Whitney test). Sammenlignende analyse af gennemsnitlig PD-1 intensiteten blev målt i en serie af 9 patienter (højre panel) (Wilcoxon test, p-værdier lavere end 0,05 blev betragtet som signifikant). Mikroskop forstørrelse er 20 x og skalalinjen repræsenterer 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: PD-L1 og Gal-9 dvs. PD-1 og Tim-3 ligander farvning på renalcellecarcinom. (A) Tumor celler er identificeret af pan-Keratin farvning. Co farvning af PD-L1 og pan-keratin (et panel) identificerer udtryk for PD-L1 på tumorceller i 58 patienter ud af 87 analyseret. (B) Galectin-9 blev udtrykt i alle de 15 tumorer fra RCC patienter analyseret. Positivitet fandtes, hvis mindst 10% af celler blev plettet for markør analyseret. Isotype kontrol blev inkluderet for hver farvning. Gule bokse repræsenterer positiv tumor (pan-Keratin +) celler for PD-L1 (panel A) eller Galectin-9 (panel B). Mikroskop forstørrelse er 20 x og skalalinjen repræsenterer 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

%/CD8+ T celler PD-1+ PD1+ Tim-3+ PD-1+ Tim-3-
TNM 0,04 0,003 0,22
Furhman 0,01 0,004 0,74
Tumorstørrelse 0,08 0,01 0,37
UISS 0,01 0,01 0,63

Tabel 1: Sammenhæng mellem udtryk for PD-1 alene eller kombineret med Tim-3 på CD8+ T celler og kliniske prognostiske parametre af RCC patienter: p-værdier. Procentdelen af PD-1+, PD-1+ Tim-3+ eller PD-1+ Tim-3- på CD8+ T celler valgt som en kontinuerlig variabel måles ved i situ immunfluorescens i kohorte af 87 patienter var korreleret med forskellige kliniske parametre defineres som en binær (TNM, Fuhrman lønklasse, UISS score) eller en kontinuerlig variabel (tumorstørrelse). TNM blev opdelt i to grupper: lokaliseret sygdom (pT1 og pT2) og fremskreden sygdom (pT3, pT4, N+eller M+). Fuhrman grade blev defineret som lav (klasse I eller II) og høj (klasse III eller IV) og UISS score var opdelt i 3 klasser (0, 1 og 2). P-værdier, der angiver en betydelig sammenhæng er vist i fed skrift.

CD8+ T-celle delmængde/CD8 PD-1+ Tim-3+ PD-1+ Tim-3-
Median (%) 34,7 8.6
Korrelation med PFS P = 0.046 P = 0,8

Tabel 2: Korrelation mellem PD-1 og Tim-3 Co udtryk på CD8+ T celler og progression gratis overlevelse. To grupper af RCC patienter (n = 87) afhængig af andelen af PD-1 uden Tim-3 (til højre), PD-1 og Tim-3 (venstre) i forhold til medianen var individualiseret. Sammenhæng med PFS foregik med medianen valgt som en cut-off. P-værdier, der angiver en betydelig sammenhæng er vist i fed skrift.

Supplerende tabel 1: Buffer sammensætning af TBS og TBST. TBS bruges til antistof blander og fortyndinger. For vasker, er alle trin udført med TBS undtagen vasker efter primære antistoffer, hvor TBST anbefales. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 2: detaljeret antistoffer Bland sammensætning for CD8-PD-1-Tim-3 immunofluorescens farvning. For hver primære, sekundære og tertiære antistof blander, er fortynding til at udføre i det tilsvarende antal TBS givet for et samlet volumen på 1 mL. For ét dias er den nødvendige samlede reaktion volumen 100 µL til et væv område 2 cm2. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ændringer og fejlfinding:

Vævet kvalitet er en vigtig parameter; Det kan let kontrolleres af hæmatoxylin og eosin farvning.

En fordel ved teknikken er muligheden for multiplex stainings, men for at undgå fluorophore spillover, anbefales det for at vælge emission bølgelængder med delta af 10 nm minimum. Her, fordi vi havde 4 stainings herunder DAPI, valgte vi at sprede ud bølgelængder (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, Cyanine 3:570 nm, Cyanine 5:670 nm). Risikoen for overlapning signaler fra forskellige fluorophores undgås ved at bruge softwaren til at beregne den ren spektrum af en fluorophore fra en blandet emission signal, kombineret med en automatiseret billedanalyse. Mono-farvede dias også bekræfte fravær af overlapning mellem fluorophores og handle som en kompensation takket være den spektrale bibliotek.

Positivitet for en markør i en celle kan undertiden være vanskeligt at afgøre, om farvning/Fluorescens er svag. Den negative kontrol inkluderet i hvert eksperiment er en god måde at bestemme en tærskel på positivitet.

I den koblede software bruges til at analysere billeder, en scoring trin til bestemmelse af positivitet cellens eksisterer, men det kun kan analysere to markører samtidigt. Fordi vi kan få tredobbelt farvning på den samme celle (CD8, PD-1, og Tim-3), vi valgte trinnet fænotyper.

Fænotyper skridt kan være besværlig, især hvis typen af farvning og baggrunden er variabel fra én prøve til en anden.

Begrænsninger af teknikken:

Selv om antallet af co-stainings er en fordel i forhold til konventionelle fluorescens, er det ikke muligt at analysere mange farver som flowcytometri. Især når colocalization af flere markører er studeret, være klar til følsomhed, der er lavere sammenlignet med Konfokal mikroskopi (for en 20 x mikroskop forstørrelse, ca 0,5 µm versus 0,1 µm per pixel for Konfokal, afhængigt af mærke) og Kontroller for fluorophore spillover (se kritisk trin i den protokol, nedenstående).

En stor begrænsning af teknikken er rå dataformatet. De rå data er .txt-filer, som kan være vanskelige at bruge. Som softwaren giver en .txt-fil pr. billede med CI for fænotype, er manuel behandling af hver af de 5 filer pr. patient i en enorm serien meget omstændelig. Bioinformatik specialist er forpligtet til at beregne alle data i en statistisk software.

Betydning med hensyn til eksisterende metoder:

Multiplex farvning analyse er let muligt. I forhold til flowcytometri, der analyserer friske prøver, giver denne teknik en hurtig optælling i en reproducerbar metode til forskellige celle subsets stede i tumor mikromiljø i store kohorter af frosne prøver med en automatiseret procedure26 ,27. Vi kunne automatisk tælle infiltrerer CD8+ T celler udtrykker PD-1 og co udtrykker Tim-3 eller ikke i fastsættelsen af RCC. Den automatiske tæller undgår flere bias som eye træthed og ikke-reproducerbare count, og er ikke tidskrævende.

Som den store kohorte studerede var på frosne prøve, vi havde retrospektive data, så vi kunne forbinde de absolutte antallet eller procentdelen af CD8+ T celle subsets med biologiske parametre og kliniske udfald. Da der er en vigtig heterogenitet af immun infiltration fra en patient til en anden28, udgør dette en fordel i forhold til fluorocytometry, at rapporter kun MFI og procentdel, men ikke infiltration lønklasse.

Fluorescens-intensiteten rapporteres kvantitativt for hver celle, og i de anden celle rum (membran/cytoplasma/kerner), kunne vi vurdere niveauet af PD-1 farvning af MFI på membranen. Dette repræsenterer en anden interessant værktøj, der svarer til flowcytometri. Vi fandt, at PD-1+ CD8+ T celler, der udtrykker Tim-3 havde højere udtryk for PD-1 og var forbundet med en dårlig prognose (indvirkning på progression gratis overlevelse). Til vores viden er det den første undersøgelse ved hjælp af denne metode, der viser en klinisk betydning af en bestemt celle delmængde.

Fremtidige ansøgninger:

Anvendelsesområdet er enorme. Vi har også fremhævet i lunge kræft tumor mikromiljø en anden specifik celle delmængde: væv bopæl hukommelse T celler kaldet TRM (CD103+ CD49a+), og de er korreleret med en bedre samlet overlevelse21,29 ,30. I et andet værk ved hjælp af denne teknik, vores team fandt, at PD-L1 var overexpressed på tumorcellerne i en undertype af lungekræft med en Anaplastisk lymfom kinase (ALK) omlejring, og dette udtryk var korreleret med CD8+ T infiltrere10. Denne teknik er velegnet til vurdering af kritiske biologiske parametre i flere sammenhænge og kan udgøre et værdifuldt redskab for biomarkør opdagelse. Da xy koordinater er givet, er det en af de første værktøjer til at studere topografi og celle/celle interaktioner med lethed31.

Kritiske trin i protokollen:

Et af de kritiske trin er optimering af co farvning, hvilket kan være tidskrævende. Valget af en god antistof er afgørende, for eksempel flere kloner er blevet testet for Tim-3 i den foreliggende sag. Desuden kan forskellige fluorophores for den samme markør give forskellige resultater, så det er vigtigt at forsøge flere kombinationer. Undersøge farvning specificitet med antistoffer, der ikke bør reagerer sammen anbefales. Trods mulighed for at analysere flere fluorophores på samme tid, anbefales kontrol for spillover med mono-farvede lysbilleder. En anden afgørende skridt er trinnet fænotyper, der bygger på brugervejledning træning skal udføres omhyggeligt.

I alt repræsenterer dette multipleksede teknik af en dygtig operatør et elegant værktøj til at analysere flere celle subsets af den lokale immun infiltrere, som er af betydning, da den perifere blod analyse ikke kan være repræsentant for de lokale tumor miljø.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere har nogen interessekonflikt at erklære.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Institut National du kræft (Inka) (ET), Ligue contre le Cancer (ET), Université Sorbonne Paris Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex Immuno-onkologi (ET), SIRIC CARPEM (CG, ET). EdG blev finansieret af et fællesskab af Fondation ARC. EV og CD blev finansieret af et fællesskab af APHP (bourse année recherche). ChB er finansieret af et fællesskab af Université Sorbonne Paris Cité (contrat ph.d.). Forfatterne takke Bristol Myers Squibb for deres støtte i dette projekt. Forfatterne takker Institut for patologi af Hopital Européen Georges Pompidou og Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel og Gisèle Legall). Forfatterne takke histologi platform af PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging  Perkin Elmer CLS142338
inForm cell analysis 2.1. Perkin Elmer CLS135781
R software https://www.r-project.org
Dakopen delimiting pen Dako S2002
Tris Buffer Salin TBS Tablets Takara, Bio Inc. TAKT9141Z pH7.6 100 tablet
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) Takara, Bio Inc. TAKT9142Z pH 7.6 100 tablets
Biotin blocking system Dako X0590 Avidin 0.1% and Biotin 0.01%
normal donkey serum Jackson Immunoresearch 017-000-001 5% vol./vol. concentration
Fluoroshield with DAPI Sigma-aldrich F6057 1.5 µg/mL concentration
Knittel glass coverslip Knittel Gläser, 100039 24x60 mm 100 cover slips
Rabbit anti-CD8 Clone P17-V novus NBP1-79055 use at 4µg/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NAT abcam ab52587 use at 2 µg/mL
Goat anti-Tim-3 R&D AF2365 use at 3 µg/mL
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 Roche 7309457001 use at 1 µg/mL
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 Cell Signalling 4528 use at 0.5 µg/mL
Goat anti-human gal9 R&D AF2045 use at 0.3 µg/mL
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit Jackson Immunoresearch 711-175-152 use at 5 µg/mL
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 715-066-150 use at 3 µg/mL
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG abcam ab150133 use at 5 µg/mL
Cy3 labeled streptavidin Amersham PA43001 use at 3 µg/mL
negative control mouse IgG1 Dako X0931 use at 2 µg/mL
IgG from goat serum Sigma-aldrich I5256 use at 3 µg/mL
IgG from rabbit serum Sigma-aldrich I5006 use at 4µg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  2. Granier, C., et al. Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs. Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).
  3. Motzer, R. J., et al. Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial. J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).
  4. Robert, C., et al. Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation. N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).
  5. Robert, C., et al. Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).
  6. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
  7. Schadendorf, D., et al. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).
  8. Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. What does PD-L1 positive or negative mean? J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).
  9. Rizvi, N. A., et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science. 348 (6230), 124-128 (2015).
  10. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. OncoImmunology. 6 (4), e1286437 (2017).
  11. Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. Biomarqueurs prédictifs de réponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices. Bull Cancer. 103, Suppl 1. S151-S159 (2016).
  12. Tumeh, P. C., et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  13. Fourcade, J., et al. Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients. J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).
  14. Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501 (2016).
  15. Wherry, E. J., Kurachi, M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).
  16. Cai, C., et al. Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma. World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).
  17. Sakuishi, K., et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity. J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).
  18. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  19. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).
  20. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).
  21. Nizard, M., et al. Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine. Nat Commun. 8, 15221 (2017).
  22. Nghiem, P. T., et al. PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).
  23. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. Oncoimmunology. (4), (2017).
  24. Woods, K., et al. Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma. J Immunother Cancer. 4, 10 (2016).
  25. Granier, C., et al. Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma. Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  26. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  27. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3, 47 (2015).
  28. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
  29. Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines. Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).
  30. Sandoval, F., et al. Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors. Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120 (2013).
  31. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nat Commun. 8, 15095 (2017).

Tags

Immunologi sag 132 Multiplex i situ multispektrale imaging immunofluorescens teknik digital billedbehandling renalcellecarcinom Tim-3 PD-1 tumor mikromiljø checkpoint hæmmere i situ enkelt celle analyse
Multipleksede immunofluorescens analyse og kvantificering af Intratumoral PD-1<sup>+</sup> Tim-3<sup>+</sup> CD8<sup>+</sup> T celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Granier, C., Vinatier, E., Colin,… More

Granier, C., Vinatier, E., Colin, E., Mandavit, M., Dariane, C., Verkarre, V., Biard, L., El Zein, R., Lesaffre, C., Galy-Fauroux, I., Roussel, H., De Guillebon, E., Blanc, C., Saldmann, A., Badoual, C., Gey, A., Tartour, É. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. J. Vis. Exp. (132), e56606, doi:10.3791/56606 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter