Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Multiplexed immunofluorescentie analyse en kwantificering van Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cellen

Published: February 8, 2018 doi: 10.3791/56606
Automatic Translation
1, 2,3,4, 2,3, 2,3, 2,3,5, 6, 7, 2, 2, 2, 2,3,6, 8, 2,3, 4, 2,6, *4, *2,4
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou
* These authors contributed equally

Summary

Bestuderen van tumor communicatie kan identificeren prognostische of voorspellende biomarkers voor klinische respons op immunotherapie. Hier wordt gepresenteerd, is een innovatieve methode op basis van in situ fluorescentie multispectrale imaging te analyseren en automatisch verschillende subpopulaties van CD8 tellen+ T cellen. Deze reproduceerbaar zijn en betrouwbare techniek is geschikt voor grote cohort analyses.

Abstract

Immune cellen zijn belangrijke componenten van de communicatie van de tumor en tumorgroei en evolutie beïnvloeden in alle stadia van carcinogenese. Met name nu ook vaststaat dat de immuun infiltreren in menselijke tumoren met de prognose en respons op therapie correleren kan. De analyse van de immuun infiltreren in de communicatie van de tumor is uitgegroeid tot een grote uitdaging voor de classificatie van patiënten en de reactie op behandeling.

De co uitdrukking van remmende receptoren zoals programma cel dood eiwit 1 (PD1; ook bekend als CD279), cytotoxische T-lymfocyten geassocieerde eiwit 4 (CTLA-4), T-cel Immunoglobulin Mucin bevattende eiwitten-3 (Tim-3; ook bekend als CD366) en lymfocyt Activering gen 3 (Lag-3; ook bekend als CD223), is een kenmerk van T cel uitputting. We ontwikkelden een multiparametric in situ immunofluorescentie kleuring te identificeren en te kwantificeren op cellulair niveau de co uitdrukking van deze remmende receptoren. Op een retrospectieve serie van bevroren weefsel van renaal cel carcinomen (RCC), met behulp van een fluorescentie multispectrale imaging technologie in combinatie met de software van de analyse van een afbeelding, bleek dat mede uiting van PD-1 en Tim-3 op tumor infiltreren CD8+ T cellen is gecorreleerd met een slechte prognose in RCC. Om onze kennis, dit is de eerste studie waaruit blijkt dat dit geautomatiseerd multiplex in situ technologie wellicht sommige klinische relevantie.

Introduction

In de afgelopen jaren, heeft immunotherapie ontpopt als een zeer veelbelovende behandeling voor vele soorten van kanker, met inbegrip van de RCC. Bijzonder, immunotherapie, gebaseerd op de remming van remmende checkpoints als PD-1 en CTLA-4 is gemeld te worden klinisch effectief1,2,3,4,5, 6. monoklonale antilichamen tegen CTLA-4, PD-1, of programma dood Ligand 1 (PD-L1) zijn al goedgekeurd in verschillende kankers en leiden tot langdurige klinische reacties in meer dan 20% van de patiënten7. Echter niet alle patiënten responders, de kosten van de behandeling is hoog, en deze behandelingen zijn giftig, wat leidt tot potentiële ernstige bijwerkingen van de auto-immune-achtige. Daarom is de huidige uitdaging het identificeren van voorspellende markers aan die nieuwe immuuntherapie. Het tempo van de mutaties in de tumor, de uitdrukking van PD-L1 of de niveaus van intratumoral CD8+ T cel infiltratie gemeld te correleren met de klinische respons. Deze vereniging is echter nog steeds te zwak om te raden het gebruik van deze klinische biomarkers in de klinische praktijk met uitzondering van de test van de metgezel voor PD-L1 vóór de administratie voor Pembrolizumab in niet-kleincellige longkanker kanker (NKCLK) patiënten8 ,9,1011,12. Het is aangetoond dat de co uitdrukking van vele remmende receptoren als PD-1, Tim-3, Lag-3, en CTLA-4, induceert een cel uitputting fenotype en weerstand tegen therapie13,14,15. Aangezien perifeer bloed niet representatief zijn voor de communicatie van de tumor is, is het van groot belang voor het analyseren van de fenotypische kenmerken van de cellen in situ. PD-1 en Tim-3 mede waarin T-cellen zitten bekend voor zitten functioneel verminderde cellen in verschillende contexten13,16,17. In deze studie, de prognostische impact van de co uitdrukking van de twee remmende receptoren PD-1 en Tim-3 op CD8+ T cellen werd beoordeeld.

Omhoog tot nu toe, het bestuderen van de co uitdrukking van meerdere markeringen op tumor infiltreren lymfocyten (TILs) is voornamelijk door stroom cytometry analyse, waardoor het noodzakelijk wordt om te werken aan nieuwe tumoren en daarom uitschakeling retrospectieve analyses verricht. Met conventionele in situ kleuring, slechts één kleuring tegelijk kan worden uitgevoerd, en de karakterisatie van het celtype die mede de markers uitdrukt is niet mogelijk. Bijvoorbeeld, wordt PD-L1 uitgedrukt door veel celtypen van het tumoraal communicatie, waardoor het moeilijk te definiëren door conventionele immunohistochemistry analyse welke cellen uiten van PD-L1 relevanter voor oereenstemming studies zijn. In dit werk, ontwikkelden we een methode van multiparametric immunofluorescentie innovatieve in situ met computer-tellen om te correleren de co uitdrukking van PD-1 en Tim-3 door tumor infiltreren CD8+ T-cellen met klinische resultaten in de RCC. Deze techniek heeft meerdere voordelen, met inbegrip van de mogelijkheid om te analyseren op het niveau van een enkele cel en meerdere markeringen op hetzelfde moment met behulp van een multispectrale camera die beperkt intervallen vangen kan > 10 nm via vloeibare kristallen filters18. De procedure is bovendien automatische waardoor een inter exploitant reproduceerbaarheid en een verkorte analyse in vergelijking met manuele technieken19. Op het gebied van kanker, verschillende studies gerapporteerd overtuigend meerdere technieken van immuun moleculen zoals PD-1, PD-L1 en CD8 in Merkel-cel carcinoom, longkanker, en hoofd en nek kanker20,21,22, 23. de telling van de geautomatiseerde cel is mogelijk met de opleiding door de gebruiker (fenotypering stap). De fluorescentie wordt gemeten in de andere cel compartimenten (kernen cytoplasma en membraan).

Hier, de verschillende subgroepen van tumor-infiltreren CD8+ T cellen waarin PD-1 en/of Tim-3 in een grote cohort van RCC werden geteld en de resultaten werden gecorreleerd met klinische Ernst scores en overleving parameters. Het was ook mogelijk om het analyseren van membraan intensiteit van de fluorescentie bij de cellulaire resolutie met bedoel fluorescentie intensiteit (MFI) gegevens zoals in cytometry. As far as we know, vertegenwoordigt dit de eerste rapportage prognostische studieresultaten met behulp van deze multispectrale imaging gebaseerde graaf techniek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd overeenkomstig de verklaring van Helsinki en werd goedgekeurd door de lokale ethische Commissie (CPP Ile de France nr. 2012-05-04). Geïnformeerde toestemming was verkregen van de deelnemer in de cohorten opgenomen.

1. de weefsels materiaal

  1. Verzamelen RCC weefselsteekproeven op de dag van de operatie. Omgaan met de chirurgische model bij kamertemperatuur (Afdeling Pathologie).
  2. Een monster van de tumor van ongeveer 0,5 x 0,5 cm x 0.5 cm grootte in een droge buis verzameld. Module bevriezen in vloeibare stikstof en opslaan bij-80 ° C.
  3. De monsters in optimale scherpe temperatuur samengestelde jas. Het gedeelte van de monsters met een cryostaat bij-20 ° C in 4-6 µm dik secties. Laat de monsters lucht droog op dia's voor 12u en direct opslaan bij-80 ° C tot het vermijden van uitdroging.
  4. Controleer de kwaliteit van het monster door een haematoxyline en eosine gekleurd sectie te bekijken.

2. in Situ immunofluorescentie kleuring van TILs

  1. Procedurele richtsnoeren
    1. Voer alle experimentele stappen uit bij kamertemperatuur.
    2. Voor alle stappen, verrichten de verdunningen met Tris Buffer Saline (TBS; Zie Tabel van materialen).
    3. Voeren de wash in TBS voor alle stappen behalve na de incubatie met primair antilichaam. Voor deze laatsten gebruiken Tris Buffer zoute Tween20 (TBST, Zie Tabel van materialen). Zie aanvullende tabel 1voor buffer samenstelling en reconstitutie.
    4. Gebruik een kamer vochtigheid voor antilichaam incubations en een kleuring pot voor wassen.
    5. Laat niet het gedeelte uitdrogen tijdens de procedure.
  2. Voorbehandeling
    1. Ontdooi de dia met het monster weefsel en zorgvuldig drogen de dia rond het model met een papieren handdoek. Afgebakend op het gebied van de reactie met het weefsel met een hydrofobe barrière pen (Zie Tabel van materialen). Droge gedurende 2 minuten.
    2. Los van de monsters in 100% aceton voor 5 min, droge gedurende 2 minuten, en wassen met TBS voor 10 min.
  3. Verzadiging en blokkade
    1. Voorbehandeling van de dia's gedurende 10 minuten met 3 druppels van avidin 0,1%, kraan en/of flick de dia de avidin distribueren en verwijderen van luchtbellen en vervolgens behandelen voor 10 min met 3 druppels van biotine 0,01% (Zie Tabel of Materials), tikt u op en/of flick. Wassen met eetlepels
    2. Het uitvoeren van een blokkade van Fc receptoren. Breng 100 µL van een 5% volume/volume van normale serum verdund in eetlepels gebruik serum van dezelfde host soorten als de gelabelde secundaire of tertiaire antilichaam (Zie Tabel van materialen); hier, werd ezel serum gebruikt. Incubeer gedurende 30 min.
    3. Tijdens de incubatie, spin kort de anti-CD8, PD-1 en Tim-3 antilichamen (Tabel van materialen). De mix van primaire antilichamen in TBS bereiden zoals beschreven in aanvullende tabel 2.
  4. Immuno-kleuring voor CD8, PD-1 en Tim-3
    1. Het primaire antilichaam mengsel te bereiden. Zie Tabel van materialen en aanvullende tabel 2 voor de antilichamen die gebruikt (anti-CD8, PD-1, Tim-3, en hun overeenkomstige secundaire antilichamen) en de concentraties ervan.
    2. Tik op en/of flick de resterende ezel serum (toegevoegd in stap 2.3.2). Incubeer de dia's met 100 µL van de mix van niet-met de label primaire antilichamen voor 1 h in een bevochtigde kamer.
    3. Tijdens de incubatie, kort spin de Cyanine anti-konijn, AF488-anti-geit, 5en biotinyleerd anti-muis-antilichamen, en de mix van secundaire antilichamen bereiden zoals beschreven in aanvullende tabel 2.
    4. Wassen van de dia's in TBST voor 5 min. droog de dia's.
    5. Incubeer de dia's met 100 µL van de secundaire antilichamen gedurende 30 min. in een bevochtigde kamer.
    6. Het mengsel van tertiaire antilichaam met Cy3-daar, zoals beschreven in aanvullende tabel 2voor te bereiden.
    7. Wassen van de dia's in TBS voor 10 min. drogen de dia's.
    8. Incubeer de dia's met 100 µL van het mengsel van de tertiaire antilichaam voor 30 min.
    9. Wassen van de dia's in TBS voor 10 min. drogen de dia's.
  5. Montage van de cel
    1. Monteren van de dia's in een 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride DAPI-bevattende montage medium (1,5 µg/mL DAPI) met een dekglaasje aan compatibel voor fluorescentie microscopie (Zie Tabel van materialen).
      Opmerking: Als een negatieve controle voor elk experiment, één dia met isotype-matched antilichamen werd gebruikt op dezelfde concentratie als de overeenkomstige antilichamen. Voor deze kleuring gebruikten we IgG1 muis, konijn IgG en geit IgG negatieve controle antilichamen (Zie Tabel van materialen). Als positieve controle gebruikten we menselijke hyperplasic tonsillen waarvan bekend is dat gunstig zijn voor de geteste markeringen, voor elk experiment. Een typische kleuring wordt beschreven in de resultaten (Figuur 1). Mono-kleuring van CD8, PD-1 en Tim-3 moet worden uitgevoerd individueel (een kleuring per dia) met de zelfde voorbehandeling en zonder DAPI. Een dia in de dezelfde proefomstandigheden zonder antilichaam en alleen DAPI montage medium moet ook worden uitgevoerd. Een dia moet worden beeld met behulp van identieke experimentele omstandigheden zonder enige antilichaam en zonder DAPI.

3. fluorescentie analyse en geautomatiseerde cellen

  1. Beeldacquisitie met de geautomatiseerde Microscoop
    1. Maak een protocol.
      1. Zet de geautomatiseerde Microscoop software en de verlichter van de fluorescentie.
      2. In de menubalk, klik op 'Bestand', "Maak protocol," Selecteer "DAPI," "FITC", en "TRITC."
      3. Klik op "Volgende", "Weefselsectie," en klik op "Next", "Protocolnaam." Kies een naam, bijvoorbeeld "CD8-PD-1-Tim-3," Klik "Next", en "opslaan".
      4. Handmatig een dia in het werkgebied plaatsen.
      5. Klik in de menubalk op "setup," "instellingen." Klik op 'Stel in huis Z' in het nieuwe venster.
      6. Belichtingstijd aanpassen met een positieve controle schuif d.w.z. een CD8, PD-1 en Tim-3 triple-gekleurd met DAPI monster.
      7. Klik in de balk met besturingselementen op "set blootstelling."
      8. De belichtingstijd voor elk filter aanpassen tot een voldoende maar niet verzadigen signaal wordt verkregen.
      9. Voor zwart-wit beeldvorming, doet u het volgende:
      10. Selecteer verwerving en kies onder 'autofocus' DAPI filter.
      11. In de "scan gebied te beperken", de objectieve bovenste naar de linkerbovenhoek van de dia te verplaatsen. Klik op de "Mark". Doe hetzelfde voor de lagere juiste hoek.
        Opmerking: Deze stap delimitates het gebied van energiebesparende denkbaar (de weergave van de LP) ter 4 X; Let erop dat u plaats rond het merk zo goed over het omringen van alle monsters van de serie.
      12. Voor hoog vermogen (HP) imaging, doet u het volgende:
      13. Kies onder 'Autofocus', "DAPI".
      14. Kies onder 'Verwerving' band, "DAPI", "FITC", "Cy3" en "Cy5". Klik op "OK". Klik op de menubalk op "Bestand", "Save protocol".
    2. De dia's scannen.
      1. Het laden van het protocol door te klikken op "Bestand", "protocol laden' in de menubalk. Klik op "Start".
      2. Voer 'Lab ID' (de locatie van de map voor beeldopslag). Geef dia-ID te identificeren van de dia. Klik op "Next".
      3. Klik op "Zwart-wit Imaging" (voor het scannen van de hele dia onder heldere veld licht en verwerven van opeenvolgende beelden met behulp van een doelstelling 4 x).
        Opmerking: Dit geeft een overzicht van de grijswaarden van de dia.
      4. Klik op "Zoeken Specimen". Selecteer het gebied van weefsel worden gescand met een lage resolutie (4 x): Houd de 'Ctrl'-toets ingedrukt en klik op een veld met behulp van de cursor selecteren of deselecteren velden (figuur 2A).
      5. Klik op "LP Imaging" (4 x imaging) voor fluorescerende rood blauw groen Beeldacquisitie van elk veld.
      6. Voor HP veldselectie, 'Ctrl' toets ingedrukt en klik op een veld met behulp van de cursor selecteren of hef de selectie van velden die overeenkomen met het gebied van weefsels die zal worden gescand met een hoge resolutie (20 x). Selecteer 5 velden (figuur 2B).
      7. Klik op "HP Imaging" (20 x imaging) voor een multispectrale Beeldacquisitie van elk veld (figuur 2C).
      8. Klik op 'Data Storage' voor het opslaan van afbeeldingen in de map die aan het begin in LabID werd geselecteerd.
        Opmerking: Het proces is samengevat en geïllustreerd in Figuur 2. Voor elke stap (weefsel detection, Veldselectie) kan een algoritme worden verhoogd en opgeleid door de gebruiker voor een geheel geautomatiseerde scanproces.
  2. Fluorescentie beeldanalyse en geautomatiseerde cellen tellen met gekoppelde analysesoftware
    1. De spectrale bibliotheek bouwen.
      1. Open de software van de analyse van de afbeelding.
      2. Open op het linker paneel, "Bouwen bibliotheken". Onder 'load image', klik op "Bladeren" en selecteer één mono gebeitste afbeelding (bijvoorbeeldCD8/Cyanine 5).
      3. Selecteer de fluorophore, (b.v., Cyanine 5). Klik op "uitpakken". Klik op "Opslaan" om op te slaan in de bibliotheek. Klik op "Opslaan".
      4. Herhaal het zelfde proces voor PD-1, Tim-3 en DAPI mono gebeitste dia's teneinde het spectrum van elke fluorophore van belang.
        Opmerking: De spectrale bibliotheek gebouw integreert het spectrum voor elke fluorophore gebruikt voor het specifieke weefsel (hier, nier), maar "synthetische" bibliotheken die al aanwezig zijn kunnen worden gebruikt. Zoals het autofluorescence-spectrum strikt ten opzichte van het weefsel is, is het belangrijk om een auto-fluorescentie en spectrale bibliotheek per project te voeren.
    2. Maak een nieuw project.
      1. In de menubalk, klikt u op 'Bestand', 'Nieuw Project'. Selecteer in het tabblad 'Zoekfunctie' "de segmentering van de cel". Selecteer in het tabblad 'Fenotypering' "fenotypering". Klik op 'Maak aan'.
      2. De representatieve beelden in het project integreren.
        1. In het tabblad 'Bestand', klik op "open image". Kies 10 tot 30 representatieve beelden van de hele reeks. De niet-gekleurde dia als u wilt verwijderen van de autofluorescence toevoegen. Op het juiste paneel: Selecteer bibliotheek bron. Selecteer fluorophore en kies die overeenkomen met de spectrale bibliotheek eerder gebouwd.
      3. Als u wilt verwijderen van weefsel autofluorescence, klikt u op de "AF" en selecteer vervolgens het gebied van de autofluorescence op de lege dia.
      4. Afbeelding behandeling en Composietbeeld generatie.
        1. Klik op "Voorbereiden alle" de fluorescentie-bibliotheek en de spectra van de autofluorescence voor het genereren van de samengestelde afbeelding (Figuur 3) te integreren. Klik op het pictogram van het 'oog' opent u het paneel 'weergave-editor' en selecteer de gegevens die worden weergegeven: Selecteer de markeringen CD8, PD-1, Tim-3 en DAPI. Verwijder de autofluorescence. Volg de stappen die zijn gepresenteerd door de software.
      5. Segment van de cellen.
        1. Selecteer om het segment de gewenste cellen, in 'Compartiment', "Kernen" en "Membrane". Stel in het tabblad "Kernen" DAPI als de nucleaire counterstain.
        2. In het tabblad 'Maximale en minimale grootte (px)' Voer "40" en "176" als minimale en maximale grootte, respectievelijk. Voor de 'Minimum' signaal, stelt "0.13". Stel "2,60" in "Split" tabblad. Stel "0,81" in "Kernen" tabblad. Selecteer 'gebruik membraan signaal voor segmentatie hulp'.
        3. Klik op 'Segment cellen"op het onderste gedeelte van het scherm. Controleer de segmentatie van de kernen en membranen van cellen en opnieuw met verschillende parameters, als het niet overeenkomt met de DAPI en membraan fluorescentie van de cellen.
          Opmerking: De software herkent de cellen met de nucleaire DAPI kleuring en gebaseerd op de grootte van de cel. De cel-parameters (grootte, split, pixels) volgens het project aanpassen.
      6. Fenotype de cellen.
        1. Klik in het tabblad 'Fenotype' op 'Voeg toe'. Maak cel fenotype Categorieën: CD8 (blauwe stip) / CD8-PD-1 (rode stip) / CD8-PD-1-Tim-3 (groene stip) / andere (zwarte) (Figuur 4).
        2. Meer dan 5 voorbeelden van cellen van elke categorie selecteren Klik op "Train classificatie".
          Opmerking: Dit genereert een statistische classificatie algoritme van de software.
        3. Klik op "Fenotype alle" om op te halen van het fenotype van elke cel.
          Opmerking: De software geeft het fenotype van een cel met een betrouwbaarheidsinterval (CI) van nauwkeurigheid.
        4. Het algoritme te verbeteren door het trainen van de software tot het verschil tussen oog en geautomatiseerde graaf concordante is (fout < 5%). Kies een CI die aanvaardbaar is voor de cellen van belang is.
          Opmerking: We kozen te maken van de opleiding op basis van 55% CI als aanvaardbaar.
      7. Sla het algoritme en project.
      8. Selecteer "project" onder 'Bestand'. Naam en klik op "Opslaan".
    3. Batch analyses van de serie uit te voeren.
      1. Selecteer "Batch analyse". Selecteer het project. Voeg toe de beelden om te analyseren. Selecteer een map voor veilige opslag van de gegevens. Klik "Run". Controleer de kwaliteit van de samengestelde afbeelding. Controleer of de fenotypering voor alle de beelden van de serie.
        Opmerking: De software van de analyse van de gekoppelde afbeelding integreert alle compartimenten (membraan/cytoplasma/kernen)-signalen van de cel. De fenotypering stap is cruciaal, zij de opleiding van het algoritme een tijdrovende stap kan zijn. Alle gegevens van elke afbeelding zijn in een txt-bestand. Alle gegevens van één cel (met name zijn fenotype gegeven met haar CI) zijn in één lijn. Voor elke dia werden de Beeldacquisitie en latere graven uitgevoerd op 5 velden.
  3. Integratie van de ruwe gegevens en de generatie van de graaf van geautomatiseerde cel
    1. Berekenen van de gegevens met een statistische programma.
      1. Berekent alle gegevens uit de 5 beelden die overeenkomt met de 5 velden geanalyseerd voor 1 patiënt. Gebruik een statistische platform, en hebben een ervaren statisticus, manager van de gegevens of gegevens wetenschapper de analyses uit te voeren. Het bouwen van een script dat automatisch telt het aantal cellen afhankelijk van hun fenotype, selecteren de CI > 55%.
      2. Alle .txt-bestanden van de reeks in dezelfde map plaatsen
    2. Het uittreksel van de gegevens.
      1. Zet alle .txt-bestanden in één map. Het automatische script gebouwd in stap 3.3.1 uitvoeren. Open de uitvoer CSV-bestand gegenereerd door de R-script. Opslaan als .xl formaat. De output verzamelt het aantal cellen voor elk fenotype (dat wil zeggen, alleen, CD8 CD8-PD-1, CD8-PD-1-Tim-3) voor elke patiënt.
      2. Bereken het gemiddelde aantal cellen voor elke patiënt per veld: verdelen van het aantal cellen per het aantal velden (dat wil zeggen, 5) om te normaliseren van het aantal cellen voor elke patiënt per veld.
      3. Bereken het percentage van PD-1+ cellen onder totale CD8+ T cellen en PD-1+ Tim-3+ cellen onder totale CD8+ T cellen. Zie Figuur 5 voor een samenvatting van deze stap.
        Opmerking: R taal (of andere programmeersoftware van keuze) is vereist voor correct maken en uitvoeren van de opdrachten, en dus een ervaren gebruiker of statisticus/gegevens wetenschapper is essentieel. De R-programma kan de gegevens van de dezelfde patiënt berekenen, maar de naam van de 5 .txt-bestanden van één patiënt moet een identieke begin, overeenkomt met een unieke id van de patiënt.
  4. Statistische analyse
    1. Gebruik statistische software voor de statistische analyse van de resultaten.
    2. Uitvoeren van passende statistische analyses uitgevoerd met de hulp van een statisticus.
      1. Gebruik de niet-parametrische Wilcoxon ondertekend rangschikking tests voor vergelijking van PD-1 MFI tussen twee fenotypes van de cel (Figuur 6). De covariate en de histologische kenmerken met een Pearson de chi-kwadraatverdeling test correleren.
      2. Gebruik een Kaplan-Meier-methode om de progressie vrije overleving en Cox regressiemodellen om een schatting van de effecten van de covariate op tijd-aan-event resultaten, zoals de totale overleving en ziektevrije overleving te schatten.
      3. Overwegen van p-waarden lager dan 0,05 belangrijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met behulp van het algemeen protocol zoals hierboven beschreven, we gericht op het kwantificeren van intratumoral CD8+ T cellen samen uiting geven aan de remmende receptoren PD-1 en Tim-3 in bevroren weefsels van patiënten met RCC, en de resultaten correleren met klinische resultaten25.

Optimalisatie van de kleuring van CD8/PD-1/Tim-3:

Verschillende soorten antilichamen (muis, konijn en geit, Zie Tabel van materiaal) werden gekozen om te voorkomen dat kruis reactie tussen de verschillende antilichamen. Het protocol werd gevalideerd op een tonsillen, oftewel een georganiseerde lymfoïde weefsel. PD-1 kleuring kan worden gevonden in de germinal centra (Figuur 1), overwegende dat CD8 en Tim-3 vlekken aanwezig rond de germinal centra zijn. De waarneming van deze typische kleuring gevalideerd dit protocol. De kleuring is ook gevalideerd op het weefsel van belang (nier).

Het ontbreken van een signaal van het primaire antilichaam geïncubeerd met hun niet-overeenkomend secundair antilichaam (gegevens niet worden weergegeven) werd bevestigd. Wilt analyseren nauwkeurig de fluorescentie kleuring en om specifieke spectrale Bibliotheken, afzonderlijke dia's afzonderlijk werden gekleurd met iedere markeerdraad (CD8, PD-1, Tim-3 of DAPI) in het weefsel van belang (nier). Een dia niet gebeitste onder dezelfde omstandigheden is noodzakelijk om het extrapoleren van de autofluorescence van het weefsel. De kleuring werd geanalyseerd door de geautomatiseerde Microscoop, die geïntegreerd de spectra van de verschillende fluorophores; iedere markeerdraad was goed gedifferentieerde en geen overlapping van markers werd waargenomen (Figuur 3).

Kwantitatieve en kwalitatieve kenmerken van de CD8 + Infiltreren in 87 RCC patiënten:

Resultaten toonden aan dat ongeveer de helft van CD8+ T cellen uitdrukkelijke PD-1 (gemiddelde 53,9%; SE: 30,49%) en over een derde werden dubbele positieve PD-1+ Tim-3+ (gemiddelde 38.16%; SE: 28.11%). Tim-3 expressie zonder PD-1 expressie werd ontdekt in minder dan 3% van CD8+ T cellen (gegevens niet worden weergegeven). Het gemiddelde aantal CD8+ T cel subpopulaties waren: total CD8+ T cellen 116.5 (SE: 216), PD-1+ CD8+T cellen 89.32 (SE: 191.8), PD-1+ Tim-3+ 66,9 (SE: 143), en PD-1+ CD8 Tim-3- + T cellen 22.38 (SE: 57,5) per veld. Het totale aantal intratumoral CD8+ T cellen was positief gecorreleerd met het percentage van de PD-1+ Tim-3+ op CD8+ T cellen.

Functionele karakterisering van de CD8 + T cellen afhankelijk van hun fenotype PD-1 en Tim-3:

PD-1 expressie niveau heet worden gecorreleerd met T cel uitputting zodat we volgende gericht op het meten van de PD-1 expressie op CD8+ T cellen volgens Tim-3 expressie staat. Zoals de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de verschillende fluorochromes is gemeld op cellulair niveau, een klein aantal patiënten handmatig voor de cellulaire gegevens werden geanalyseerd: resultaten toonde een correlatie van PD-1 membraan MFI met het subtype van de cel. PD-1 tl intensiteit werd gemeten (Figuur 6) op het cellulaire niveau PD-1+ Tim-3+ versus PD-1+ CD8 Tim-3- + T cellen (een paneel) en niveau van de individuele patiënt na de integratie van deze verschillende cel signalen op een weefselsectie. In een serie van 9 patiënten vond een vergelijking met de Wilcoxon gepaarde toets dat PD-1 MFI hoger als Tim-3 mede is uitgedrukt, het functionele belang van Tim-3 expressie (B panel) te versterken.

Uitdrukking van PD-1 en Tim-3 liganden aan de oppervlakte van de tumorcellen uit meerdere co-kleuring:

Zoals T cel uitputting is bemiddeld door receptor/ligand interactie, wij de uitdrukking van PD-1 en Tim-3 liganden beoordeeld (PD-L1 en Galectin-9 (Gal-9), respectievelijk) op renale tumorcellen geïdentificeerd door pan-keratine kleuring. Positiviteit is gedefinieerd als een licht-donkerscheiding van 10% van de tumorcellen uiting geven aan de marker: (i) 58 uit 87 patiënten (66%) waren positief voor PD-L1; (ii) alle 15 tumoren geanalyseerd waren positief voor Gal-9 (figuur 7A, B).

Klinische effect van de co uitdrukking van Tim-3 + PD-1 + op CD8 + T-cellen:

Tumor knooppunt metastase (TNM) scoren, Fuhrman rang grootte van de tumor en UISS score zijn histologische kenmerken (gecombineerd met klinische score voor UISS) gebruikt om de waarde van de prognose van primaire RCC te definiëren. Een positieve correlatie bestaat tussen het nummer en/of percentage van tumor-infiltreren CD8 werd waargenomen+ T cellen uiten PD-1 en Tim-3 (maar niet uiten alleen PD-1 zonder Tim-3) met al deze parameters (tabel 1). In overeenstemming met deze meer pejoratief fenotype, RCC patiënten met CD8+ T cellen samen waarin PD-1 en Tim-3 boven het gemiddelde percentage (34,7) waren meer kans op het terugvallen (p = 0.046; HR 2.9; 95% CI: 1.02-8.21). Deze correlatie werd niet waargenomen met het percentage van PD-1 op CD8+ T cellen onafhankelijk van Tim-3 status (tabel 2). Een correlatie werd ook aangetoond tussen het percentage van CD8+ T cellen samen waarin PD-1 en Tim-3 en de 36 maanden totale overlevingskans (gegevens niet worden weergegeven). We gevalideerd ook de drievoudige immunokleuring op tonsillen paraffine weefsels (Figuur 1).

Figure 1
Figuur 1: CD8-PD-1-Tim-3 immunokleuring op tonsillen paraffine-ingebedde tissues. Paraffine ingesloten weefsel secties in plaats van cryopreserved secties werden geselecteerd voor triple immunokleuring. Na Wasuitsmeltovens en rehydratie, werd hetzelfde protocol van kleuring eerder ontwikkeld voor cryopreserved secties toegepast. CD8+ T cellen bevinden zich buiten het germinal center en niet-CD8+ T cellen uiten van PD-1 zijn geclusterd in het germinal center. De vergroting van de Microscoop is 20 x en de schaal staaf vertegenwoordigt 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: geautomatiseerde analyse van renaal cel carcinoom weefsel specimens. Na de opname van het weefsel in helder veld afbeelding (A, schaal bar 1 mm), 4 x Microscoop vergroting lage resolutie beeldvorming in RGB (rood blauw groen conventionele fluorescentie) wordt gebruikt voor het selecteren van de velden (B, schaal bar 500 µm. Het volledige rode vierkantje vertegenwoordigt een veld. Een afbeelding met hoge resolutie (multispectrale kubus fluorescentie afbeelding specifiek voor deze technologie) met op 20 x vergroting uitgevoerd door de multispectrale Microscoop wordt weergegeven (C, schaal bar 100 µm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: multispectrale microscopie en software combinatie analyse voor de generatie van een samengestelde afbeelding van een niercelcarcinoom (20 x vergroting van de Microscoop). De hoge resolutie raw opname (A) is een fluorescerende beeld van het veld na het multispectrale scannen door fluorescentie filter kubussen. Blauwe signaal is AF488, rood is Cyanine 5 en groen is Cyanin3. De samenvoegbewerking toont verschillende kleuren bijvoorbeeld geel is een samenvoeging van de drie fluorophores. Dit beeld is verwerkt in de software van de analyse van de afbeelding. Spectrale bibliotheek integratie kunt een nauwkeurige spectrum scheiding van elke fluorophore en autofluorescence leidt tot een fluorescerende Composietbeeld (B). Representatieve kleuren worden gekozen door de exploitant: blauw illustreert Cyanine 5 (CD8), Red Cyanine 3 (PD-1), groene AF488 (Tim-3). Mix kleuren zoals paars gebruikt voor CD8-PD-1 dubbele positief. De schaal staaf vertegenwoordigt 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: PD-1 en Tim-3 expressie op CD8 infiltreert in tumor+ T cellen in een cel wissen renaal cel carcinoom specimen geanalyseerd door fluorescentie multispectrale imaging technologie (20 x vergroting van de Microscoop). (A) CD8 (blauw), PD-1 (rood) en Tim-3 (groen) werden gekleurd op bevroren weefselsecties die zijn afgeleid van de RCC patiënten. Colocalization van deze drie markers kan worden gedetecteerd door het samenvoegen van de mono-kleuring afbeeldingen. Isotype controles werden uitgevoerd in elk experiment. De schaal staaf vertegenwoordigt 20 µm. gele vakken samen gekleurde cellen opsporen: een Tim-3- PD-1+ CD8-cel en een Tim-3+ PD-1+ CD8-cel. (B) Triple mede kleuring voor CD8, PD-1 en Tim-3 (samengevoegd met) wordt getoond aan de linkerkant met de waarmee wordt aangegeven dat groene CD8 is+ T cellen samen waarin PD-1 en/of Tim-3. Voor geautomatiseerde tellen met de software van de analyse van het beeld, de identificatie van de cellen is afhankelijk van de aanwezigheid van een nucleaire kleuring (DAPI); de cel-segmentatie is ook gebaseerd op Morfometrische kenmerken weergegeven als rode grenzen (middelste deelvenster). Een algoritme die getraind door de gebruiker tot concordantie met visuele count (rechts) wordt uitgevoerd, en na geautomatiseerde fenotypering, groene stippen aangeduid als CD8+ T cellen uiten mede PD-1 en Tim-3, rode stippen als CD8+ T cellen uiten van PD-1 zonder Tim-3, en blauwe stippen als CD8+ T cellen niet waarin PD-1 of Tim-3. De schaal staaf vertegenwoordigt 20 µm. geel vak geeft PD-1 en/of Tim-3 uiting van CD8+ T cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: de ruwe gegevens van multispectrale analyse Computing. Gegevens van de graaf van elke cel categorie aanwezig in elk veld (d.w.z.5 velden/patiënt, dat wil zeggen, 5 .txt-bestanden) worden verzameld na beeldanalyse. Een script R combineert de 5 velden gegevens, alleen het overwegen van cellen met een betrouwbaarheidsinterval > 55% phenotyped. De vergroting van de Microscoop is 20 x en de schaal staaf vertegenwoordigt 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cellen uiten hogere niveaus van PD-1 ten opzichte van PD-1+ CD8 Tim-3- + T cellen in niercelcarcinoom. De intensiteit van de PD-1 wordt gedetecteerd op cellulair niveau (linkerdeel) door in situ immunofluorescentie analyse op PD-1+ Tim-3+ en PD-1+ CD8 Tim-3- + T cellen. Op individueel niveau (middelste deelvenster): resultaten worden weergegeven voor de hele CD8+ T cel subsets PD-1+ Tim-3+ versus PD-1+ Tim-3- aanwezig op een weefselsectie (d.w.z., één patiënt; Mann-Whitney test). Vergelijkende analyse van de gemiddelde intensiteit van de PD-1 werd gemeten in een serie van 9 patiënten (rechtervenster) (Wilcoxon toets, p-waarden lager dan 0,05 werden beschouwd als zo belangrijk). De vergroting van de Microscoop is 20 x en de schaal staaf vertegenwoordigt 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: PD-L1 en Gal-9 d.w.z. PD-1 en Tim-3 liganden kleuring op niercelkanker. (A) Tumor cellen worden geïdentificeerd door pan-keratine kleuring. Co van de PD-L1 en pan-keratine (een paneel) kleuring identificeert de uitdrukking van PD-L1 op tumorcellen in 58 patiënten uit 87 geanalyseerd. (B) Galectin-9 kwam tot uitdrukking in alle van de 15 tumoren van de RCC patiënten geanalyseerd. Positiviteit werd beschouwd als ten minste 10% van de cellen werden gekleurd voor de marker geanalyseerd. Isotype besturingselementen werden opgenomen voor elke kleuring. Gele vakken vertegenwoordigen positieve tumor (pan-keratine +) cellen voor PD-L1 (a-panel) of Galectin-9 (deelvenster B). De vergroting van de Microscoop is 20 x en de schaal staaf vertegenwoordigt 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

%/CD8+ T-cellen PD-1+ PD1+ Tim-3+ PD-1+ Tim-3-
TNM 0.04 0.003 0.22
Furhman 0,01 0.004 0,74
De grootte van de tumor 0.08 0,01 0.37
UISS 0,01 0,01 0.63

Tabel 1: Correlatie tussen de uitdrukking van PD-1 alleen of in combinatie met Tim-3 op CD8+ T cellen en klinische prognostische parameters van de RCC patiënten: p-waarden. Het percentage van PD-1+, PD-1+ Tim-3+ of PD-1+ Tim-3- op CD8+ T cellen geselecteerd als een continu variabele gemeten met in situ immunofluorescentie in het cohort van 87 patiënten was gecorreleerd met diverse klinische parameters gedefinieerd als een binaire (TNM, Fuhrman rang, UISS score) of een continu variabele (de grootte van de tumor). TNM was verdeeld in twee groepen: gelokaliseerde ziekte (pT1 en pT2) en gevorderde ziekte (pT3, pT4, N+of M+). Fuhrman rang werd gedefinieerd als lage (graad I of II) en hoog (grade III of IV) en de UISS score was verdeeld in 3 klassen (0, 1 en 2). P-waarden die aangeven een significante correlatie zijn vetgedrukt.

CD8+ T cel deelverzameling/CD8 PD-1+ Tim-3+ PD-1+ Tim-3-
Mediaan (%) 34,7 8.6
Correlatie met PFS P = 0.046 P = 0,8

Tabel 2: Correlatie tussen PD-1 en Tim-3 mede expressie op CD8+ T cellen en progressie vrije overleving. Twee groepen van de RCC patiënten (n = 87) afhankelijk van het percentage van de PD-1 zonder Tim-3 (rechts), PD-1 en Tim-3 (links) ten opzichte van de mediaan waren geïndividualiseerd. De correlatie met de PFS werd gemaakt met de mediaan als een licht-donkerscheiding geselecteerd. P-waarden die aangeven een significante correlatie zijn vetgedrukt.

Aanvullende tabel 1: samenstelling van TBS en TBST Buffer. TBS is gebruikt voor antilichaam mixen en verdunningen. Voor wast, worden alle stappen uitgevoerd met TBS met uitzondering van de volgende primaire antilichamen, waar TBST is aanbevolen wast. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: gedetailleerde antilichamen mix samenstelling voor CD8-PD-1-Tim-3 immunofluorescentie kleuring. Voor elke primaire, secundaire en tertiaire antilichaam mengt, krijgt de verdunning uit te voeren in de overeenkomstige hoeveelheid TBS voor een totaal volume van 1 mL. Voor één dia bedraagt de nodige totale reactie volumewaarde 100 µL voor een weefsel gebied van 2 cm,2. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wijzigingen en probleemoplossing:

De kwaliteit van het weefsel is een belangrijke parameter; het kan gemakkelijk worden gecontroleerd door de haematoxyline en eosine-kleuring.

Een voordeel van de techniek is de mogelijkheid van multiplexed technieken, maar om te voorkomen dat fluorophore spill-over, het aanbevolen te kiezen emissie golflengten met delta van 10 nm minimum. Hier, omdat we 4 technieken waaronder DAPI hadden, we kozen te spreiden de golflengten (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, Cyanine 3:570 nm, Cyanine 5:670 nm). Het risico van overlapping van de signalen van verschillende fluorophores wordt vermeden door het gebruik van de software voor het berekenen van het zuivere spectrum van een fluorophore van een gemengde emissie signaal, gecombineerd met een automatische beeldanalyse. De mono gebeitste dia's bevestigen ook de afwezigheid van overlapping tussen fluorophores en handelen als een compensatie dankzij de spectrale bibliotheek.

Positiviteit voor een marker in één cel kunnen soms moeilijk om te bepalen als de kleuring/fluorescentie zwak is. De negatieve controle opgenomen in elk experiment is een goede manier om te bepalen van een drempel van positiviteit.

Een scorende stap voor het bepalen van de positiviteit van de cel bestaat in de gekoppelde software gebruikt voor het analyseren van de beelden, maar het alleen kunt analyseren twee markeringen gelijktijdig. Omdat we kunnen beschikken over triple kleuring op dezelfde cel (CD8, PD-1 en Tim-3), kozen we de fenotypering stap.

De fenotypering stap kan zijn moeizaam, vooral als het type vlekken en achtergrond variabele uit één monster naar de andere is.

Beperkingen van de techniek:

Zelfs als het aantal co-technieken een voordeel ten opzichte van conventionele fluorescentie is, is het niet mogelijk om te analyseren van vele kleuren zoals in stroom cytometry. Vooral wanneer de colocalization van meerdere markeringen wordt bestudeerd, Let wel, voor de gevoeligheid die lager vergeleken met confocale microscopie (voor een 20 x Microscoop vergroting, ongeveer 0,5 µm versus 0.1 µm per pixel voor confocal, afhankelijk van het merk) en Check voor fluorophore-spill-over (kritische stappen binnen het Protocol, zie hieronder).

Een grote beperking van de techniek is de ruwe dataformaat. De onbewerkte gegevens zijn .txt-bestanden die lastig wellicht te gebruiken. Als de software een txt-bestand per beeld met CI voor het fenotype geeft, is de handmatige behandeling van elk van de 5 bestanden per patiënt een enorme reeks zeer moeizaam. Een specialist bioinformatica is vereist voor het berekenen van alle gegevens in een statistische software.

Betekenis ten opzichte van bestaande methoden:

Multiplexed kleuring analyse is gemakkelijk mogelijk. In vergelijking met stroom cytometry, die verse voorbeelden analyseert, deze techniek maakt het mogelijk een snelle tellen in een reproduceerbare methode van de andere cel subsets aanwezig in de communicatie van de tumor, in grote cohorten van bevroren monsters met een geautomatiseerde procedure26 ,27. Automatisch konden we rekenen infiltreren CD8+ T cellen waarin PD-1 en co waarin Tim-3 of niet in het kader van de RCC. De automatische telling vermijdt enkele vooroordelen zoals oog vermoeidheid en niet-reproduceerbare tellen en niet tijdrovend.

Zoals de grote cohort studeerde op bevroren monster was, hadden we retrospectieve gegevens zodat we de absoluut getal of percentage van de CD8 koppelen konden+ T cel subsets met biologische parameters en de klinische resultaten. Aangezien er een belangrijk heterogeniteit van de immuun infiltratie van één patiënt naar een ander28, vertegenwoordigt dit een voordeel ten opzichte van fluorocytometry die alleen MFI en percentage maar niet de rang van de infiltratie rapporteert.

De intensiteit van de fluorescentie kwantitatief voor elke cel wordt gerapporteerd, en in de andere cel compartimenten (membraan/cytoplasma/kernen), kunnen we het niveau van de PD-1 kleuring door MFI op het membraan evalueren. Dit is een andere interessante tool die vergelijkbaar is met de stroom cytometry. We vonden dat de PD-1+ CD8+ T cellen uiten van Tim-3 had hogere uitdrukking voor PD-1 en werden geassocieerd met een slechte prognose (impact op progressie vrije overleving). Om onze kennis is het de eerste studie met behulp van deze methode waarin een klinische betekenis van een bepaalde cel deelverzameling.

Toekomstige toepassingen:

Het toepassingsgebied is enorm. Wij ook benadrukt in long kanker tumor van communicatie een andere specifieke cel deelverzameling: het weefsel ingezeten geheugen T cellen genaamd TRM (CD103+ CD49a+), en ze zijn gecorreleerd met een betere algemene overleving21,29 ,30. In een ander werk met behulp van deze techniek, ons team vond dat PD-L1 was overexpressie tumor cellen in een subtype van longkanker met een omlegging van anaplastic lymfoom kinase (ALK), en deze expressie was gecorreleerd met CD8+ T10infiltreren. Deze techniek is geschikt voor de evaluatie van de kritieke biologische parameters in verschillende contexten en een waardevol instrument voor de ontdekking van biomarker kan vertegenwoordigen. Aangezien de xy-coördinaten zijn gegeven, is het een van de eerste tools om te bestuderen van de topografie en cel/interacties met gemak31.

Kritische stappen binnen het Protocol:

Een van de kritische stappen is de optimalisatie van de mede-kleuring, die tijdrovend kan zijn. De keuze van een goede antilichaam is van cruciaal belang, bijvoorbeeld meerdere klonen zijn getest voor Tim-3 in het onderhavige geval. Bovendien kunnen verschillende fluorophores voor de dezelfde marker verschillende resultaten geven dus het is belangrijk om te proberen verschillende combinaties. Behandeling van de kleuring specificiteit met antilichamen die niet samen moeten reageren wordt aanbevolen. Ondanks de mogelijkheid om te analyseren verschillende fluorophores op hetzelfde moment, wordt controleren op spill-over met de mono gebeitste dia's aanbevolen. Een andere cruciale stap is de fenotypering stap die is gebaseerd op de handleiding opleiding zorgvuldig uitvoeren.

In totaal vormt het gebruik van deze multiplexed techniek bedreven exploitant een elegante hulpmiddel om te analyseren meerdere cel subsets van de lokale immuun infiltreren, die van belang is aangezien het perifere bloed-analyse kan niet representatief voor de lokale tumor zijn milieu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle auteurs hebben geen conflict van belang te verklaren.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door subsidies van het Institut National du Cancer (INCA) (ET), Ligue contre le Cancer (ET), Université Sorbonne Paris Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex Immuno-oncologie (ET), SIRIC CARPEM (CG, ET). EdG werd gefinancierd door een beurs van de Fondation ARC. EV en CD werden gefinancierd door een beurs van APHP (bourse année recherche). ChB wordt gefinancierd door een beurs van de universiteit Sorbonne Paris Cité (contrat promovendi). De auteurs bedanken Bristol-Myers Squibb voor hun financiering in dit project. De auteurs bedanken de afdeling pathologie van Hopital Européen Georges Pompidou en Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel en Gisèle Legall). De auteurs bedanken de histologie platform van PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging  Perkin Elmer CLS142338
inForm cell analysis 2.1. Perkin Elmer CLS135781
R software https://www.r-project.org
Dakopen delimiting pen Dako S2002
Tris Buffer Salin TBS Tablets Takara, Bio Inc. TAKT9141Z pH7.6 100 tablet
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) Takara, Bio Inc. TAKT9142Z pH 7.6 100 tablets
Biotin blocking system Dako X0590 Avidin 0.1% and Biotin 0.01%
normal donkey serum Jackson Immunoresearch 017-000-001 5% vol./vol. concentration
Fluoroshield with DAPI Sigma-aldrich F6057 1.5 µg/mL concentration
Knittel glass coverslip Knittel Gläser, 100039 24x60 mm 100 cover slips
Rabbit anti-CD8 Clone P17-V novus NBP1-79055 use at 4µg/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NAT abcam ab52587 use at 2 µg/mL
Goat anti-Tim-3 R&D AF2365 use at 3 µg/mL
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 Roche 7309457001 use at 1 µg/mL
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 Cell Signalling 4528 use at 0.5 µg/mL
Goat anti-human gal9 R&D AF2045 use at 0.3 µg/mL
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit Jackson Immunoresearch 711-175-152 use at 5 µg/mL
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 715-066-150 use at 3 µg/mL
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG abcam ab150133 use at 5 µg/mL
Cy3 labeled streptavidin Amersham PA43001 use at 3 µg/mL
negative control mouse IgG1 Dako X0931 use at 2 µg/mL
IgG from goat serum Sigma-aldrich I5256 use at 3 µg/mL
IgG from rabbit serum Sigma-aldrich I5006 use at 4µg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  2. Granier, C., et al. Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs. Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).
  3. Motzer, R. J., et al. Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial. J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).
  4. Robert, C., et al. Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation. N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).
  5. Robert, C., et al. Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).
  6. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
  7. Schadendorf, D., et al. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).
  8. Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. What does PD-L1 positive or negative mean? J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).
  9. Rizvi, N. A., et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science. 348 (6230), 124-128 (2015).
  10. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. OncoImmunology. 6 (4), e1286437 (2017).
  11. Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. Biomarqueurs prédictifs de réponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices. Bull Cancer. 103, Suppl 1. S151-S159 (2016).
  12. Tumeh, P. C., et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  13. Fourcade, J., et al. Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients. J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).
  14. Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501 (2016).
  15. Wherry, E. J., Kurachi, M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).
  16. Cai, C., et al. Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma. World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).
  17. Sakuishi, K., et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity. J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).
  18. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  19. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).
  20. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).
  21. Nizard, M., et al. Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine. Nat Commun. 8, 15221 (2017).
  22. Nghiem, P. T., et al. PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).
  23. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. Oncoimmunology. (4), (2017).
  24. Woods, K., et al. Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma. J Immunother Cancer. 4, 10 (2016).
  25. Granier, C., et al. Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma. Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  26. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  27. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3, 47 (2015).
  28. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
  29. Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines. Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).
  30. Sandoval, F., et al. Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors. Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120 (2013).
  31. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nat Commun. 8, 15095 (2017).

Tags

Immunologie kwestie 132 Multiplex in situ multispectrale beeldvorming immunofluorescentie techniek digitale beeldbewerking niercelkanker Tim-3 PD-1 tumor communicatie checkpoint remmers in situ eencellige analyse
Multiplexed immunofluorescentie analyse en kwantificering van Intratumoral PD-1<sup>+</sup> Tim-3<sup>+</sup> CD8<sup>+</sup> T cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Granier, C., Vinatier, E., Colin,… More

Granier, C., Vinatier, E., Colin, E., Mandavit, M., Dariane, C., Verkarre, V., Biard, L., El Zein, R., Lesaffre, C., Galy-Fauroux, I., Roussel, H., De Guillebon, E., Blanc, C., Saldmann, A., Badoual, C., Gey, A., Tartour, É. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. J. Vis. Exp. (132), e56606, doi:10.3791/56606 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter