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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Multiplexado imunofluorescência análise e quantificação de Intratumoral PD-1+ + Tim-3 CD8+ T células

Published: February 8, 2018 doi: 10.3791/56606
Automatic Translation
1, 2,3,4, 2,3, 2,3, 2,3,5, 6, 7, 2, 2, 2, 2,3,6, 8, 2,3, 4, 2,6, *4, *2,4
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou
* These authors contributed equally

Summary

Estudar o microambiente do tumor pode identificar biomarcadores prognósticos ou preditivos de resposta clínica à imunoterapia. Apresentado aqui, é um método inovador baseado em situ fluorescência multiespectral de imagens para analisar e contar automaticamente várias subpopulações de CD8+ T células. Esta técnica reprodutível e confiável é apropriada para análises de grandes coorte.

Abstract

Células do sistema imunológico são importantes componentes do microambiente do tumor e influenciam o crescimento do tumor e evolução em todas as fases da carcinogénese. Notavelmente, está agora bem estabelecido que o infiltrado imune em tumores humanos pode correlacionar com prognóstico e resposta à terapia. A análise do imune infiltrado no microambiente do tumor tornou-se um grande desafio para a classificação dos pacientes e a resposta ao tratamento.

A expressão co de receptores inibitórios como programa célula morte proteína 1 (PD1; também conhecido como CD279), citotóxica dos linfócitos T associado proteína 4 (CTLA-4), T-Cell imunoglobulina e mucina que contém proteína-3 (Tim-3, também conhecido como CD366) e linfócitos Gene de ativação 3 (GAL-3; também conhecido como CD223), é uma marca registrada da exaustão de célula T. Desenvolvemos uma imunofluorescência Multiparamétrico em situ coloração para identificar e quantificar a nível celular, a expressão co destes receptores inibitórios. Em uma série retrospectiva de tecido congelado de carcinomas de células renais (RCC), usar uma tecnologia de imagem multiespectral de fluorescência juntamente com um software de análise de imagem, verificou-se essa expressão co de PD-1 e Tim-3 tumor infiltrando CD8+ T células está correlacionado com um mau prognóstico na RCC. A nosso conhecimento, este representa o primeiro estudo demonstrando que este multiplex em situ tecnologia automatizada pode ter alguma relevância clínica.

Introduction

Nos últimos anos, a imunoterapia tem emergido como um tratamento muito promissor para muitos tipos de cânceres, incluindo o RCC. Particularmente, gosto de imunoterapia baseia a inibição dos postos de controlo inibitórios PD-1 e CTLA-4 foi relatado para ser clinicamente eficaz1,2,3,4,5, 6. anticorpos monoclonais contra CTLA-4, PD-1, ou programa morte ligante 1 (PD-L1) estão já aprovados em vários tipos de câncer e levar a longa duração respostas clínicas em mais de 20% dos pacientes7. No entanto, nem todos os pacientes são os respondentes, o custo do tratamento é alto, e estes tratamentos são tóxicos, levando a graves doença auto-imune, como efeitos colaterais. Portanto, o atual desafio é identificar marcadores preditivos para essas novas imunoterapias. A taxa de mutações no tumor, a expressão de PD-L1 ou os níveis de intratumoral CD8+ infiltração de células T têm sido relatados para correlacionar com a resposta clínica. No entanto, esta associação ainda é muito fraca para recomendar o uso desses biomarcadores clínicos na prática clínica, exceto para o teste de companheiro para PD-L1 antes da administração de Pembrolizumab em não-pequenas células lung cancer (NSCLC) pacientes8 ,9,1011,12. Foi demonstrado que a expressão co de muitos receptores inibitórios como PD-1, Tim-3, 3-Lag, e CTLA-4, induz um fenótipo de exaustão celular e resistência à terapia13,14,15. Desde que o sangue periférico não é representativo do microambiente do tumor, é de grande interesse para analisar as características fenotípicas das células em situ. PD-1 e Tim-3 co expressando as pilhas de T são conhecidas por serem células funcionalmente deficientes em vários contextos13,16,17. Neste estudo, o impacto prognóstico da expressão co dos dois receptores inibitórios PD-1 e Tim-3 em CD8+ T células foi avaliada.

Até agora, estudando a expressão co de vários marcadores tumor infiltrando linfócitos (TILs) tem sido realizado principalmente pela análise de citometria de fluxo, tornando-se necessário trabalhar em tumores frescos e, portanto, impedindo as análises retrospectivas. Com a coloração convencional em situ , manchando apenas um de cada vez pode ser executada, e a caracterização do tipo de célula que co expressa os marcadores não é possível. Por exemplo, PD-L1 é expressa por muitos tipos de células do microambiente tumoral, tornando-se difícil definir por análise imuno-histoquímica convencionais quais células expressando PD-L1 são os mais relevantes para estudos correlativos. Neste trabalho, desenvolvemos um método inovador em situ Multiparamétrico imunofluorescência com contagem de computador correlacionar a expressão co de PD-1 e Tim-3 pelo tumor infiltrando CD8 + T-células com desfechos clínicos na RCC. Esta técnica tem várias vantagens, incluindo a possibilidade de analisar em um nível de célula única e vários marcadores ao mesmo tempo usando uma câmera multiespectral que pode capturar intervalos restritos > 10 nm através de cristal líquido filtra18. Além disso, o procedimento é automático que permite que um operador inter reprodutibilidade e uma análise reduzida em comparação com técnicas manuais19. No campo do câncer, diversos estudos relataram convincente várias colorações de moléculas imunes como PD-1, PD-L1 e CD8 em células de Merkel carcinoma, câncer de pulmão e cabeça e pescoço câncer20,21,22, 23. a contagem automatizada de células é possível com treinamento pelo usuário (etapa de fenotipagem). A fluorescência é medida nos compartimentos diferentes células (núcleos, citoplasma e membrana).

Aqui, os diferentes subconjuntos de tumor infiltrando CD8+ T células expressando PD-1 e/ou Tim-3 em uma grande coorte de RCC foram contados e os resultados foram correlacionados com escores de gravidade clínica e parâmetros de sobrevivência. Também foi possível analisar a intensidade de fluorescência da membrana na resolução do celular com dados de intensidade de fluorescência dizer (IFM) como em citometria. Tanto quanto sabemos, isto representa os primeiro estudo relatórios prognóstico resultados usando esta técnica de contagem com base de imagens multiespectrais.

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Protocol

Este estudo foi conduzido em conformidade com a declaração de Helsínquia e foi aprovado pelo Comitê de ética local (CPP Ile de France nr. 2012-05-04). Consentimento informado foi obtido o participante incluído nas coortes.

1. tecido Material

  1. Colete amostras de tecido da RCC no dia da cirurgia. Lidar com o espécime cirúrgico à temperatura ambiente (departamento de patologia).
  2. Recolha uma amostra de tumor de aproximadamente 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm de tamanho em um tubo seco. Snap freeze em nitrogênio líquido e armazenar a-80 ° C.
  3. Revesti as amostras na temperatura ideal de corte composta. Seção as amostras com um criostato a-20 ° C em 4-6 µm seções espessas. Deixe as amostras de ar seco em slides para 12h e diretamente, armazená-los a-80 ° C para evitar a dessecação.
  4. Verificar a qualidade da amostra exibindo uma hematoxilina e eosina manchado de seção.

2. in Situ mancha da imunofluorescência de TILs

  1. Orientações processuais
    1. Execute todas as etapas experimentais à temperatura ambiente.
    2. Para todas as etapas, execute as diluições com Tris Buffer Saline (TBS; ver Tabela de materiais).
    3. Realizar a lavagem em TBS para todas as etapas, exceto após a incubação do anticorpo primário. Para este último, use Tris Buffer Tween20 salina (TBST, consulte Tabela de materiais). Para a composição do tampão e reconstituição ver quadro suplementar 1.
    4. Use uma câmara de umidade para a incubação do anticorpo e um frasco de coloração para lavar.
    5. Não deixe que a seção secar durante o procedimento.
  2. Pré-tratamento
    1. Descongelar o slide que contém a amostra de tecido e seque cuidadosamente o deslizar a amostra com uma toalha de papel. Delimitar a área de reação contendo o tecido com uma caneta de barreira hidrofóbica (ver Tabela de materiais). Seco por 2 min.
    2. Corrigir as amostras em acetona 100% por 5 min, seco por 2 min e lavar com TBS por 10 min.
  3. Saturação e bloqueio
    1. Pré-tratamento dos slides por 10 min com 3 gotas de avidina 0,1%, torneira e/ou filme de slide para distribuir a avidina e remover bolhas de ar e em seguida tratar por 10 min com 3 gotas de biotina 0,01% (ver Tabela de materiais), toque, e/ou filme. Lavar com TBS.
    2. Realize um bloqueio de receptores de Fc. Aplicam-se 100 µ l de uma volumétrica 5% de soro normal diluído em TBS usar soro da mesma espécie hospedeiro como o anticorpo secundário ou terciário marcado (ver Tabela de materiais); aqui, utilizou-se soro de burro. Incube durante 30 min.
    3. Durante a incubação, rotação brevemente o anti-CD8, PD-1 e Tim-3 anticorpos (Tabela de materiais). Prepare a mistura de anticorpos primários na TBS, conforme descrito no quadro suplementar 2.
  4. Imuno-mancha para CD8, PD-1 e Tim-3
    1. Prepare a mistura de anticorpo primário. Consulte Tabela de materiais e suplementar tabela 2 para os anticorpos usados (anti-CD8, PD-1, Tim-3 e seus correspondentes anticorpos secundários) e as respectivas concentrações.
    2. Toque e/ou agite o soro restante de burro (adicionado na etapa 2.3.2). Incube as lâminas com 100 µ l da mistura os anticorpos primários não-rotulados por 1h em uma câmara umidificada.
    3. Durante a incubação, brevemente girar a cianina 5 anticoelho, AF488-anticabra e anticorpos de biotinilado antirato e preparar a mistura de anticorpos secundários, conforme descrito no quadro suplementar 2.
    4. Lave as lâminas em TBST 5 min. seco os slides.
    5. Incube as lâminas com 100 µ l dos anticorpos secundários por 30 min em uma câmara umidificada.
    6. Prepare a mistura de anticorpo terciário contendo Cy3-streptavidin conforme descrito no quadro suplementar 2.
    7. Lave as lâminas em TBS durante 10 min. seco os slides.
    8. Incube as lâminas com 100 µ l da mistura de anticorpo terciário por 30 min.
    9. Lave as lâminas em TBS durante 10 min. seco os slides.
  5. Célula de montagem
    1. Montar as lâminas em um 4' 6-Diamidino-2-Phenylindole, contendo dicloridrato DAPI médio (1,5 µ g/mL DAPI) com uma lamela compatível para microscopia de fluorescência de montagem (veja a Tabela de materiais).
      Nota: Como um controle negativo para cada experimento, utilizou-se um slide com anticorpos isotipo-combinados na mesma concentração como os anticorpos correspondentes. Para esta coloração, usamos rato IgG1, IgG de coelho e anticorpos de controlo negativo de IgG de cabra (veja a Tabela de materiais). Como um controle positivo, usamos tonsila hiperplásica humana que é sabida para ser positivo para os marcadores testados, para cada experimento. Uma coloração típica é descrita nos resultados (Figura 1). Mono-coloração de CD8, PD-1 e Tim-3 devem ser realizada individualmente (uma coloração por slide) com o mesmo tratamento prévio e sem DAPI. Também deve ser realizado um slide nas mesmas condições experimentais sem qualquer anticorpo e apenas meio de montagem de DAPI. Um slide deve ser fotografado usando idênticas condições experimentais sem qualquer anticorpo e sem DAPI.

3. análise fluorescência e automatizado de contagem de células

  1. Aquisição de imagens com o microscópio automatizado
    1. Crie um protocolo.
      1. Ative o software automatizado do microscópio e o iluminador de fluorescência.
      2. Na barra de menus, clique em "Arquivo", "criar o protocolo," selecione "DAPI," "FITC" e "TRITC."
      3. Clique em "Next", "Seção de tecido" e clique em "Next", "Nome do protocolo." Escolha um clique de nome, por exemplo, "CD8-PD-1-Tim-3,", "Next" e "salvar".
      4. Manualmente coloca um slide no palco.
      5. Na barra de menus, clique em "configurar", "configurações". Clique em "conjunto Z casa" na nova janela.
      6. Ajustar o tempo de exposição com um controlo positivo deslize, ou seja, um CD8, PD-1 e Tim-3 triplo-manchado com amostra DAPI.
      7. Na barra de controle clique em "definir a exposição."
      8. Ajuste o tempo de exposição para cada filtro até à obtenção de um sinal suficiente mas não saturante.
      9. Para imagens monocromáticas, execute o seguinte procedimento:
      10. Selecione a aquisição e em 'autofocus' escolha filtro DAPI.
      11. No "limite de área de verificação", mova o objetivo superior para o canto superior esquerdo do slide. Clique em "Marcar". Faça o mesmo para o canto inferior direito.
        Nota: Este passo delimita a área de baixa potência de imagem (imagem latente do LP) em 4x; esteja ciente de que colocar a marca tão bem quanto cercar todas as amostras da série.
      12. De alta potência (HP) de imagem, execute o seguinte procedimento:
      13. Em 'Autofocus', escolha "DAPI".
      14. Em banda 'Aquisição', escolha "DAPI", "FITC", "Cy3" e "Cy5". Clique em "Okey". Na barra de menus clique em "Arquivo", "salvar o protocolo".
    2. Digitalizar slides.
      1. Carrega o protocolo clicando em "Arquivo", "protocolo de carga" na barra de menus. Clique em "Iniciar".
      2. Digite 'Laboratório ID' (local da pasta para armazenamento de imagem). Digite o ID de Slide para identificar o slide. Clique em "Next".
      3. Clique em "Imagem monocromática" (para varrer o slide inteiro sob a luz brilhante do campo e adquirir imagens sequenciais usando um objectivo de 4x).
        Nota: Este produz uma visão geral de tons de cinza do slide.
      4. Clique em "Localizar espécime". Selecione a área de tecido a ser digitalizado em baixa resolução (4x): Mantenha a tecla 'Ctrl' e clique em um campo usando o cursor para selecionar ou cancelar a seleção de campos (Figura 2A).
      5. Clique em "LP Imaging" (imagens de 4x) para aquisição de imagem vermelho azul verde fluorescente de cada campo.
      6. Para a seleção de campo HP, mantenha pressionada a tecla 'Ctrl' e clique em um campo usando o cursor para selecionar ou desmarcar os campos que correspondem à área de tecidos que serão digitalizados em alta resolução (x 20). Selecione 5 campos (Figura 2B).
      7. Clique em "HP Imaging" (20 x imagem) para a aquisição de imagens multiespectrais de cada campo (Figura 2).
      8. Clique em "Armazenamento de dados" para armazenar imagens na pasta que foi seleccionada no início em LabID.
        Nota: O processo é resumido e ilustrado na Figura 2. Para cada etapa (deteção de tecido, seleção de campo), um algoritmo pode ser incrementado e treinado pelo usuário para um processo de verificação automatizada de todo.
  2. Análise de imagens de fluorescência e célula automatizada contando com software de análise acopladas
    1. Construa a biblioteca espectral.
      1. Abra o software de análise de imagem.
      2. No painel da esquerda, abra "Construir bibliotecas". Em 'imagem de carga', clique em "Procurar" e selecione uma imagem manchada de mono (por exemplo, CD8/cianina 5).
      3. Selecione o fluoróforo, (por exemplo, cianina 5). Clique em "extrair". Clique em "Salvar" para armazenar na biblioteca. Clique em "Salvar".
      4. Repita o mesmo processo para PD-1, Tim-3 e slides de mono-manchado de DAPI para integrar o espectro de cada fluoróforo de interesse.
        Nota: A biblioteca espectral de construção integra o espectro para cada fluoróforo usado para o tecido específico (aqui, rim), mas "sintéticas" bibliotecas já existentes podem ser usadas. Como o espectro de autofluorescência é estritamente em relação ao tecido, é importante realizar uma autofluorescência e biblioteca espectral por projeto.
    2. Crie um novo projeto.
      1. Na barra de menus, clique em "Arquivo", "New Project". Na guia 'Recurso Find', selecione "segmentação de célula". Na guia 'Fenotipagem', selecione "fenotipagem". Clique em "Criar".
      2. Integre as imagens representativas do projeto.
        1. Na guia 'Arquivo', clique em "abrir imagem". Escolha de 10 a 30 imagens representativas de toda a série. Adicione o slide não manchadas para remover autofluorescência. No painel direito: fonte selecione biblioteca. Selecione o fluoróforo e escolher os correspondentes à biblioteca espectral anteriormente construída.
      3. Para remover o tecido autofluorescência, clique no botão"AF" e em seguida, selecione a área de autofluorescência no slide em branco.
      4. Tratamento de imagem e geração de imagem composta.
        1. Clique em "Preparar tudo" para integrar a biblioteca de fluorescência e os espectros de autofluorescência para gerar a imagem composta (Figura 3). Clique no ícone 'olho' para abrir o painel 'editor de exibição' e selecione os dados exibidos: selecione os marcadores CD8, PD-1, 3-Tim e DAPI. Remova a autofluorescência. Siga os passos apresentados pelo software.
      5. Segmente as células.
        1. Para segmentar as células, em 'Compartimento', seleccione "Núcleos" e "Membrana". Na guia "Núcleos", defina DAPI como o corante de contraste nuclear.
        2. Na aba 'Máximo e mínimo tamanho (px)' digite "40" e "176" como os tamanhos mínimos e máximos, respectivamente. Para o sinal de 'Mínimo', defina "0,13". Na guia "Split", defina "2,60". Na guia "Núcleos", defina "0.81". Selecione "usar o sinal de membrana para auxiliar a segmentação".
        3. Clique em "Células do segmento" na parte inferior da tela. Verifique a segmentação dos núcleos e das membranas das células e novamente com parâmetros diferentes, se não coincide com a fluorescência DAPI e membrana das células.
          Nota: O software reconhece as células com o DAPI nuclear manchando e baseado no tamanho da célula. Ajuste os parâmetros de célula (tamanho, separação, pixels) de acordo com o projeto.
      6. Fenótipo das células.
        1. Na guia 'Fenótipo', clique em "Adicionar". Criar células fenótipo categorias: CD8 (ponto azul) / CD8-PD-1 (ponto vermelho) / CD8-PD-1-Tim-3 (ponto verde) / outro (ponto preto) (Figura 4).
        2. Selecione mais de 5 exemplos de células de cada categoria. Clique em "Classificador de trem".
          Nota: Isto gera um algoritmo de classificação estatística pelo software.
        3. Clique em "Fenótipo todas" para obter o fenótipo de cada célula.
          Nota: O software dá o fenótipo de uma célula com um intervalo de confiança (IC) de precisão.
        4. Melhorar o algoritmo, o software de treinamento até que a diferença entre o olho e contagem automatizada é concordante (< 5% de erro). Escolha um CI que é aceitável para as células de interesse.
          Nota: Nós escolhemos fazer a formação com base em 55% CI como aceitável.
      7. Salve o projeto e o algoritmo.
      8. Em 'Arquivo' selecione "project". O nome e clique em "Salvar".
    3. Realizar análise de lote da série.
      1. Selecione "Análise de lote". Selecione o projeto. Adicione as imagens para analisar. Selecione uma pasta de armazenamento para os dados. Clique em "Executar". Verifica a qualidade da imagem composta. Verifique se a fenotipagem para todas as imagens da série.
        Nota: O software de análise de imagem acoplado integra todos os sinais de compartimentos (núcleos/membrana/citoplasma) da célula. A etapa de fenotipagem é crucial, embora a formação do algoritmo pode ser uma etapa demorada. Todos os dados de cada imagem estão em um arquivo. txt. Todos os dados de uma célula (particularmente seu fenótipo dado com sua CI) estão em uma linha. Para cada slide, a aquisição de imagens e contagens subsequentes foram realizadas em 5 campos.
  3. Integração dos dados brutos e geração da contagem automatizada de células
    1. Calcule os dados com um programa de estatístico.
      1. Calcule todos os dados a partir das 5 imagens correspondentes aos 5 campos analisados para 1 paciente. Usar uma plataforma estatística e tem um estatístico experiente, Gerenciador de dados ou cientista de dados realizar a análise. Crie um script que conta automaticamente as células dependendo de seu fenótipo, selecionando o CI > 55%.
      2. Coloque todos os arquivos. txt da série na mesma pasta.
    2. Extrair os dados.
      1. Colocar todos os arquivos. txt em uma pasta. Execute o script automático construído na etapa 3.3.1. Abra o arquivo de saída CSV gerado pelo script R. Salve como formato de .xl. A saída reúne o número de células para cada fenótipo (ou seja, sozinho, CD8 CD8-PD-1, CD8-PD-1-Tim-3) para cada paciente.
      2. Calcular o número médio de células para cada paciente por campo: dividir o número de células pelo número de campos (ou seja, 5) para normalizar o número de células para cada paciente por campo.
      3. Calcular a percentagem de células PD-1+ entre CD8 total+ T células e PD-1+ + Tim 3 células entre CD8 total+ T células. Consulte a Figura 5 Resumo desta etapa.
        Nota: A linguagem R (ou outro software de programação de escolha) é necessário para criar e executar os comandos corretamente, e então um usuário experiente ou cientista estatístico/dados é essencial. O programa R pode calcular os dados do mesmo paciente, mas o nome dos 5 arquivos. txt de um paciente deve ter um início idêntico, correspondente a um identificador exclusivo do paciente.
  4. Análise estatística
    1. Use o software estatístico para a análise estatística dos resultados.
    2. Realize análises estatísticas adequadas, com a ajuda de um estatístico.
      1. Uso da não-paramétricos Wilcoxon assinou classificação testes para comparação de PD-1 IFM entre dois fenótipos de célula (Figura 6). Correlacione as características histológicas e covariável com teste Chi-quadrado de Pearson, um.
      2. Use um método de Kaplan-Meier para estimar a sobrevivência livre de progressão e modelos de regressão de Cox para estimar os efeitos covariável no tempo-para-evento resultados, como a sobrevivência global e sobrevivência livre de doença.
      3. Considere p-valores inferiores a 0,05 como significativos.

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Representative Results

Usando o protocolo geral descrito acima, tivemos como objetivo quantificar intratumoral CD8+ T células co expressando os receptores inibitórios PD-1 e Tim-3 em tecidos congelados de pacientes com RCC e correlacionar os resultados com os resultados clínicos25.

Otimização de manchar o CD8/PD-1/Tim-3:

Espécies diferentes de anticorpos (rato, coelho e cabra, consulte a Tabela de Material) foram escolhidos para evitar reação cruzada entre os anticorpos diferentes. O protocolo foi validado em uma amígdala, que é um tecido linfoide organizado. PD-1 coloração podia ser encontrado nos centros germinativos (Figura 1), Considerando que CD8 e Tim-3 coloração estão presentes em torno os centros germinativos. A observação desta coloração típica deste Protocolo validado. A coloração também foi validada no tecido de interesse (rim).

Foi confirmada a ausência do sinal do anticorpo primário incubado com o anticorpo secundário não correspondente (dados não mostrados). Para analisar com precisão a fluorescência de coloração e para tornar as bibliotecas espectrais específicas, slides individuais isoladamente foram corados com cada marcador (CD8, PD-1, 3-Tim, ou DAPI) no tecido de interesse (rim). Um slide não manchadas nas mesmas condições é necessário extrapolar a autofluorescência do tecido. A coloração foi analisada por microscópio automatizado, que integrou os espectros dos fluorophores diferentes; cada marcador foi bem diferenciado e sem sobreposição dos marcadores foi observada (Figura 3).

Características quantitativas e qualitativas do CD8 + Se infiltrar em 87 pacientes RCC:

Os resultados mostraram-que aproximadamente metade de CD8+ T células expressa PD-1 (média 53,9%; SE: 30.49%) e sobre um terço foram duplo positivo PD-1+ + (média 38.16%; Tim-3 SE: 28.11%). Tim-3 expressão sem expressão PD-1 foi detectado em menos de 3% de CD8+ T células (dados não mostrados). Os números médios de CD8+ célula T subpopulações foram: total CD8+ T células 116,5 (SE: 216), PD-1+ CD8+T células 89.32 (SE: 191.8), PD-1+ + 66,9 Tim-3 (SE: 143) e PD-1+ – Tim-3 CD8 + T células 22.38 (SE: 57,5) por campo. O número total de intratumoral CD8+ T células foi positivamente correlacionada com a porcentagem de PD-1 Tim-3+ + em CD8+ T células.

Caracterização funcional do CD8 + T células dependendo de seu fenótipo PD-1 e Tim-3:

Nível de expressão do PD-1 é conhecido por ser correlacionados com exaustão de célula T então próximo objetivo medir PD-1 expressão em CD8+ T células de acordo com o estatuto de expressão Tim-3. Como a intensidade média de fluorescência dos fluorochromes diferentes é relatada a nível celular, uma pequena série de pacientes foram analisadas manualmente para o celular de dados: os resultados mostraram uma correlação da membrana PD-1 IFM com o subtipo de célula. PD-1 intensidade fluorescente foi medido (Figura 6), a nível celular em PD-1+ + Tim-3 contra o PD-1+ CD8 Tim-3– + T células (um painel) e no nível do paciente individual após integrar estas várias sinais de célula em uma seção de tecido. Em uma série de 9 pacientes, uma comparação com o teste de Wilcoxon pareado encontrado que o PD-1 IFM é maior quando Tim-3 co é expresso, reforçando a relevância funcional da expressão Tim-3 (painel B).

Expressão de PD-1 e Tim-3 ligantes na superfície das células de Tumor de múltiplas co manchas:

Como exaustão de célula T é mediada através da interação do receptor/ligante, avaliamos a expressão de PD-1 e Tim-3 ligantes (PD-L1 e Galectin-9 (Gal-9), respectivamente) em células de tumor renal identificadas pela coloração de panqueratina. Positividade é definida como um corte de 10% das células tumorais, expressando o marcador: (i) 58 fora 87 pacientes (66%) foram positivas para PD-L1; (ii) todos os 15 tumores analisados foram positivos para Gal-9 (Figura 7A, B).

Impacto clínico da expressão co do Tim-3 + PD-1 + em CD8 + Células T:

Marcando de nó metástase (TNM) do tumor, grau de Fuhrman, tamanho do tumor e pontuação UISS é características histológicas (combinadas com escore clínico para UISS) usadas para definir o valor prognóstico da RCC primário. Observou-se uma correlação positiva entre o número e/ou a percentagem de tumor infiltrando CD8+ T células expressando PD-1 e Tim-3 (mas não expressando apenas PD-1 Tim-3), com todos estes parâmetros (tabela 1). Em consonância com este fenótipo mais pejorativo, pacientes RCC com CD8+ T células co expressando PD-1 e Tim-3 acima o percentual mediano (34,7) eram mais propensos a recaída (p = 0,046; RH 2,9; IC 95%: 1,02-8.21). Esta correlação não foi observada com a porcentagem de PD-1 em CD8+ T células independentemente do estado Tim-3 (tabela 2). Também foi demonstrada para uma correlação entre a porcentagem de CD8+ T células co expressando PD-1 e Tim-3 e a taxa de sobrevida global de 36 meses (dados não mostrados). Nós também validada a imunocoloração tripla em tecidos de parafina da amígdala (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: CD8-PD-1-3-Tim immunostaining sobre um tecido de parafina de tonsila. Tecido incorporado seções em vez criopreservadas seções foram selecionadas para tripla imunocoloração de parafina. Depois de desparafinagem e reidratação, aplicou-se o mesmo protocolo de coloração previamente desenvolvido para seções criopreservadas. CD8+ T células estão localizadas fora do centro germinativo e células T CD8 não-+ , expressando o PD-1 são agrupadas no centro germinativo. A ampliação do microscópio é 20 x e a barra de escala representa 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: análise de amostras de carcinoma de células renais automatizada. Após o reconhecimento do tecido na imagem do campo claro (A, escala bar 1 mm), 4 x ampliação do microscópio imagens de baixa resolução em RGB (vermelha azul verde convencional fluorescência) é usada para selecionar os campos (B, escala bar 500 µm. O quadrado vermelho completo representa um campo. Uma imagem de alta resolução (multiespectrais cubo fluorescência imagem específica para esta tecnologia) com ampliação de 20 x realizada por microscópio multiespectral é mostrada (C, escala bar 100 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: microscopia multiespectral e software acoplado a análise para a geração de uma imagem composta de um carcinoma de células renais (20 x ampliação do microscópio). A imagem raw de alta resolução (A) é uma imagem fluorescente do campo após a varredura multispectral por cubos de filtro de fluorescência. Sinal azul é AF488, vermelho é cianina 5, e é verde e Cyanin3. A mesclagem mostra cores diferentes, por exemplo, o amarela é uma mesclagem dos três fluorophores. Esta imagem é incorporada no software de análise de imagem. Integração de biblioteca espectral permite uma separação de espectro exatos de cada fluoróforo e autofluorescência, levando a uma imagem composta fluorescente (B). Cores representativas são escolhidas pelo operador: azul ilustra cianina 5 (CD8), Red cianina 3 (PD-1), AF488 verde (Tim-3). Mesclando a cor da mistura como o roxo é usado para CD8-PD-1 duplo positivo. A barra de escala representa 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: PD-1 e Tim-3 expressão no tumor infiltrando CD8+ T células em um espécime de carcinoma de célula renal de células claras analisado pela tecnologia de imagem multiespectral de fluorescência (20 x ampliação do microscópio). (A) CD8 (azul), PD-1 (vermelho) e Tim-3 (verde) foram corados em secções de tecido congelado derivadas de pacientes RCC. Colocalization destes três marcadores pode ser detectado por mesclar as fotos mono-mancha. ISOTYPE controles foram realizados em cada experimento. A barra de escala representa 20 µm. amarelo caixas identificam co manchada de células: uma célula CD8 de PD-1+ – Tim-3 e uma célula CD8 PD-1 de Tim-3+ + . (B) tripla co mancha para CD8, PD-1 e Tim-3 (fundido) são mostrado à esquerda com a caixa indicando que verde é CD8+ T células co expressando PD-1 e/ou Tim-3. Para a contagem automatizada com o software de análise de imagem, a identificação das células depende da presença de uma coloração nuclear (DAPI); a segmentação da célula também é baseada em características morfométricas representadas como limites de vermelhos (painel central). Um algoritmo treinado pelo usuário até que a concordância com a contagem visual é executada (à direita) e depois fenotipagem automatizada, identifica pontos verdes como CD8+ T células expressando co PD-1 e Tim-3, pontos do vermelho como CD8+ T células expressando PD-1 sem Tim-3 e azuis pontos como CD8+ T células não expressando PD-1 ou 3-Tim. A barra de escala representa 20 µm. amarelo caixa mostra PD-1 e/ou Tim-3 expressando CD8+ T células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: computação dos dados brutos de análise multiespectral. Após a análise de imagem, são recolhidos dados da contagem de cada categoria de célula presente em cada campo (isto é, 5 campos/paciente, ou seja, 5 arquivos. txt). Um script de R combina os dados de 5 campos, considerando apenas as células phenotyped com um intervalo de confiança > 55%. A ampliação do microscópio é 20 x e a barra de escala representa 100 µm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: PD-1+ + CD8 Tim-3+ T células expressam níveis mais elevados de PD-1 em relação ao PD-1+ CD8 Tim-3– + T células de carcinoma de células renais. a intensidade da PD-1 é detectada no nível celular (painel esquerdo) pela análise de imunofluorescência em situ em PD-1+ + Tim-3 e PD-1+ CD8 Tim-3– + T células. A nível individual (painel central): os resultados são apresentados para o CD8 toda+ T célula subconjuntos PD-1+ + Tim-3 contra o PD-1+ Tim-3– presente em uma seção de tecido (ou seja, um paciente; Teste de Mann Whitney). Análise comparativa da intensidade média PD-1 foi medido em uma série de 9 pacientes (painel direito) (teste de Wilcoxon, p-valores inferiores 0,05 foram considerados como significativos). A ampliação do microscópio é 20 x e a barra de escala representa 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: PD-L1 e Gal-9 ou seja, PD-1 e Tim-3 ligantes coloração sobre carcinoma de células renais. (A) Tumor células são identificadas pela coloração de panqueratina. Co, coloração de PD-L1 e panqueratina (um painel) identifica a expressão de PD-L1 em células tumorais em 58 pacientes fora 87 analisados. (B) Galectin-9 foi expressa em todos os 15 tumores de pacientes RCC analisados. Considerou-se positividade se pelo menos 10% das células foram corado para o marcador analisado. ISOTYPE controles foram incluídos para cada coloração. Caixas amarelas representam tumor positivo (panqueratina +) células para PD-L1 (painel A) ou Galectin-9 (painel B). A ampliação do microscópio é 20 x e a barra de escala representa 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Pilhas de T %/CD8+ PD-1+ PD1+ + Tim-3 PD-1+ Tim-3–
TNM 0,04 0,003 0.22
Furhman 0.01 0,004 0,74
Tamanho do tumor 0.08 0.01 0,37
UISS 0.01 0.01 0,63

Tabela 1: Correlação entre a expressão do PD-1 sozinho ou combinado com Tim-3 em CD8+ T células e parâmetros de prognósticos clínicos dos pacientes RCC: p-valores. a porcentagem de PD-1+, PD-1+ + Tim-3 ou PD-1+ – Tim-3 em CD8+ T células selecionadas como uma variável contínua, medida por imunofluorescência em situ na coorte de 87 pacientes foi correlacionada com vários parâmetros clínicos definidos como um binário (TNM, grau de Fuhrman, Pontuação UISS) ou uma variável contínua (tamanho do tumor). TNM foi dividida em dois grupos: localizadas (pT1 e pT2) e doença avançada (pT3, pT4, N+, ou M+). Grau de Fuhrman foi definida como baixa (grau I ou II) e alta (classe III ou IV) e a pontuação UISS foi dividida em 3 classes (0, 1 e 2). P-valores, indicando uma correlação significativa são mostrados em negrito.

CD8+ subconjunto de células T/CD8 PD-1+ Tim-3+ PD-1+ Tim-3–
Mediana (%) 34,7 8.6
Correlação com PFS P = 0,046 P = 0,8

Tabela 2: Correlação entre PD-1 e Tim-3 co expressão em CD8+ T células e progressão livre sobrevivência. Dois grupos de pacientes RCC (n = 87) dependendo da percentagem de PD-1 Tim-3 (à direita), PD-1 e Tim-3 (à esquerda) em relação à mediana foram individualizadas. A correlação com o PFS foi feita com a mediana seleccionada como um Cut-off. P-valores, indicando uma correlação significativa são mostrados em negrito.

Suplementar tabela 1: composição de TBS e TBST de Buffer. TBS é usado para anticorpo misturas e diluições. Para lavagens, todas as etapas são executadas com TBS exceto as lavagens seguindo os anticorpos primários, onde TBST é recomendado. Clique aqui para baixar este arquivo.

Suplementar tabela 2: anticorpos detalhados misturam composição para coloração de imunofluorescência CD8-PD-1-3-Tim. Para misturas de cada anticorpo primário, secundário e terciário, a diluição para realizar o volume correspondente de TBS é dado para um volume total de 1 mL. Para um slide, o volume necessário de reação total é de 100 µ l para uma área de tecido de 2 cm2. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Modificações e solução de problemas:

A qualidade do tecido é um parâmetro importante; Isso pode ser facilmente verificado pela coloração de hematoxilina e eosina.

Uma vantagem da técnica é a possibilidade de colorações multiplexadas, mas para evitar repercussões fluoróforo, recomendado para escolher com delta de no mínimo 10 nm, comprimentos de onda de emissão. Aqui, porque nós tivemos 4 colorações incluindo DAPI, escolhemos a espalhar-se os comprimentos de onda (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, cianina 3:570 nm, cianina 5:670 nm). O risco de sobreposição de sinais de vários fluorophores é evitado usando o software para calcular o espectro puro de um fluoróforo de um sinal de emissão misto, combinado com uma análise automatizada de imagem. Os slides de mono-manchado também confirmam a ausência de sobreposição entre fluorophores e ato como uma compensação graças a biblioteca espectral.

Às vezes, positividade para um marcador em uma célula pode ser difícil determinar se a mancha/fluorescência é fraca. O controlo negativo, incluído em cada experiência é uma boa maneira de determinar um limite de positividade.

No software acoplado utilizado para analisar as imagens, um passo de Pontuação para determinar a positividade da célula existe, mas ele só pode analisar dois marcadores simultaneamente. Porque podemos ter coloração triplo na mesma célula (CD8, PD-1 e Tim-3), escolhemos a etapa de fenotipagem.

A etapa de fenotipagem pode ser trabalhosa, especialmente se o tipo de mancha e plano de fundo é variável de uma amostra para outra.

Limitações da técnica:

Mesmo que o número de co-citológicas é uma vantagem em relação a fluorescência convencional, não é possível analisar muitas cores como em citometria de fluxo. Especialmente quando o colocalization de vários marcadores é estudado, estar ciente de sensibilidade que é mais baixa em comparação com microscopia confocal (de 20 x ampliação do microscópio, aproximadamente 0,5 µm versus 0,1 µm por pixel para confocal, dependendo da marca) e verificar se há repercussões fluoróforo (consulte etapas críticas dentro do protocolo, abaixo).

Uma grande limitação da técnica é o formato de dados brutos. Os dados brutos são arquivos. txt que podem ser complicados de usar. Como o software dá um arquivo. txt por imagem com CI para o fenótipo, o tratamento manual de cada um dos 5 arquivos por paciente de uma série enorme é muito trabalhoso. Especialista em Bioinformática é necessária para calcular todos os dados em um software estatístico.

Importância no que diz respeito a métodos existentes:

Análise de coloração multiplexada é facilmente possível. Comparado a citometria de fluxo, que analisa as amostras frescas, esta técnica permite uma rápida contagem em um método reprodutível de subconjuntos diferentes células presentes no microambiente do tumor, em grandes coortes de amostras congeladas com um procedimento automatizado26 ,,27. Podíamos contar automaticamente infiltrando CD8+ T células expressando PD-1 e co expressando Tim-3 ou não no cenário do RCC. A contagem automática evita vários preconceitos como fadiga ocular e a contagem não pode ser reproduzido e não é demorada.

Como o grande coorte estudada foi na amostra congelada, tivemos dados retrospectivos, então nós poderíamos vincular o número absoluto ou percentagem do CD8+ T subconjuntos com parâmetros biológicos e resultados clínicos de célula. Como existe uma heterogeneidade importante da infiltração imune de um paciente para outro28, isto representa uma vantagem em relação ao fluorocytometry que relata somente IFM e porcentagem, mas não o grau de infiltração.

A intensidade da fluorescência é relatada quantitativamente para cada célula, e nos compartimentos diferentes células (núcleos/membrana/citoplasma), pode avaliar o nível de PD-1 coloração por IFM na membrana. Isto representa mais uma ferramenta interessante que é semelhante a citometria de fluxo. Descobrimos que o PD-1+ CD8+ T células expressando Tim-3 teve a maior expressão de PD-1 e foram associadas a um mau prognóstico (impacto na sobrevivência livre de progressão). A nosso conhecimento, é o primeiro estudo utilizando este método que mostra um significado clínico de um subconjunto de célula específica.

Aplicações futuras:

O campo de aplicação é imenso. Nós também destaque no microambiente do tumor de câncer de pulmão outro subconjunto de célula específica: a memória residente do tecido T células chamado TRM (CD103+ CD49a+), e eles estão correlacionados com uma melhor global sobrevivência21,29 ,30. Em outro trabalho utilizando esta técnica, nossa equipe descobriu que PD-L1 foi overexpressed em células tumorais em um subtipo de câncer de pulmão com um rearranjo de quinase (ALK) Linfoma anaplásico, e esta expressão foi correlacionada com CD8+ T infiltrar10. Esta técnica é apropriada para a avaliação de parâmetros biológicos críticos em vários contextos e pode representar uma valiosa ferramenta para descoberta de biomarker. Uma vez que são dadas as coordenadas xy, é uma das primeiras ferramentas para estudar a topografia e a célula/célula interações com facilidade31.

Passos críticos dentro do protocolo:

Um dos passos essenciais é a otimização da co coloração, que pode ser demorado. A escolha de um bom anticorpo é crucial, por exemplo vários clones foram testados para Tim-3 no presente caso. Além disso, fluorophores diferentes para o mesmo marcador pode dar resultados diferentes, por isso é importante tentar várias combinações. Examinando a especificidade coloração com anticorpos que não devem reagir juntos é recomendado. Apesar da possibilidade de analisar fluorophores vários ao mesmo tempo, verificação de auxílios com as lâminas mono-manchado é recomendado. Outro passo crucial é a etapa de fenotipagem que se baseia em manual de treinamento para executar cuidadosamente.

No total, o uso desta técnica multiplexada por um operador hábil representa uma ferramenta elegante para analisar vários subconjuntos de células do infiltrado imune local, que é de importância, uma vez que a análise do sangue periférico não pode ser representante do tumor local meio ambiente.

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Disclosures

Todos os autores não têm nenhum conflito de interesses para declarar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por concessões do Institut National du Cancer (INCA) (ET), Ligue contre le Cancer (ET), Université Sorbonne Paris Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex imuno-Oncologia (ET), CARPEM SIRIC (CG, ET). EdG foi financiado por uma bolsa da Fundação arco. EV e CD foram financiados por uma irmandade do PHP (bourse année recherche). ChB é financiado por uma bolsa da Université Sorbonne Paris Cité (contrat doutorado). Os autores graças a Bristol Myers Squibb para seu financiamento neste projeto. Os autores agradecer ao departamento de patologia do Hopital Européen Georges Pompidou e Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel e Gisèle Legall). Os autores graças a plataforma de histologia de PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging  Perkin Elmer CLS142338
inForm cell analysis 2.1. Perkin Elmer CLS135781
R software https://www.r-project.org
Dakopen delimiting pen Dako S2002
Tris Buffer Salin TBS Tablets Takara, Bio Inc. TAKT9141Z pH7.6 100 tablet
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) Takara, Bio Inc. TAKT9142Z pH 7.6 100 tablets
Biotin blocking system Dako X0590 Avidin 0.1% and Biotin 0.01%
normal donkey serum Jackson Immunoresearch 017-000-001 5% vol./vol. concentration
Fluoroshield with DAPI Sigma-aldrich F6057 1.5 µg/mL concentration
Knittel glass coverslip Knittel Gläser, 100039 24x60 mm 100 cover slips
Rabbit anti-CD8 Clone P17-V novus NBP1-79055 use at 4µg/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NAT abcam ab52587 use at 2 µg/mL
Goat anti-Tim-3 R&D AF2365 use at 3 µg/mL
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 Roche 7309457001 use at 1 µg/mL
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 Cell Signalling 4528 use at 0.5 µg/mL
Goat anti-human gal9 R&D AF2045 use at 0.3 µg/mL
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit Jackson Immunoresearch 711-175-152 use at 5 µg/mL
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 715-066-150 use at 3 µg/mL
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG abcam ab150133 use at 5 µg/mL
Cy3 labeled streptavidin Amersham PA43001 use at 3 µg/mL
negative control mouse IgG1 Dako X0931 use at 2 µg/mL
IgG from goat serum Sigma-aldrich I5256 use at 3 µg/mL
IgG from rabbit serum Sigma-aldrich I5006 use at 4µg/mL

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References

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Multiplexado imunofluorescência análise e quantificação de Intratumoral PD-1<sup>+</sup> <sup>+</sup> Tim-3 CD8<sup>+</sup> T células
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