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Cancer Research

Multiplexado de análisis de la inmunofluorescencia y la cuantificación de Intratumoral PD-1+ + de Tim-3 CD8 células+ T

Published: February 8, 2018 doi: 10.3791/56606
Automatic Translation
1, 2,3,4, 2,3, 2,3, 2,3,5, 6, 7, 2, 2, 2, 2,3,6, 8, 2,3, 4, 2,6, *4, *2,4
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou
* These authors contributed equally

Summary

Estudio de microambiente tumoral puede identificar biomarcadores pronósticos o predictivos de la respuesta clínica a la inmunoterapia. Presentado aquí, es un método innovador basado en situ de la fluorescencia multiespectral de imágenes para analizar y contar automáticamente varias subpoblaciones de CD8+ T las células. Esta técnica reproducible y confiable es adecuada para análisis de grandes cohortes.

Abstract

Las células inmunes son importantes componentes del microambiente tumoral e influyen en el crecimiento del tumor y la evolución en todas las etapas de la carcinogénesis. En particular, está ahora bien establecido que el infiltrado inmune en tumores humanos puede correlacionan con el pronóstico y respuesta al tratamiento. El análisis de la infiltración inmunitaria en el microambiente del tumor se ha convertido en un reto importante para la clasificación de los pacientes y la respuesta al tratamiento.

La coexpresión de los receptores inhibitorios como programa celular muerte proteína 1 (PD1; también conocido como CD279), citotóxico linfocitos T asociados proteína 4 (CTLA-4), T-Cell de la inmunoglobulina y mucina que contienen proteína-3 (Tim 3; también conocido como CD366) y linfocitos Activación gen 3 (Lag-3; también conocido como CD223), es un sello de agotamiento de la célula de T. Hemos desarrollado una inmunofluorescencia multiparamétrico en situ tinción para identificar y cuantificar a nivel celular la coexpresión de estos receptores inhibitorios. En una serie retrospectiva de tejido congelado de los carcinomas de células renales (RCC), utilizando una tecnología de imágenes multiespectrales de fluorescencia junto con un software de análisis de imagen, se encontró que la expresión de PD-1 y Tim-3 el tumor infiltrante CD8+ T células se correlaciona con un pronóstico pobre en RCC. A nuestro conocimiento, esto representa el primer estudio que demuestra que este automatizado tecnología multiplex in situ puede tener alguna importancia clínica.

Introduction

En los últimos años, la inmunoterapia ha surgido como un tratamiento prometedor para muchos tipos de cánceres, incluyendo RCC. Particularmente, la inmunoterapia basada en la inhibición de los puestos de control inhibitorios como PD-1 y CTLA-4 se ha divulgado para ser clínicamente eficaz1,2,3,4,5, 6. anticuerpos monoclonales contra CTLA-4, PD-1, o programa muerte ligando 1 (PD-L1) están ya aprobados en varios cánceres y conducen a respuestas clínicas duraderas en más del 20% de los pacientes7. Sin embargo, no todos los pacientes son respondedores, el costo del tratamiento es alta, y estos tratamientos son tóxicos, llevando a graves autoinmunes-como efectos secundarios. Por lo tanto, el reto actual es identificar marcadores predictivos para esas nuevas inmunoterapias. La tasa de mutaciones en el tumor, la expresión de PD-L1 o los niveles de intratumoral CD8+ infiltración de células T se han divulgado para correlacionar con la respuesta clínica. Sin embargo, esta asociación sigue siendo demasiado débil para recomendar el uso de estos biomarcadores clínicos en la práctica clínica, salvo la prueba compañero para PD-L1 antes de la administración de Pembrolizumab en células no pequeñas lung cancer (NSCLC) pacientes8 ,9,1011,12. Se ha demostrado que la expresión conjunta de muchos receptores inhibitorios como PD-1 Tim 3, Lag-3, y CTLA-4, induce un fenotipo de agotamiento de la célula y la resistencia a la terapia13,14,15. Desde sangre periférica no es representativa del microambiente tumoral, es de gran interés para analizar las características fenotípicas de las células in situ. PD-1 y Tim-3 Co expresando las células de T son conocidas por ser células funcionalmente deterioradas en varios contextos13,16,17. En este estudio, el impacto pronóstico de la coexpresión de los receptores inhibitorios dos PD-1 y Tim-3 en CD8+ T las células fue evaluada.

Hasta ahora, estudiando la coexpresión de marcadores múltiples de tumor (TILs) los linfocitos de la infiltración se ha realizado principalmente por análisis de citometría de flujo, lo que es necesario trabajar en tumores frescos y por lo tanto perjuicio análisis retrospectivos. Convencionales en situ tinción, tinción sólo uno a la vez puede llevar a cabo, y la caracterización del tipo de la célula que expresa conjuntamente los marcadores no es posible. Por ejemplo, PD-L1 es expresada por muchos tipos de células del microambiente tumoral, lo que es difícil de definir por análisis inmunohistoquímica convencionales que las células que expresan PD-L1 son los más relevantes estudios correlativos. En este trabajo, hemos desarrollado un método innovador en situ multiparamétrico inmunofluorescencia con la cuenta de equipo correlacionar la co-expresión de PD-1 y Tim-3 por tumor infiltrante CD8+ las células T con los resultados clínicos en RCC. Esta técnica tiene varias ventajas, incluyendo la posibilidad de analizar a un nivel unicelular y marcadores múltiples al mismo tiempo usando una cámara multiespectral que puede captar intervalos restringidos > 10 nanómetro a través del cristal líquido filtros18. Por otra parte, el procedimiento es automático que permite un análisis acortado comparado con técnicas manuales19y una reproducibilidad inter-operador. En el campo del cáncer, varios estudios informaron convencer los stainings múltiples de moléculas inmunes como PD-1, PD-L1 y CD8 en carcinoma de células de Merkel, cáncer de pulmón y cabeza y cuello cáncer20,21,22, 23. el recuento celular automatizado es posible con capacitación por parte del usuario (paso de fenotipo). La fluorescencia se mide en los compartimientos diferentes de la célula (núcleo, citoplasma y membrana).

Aquí, diversos subconjuntos de la tumor-infiltración CD8+ T células expresando PD-1 y Tim-3 en una cohorte grande de RCC fueron contados y los resultados fueron correlacionados con las puntuaciones de gravedad clínica y parámetros de supervivencia. También es posible analizar la intensidad de fluorescencia de membrana en la resolución de celular con datos de la intensidad media de fluorescencia (IMF) como en la citometría. Lo que sabemos, esto representa el primer estudio informes pronóstico resultados utilizando esta técnica de conteo basado en proyección de imagen multiespectral.

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Protocol

Este estudio se llevó a cabo con arreglo a la declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de ética local (CPP Ile de France no. 2012-05-04). El consentimiento informado fue obtenido de los participantes incluidos en las cohortes.

1. tejido Material

  1. Recoger muestras de tejido de la RCC en el día de la cirugía. Manejar al espécimen quirúrgico a temperatura ambiente (Departamento de patología).
  2. Recoge una muestra de tumor de aproximadamente 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm de tamaño en un tubo seco. Congelación en nitrógeno líquido y almacenar a-80 ° C.
  3. Las muestras de temperatura óptima de corte compuesto de la capa. Sección de las muestras con un criostato a-20 ° C en secciones gruesas de 4-6 μm. Deje que las muestras de aire seco en las diapositivas por 12 h y guardarlas directamente a-80 ° C para evitar la desecación.
  4. Compruebe la calidad de la muestra mediante la visualización de una hematoxilina y eosina teñidos sección.

2. in Situ tinción de inmunofluorescencia de TILs

  1. Directrices de procedimiento
    1. Realizar todos los pasos experimentales a temperatura ambiente.
    2. Para todos los pasos, realizar las diluciones con Tris Buffer salino (TBS; véase Tabla de materiales).
    3. Realizar el lavado en TBS para todos los pasos excepto después de la incubación del anticuerpo primario. Para este último, utiliza Tris Buffer salina Tween20 (TBST, véase Tabla de materiales). Para la composición del tampón y reconstitución ver suplemento tabla 1.
    4. Utilizar una cámara de humedad para incubaciones de anticuerpo y una jarra de tinción para el lavado.
    5. No permita que la sección sequen durante el procedimiento.
  2. Tratamiento previo
    1. La diapositiva que contiene la muestra de tejido de descongelar y secar cuidadosamente la diapositiva alrededor de la muestra con una toalla de papel. Delimitar la zona de reacción que contiene el tejido con un bolígrafo de la barrera hidrofóbica (véase Tabla de materiales). Seco por 2 min.
    2. Fijar las muestras en acetona al 100% por 5 min, durante 2 min y lavar con TBS durante 10 minutos.
  3. Saturación y bloqueo
    1. Prepare los portaobjetos por 10 min con 3 gotas de avidina 0.1%, grifo o película de la diapositiva para distribuir la avidina y eliminar burbujas de aire y luego tratar por 10 min con 3 gotas de biotina 0,01% (véase Tabla de materiales), pulse, o la película. Lavado con TBS.
    2. Realizar un bloqueo de receptores Fc. Aplicar 100 μl de un volumen de 5% de suero normal diluido en suero de TBS. uso de la misma especie del anfitrión que el anticuerpo marcado secundario o terciario (véase Tabla de materiales); aquí, se utilizó suero de burro. Incubar durante 30 minutos.
    3. Durante la incubación, girar brevemente el anti-CD8, PD-1 y Tim-3 anticuerpos (Tabla de materiales). Preparar la mezcla de anticuerpos primarios en TBS como se describe en la tabla adicional 2.
  4. Inmuno-tinción para CD8, PD-1 y Tim-3
    1. Preparar la mezcla del anticuerpo primario. Consulte Tabla de materiales y tabla 2 suplementaria para los anticuerpos utilizados (anti-CD8, PD-1, Tim-3 y sus correspondientes anticuerpos secundarios) y sus concentraciones.
    2. Toque o mueva el suero restante de burro (agregado en el paso 2.3.2). Incube los portaobjetos con 100 μl de la mezcla de anticuerpos primarios no etiquetadas de 1 h en una cámara humidificada.
    3. Durante la incubación, brevemente la Cianina 5 anti-conejo AF488 anti de cabra y los anticuerpos anti-ratón biotinilado de la vuelta y preparar la mezcla de anticuerpos secundarios como se describe en la tabla adicional 2.
    4. Lave los portaobjetos en TBST por 5 min seco las diapositivas.
    5. Incube los portaobjetos con 100 μl de los anticuerpos secundarios durante 30 minutos en una cámara humidificada.
    6. Prepara la mezcla de anticuerpo terciario con Cy3-estreptavidina como se describe en la tabla adicional 2.
    7. Lave los portaobjetos en TBS 10 min seco las diapositivas.
    8. Incube los portaobjetos con 100 μl de la mezcla de anticuerpo terciario durante 30 minutos.
    9. Lave los portaobjetos en TBS 10 min seco las diapositivas.
  5. Montaje de la célula
    1. Montar las diapositivas en un 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, medio (DAPI de 1.5 μg/mL) con un cubreobjetos compatible para microscopía de fluorescencia de montaje que contiene diclorhidrato de DAPI (véase Tabla de materiales).
      Nota: Como un control negativo para cada experimento, se utilizó una diapositiva con los anticuerpos de isotipo-emparejados en la misma concentración como anticuerpos correspondientes. Para esta tinción se utilizan mouse IgG1, conejo IgG y anticuerpos de control negativo de IgG de cabra (véase Tabla de materiales). Como control positivo se utilizó humano amígdala hiperplásica que se conoce para ser positivo para los marcadores probados, para cada experimento. Una coloración típica se describe en los resultados (figura 1). Mono-tinción de CD8, PD-1 y Tim-3 se deben realizar individualmente (una tinción por diapositiva) con el mismo tratamiento previo y sin DAPI. También se debe realizar una diapositiva en las mismas condiciones experimentales sin ningún anticuerpo y sólo medio de montaje DAPI. Una diapositiva debe ser reflejada con idénticas condiciones experimentales sin ningún anticuerpo ni DAPI.

3. fluorescencia análisis y recuento celular automatizado

  1. Adquisición de imágenes con el microscopio automatizado
    1. Crear un protocolo.
      1. Abra el software del microscopio automatizado y el iluminador de fluorescencia.
      2. En la barra de menú, haga clic en "Archivo", "crear el protocolo," seleccione "DAPI", "FITC" y "TRITC."
      3. Haga clic en "Siguiente", "Sección de tejido," y haga clic en "Siguiente", "Nombre del protocolo". Elegir un clic nombre, por ejemplo, "CD8-PD-1-Tim-3" "Siguiente" y "guardar".
      4. Manualmente, coloque un portaobjetos en el escenario.
      5. En la barra de menú, haga clic en "setup", "configuración". Haga clic en "set Inicio Z" en la nueva ventana.
      6. Ajustar el tiempo de exposición con un control positivo , es decir un CD8 Deslice, PD-1 y Tim-3 triple teñidos con muestra DAPI.
      7. En la barra de control, haga clic en "ajustar la exposición."
      8. Ajuste el tiempo de exposición para cada filtro hasta que se obtiene una señal suficiente pero no saturación.
      9. Para imágenes monocromo, realizar lo siguiente:
      10. Elige la adquisición y en 'autofocus' elija Filtro DAPI.
      11. En el "límite de área de exploración", mueva el objetivo superior a la esquina superior izquierda de la diapositiva. Haga clic en "Marcar". Hacer lo mismo con la esquina inferior derecha.
        Nota: Este paso delimita la zona de baja potencia (proyección de imagen de LP) la proyección de imagen a 4 X; Tenga en cuenta lugar bien así que rodean todas las muestras de la serie.
      12. Para alta potencia (HP) la proyección de imagen, realizar lo siguiente:
      13. En 'Enfoque', elija "DAPI".
      14. En la banda de 'Adquisición', elija "DAPI", "", "Cy3" y FITC "Cy5". Haga clic en "Aceptar". En la barra de menú haga clic en "Archivo", "guardar el protocolo".
    2. Escanear las diapositivas.
      1. El protocolo de carga haciendo clic en "Archivo", "Protocolo de carga" de la barra de menús. Haga clic en "Inicio".
      2. Introduzca 'Laboratorio ID' (ubicación de la carpeta de almacenamiento de la imagen). Introduzca el ID de la diapositiva para identificar la diapositiva. Haga clic en "Siguiente".
      3. Haga clic en "Imagen monocromática" (para explorar la diapositiva entera bajo la luz de campo brillante y adquirir imágenes secuenciales usando un objetivo de 4 x).
        Nota: Esto produce una visión de escala de grises de la diapositiva.
      4. Haga clic en "Buscar ejemplar". Seleccione el área de tejido para ser escaneado en baja resolución (4 x): Mantenga pulsada la tecla 'Ctrl' y haga clic en un campo utilizando el cursor para seleccionar o deseleccionar los campos (figura 2A).
      5. Haga clic en "Imagen del LP" (4 imágenes) para la adquisición de imagen verde azul rojo fluorescente de cada campo.
      6. Para la selección de campo de caballos de fuerza, mantenga pulsada la tecla 'Ctrl' y haga clic en un campo utilizando el cursor para seleccionar o deseleccionar los campos que corresponden a la zona de los tejidos que se analizarán en alta resolución (20 x). Seleccione 5 campos (figura 2B).
      7. Haga clic en "HP Imaging" (20 x la proyección de imagen) para la adquisición de una imagen multiespectral de cada campo (figura 2).
      8. Haga clic en "Almacenamiento de datos" para almacenar imágenes en la carpeta que seleccionaron al principio en LabID.
        Nota: El proceso es resumido e ilustrado en la figura 2. Para cada paso (detección de tejido, selección de campo) un algoritmo puede ser incrementado y entrenado por el usuario para un proceso de análisis automatizado de todo.
  2. Análisis de imágenes de fluorescencia y célula automatizada contando con software de análisis acoplados
    1. Construir la biblioteca espectral.
      1. Abra el software de análisis de imagen.
      2. En el panel izquierdo, abra "Construcción de bibliotecas". En 'imagen de carga', haga clic en "Examinar" y seleccione un mono manchada imagen (p. ej., CD8/Cianina 5).
      3. Seleccione el fluoróforo (p. ej., Cianina 5). Haga clic en "extraer". Haga clic en "Guardar" para almacenar en la biblioteca. Haga clic en "Guardar".
      4. Repita el mismo proceso para PD-1 Tim 3 y DAPI mono manchado diapositivas con el fin de integrar el espectro de cada fluoróforo de interés.
        Nota: La biblioteca espectral de construcción integra el espectro para cada fluoróforo que se utiliza para el tejido específico (aquí, riñón), pero pueden usar bibliotecas de "sintéticas" que ya existen. Como el espectro de Autofluorescencia es estrictamente en relación con el tejido, es importante realizar una auto-fluorescencia y biblioteca espectral por proyecto.
    2. Cree un nuevo proyecto.
      1. En la barra de menú, haga clic en "Archivo", "Nuevo proyecto". En la pestaña 'Buscar característica', seleccione "segmentación de la célula". En la ficha 'Fenotipo', seleccione "fenotipo". Haga clic en "Crear".
      2. Integrar las imágenes representativas del proyecto.
        1. En la pestaña de 'Archivo', haga clic en "abrir imagen". Elegir 10 a 30 imágenes representativas de toda la serie. Agregar la diapositiva no manchado para quitar la autofluorescencia. En el panel derecho: fuente de la biblioteca selecta. Seleccione fluoróforo y los correspondientes a la biblioteca espectral previamente construida elegir a.
      3. Para quitar el tejido autofluorescencia, haga clic en el botón"AF" y seleccione el área de Autofluorescencia en la diapositiva en blanco.
      4. Tratamiento de imágenes y generación de la imagen compuesta.
        1. Haga clic en "Preparar todo" para integrar la biblioteca de fluorescencia y los espectros de Autofluorescencia para generar la imagen compuesta (figura 3). Haga clic en el icono de 'ojo' para abrir el panel de 'editor de vista' y seleccione los datos mostrados: seleccione los marcadores CD8, PD-1, Tim-3 y DAPI. Retire la autofluorescencia. Siga los pasos presentados por el software.
      5. Las células del segmento.
        1. Para el segmento de las células, en 'Compartimento', seleccione "Núcleos" y la "Membrana". En la pestaña de "Núcleos", sistema DAPI como contratinción nuclear.
        2. En la pestaña de "Máximo y mínimo (px)" entrar "40" y "176" como tamaños mínimos y máximos, respectivamente. Para la señal de 'Mínimo', conjunto "0.13". En la pestaña "Split", establecer "2.60". En la pestaña de "Núcleos", establecer "0.81". Seleccione "utilizar la señal de la membrana para facilitar la segmentación".
        3. Haga clic en "Celdas de segmento" en la parte inferior de la pantalla. Controlar la segmentación de los núcleos y membranas de las células y con diferentes parámetros de reintento si no coincide con la fluorescencia de DAPI y la membrana de las células.
          Nota: El software reconoce las células con la nuclear DAPI coloración y basado en el tamaño de celda. Ajustar los parámetros de la célula (tamaño, split, píxeles) de acuerdo con el proyecto.
      6. Fenotipo de las células.
        1. En la ficha 'Fenotipo', haga clic en "agregar". Crear células fenotipo categorías: CD8 (punto azul) / CD8-PD-1 (punto rojo) / CD8-PD-1-Tim-3 (punto verde) / otros (punto negro) (figura 4).
        2. Seleccione más de 5 ejemplos de células de cada categoría. Haga clic en "Clasificador del tren".
          Nota: Esto genera un algoritmo de Clasificación Estadística por el software.
        3. Haga clic en el "Fenotipo todos" para obtener el fenotipo de cada célula.
          Nota: El software da el fenotipo de una célula con un intervalo de confianza (IC) de precisión.
        4. Mejorar el algoritmo por el software del entrenamiento hasta que la diferencia entre el ojo y recuento automatizado es concordante (error < 5%). Elegir un CI que es aceptable para las células de interés.
          Nota: Hemos optado por realizar la capacitación sobre la base de CI de 55% como aceptable.
      7. Guarde el proyecto y algoritmo.
      8. En 'Archivo' Seleccione "proyecto". El nombre y haga clic en "Guardar".
    3. Realizar el análisis de lote de la serie.
      1. Seleccione "Análisis de lote". Seleccione el proyecto. Añadir las imágenes a analizar. Seleccione una carpeta de almacenamiento para los datos. Haga clic en "Ejecutar". Compruebe la calidad de la imagen compuesta. Verificar el fenotipado de todas las imágenes de la serie.
        Nota: El software de análisis de imagen acoplado integra todas las señales de celular compartimentos (membrana/citoplasma/núcleo). El paso de fenotipado es crucial aunque el entrenamiento del algoritmo puede ser un paso lento. Todos los datos de cada imagen están en un archivo .txt. Todos los datos de una celda (particularmente su fenotipo con su CI) están en una línea. Para cada diapositiva, la adquisición de imágenes y recuentos posteriores se realizaron en 5 campos.
  3. Integración de los datos y la generación de la cuenta de célula automatizada
    1. Calcular los datos con un programa estadístico.
      1. Calcular todos los datos de las 5 imágenes correspondientes a los 5 campos para 1 paciente. Utilizar una plataforma estadística y tiene un estadístico experimentado, administrador de datos o científico de datos realizar el análisis. Crear un script que cuenta automáticamente las celdas según su fenotipo, seleccionar el CI > 55%.
      2. Poner todos los archivos .txt de la serie en la misma carpeta.
    2. Extraer los datos.
      1. Poner todos los archivos de txt en una carpeta. Ejecute el script automático construido en paso 3.3.1. Abra el archivo .csv de salida generado por el script de R. Guardar como formato de .xl. La salida reúne al número de células para cada fenotipo (es decir, solo, CD8 CD8-PD-1, CD8-PD-1-Tim-3) para cada paciente.
      2. Calcular el número promedio de células para cada paciente por campo: dividir el número de células por el número de campos (es decir, 5) para normalizar el número de células para cada paciente por campo.
      3. Calcular el porcentaje de células entre CD8 total de PD-1+ + T células y células de PD-1+ Tim-3+ entre CD8 total+ T las células. Vea la figura 5 para el Resumen de este paso.
        Nota: Idioma R (u otro software de programación de elección) es necesario crear y ejecutar los comandos correctamente, y así que un usuario experimentado o un científico estadístico/de datos es esencial. El programa de R puede calcular los datos del mismo paciente, pero el nombre de los 5 archivos de .txt de un paciente debe tener un principio idéntico, correspondiente a un identificador de paciente único.
  4. Análisis estadístico
    1. Utilizar software estadístico para el análisis estadístico de los resultados.
    2. Realizar análisis estadísticos apropiados con la ayuda de un estadístico.
      1. Usar la no paramétrica Wilcoxon firmó fila pruebas para comparación de PD-1 MFI entre dos fenotipos de células (figura 6). Correlacionar las características histológicas y covariable con la prueba chi-cuadrada de Pearson.
      2. Use un método de Kaplan-Meier para estimar supervivencia libre de progresión los modelos de regresión de Cox para estimar los efectos de la covariable en los resultados de tiempo hasta el evento, como la supervivencia global y supervivencia libre de enfermedad.
      3. Considerar p-valores inferiores a 0,05 como significativo.

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Representative Results

Utilizando el protocolo general descrito anteriormente, el objetivo fue cuantificar intratumoral CD8 células de+ T Co expresando los receptores inhibitorios PD-1 y Tim-3 en tejidos congelados de pacientes con CCR y correlacionar los resultados con los resultados clínicos25.

Optimización de la tinción de CD8/PD-1/Tim-3:

Especies diferentes de anticuerpos (ratón, conejo y cabra, véase Tabla de materiales) fueron escogidas para evitar reacción cruzada entre los diferentes anticuerpos. El protocolo fue validado en una amígdala, que es un tejido linfoide organizado. Tinción de PD-1 se encuentran en los centros germinales (figura 1), mientras que CD8 y Tim-3 manchas están presentes alrededor de los centros germinales. La observación de la coloración típica había validado este protocolo. La tinción se validó también el tejido de interés (riñón).

Se confirmó la ausencia de señal del anticuerpo primario que se incubaron con su anticuerpo secundario no correspondientes (datos no mostrados). Para analizar con precisión la tinción de la fluorescencia y para hacer bibliotecas espectrales específicas, diapositivas individuales fueron manchados por separado con cada marcador (CD8, PD-1, Tim-3 o DAPI) en el tejido de interés (riñón). Una diapositiva no manchados en las mismas condiciones es necesaria extrapolar la autofluorescencia de los tejidos. La tinción fue analizada por el microscopio automatizado, que integran los espectros de los fluoróforos diferentes; cada marcador fue bien diferenciado y superposición de marcadores no se observó (figura 3).

Características cuantitativas y cualitativas de los CD8 + Infiltrarse en 87 pacientes RCC:

Los resultados mostraron que aproximadamente la mitad de CD8+ T células expresa PD-1 (promedio 53,9%; SE: 30.49%) y sobre un tercio eran doble positivo PD-1+ Tim-3+ (media 38.16%; SE: 28.11%). Tim-3 expresión sin expresión de PD-1 fue detectada en menos del 3% de CD8+ T las células (datos no mostrados). El número promedio de CD8+ T cell subpoblaciones fueron: total CD8+ T células 116.5 (SE: 216), PD-1+ CD8+T células 89.32 (SE: 191.8), PD-1+ + 66.9 Tim-3 (SE: 143) y PD-1+ CD8 Tim-3– + Células de T 22.38 (SE: 57.5) por campo. El número total de intratumoral CD8+ T las células se correlacionó positivamente con el porcentaje de PD-1+ + de Tim-3 en CD8+ T las células.

Caracterización funcional de los CD8 + T las células según su fenotipo PD-1 y Tim-3:

Nivel de expresión de PD-1 se sabe para ser correlacionado con el agotamiento de la célula de T por lo siguiente el objetivo fue medir la expresión de PD-1 en CD8+ T las células según Tim-3 Estado de expresión. Como la intensidad de fluorescencia media de los diferentes fluorocromos se divulga a nivel celular, una pequeña serie de pacientes se analizaron manualmente para los datos: los resultados mostraron una correlación de membrana de PD-1 MFI con el subtipo de células. PD-1 intensidad fluorescente fue medido (figura 6) a nivel celular en el PD-1+ + de Tim-3 versus PD-1+ CD8 Tim-3– + T las células (un panel) y a nivel de paciente individual después de integrar estos varios señales de celular en una sección de tejido. En una serie de 9 pacientes, una comparación con la prueba de Wilcoxon pareada encontró que PD-1 MFI es mayor cuando Tim-3 se expresa Co, reforzando la relevancia funcional de la expresión de Tim-3 (panel B).

Expresión de PD-1 y Tim-3 ligandos en la superficie de las células tumorales de múltiples co manchas:

Como agotamiento de la célula de T es mediada a través de la interacción del ligand/del receptor, se evaluó la expresión de PD-1 y Tim-3 ligandos (PD-L1 y Galectin-9 (Gal-9), respectivamente) en las células de tumor renal identificadas por la coloración del pan-queratina. La positividad se define como un corte del 10% de las células tumorales que expresan el marcador: (i) 58 de 87 pacientes (66%) eran positivas para el PD-L1; (ii) todos los 15 tumores analizados fueron positivos para Gal-9 (Figura 7A, B).

Impacto clínico de la expresión conjunta de Tim-3 + PD-1 + en CD8 + Células T:

Tumor nodo metástasis (TNM) anotar grado de Fuhrman, tamaño del tumor y puntuación UISS es características histológicas (combinadas con puntuación clínica para UISS) utilizadas para definir el valor pronóstico de RCC primario. Se observó una correlación positiva entre el número o porcentaje de CD8 tumor-infiltración+ T células expresando PD-1 y Tim-3 (pero no expresan sólo PD-1 sin Tim-3) con todos estos parámetros (tabla 1). En consonancia con este fenotipo más peyorativo, pacientes RCC con CD8+ T las células Co expresando PD-1 y Tim-3 sobre el porcentaje promedio (34.7) eran más propensos a la recidiva (p = 0.046; HR 2,9; IC DEL 95%: 1,02-8.21). Esta correlación no se observó con el porcentaje de PD-1 en CD8 células+ T independientemente del estado de Tim-3 (tabla 2). También se demostró una correlación entre el porcentaje de CD8 de las células+ T Co expresando PD-1 y Tim-3 y la tasa de supervivencia general 36 meses (datos no mostrados). También validamos el immunostaining triple sobre los tejidos amígdala parafina (figura 1).

Figure 1
Figura 1: CD8-PD-1-Tim-3 immunostaining en un tejido parafina-encajado de la amígdala. Tejido incorporado secciones en lugar de secciones criopreservadas fueron seleccionadas para la inmunotinción triple de parafina. Después de desparafinado y rehidratación, se aplicó el mismo protocolo de tinción previamente desarrollados para secciones criopreservadas. CD8+ T las células se encuentran fuera del centro germinal y células de T+ no CD8 expresan PD-1 se agrupan en el centro germinal. El aumento del microscopio es 20 x y la barra de escala representa 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: automatizado de análisis de muestras de tejido de carcinoma de células renales. Después del reconocimiento de tejido en la imagen de campo brillante (Aescala de la barra 1 mm), 4 x aumentos de microscopio, proyección de imagen de baja resolución RGB (rojo azul verde convencional de la fluorescencia) se utiliza para seleccionar los campos (B, escala de la barra 500 μm. La Plaza Roja completo representa un campo. Una imagen de alta resolución (imagen multiespectral cubo de fluorescencia específica para esta tecnología) con aumento 20 x realizadas por el microscopio multiespectral se muestra (C, escala de la barra 100 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: microscopía multiespectral y software junto análisis para la generación de una imagen compuesta de un carcinoma de células renales (20 x aumentos de microscopio). La imagen raw de alta resolución (A) es una imagen fluorescente del campo después de la digitalización multiespectral por cubos de filtro de la fluorescencia. Señal azul es AF488, el rojo es Cianina 5 y verde es Cyanin3. La combinación muestra diferentes colores por ejemplo, el amarilla es una combinación de los tres fluoróforos. Esta imagen está incorporada en el software de análisis de imagen. Integración de la biblioteca de espectros permite una separación precisa del espectro de cada fluoróforo y autofluorescencia conduce a una compuesto fluorescente de la imagen (B). Colores representativos son elegidos por el operador: azul ilustra Cianina 5 (CD8), rojo Cianina 3 (PD-1), Green AF488 (Tim-3). Combinar la mezcla de colores como el púrpura se utiliza para CD8-PD-1 doble positivo. La barra de escala representa 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Expresión de PD-1 y Tim-3 en CD8 tumor-infiltración+ T las células en una muestra de carcinoma de células renales claro de la célula analizada por tecnología de imágenes multiespectrales de fluorescencia (20 x aumentos de microscopio). (A) CD8 (azul), PD-1 (rojo) y Tim-3 (verde) fueron manchados en secciones congeladas del tejido derivadas de pacientes RCC. Colocalización de estos tres marcadores puede detectarse por la fusión de las imágenes tinción de mono. Se realizaron controles de isotipo en cada experimento. La barra de escala representa 20 μm. amarillo cajas identifican Co células: una célula CD8 de PD-1+ de Tim-3– y una célula CD8 de PD-1 de Tim-3+ + . (B) Triple coloración Co para CD8, PD-1 y Tim-3 (combinado) se muestra a la izquierda con el cuadro que indica que verde es CD8 de las células+ T Co expresando PD-1 y Tim-3. Para el recuento automatizado con el software de análisis de imagen, la identificación de las células depende de la presencia de una tinción nuclear (DAPI); la segmentación de la célula también se basa en características morfométricas representadas como rojo límites (panel central). Un algoritmo formado por el usuario hasta que la concordancia con la cuenta visual se realiza (derecha) y después de fenotipado automático, identifica puntos verdes como CD8+ T las células Co expresión de PD-1 y Tim-3, rojo puntos como CD8+ T las células expresan PD-1 sin Tim-3 y azules puntos como CD8+ T las células no expresan PD-1 o Tim-3. La barra de escala representa 20 μm. amarillo caja muestra PD-1 y Tim-3 expresando CD8+ T las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: informática los datos brutos de análisis multiespectral. Después de análisis de imágenes se recogen datos de la cuenta de cada categoría de célula presente en cada campo (es decir, 5 campos de paciente, es decir, 5 archivos .txt). Un script de R combina los datos de 5 campos, considerando sólo las células fenotipados con un intervalo de confianza: > 55%. El aumento del microscopio es 20 x y la barra de la escala representa 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: PD-1+ + CD8 de Tim-3+ T las células expresan mayores niveles de PD-1 en comparación con PD-1+ CD8 Tim-3– + T de las células de carcinoma de células renales. La intensidad de PD-1 se detecta en el nivel celular (panel izquierdo) por análisis de inmunofluorescencia in situ sobre PD-1+ Tim-3+ y PD-1+ CD8 Tim-3– + T las células. A nivel individual (panel central): se muestran los resultados para el CD8 todo+ T célula subconjuntos PD-1+ + de Tim-3 versus PD-1+ Tim-3– presentes en una sección de tejido(es decir, un paciente; Prueba de Mann Whitney). Análisis comparativo de la intensidad media de PD-1 se midieron en una serie de 9 pacientes (panel derecho) (prueba de Wilcoxon, p-valores inferiores a 0,05 se consideraron significativos). El aumento del microscopio es 20 x y la barra de escala representa 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: PD-L1 y Gal-9 es decir, PD-1 y Tim-3 ligandos tinción en carcinoma de células renales. (A) Tumor células se identifican por la coloración del pan-queratina. Co teñido de PD-L1 y pan-queratina (un panel) identifica la expresión de PD-L1 en células tumorales en 58 pacientes de 87 analizado. (B) Galectin-9 se expresó en todos los 15 tumores de pacientes RCC analizados. La positividad se consideró si por lo menos el 10% de células fueron manchado para el marcador analizado. Controles de isotipo se incluyeron para cada coloración. Cajas amarillas representan tumor positivo (pan-queratina +) células para PD-L1 (panel A) o Galectin-9 (panel B). El aumento del microscopio es 20 x y la barra de escala representa 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Células de T %/CD8+ PD-1+ PD1+ + de Tim-3 PD-1+ Tim-3–
TNM 0.04 0.003 0.22
Furhman 0.01 0.004 0.74
Tamaño del tumor 0.08 0.01 0.37
UISS 0.01 0.01 0,63

Tabla 1: Correlación entre la expresión de PD-1 sola o combinada con Tim-3 en CD8+ T las células y parámetros clínicos de pronósticos de los pacientes RCC: p-valores. El porcentaje de PD-1+,+ + de Tim-3 PD-1 o PD-1+ Tim-3– en CD8+ T las células seleccionadas como una variable continua que mide por inmunofluorescencia en situ en la cohorte de 87 pacientes se correlacionó con diferentes parámetros clínicos definidos como un binario (TNM, grado de Fuhrman, UISS partitura) o una variable continua (tamaño del tumor). TNM se dividió en dos grupos: localizada enfermedad (pT1 y pT2) y enfermedad avanzada (pT3, pT4, N+, o M+). Grado de Fuhrman fue definido como bajo (grado I o II) y alto (grado III o IV) y la puntuación de la UISS se dividió en 3 clases (0, 1 y 2). P-que indica una correlación significativa entre los valores se muestran en negrita.

CD8+ subconjunto células T CD8 PD-1+ Tim-3+ PD-1+ Tim-3–
Mediana (%) 34.7 8.6
Correlación con PFS P = 0.046 P = 0.8

Tabla 2: Correlación entre el PD-1 y Tim-3 la expresión CD8+ T las células y la progresión liberan supervivencia. Dos grupos de pacientes RCC (n = 87) dependiendo del porcentaje de PD-1 sin Tim-3 (derecha), PD-1 y Tim-3 (izquierda) comparado con la mediana fueron individualizados. La correlación con el PFS se hizo con la mediana como un punto de corte. P-que indica una correlación significativa entre los valores se muestran en negrita.

Suplemento tabla 1: composición de TBS y TBST del almacenador intermediario. TBS se utiliza para mezclas de anticuerpos y diluciones. Lavados, se realizan todos los pasos con TBS excepto los lavados después de anticuerpos primarios, donde se recomienda TBST. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla 2 suplementaria: anticuerpos toda mezclan de composición para la tinción de inmunofluorescencia de CD8-PD-1-Tim-3. Para cada anticuerpo primario, secundario y terciario se mezcla, se da la dilución a realizar en el correspondiente volumen de TBS para un volumen total de 1 mL. Para una diapositiva, el volumen de reacción total necesaria es 100 μl de una zona de tejido de 2 cm2. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Modificaciones y resolución de problemas:

La calidad del tejido es un parámetro importante; puede comprobarse fácilmente por la coloración de hematoxilina y eosina.

Una de las ventajas de la técnica es la posibilidad de multiplexado stainings, pero para evitar el contagio del fluoróforo, recomienda para seleccionar longitudes de onda de emisión con delta de 10 mínimo de nm. Aquí, porque teníamos 4 stainings incluyendo DAPI, decidimos difundir hacia fuera las longitudes de onda (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, Cianina 3:570 nm, Cianina 5:670 nm). El riesgo de superposición de señales de diferentes fluoróforos se evita mediante el software para calcular el espectro puro de un fluoróforo de una señal de emisión mixta, combinado con un análisis de imagen automatizado. Las diapositivas manchadas de mono también confirman la ausencia de solapamiento de fluoróforos y acto como compensación gracias a la biblioteca espectral.

A veces la positividad de un marcador en una celda puede ser difícil determinar si la coloración/fluorescencia es débil. El control negativo en cada experimento es una buena manera para determinar un umbral de positividad.

En el acoplado software para analizar imágenes, un paso de puntuación para determinar la positividad de la célula existe pero sólo puede analizar simultáneamente dos marcadores. Porque podemos tener manchas triple en la misma célula (CD8, PD-1 y Tim-3), elegimos el paso phenotyping.

El paso de fenotipo puede ser laborioso, sobre todo si el tipo de tinción y fondo es variable de una muestra a otra.

Limitaciones de la técnica:

Aunque el número de co-stainings es una ventaja en comparación con la fluorescencia convencional, no es posible analizar muchos colores como en la citometría de flujo. Especialmente cuando se estudia la colocalización de marcadores múltiples, tenga en cuenta para la sensibilidad que es menor en comparación con la microscopía confocal (20 x aumentos del microscopio, aproximadamente 0,5 μm versus 0.1 μm por píxel para confocal, dependiendo de la marca) y Busque fluoróforo derrame (ver pasos críticos en el protocolo, a continuación).

Una gran limitación de la técnica es el formato de datos raw. Los datos en bruto son archivos .txt que podrían ser difíciles de usar. Como el software da un archivo .txt por imagen con CI para el fenotipo, el tratamiento manual de cada uno de los 5 archivos por paciente de una serie enorme es muy laborioso. Especialista en Bioinformática es necesaria para calcular todos los datos en un software estadístico.

Importancia con respecto a los métodos existentes:

Análisis de tinción multiplexados es fácilmente posible. En comparación con citometría de flujo, que analiza muestras frescas, esta técnica permite un conteo rápido en un método reproducible de los subconjuntos diferentes células presentes en el microambiente tumoral, en cohortes grandes de las muestras congeladas con un procedimiento automatizado26 ,27. Podríamos contar automáticamente infiltración CD8+ T células expresando Tim-3 PD-1 y co expresando o no en el marco de la RCC. La cuenta automática evita varios sesgos como fatiga ocular y cuenta no reproducibles y no es mucho tiempo.

Como la gran cohorte estudiada muestra congelada, tuvimos datos retrospectivos, así podríamos vincular el número absoluto o porcentaje de los CD8+ T subconjuntos con parámetros biológicos y evolución clínica de la célula. Como existe una importante heterogeneidad de la infiltración inmune de un paciente a otro28, esto representa una ventaja en comparación con el fluorocytometry que informa sólo MFI y porcentaje pero no el grado de infiltración.

La intensidad de fluorescencia cuantitativa se divulga para cada celda, y en los compartimientos diferentes de la célula (membrana/citoplasma/núcleo), podríamos evaluar el nivel de PD-1 coloración por la IMF en la membrana. Esto representa otra herramienta interesante que es similar a la citometría de flujo. Encontramos que el PD-1+ CD8+ T las células expresan Tim-3 había mayor expresión de PD-1 y fueron asociadas con un pronóstico pobre (impacto en la supervivencia libre de progresión). A nuestro conocimiento, es el primer estudio utilizando este método que muestra una significación clínica de un subconjunto de células específicas.

Futuras aplicaciones:

El campo de aplicación es inmenso. También destacamos en el microambiente del tumor del cáncer de pulmón otro subconjunto específico de la célula: células de la memoria residente del tejido T llamado TRM (CD103+ CD49a+), y se correlacionan con un mejor total supervivencia21,29 ,30. En otro trabajo usando esta técnica, nuestro equipo encontró que PD-L1 se sobreexpresa en las células tumorales en un subtipo de cáncer de pulmón con un cambio de linfoma anaplásico kinasa (ALK), y esta expresión se correlacionó con CD8+ T infiltran10. Esta técnica es conveniente para la evaluación de parámetros biológicos críticos en varios contextos y puede representar una valiosa herramienta para el descubrimiento de biomarcadores. Puesto que se dan las coordenadas xy, es una de las primeras herramientas para estudiar la topografía y las interacciones con facilidad31de célula.

Pasos críticos dentro del Protocolo:

Uno de los pasos críticos es la optimización de la tinción conjunta, que puede ser muy lento. La elección de un buen anticuerpo es crucial, por ejemplo múltiples clones han sido probados para Tim-3 en el presente caso. Además, fluoróforos diferentes por el mismo marcador pueden dar resultados diferentes por lo que es importante intentar varias combinaciones. Se recomienda examinar la especificidad de la tinción con los anticuerpos que no debe reaccionar juntos. A pesar de la posibilidad de analizar varios fluoróforos al mismo tiempo, se recomienda la comprobación de desbordamiento con las diapositivas manchadas de mono. Otro paso fundamental es el paso de fenotipado que se basa en el manual de capacitación para llevar a cabo cuidadosamente.

En total, el uso de esta técnica multiplexada por un operador experto representa una herramienta elegante para analizar varios subconjuntos de la célula del infiltrado inmune local, que es de importancia ya que el análisis de sangre periférica no puede ser representante del tumor local medio ambiente.

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Disclosures

Todos los autores no tienen ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por becas del Instituto Nacional del cáncer (INCA) (ET), Ligue contre le cáncer (ET), Cité Université de Paris Sorbonne (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), empresa Labex inmuno-Oncología (ET), CARPEM SIRIC (CG, ET). EdG fue financiado por una beca de la Fundación arco. EV y CD fueron financiados por una beca de php (bolsa année recherche). ChB es financiado por una beca de la Université Sorbonne París Cité (contrat doctoral). Los autores agradecen a Bristol Myers Squibb para su financiación en este proyecto. Los autores agradecen al Departamento de patología del hospital Européen Georges Pompidou y Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel y Gisèle Legall). Los autores agradecen la plataforma histología de PARCC, hospital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging  Perkin Elmer CLS142338
inForm cell analysis 2.1. Perkin Elmer CLS135781
R software https://www.r-project.org
Dakopen delimiting pen Dako S2002
Tris Buffer Salin TBS Tablets Takara, Bio Inc. TAKT9141Z pH7.6 100 tablet
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) Takara, Bio Inc. TAKT9142Z pH 7.6 100 tablets
Biotin blocking system Dako X0590 Avidin 0.1% and Biotin 0.01%
normal donkey serum Jackson Immunoresearch 017-000-001 5% vol./vol. concentration
Fluoroshield with DAPI Sigma-aldrich F6057 1.5 µg/mL concentration
Knittel glass coverslip Knittel Gläser, 100039 24x60 mm 100 cover slips
Rabbit anti-CD8 Clone P17-V novus NBP1-79055 use at 4µg/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NAT abcam ab52587 use at 2 µg/mL
Goat anti-Tim-3 R&D AF2365 use at 3 µg/mL
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 Roche 7309457001 use at 1 µg/mL
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 Cell Signalling 4528 use at 0.5 µg/mL
Goat anti-human gal9 R&D AF2045 use at 0.3 µg/mL
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit Jackson Immunoresearch 711-175-152 use at 5 µg/mL
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 715-066-150 use at 3 µg/mL
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG abcam ab150133 use at 5 µg/mL
Cy3 labeled streptavidin Amersham PA43001 use at 3 µg/mL
negative control mouse IgG1 Dako X0931 use at 2 µg/mL
IgG from goat serum Sigma-aldrich I5256 use at 3 µg/mL
IgG from rabbit serum Sigma-aldrich I5006 use at 4µg/mL

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References

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