Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Multiplexed ayirt analizi ve Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8 miktar+ T hücreleri

Published: February 8, 2018 doi: 10.3791/56606
Automatic Translation
1, 2,3,4, 2,3, 2,3, 2,3,5, 6, 7, 2, 2, 2, 2,3,6, 8, 2,3, 4, 2,6, *4, *2,4
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou
* These authors contributed equally

Summary

Tümör microenvironment eğitim klinik yanıt immünoterapi prognostik veya akýllý biyolojik tespit edebilir. Burada sunulan, bir yöntem situ Floresans spektral analiz ve CD8 otomatik olarak çeşitli altgrupları saymak için görüntüleme üzerinde dayanır+ T hücreleri. Bu tekrarlanabilir ve güvenilir teknik büyük kohort analizi için uygundur.

Abstract

Bağışıklık hücreleri tümör microenvironment önemli bileşenleridir ve karsinojenezis tüm aşamalarında tümör büyüme ve evrimi etkiler. Özellikle, bu şimdi de insan tümörler bağışıklık infiltrat prognoz ve tedaviye yanıt ile ilişkilendirmek kuruldu. Tümör microenvironment bağışıklık infiltrat analizini hastalar ve tedaviye yanıt sınıflandırılması için büyük bir sorun haline gelmiştir.

İnhibitör reseptörler Program hücre ölüm Protein 1 (PD1; olarak da bilinen CD279), sitotoksik T lenfosit ilişkili Protein 4 (CTLA-4), T-hücre immünglobulin ve müsin içeren Protein-3 (Tim-3; olarak da bilinen CD366) ve lenfosit gibi ortak ifade Harekete geçirmek gen 3 (Lag-3; CD223 olarak da bilinir), T hücre tükenme damgasını olduğunu. Tanımlamak ve hücresel düzeyde Bu inhibitör reseptörler ortak ifade ölçmek için boyama multiparametric in situ ayirt geliştirdik. Renal hücreli karsinom (RCC) dondurulmuş dokusunun retrospektif bir dizi üzerinde bir floresan spektral görüntüleme teknolojisi kullanarak bir görüntü analiz yazılımı ile birleştiğinde, CD8 infiltre tümörle PD-1 ve Tim-3 Co o ifade bulundu+ T hücreleri RCC içinde kötü prognoz ile ilişkilidir. Bu çok katmanlı içinde in situ teknoloji otomatik gösteren ilk çalışma bazı klinik önemi olabilir bizim bilgi için bu temsil eder.

Introduction

Son birkaç yıl içinde immünoterapi kanserlerinin RCC dahil olmak üzere, birçok türleri için çok umut verici bir tedavi olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, inhibitör denetim noktaları inhibisyonu dayalı immünoterapi gibi PD-1 ve klinik olarak etkili1,2,3,4,5, olmak CTLA-4 bildirilmiştir 6. monoklonal antikorlar karşı CTLA-4, PD-1 veya Program ölüm Ligand 1 (PD-L1) zaten çeşitli kanserler içinde onaylanır ve hastalar%720'den fazla uzun süreli klinik yanıt yol açar. Sonuçta, tüm hastalar cevaplama, tedavi maliyeti yüksektir, ve bu tedaviler potansiyel ciddi otoimmün gibi yan etkileri için önde gelen zehirli. Bu nedenle, geçerli meydan bu yeni immunotherapies için akıllı işaretleri belirlemektir. Tümör, PD-L1 ifade veya intratumoral CD8+ T hücre infiltrasyonu ve düzeyde mutasyonların oranı ile klinik yanıt ilişkilendirmek için bildirilmiştir. Ancak, bu ilişki hala bu klinik biyolojik PD-L1 arkadaşı sınava daha önce küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hastaların8 Pembrolizumab yönetiminde dışında klinik pratikte kullanılmasını tavsiye için çok zayıftır ,9,1011,12. PD-1, Tim-3, Lag-3 gibi birçok inhibitör reseptörlerinin ortak ifade ve CTLA-4, indükler bir hücre tükenme fenotip ve terapi13,14,15direnç kanıtlanmıştır. Periferik kan tümör microenvironment temsilcisi olmadığına göre bu hücreleri içinde in situfenotipik özellikleri analiz etmek için yüksek ilgi var. PD-1 ve Tim-3 ortak ifade T hücreleri çeşitli bağlamlarda13,16,17işlevsel olarak Engelli hücrelerde olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada, iki inhibitör reseptörler PD-1 ortak ifade ve Tim-3 CD8 prognostik etkisini+ T hücreleri değerlendirildi.

Akış Sitometresi Analizi, taze tümörler ve bu nedenle engelleyen retrospektif analizleri üzerinde çalışmak gerekli olduğunun tarafından ortak ifade birden çok işaretçilerinin tümör infiltre lenfositler (TILs) üzerinde çalışmaya kadar şimdiye kadar esas olarak yapıldı. Geleneksel in situ boyama, tek teker teker boyama gerçekleştirilebilir ve işbirliği işaretleyiciler ifade hücre tipi karakterizasyonu mümkün değildir. Örneğin, PD-L1 PD-L1 ifade hangi hücrelerin Bağdaşık çalışmalar için daha uygun olan geleneksel immünhistokimya analizi tarafından tanımlamak üzere birçok hücre türleri tumoral microenvironment tarafından ifade edilir. Bu çalışmada, geliştirdiğimiz bir yenilikçi in situ multiparametric ayirt yöntemi bilgisayar-PD-1 ve Tim-3 ortak ifade CD8 infiltre tümör tarafından ilişkilendirmek için sayma ile+ T-hücreleri RCC klinik sonuçlar ile. Bu teknik bir tek hücre düzeyi ve birden çok işaretçileri sınırlı aralıklarla yakalayabilir bir spektral kamera ile aynı anda analiz imkanı da dahil olmak üzere çeşitli yararları vardır > 10 nm sıvı kristal ile filtreler18. Ayrıca, bu işlem bir arası operatör tekrarlanabilirlik ve el teknikleri19' a göre kısaltılmış bir analiz sağlayan otomatik demek. Kanser alanında çeşitli çalışmalarda Merkel hücreli karsinom, akciğer kanseri ve baş ve boyun kanseri20,21,22, gibi PD-1, PD-L1 ve CD8 bağışıklık moleküllerin birden çok stainings inandırıcı bildirdi 23. otomatik hücre sayısı (fenotipleme adım) kullanıcı tarafından eğitim ile mümkündür. Floresans farklı hücre bölmeleri (nükleuslar, sitoplazma ve membran) ölçülür.

Burada, tümör infiltre-CD8, farklı alt kümelerini+ T hücreleri ifade PD-1 ve/veya Tim-3 RCC büyük bir kohort sayılır ve sonuçları klinik ağırlık puanları ve hayatta kalma parametreleri ile ilişkili. Membran floresan yoğunluğu gibi demek floresan yoğunluğu (MFI) verilerde sitometresi ile hücresel çözünürlükte analiz etmek mümkündü. Bildiğimiz gibi bu bu spektral görüntüleme tabanlı count tekniğin ilk çalışma raporlama prognostik sonuçları kullanarak temsil eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmada Helsinki Bildirgesi uygun olarak yapılmıştır ve yerel Etik Komitesi tarafından (CPP Ile de France nr. 2012-05 / 04) kabul edildi. Aydınlatılmış onam olan kohort dahil katılımcıdan elde edildi.

1. doku malzeme

  1. RCC doku örnekleri ameliyat günü toplamak. Oda sıcaklığında (patoloji Bölümü) cerrahi numune baş.
  2. Yaklaşık 0.5 cm x 0.5 cm x 0.5 cm boyut kuru bir tüp tümör örnek toplamak. Ek sıvı azot donma ve-80 ° C'de depolayın
  3. En iyi kesim ısı bileşik örneklerinde kat. Örnekleri-20 ° C'de cryostat ile 4-6 µm kalınlığında bölümlere bölüm. 12 h için slaytlar üzerindeki kurutma ve doğrudan kuruma önlemek için-80 ° C'de saklamak örnekleri ver.
  4. Örnek kalitesini Hematoksilen ve Eozin bölüm lekeli görüntüleyerek denetleyin.

2. Situ ayirt TILs boyama

  1. Usul kuralları
    1. Oda sıcaklığında tüm deneysel adımları gerçekleştirin.
    2. Tüm adımlar için Tris tampon tuzlu (TBS; bkz: Malzemeler tablo) ile dilutions gerçekleştirin.
    3. Yıkama TBS içinde sonra birincil antikor kuluçka için tüm adımları gerçekleştirin. İkincisi, Tris tampon tuzlu Tween20 kullanın (TBST, Tablo malzemelerigörmek). Arabellek oluşturma ve sulandırma için ek tablo 1bakın.
    4. Nem odası antikor incubations ve yıkama boyama bir kavanoz için kullanın.
    5. Bölüm işlem sırasında kurumasına izin vermeyin.
  2. Önarıtma
    1. Doku örneği içeren slayt çözülme ve dikkatle slayt örnek bir kağıt havlu ile çevresinde kuru. Doku hidrofobik bariyer kalemle içeren tepki alan sınırlandırmak ( Tablo malzemelerigörmek). Kuru 2 dk için.
    2. Örnekleri % 100 aseton 5 min, 2 dk için kuru için fix ve 10 dakikadır TBS ile yıkayın.
  3. Doygunluk ve abluka
    1. Avidin %0,1 10 min 3 damla ile slaytlarını pretreat, musluk ve/veya fiske avidin dağıtmak ve hava kabarcıkları kaldırıp için biotin %0.01 10 min 3 damla ile tedavi etmek için slayt (bkz. Tablo reçetesi) dokunun ve/veya hafifçe vur. TBS ile yıkayın
    2. Fc reseptörü abluka gerçekleştirin. 100 µL % 5 birim/birim normal serum etiketli ikincil veya üçüncül antikor olarak aynı ana bilgisayar türlerden TBS. kullanım Serumda seyreltilmiş uygulayın (bkz. Tablo reçetesi); Burada, eşek serum kullanıldı. 30 dk için kuluçkaya.
    3. Kuluçka sırasında kısaca anti-CD8, PD-1 ve Tim-3 antikorlar (Tablo reçetesi) spin. TBS birincil antikor karışımı ek tablo 2' de açıklandığı şekilde hazırlayın.
  4. IMMUNO-boyama için CD8, PD-1 ve Tim-3
    1. Birincil antikor karışımı hazırlayın. Malzemeler tablo ve ek tablo 2 kullanılan antikor için başvurun (anti-CD8, PD-1, Tim-3 ve onların karşılık gelen ikincil antikorlar) ve onların konsantrasyonları.
    2. Dokunun ve/veya (2.3.2 basamaktaki) kalan eşek serum hafifçe vur. 100 µL 1s oksijen odasında için olmayan etiketli birincil antikorlar karışımı ile slaytlar kuluçkaya.
    3. Kuluçka sırasında kısaca siyanür 5 Anti-tavşan, AF488-anti-keçi ve biotinylated Anti-fare antikorlar spin ve ek tablo 2' de açıklandığı gibi ikincil antikorlar karışımı hazırlar.
    4. 5 dk. kuru TBST içindeki slaytları slaytlar yıkayın.
    5. 30 dk içinde oksijen odası için ikincil antikorların 100 µL slaytlarla kuluçkaya.
    6. Tersiyer antikor içeren Cy3-streptavidin ek tablo 2' de açıklandığı gibi karışımı hazırlayın.
    7. TBS slaytları 10 dk. kuru için slaytları yıkayın.
    8. 30 dk için Tersiyer antikor karışımı 100 µL slaytlarla kuluçkaya.
    9. TBS slaytları 10 dk. kuru için slaytları yıkayın.
  5. Hücre montaj
    1. Slaytları 4' mount, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride DAPI-içeren orta (1,5 µg/mL DAPI) ile bir coverslip floresan mikroskopi için uyumlu montaj ( Tablo malzemelerigörmek).
      Not: her deneme için bir negatif kontrol, karşılık gelen antikorlar olarak aynı konsantrasyonu izotip eşlemeli antikorlar ile bir slayt kullanıldı. Bu boyama için fare Igg1, tavşan IgG ve keçi IgG negatif kontrol antikorlar ( Tablo malzemelerigörmek) kullanılır. Pozitif kontrol, biz her deneme için test edilmiş işaretçileri için pozitif olarak bilinen insan hyperplasic bademcik kullanılır. Tipik bir boyama sonuçları (şekil 1) açıklanmıştır. Mono-CD8 boyama, PD-1 ve Tim-3 ayrı ayrı yapılmalıdır (bir slayt boyama) aynı ön arıtma ve DAPI olmadan. Bir slayt aynı deneysel koşullarda herhangi bir antikor ve sadece DAPI montaj orta da yapılmalıdır. Bir slayt aynı deneysel koşullar herhangi bir antikor ve DAPI olmadan kullanarak yansıma.

3. Floresans analizi ve otomatik hücre sayısı

  1. Resim alma otomatik mikroskop ile
    1. Bir iletişim kuralı oluşturun.
      1. Otomatik mikroskop bilgisayar yazılımı ve floresan ışığı açın.
      2. Menü çubuğunda tıklayın "dosya"protokolü, oluşturmak"," seçin "DAPI," "FITC" ve "TRITC."
      3. "İleri", "Doku bölümünde," düğmesini tıklatın ve ","İletişim kuralı adı"Next" A adı, örneğin, "CD8-PD-1-Tim-3," tıkırtı "İleri" ve "Kaydet" seçin
      4. El ile bir slayt sahne alanı üzerine yerleştirin.
      5. Menü çubuğunda tıklayın "Kur"ayarları."" "Ev Z" yeni pencerede'u tıklatın.
      6. Çekim hızı ayarlamak olumlu bir denetimle Yani bir CD8 slayt, PD-1 ve Tim-3 Kişilik lekeli DAPI örnek ile.
      7. Denetimde çubuğunu tıklatın "pozlama ayarlayın."
      8. Yeterli ama değil doyurarak sinyal elde edene kadar her filtre için çekim hızı ayarlayın.
      9. Tek renkli görüntüleme için aşağıdakileri gerçekleştirin:
      10. Satın alma ve 'altında otofokus' DAPI filtre seçin.
      11. "Tarama alanı sınırı içinde", objektif üst slaytın sol üst köşesinde hareket. "Mark"'ı tıklatın. Sağ alt köşede için aynı şeyi.
        Not: Bu adımı düşük güç (LP görüntüleme) 4 X görüntüleme alanının delimitates; dikkat edin de bu yüzden serisi tüm örnekleri çevreleyen olarak işaretleyin.
      12. Imaging yüksek güç (HP), aşağıdakileri gerçekleştirin:
      13. 'Altında otofokus', "DAPI" seçin.
      14. 'Satın alma' grup altında "DAPI", "FITC", "Cy3" ve "Cy5" seçin. "Tamam" düğmesini tıklatın. Menü çubuğunda "iletişim kuralı" tıklayın "Dosya", tıkırtı.
    2. Slaytları tarama.
      1. Protokol "dosya" "load Protokolü menü çubuğundan", tıklatarak yükleyin. "Başlat".
      2. 'Laboratuvar ID' (fotoğraf saklamak için klasör konumunu) girin. Slayt Slayt tanımlamak için kimlik girin. "İleri" yi tıklatın.
      3. "(Parlak alan ışığı altında tüm slayt tarama ve bir 4 x hedefi kullanarak sıralı görüntüleri elde etmek için) tek renkli görüntüleme"'ı tıklatın.
        Not: Bu slayt gri tonlamalı bakış üretir.
      4. "Numune bul" seçeneğini tıklatın. Doku düşük çözünürlükte (4 x) Taranacak alanı seçin: 'Ctrl' tuşunu basılı tutun ve seçmek veya alanları (şekil 2A) seçimini kaldırmak için imleci kullanarak bir alan'ı tıklatın.
      5. "LP Imaging" (4 x görüntüleme) her alan için floresan kırmızı mavi yeşil resim alma tıklatın.
      6. HP alan seçimi için 'Ctrl' tuşunu basılı tutun ve seçmek veya yüksek çözünürlükte (20 x) taranır dokuların alanına karşılık gelen alanların seçimini kaldırmak için imleci kullanarak bir alanı tıklatın. 5 alanları (şekil 2B) seçin.
      7. "HP Imaging" (20 x görüntüleme) her alan (şekil 2C) spektral görüntü alımı için'ı tıklatın.
      8. "Veri Lebid'in başlangıçta sırasında seçilen klasördeki görüntüleri depolamak için depolama"'ni tıklatın.
        Not: İşlemi özetlenen ve Şekil 2' de gösterilmiştir. (Doku algılama, alan seçimi) her adım için bir algoritma artar ve bütün otomatik tarama işlemi kullanıcı tarafından eğitilmiş.
  2. Floresan görüntü analizi ve otomatik hücre eşleşmiş analiz yazılımı ile sayma
    1. Spektral kütüphane oluşturmak.
      1. Görüntü analiz yazılımı açın.
      2. Sol panelde, "kütüphaneler derlenir" açın. 'Yük resmi', altında "Gözat" ı tıklatın ve mono-lekeli bir resim (örneğin, CD8/siyanür 5) seçin.
      3. Fluorophore, (örneğin, siyanür 5) seçin. "Ayıkla"'yı tıklatın. "Kaydet" i tıklayın kütüphanede sakla. "Kaydet" i tıklayın.
      4. PD-1 için aynı işlemi tekrarlayın Tim-3 ve her fluorophore ilgi spektrum entegrasyon için DAPI mono lekeli slaytlar.
        Not: spektral Kütüphane Binası spektrum belirli doku (burada, böbrek) için kullanılan her fluorophore için entegre, ama zaten mevcut "sentetik" kütüphaneleri kullanılabilir. Autofluorescence spektrum kesinlikle göre doku olduğu için bir otomatik Floresans ve spektral Kütüphane her proje gerçekleştirmek önemlidir.
    2. Yeni bir proje oluşturun.
      1. Menü çubuğundan "Dosya", "Yeni projesi"'ı tıklatın. 'Bul özelliğini' sekmesinde "hücre segmentasyon" seçin. "Fenotipleme" 'Fenotipleme' sekmesini seçin. "Oluştur" u tıklayın.
      2. Proje temsilcisi Albümdeki entegre.
        1. 'Dosya' sekmesinde, "açık" resme. 10-30 dizi temsilcisi görüntülerini seçin. Autofluorescence kaldırmak için sigara lekeli slayt ekleyin. Sağ panosunda: select kitaplığı kaynak. Fluorophore seçin ve bu daha önce inşa spektral kitaplığına karşılık gelen seçin.
      3. Doku autofluorescence kaldırmak için "AF" düğmesini ve sonra autofluorescence boş slaytta alanı seçin.
      4. Görüntü tedavi ve kompozit görüntü üretimi.
        1. "Floresan Kütüphane ve kompozit görüntü (şekil 3) oluşturmak için autofluorescence spectra entegre hazırlayın bütün"'ı tıklatın. 'Görünüm Düzenleyicisi' paneli açmak ve görüntülenen verileri seçmek için 'göz' simgesini tıklatın: CD8 işaretleyicileri seçin, PD-1, Tim-3 ve DAPI. Autofluorescence kaldırın. Yazılım tarafından sunulan adımları izleyin.
      5. Hücreleri kesiminde.
        1. Hücrelerde 'Yuvası', segment için "Çekirdek" ve "Zar" seçin. "Çekirdek" sekmesinde, DAPI nükleer counterstain ayarlayın.
        2. 'En büyük ve en küçük boyutu (piksel)' sekmesinde "40" ve "176" minimum ve maksimum boyutları anılan sıraya göre girin. 'En az' sinyal için "0,13" ayarlayın. "Bölünmüş" sekmesinde, "2,60" ayarlayın. "Çekirdek" sekmesinde, "0,81" ayarlayın. "Segmentasyon yardım için membran sinyal kullan" ı seçin.
        3. "Hücreleri ekranın alt kısmında Segment"'ı tıklatın. Çekirdeklerin ayrılmasını ve hücrelerinin denetleyin ve hücrelerin DAPI ve membran Floresans eşleşmezse farklı parametrelerle yeniden deneyin.
          Not: Yazılım ile boyama ve hücre boyutuna göre nükleer DAPI hücreleri tanır. Projeye göre hücre parametreleri (boyut, split, piksel) ayarlayın.
      6. Fenotip hücreleri.
        1. 'Fenotip' sekmesinde "Ekle" seçeneğini tıklatın. Hücre fenotip kategoriler oluşturabilirsiniz: CD8 (mavi nokta) / CD8-PD-1 (kırmızı nokta) / CD8-PD-1-Tim-3 (yeşil nokta) / diğer (siyah nokta) (şekil 4).
        2. Hücreleri her kategorinin 5'ten fazla örnekleri seçin. "Sınıflandırıcısı tren"'ı tıklatın.
          Not: Bu yazılım tarafından istatistiksel sınıflandırma algoritması oluşturur.
        3. "Her hücrenin fenotip elde etmek için fenotip tüm"'ı tıklatın.
          Not: Yazılımın doğruluk güven aralığı (CI) ile bir hücre fenotip verir.
        4. Göz ve otomatik sayı arasındaki fark uyumlu olana yazılım eğitim algoritma geliştirmek (hata < %5). Faiz hücreler için kabul edilebilir bir CI seçin.
          Not: %55 CI kabul edilebilir olarak temelinde eğitim yapmayı tercih etti.
      7. Algoritma ve proje kaydedin.
      8. 'Altında File' "Proje" seçin. Adını koy ve "Kaydet" i tıklayın.
    3. Serisinin toplu iş çözümlemesi gerçekleştirin.
      1. "Analiz toplu" seçin. Projeyi seçin. Analiz için görüntüleri ekleme. Depolama veriler için bir klasör seçin. "Çalıştır" ı tıklatın. Bileşik görüntü kalitesini kontrol edin. Fenotipleme serisi tüm görüntüler için doğrulayın.
        Not: Tüm hücre bölmeleri (membran/sitoplazma/çekirdek) sinyalleri birleştiğinde görüntü analiz yazılımı entegre. Algoritma eğitim-ebilmek var olmak zaman alıcı bir adım de olsa fenotipleme çok önemli adımdır. Her görüntünün tüm verileri bir .txt dosya mısınız. Bir hücre (özellikle onun CI ile verilen onun fenotip) tüm verileri tek bir satır vardır. Her slayt için resim alma ve sonraki sayıları 5 alanların yapıldı.
  3. Ham veri ve otomatik hücre sayısı nesil entegrasyon
    1. Bir istatistik programı ile verileri hesaplamak.
      1. 1 hasta için analiz 5 alanlara karşılık gelen 5 resim tüm verileri hesaplamak için. İstatistiksel bir platformu kullanmak ve deneyimli istatistikçi, veri yöneticisi veya veri bilim adamı Çözümlemeyi gerçekleştirmek. Otomatik olarak bağlı olarak onların fenotip, CI > %55 seçerek hücreleri sayar bir komut dosyası oluşturmak.
      2. Serinin tüm .txt dosyalarını aynı klasöre koyun.
    2. Veri ayıklamak.
      1. Tüm .txt dosyalarını bir klasöre koyun. Adımda 3.3.1 otomatik komut dosyasını çalıştırın. R komut dosyası tarafından oluşturulan çıktı .csv dosyası açın. .XL formatında kaydedebilirsiniz. Çıkış hücreleri her fenotip (Yani, CD8 yalnız, CD8-PD-1, CD8-PD-1-Tim-3) için her bir hasta için toplar.
      2. Her alanı için her hasta için hücrelerin ortalama sayısını hesaplayın: alanların sayısı her alanı için her hasta için hücre sayısı normale (Yani, 5) başına hücre sayısına bölün.
      3. PD-1+ hücreler arasında toplam CD8 yüzdesini hesaplamak+ T hücreleri ve PD-1+ Tim-3+ hücreler arasında toplam CD8+ T hücreleri. Şekil 5 bu adımı Özeti için bkz.
        Not: R dil (veya diğer programlama yazılım) doğru bir şekilde oluşturma ve komutları çalıştırmak için gerekli değildir ve bu yüzden bir deneyimli kullanıcı veya istatistikçi/veri bilim adamı esastır. R programı aynı hastanın verileri hesaplayabilir ancak bir hastanın 5 .txt dosya adı benzersiz bir hasta tanıtıcısını ilgili özdeş bir başlangıç olmalıdır.
  4. İstatistiksel analiz
    1. İstatistiksel yazılım sonuçları istatistiksel analizi için kullanın.
    2. Bir istatistikçi yardımı ile uygun istatistiksel analizleri gerçekleştirmek.
      1. İmzalı kullanma non-parametrik Wilcoxon'ın rütbe testleri, PD-1 MFI karşılaştırma arasında iki hücre fenotipleri (şekil 6). Covariate ve histolojik özellikleri bir Pearson ki-kare testi ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir.
      2. Kaplan-Meier yöntemi ilerleme ücretsiz hayatta kalma ve Cox regresyon modelleri genel sağkalım ve hastalıksız sağkalım gibi zaman olay sonuçlar üzerine covariate etkilerini tahmin etmek için tahmin etmek için kullanın.
      3. Pdüşünün-değerleri daha düşük daha önemli olarak 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yukarıda açıklanan genel iletişim kuralını kullanarak, intratumoral CD8 ölçmek amaçlanmıştır+ T hücreleri hastaların RCC ile sonuçları klinik sonuçlar25ile ilişkilendirmek için dondurulmuş dokularda inhibitör reseptörler PD-1 ve Tim-3 ortak ifade.

CD8/PD-1/Tim-3 boyama en iyileştirme:

Antikorlar (fare, tavşan ve keçi, Bilgileri tablobakınız) farklı türler farklı antikorlar arasında çapraz reaksiyon önlemek için seçilmiştir. Protokol bir organize lenfoid doku bir bademcik üzerinde doğrulandı. PD-1 boyama bulunamadı germinal merkezleri (şekil 1), oysa CD8 ve Tim-3 germinal merkezleri çevreleyen boyama mevcuttur. Bu tipik boyama gözlem bu protokolü doğrulandı. Boyama da faiz (böbrek) doku üzerinde doğrulandı.

Onların sigara karşılık gelen ikincil antikor ile (veri gösterilmez) inkübe birincil antikor sinyalinin yokluğunda teyit edildi. Floresans boyama doğru bir şekilde analiz etmek ve belirli spektral kitaplıkları yapmak için tek tek slaytları tek başına her marker ile lekeli (CD8, PD-1, Tim-3 veya DAPI) faiz (böbrek) doku. Bir sigara lekeli slayt aynı koşullarda dokusunun autofluorescence ulaşmak gereklidir. Boyama farklı fluorophores spektrumu entegre otomatik mikroskop tarafından analiz edildi; Her işareti iyi farklılaşmış ve işaretleri örtüşmez (şekil 3) gözlenmiştir.

CD8 nicel ve nitel özellikleri + 87 RCC hastalarda sızmak:

Sonuçlar göstermiştir ki approximatively CD8 yarısı+ T hücreleri hızlı PD-1 (ortalama %53.9; SE: %30.49) ve hakkında tam bir bölü üç kişilik olumlu PD-1+ Tim-3+ (ortalama %38.16; SE: %28.11). Tim-3 ifadesi olmadan PD-1 ifade CD8 az % 3 tespit edildi (veri gösterilmez)+ T hücreleri. CD8 ortalama sayıda+ T hücre altgrupları edildi: Toplam CD8+ T hücreleri 116.5 (SE: 216), PD-1+ CD8+T hücreleri 89.32 (SE: 191.8), PD-1+ Tim-3+ 66.9 (SE: 143) ve PD-1+ Tim-3- CD8 + T hücre 22.38 (SE: 57.5) her alanı için. İntratumoral CD8+ T toplam sayısı hücreleri olumlu PD-1+ Tim-3+ CD8 üzerinde yüzdesi ile ilişkili+ T hücreleri.

CD8 fonksiyonel karakterizasyonu + T hücreleri fenotip PD-1 ve Tim-3 bağlı olarak:

PD-1 ifade düzey ilişkili olduğu bilinen bir sonraki PD-1 ifade CD8 üzerinde ölçmek amaçlanmıştır böylece T hücre yorgunluk ile Tim-3 ifade durumuna göre+ T hücreleri. Farklı fluorochromes ortalama Floresans yoğunluğunu hücresel düzeyde raporlandıkça, hastaların küçük bir dizi el ile analiz için hücresel veri: sonuçlar PD-1 membran MFI hücre alt türü ile bir korelasyon gösterdi. PD-1 floresan yoğunluğu oldu ölçülen (şekil 6) hücresel düzeyde PD-1+ Tim-3+ PD-1+ Tim-3- CD8 karşı+ T hücreler (bir panel) ve bunlar çeşitli entegre sonra bireysel hasta düzeyinde hücre sinyalleri bir doku bölümünde. 9 hasta bir dizi, bir karşılaştırma Wilcoxon eşli testi ile Tim-3, Tim-3 ifadesi (B paneli) fonksiyonel alaka takviye ortak ifade edilir zaman PD-1 MFI daha yüksek olduğunu fark ettik.

PD-1 ve Tim-3 ligandlar birden çok ortak boyama gelen tümör hücrelerinin yüzeyde ifade:

T hücre tükenme Reseptör/ligand etkileşim yoluyla aracılık ettiği gibi PD-1 ve Tim-3 ligandlar ifade değerlendirilir (PD-L1 ve Galectin-9 (Gal-9), sırasıyla) pan-Keratin boyama tarafından tanımlanan böbrek tümör hücreleri üzerinde. Pozitifliği işaretçiyi ifade tümör hücrelerinin % 10 bir cut-off tanımlanır: (i) 58 87 hastadan (% 66) dışında olumlu PD-L1 için; (ii) analiz tüm 15 Tümörleri (şekil 7A, B) Gal-9 için olumlu idi.

Tim-3 ortak ifade klinik etki + PD-1 + CD8 üzerinde + T hücreleri:

Tümör düğümü metastaz (TNM) puanlama, Fuhrman'a sınıf, tümör boyutu ve UISS puanı histolojik özellikleri (UISS için klinik skoru ile birlikte) birincil RCC prognoz değerini tanımlamak için kullanılan vardır. Numarası ve/veya tümör infiltre CD8 yüzdesi arasında pozitif bir korelasyon gözlendi+ T hücreleri PD-1 ve Tim-3 ifade (ama sadece PD-1 Tim-3 olmadan ifade değil) tüm bu parametreleri (Tablo 1). Bu daha aşağılayıcı fenotip, CD8 hastalarda RCC doğrultusunda+ T hücreleri ortak ifade PD-1 ve Tim-3 yukarıda ortalama yüzde (34,7) nüks olasılığı (p 0.046; = İK 2,9; % 95 CI: 1.02-8.21). Bu korelasyon PD-1 CD8 oranı olan gözlendi değil+ T hücreleri bağımsız olarak Tim-3 durumu (Tablo 2). Bir korelasyon da CD8 yüzdesi arasında gösterilmiştir+ T hücreleri ortak ifade PD-1 ve Tim-3 ve 36 aylık genel sağkalım oranı (veri gösterilmez). Ayrıca bademcik parafin dokuları (şekil 1) üzerinde Çift Kişilik immunostaining doğrulanmış.

Figure 1
Şekil 1: parafin gömülü bir bademcik dokusu üzerinde CD8-PD-1-Tim-3 immunostaining. Alkol katıştırılmış doku bölümleri cryopreserved bölümleri yerine Çift Kişilik immunostaining için seçildi. Mum eritme ve rehydration sonra daha önce cryopreserved bölümleri için gelişmiş boyama aynı protokolü uygulandı. CD8+ T hücreleri germinal Merkez dışında yer alan ve+ CD8-T hücreleri PD-1 ifade germinal merkezde kümelenmiş. Mikroskop büyütme 20 x ve ölçek çubuğu 20 µm. temsil eder Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: renal hücreli karsinom doku örneklerin analiz otomatik. Doku tanıma parlak alan görüntü sonra (A, ölçek çubuğu 1 mm), 4 x mikroskop büyütme RGB (kırmızı mavi yeşil geleneksel floresan) düşük çözünürlükte görüntüleme (B, ölçek 500 µm bar. alanları seçmek için kullanılır Tam kırmızı kare bir alanı temsil eder. Bir yüksek çözünürlüklü görüntü (spektral küp floresan görüntü bu teknoloji için belirli) ile 20 x büyütme spektral mikroskop tarafından gerçekleştirilen, (C, ölçek bar 100 µm) gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: spektral mikroskobu ve yazılım renal hücreli karsinom (20 x mikroskop büyütme) bir kompozit görüntü üretimi için analiz birleştiğinde. Yüksek çözünürlüklü bir raw görüntü(a)spektral floresan filtre küpler tarafından taramadan sonra alan floresan bir görüntüsüdür. Mavi sinyal AF488, kırmızı siyanür 5 ve Cyanin3 yeşildir. Birleştirme işlemini farklı renkler Örneğin, üç fluorophores bir birleştirme sarı göstermesidir. Bu görüntü görüntü analiz yazılımı içinde kurulmuştur. Spektral Kütüphane Entegrasyon her fluorophore ve floresan bileşik görüntü (B) için önde gelen autofluorescence bir doğru spektrum ayırma verir. Temsilcisi renkleri operatör tarafından seçilmiş: mavi gösterir siyanür 5 (CD8), Red siyanür 3 (PD-1), yeşil AF488 (Tim-3). Mix renk mor gibi birleştirme CD8-PD-1 Çift Kişilik Pozitif için kullanılır. Ölçek çubuğu 20 µm. temsil eden Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: PD-1 ve Tim-3 ifadesi tümör infiltre CD8+ T hücreleri floresan spektral görüntüleme teknolojisi (20 x mikroskop büyütme) tarafından analiz bir Açik Hücre renal hücreli karsinom numune üzerinde. (A)CD8 (mavi), PD-1 (kırmızı) ve Tim-3 (yeşil) dondurulmuş doku bölümlerinde RCC hastalardan elde edilen lekeli. Colocalization bu üç işaretleri mono-boyama resimleri birleştirerek tespit edilebilir. Her denemede izotip denetimleri yapıldı. Ölçek çubuğu 20 µm. sarı temsil eden kutularını belirlemek eş lekeli hücreleri: Tim-3- PD-1+ CD8 hücre ve Tim-3+ PD-1+ CD8 hücre. (B) üçlü işbirliği CD8 için boyama, PD-1 ve Tim-3 (birleştirilmiş) kutusunu gösteren ile soldaki yeşil gösterilen CD8 olduğunu+ T hücreleri ortak ifade PD-1 ve/veya Tim-3. Otomatik görüntü analiz yazılımı ile sayım için hücreleri tanımlaması bir nükleer boyama (DAPI); varlığı dayanır hücre ayrılmasını da kırmızı sınırları (orta Masası) temsil xarakteristikaları özelliklerine dayanarak. Görsel sayısı olan uyumluluk (sağda) gerçekleştirilene kadar kullanıcı tarafından ve otomatik fenotipleme sonra eğitimli bir algoritma yeşil noktalar CD8 tanımlayan+ T hücreleri PD-1 ve Tim-3 ortak ifade etmek, kırmızı nokta CD8+ T hücreleri PD-1 olmadan ifade Tim-3 ve mavi noktalar olarak CD8+ T hücreleri değil ifade PD-1 veya Tim-3. Ölçek çubuğu 20 µm. sarı temsil eden kutusu gösterir PD-1 ve/veya Tim-3 CD8 ifade+ T hücreleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: ham veri spektral analiz bilgisayar. Her alan (Yani, 5 alanları/hasta, Yani, 5 .txt dosyaları) mevcut her hücre Kategori sayısının veri görüntü analizi sonra toplanır. Bir R komut dosyası yalnızca hücre bir güven aralığı > %55 phenotyped göz önünde bulundurarak 5 alanları verileri birleştirir. Mikroskop büyütme 20 x ve ölçek çubuğu 100 µm. temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: PD-1+ Tim-3+ CD8+ T hücreleri ifade PD-1+ Tim-3- CD8 PD-1'e göre daha yüksek düzeyde+ T hücreleri renal hücreli karsinom. PD-1 yoğunluğu içinde in situ ayirt göre analiz PD-1+ Tim-3+ ve PD-1+ Tim-3- CD8+ T hücresel düzeyde (sol panelde) algılandığında hücreleri. Bireysel düzeyde (orta Masası): sonuçları are göstermek için bütün CD8+ T hücre alt kümeleri PD-1+ Tim-3+ karşı PD-1+ Tim-3- mevcut bir doku bölümünde (örneğin, bir hasta; Mann Whitney testi). Ortalama PD-1 yoğunluk karşılaştırmalı analizi bir dizi 9 hasta (doğru kapı aynası) ölçülen (Wilcoxon testi, p-0,05 olarak anlamlı kabul edildi daha düşük değerler). Mikroskop büyütme 20 x ve ölçek çubuğu 10 µm. temsil eder Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: renal hücreli karsinom üzerinde boyama PD-L1 ve Gal-9 Yani PD-1 ve Tim-3 ligandlar. (A)tümör hücreleri pan-Keratin boyama tarafından tanımlanır. PD-L1 ve pan-keratin (bir panel) Co boyama PD-L1 tümör hücreleri üzerinde yapılan analiz 87 58 hastaları ifade tanımlar. (B) Galectin-9 tüm analiz RCC hastaların 15 tümörlerin ifade edildi. Hücreleri en az yüzde 10'u analiz için işaretleyici lekeli eğer pozitif olarak kabul edildi. İzotip denetimleri her boyama için dahil edildi. Sarı kutuları temsil pozitif tümör (pan-Keratin +) hücreler PD-L1 (Masası'nda) veya Galectin-9 (Masası B) için. Mikroskop büyütme 20 x ve ölçek çubuğu 20 µm. temsil eder Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

%/CD8+ T hücreleri PD-1+ PD1+ Tim-3+ PD-1+ Tim-3-
TNM 0,04 0,003 0,22
Furhman 0,01 0,004 0,74
Tümör boyutu 0,08 0,01 0,37
UISS 0,01 0,01 0,63

Tablo 1: Korelasyon PD-1 tek başına veya kombine CD8 üstünde Tim-3 ifadesi arasında+ T hücreleri ve RCC hastaların klinik prognostik Parametreler: p-değerleri. Yüzdesi PD-1+, PD-1+ Tim-3+ veya PD-1+ CD8 üzerinde Tim-3- + T in situ ayirt 87 hastadan kohort tarafından ölçülen bir sürekli değişken ilişkili olarak seçilen hücreleri bir ikili dosya (TNM, Fuhrman'a sınıf, UISS puanı) olarak tanımlanan çeşitli klinik parametrelerle veya sürekli değişken (tümör boyutu). TNM iki gruba bölündü: lokalize hastalık (pT1 ve pT2) ve gelişmiş Hastaligi (pT3, PT4'ü, N+veya M+). Fuhrman'a notu düşük tanımlanmış (grade ı veya II) ve yüksek (grade III veya IV) ve UISS puanı 3 sınıfa (0, 1 ve 2) bölündü. P-önemli bir bağıntı gösteren değerleri kalın olarak gösterilir.

CD8+ T hücre alt/CD8 PD-1+ Tim-3+ PD-1+ Tim-3-
Medyan (%) 34,7 8.6
PFS ile korelasyon P 0.046 = P = 0,8

Tablo 2: PD-1 ve CD8 Tim-3 ortak ifade arasında korelasyon+ T hücreleri ve ilerleme Alerjik Yaşam. İki grup RCC hastaların (n = 87) PD-1 Tim-3 (sağda) olmadan yüzdesi bağlı olarak, PD-1 ve Tim-3 (Medyan için göreli sol) bireyselleştirilmiş. PFS ile ilişki kesme seçilen medyan ile yapılmıştır. P-önemli bir bağıntı gösteren değerleri kalın olarak gösterilir.

Ek tablo 1: arabellek bileşimi TBS ve TBST. TBS antikor karışımları ve dilutions için kullanılır. Yıkama için tüm adımları nerede TBST önerilir birincil antikorlar, takip yıkama dışında TBS ile gerçekleştirilir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek tablo 2: detaylı antikorlar mix ayirt CD8-PD-1-Tim-3 boyama için kompozisyon. Her birincil, ikincil ve üçüncül antikor karışımları için ilgili birimin TBS gerçekleştirmek için seyreltme toplam hacmi 1 mL için verilir. Bir slayt için 100 µL doku alanı 2 cm2için gerekli toplam reaksiyon birimdir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Değişiklikler ve sorun giderme:

Doku kalitesi önemli bir parametre. kolayca Hematoksilen ve Eozin renklendirme tarafından denetlenebilir.

Çoğaltılmış stainings imkanı teknik bir avantajı vardır, ancak fluorophore yayılma önlemek için emisyon boyları 10 nm asgari delta ile seçmek için öneririz. Çünkü biz 4 stainings DAPI dahil olmak üzere, burada, dalga boylarında yayılan seçtiniz (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, siyanür 3:570 nm, siyanür 5:670 nm). Çeşitli fluorophores gelen sinyalleri örtüşen riskini bir otomatik görüntü analizi ile kombine bir karışık emisyon sinyalinden gelen bir fluorophore saf spektrum hesaplamak için yazılım kullanarak önlenmiş olur. Mono-lekeli slaytlar da fluorophores ve hareket arasında örtüşme yokluğu spektral Kütüphane sayesinde bir tazminat olarak onaylayın.

Bazen pozitif bir hücredeki bir işaretçi için boyama/floresan zayıf olup olmadığını belirlemek zor olabilir. Her denemede dahil negatif kontrol pozitif bir eşiği belirlemek için iyi bir yoldur.

Görüntüleri olarak çözümlemeye eşleşmiş yazılım pozitif hücre belirlenmesi için skor bir adım var, ancak bu sadece aynı anda iki işaretleri analiz edebilirsiniz. Üçlü aynı cepten boyama olabileceğinden (CD8, PD-1 ve Tim-3), fenotipleme adım seçtik.

Fenotipleme adım özellikle boyama ve arka plan türü bir örnek değişkeninden diğerine ise zahmetli olabilir.

Teknik sınırlamaları:

Co-stainings sayısı için geleneksel floresan göre bir avantaj olsa bile, çok renkli olduğu gibi Akış Sitometresi analiz etmek mümkün değildir. Zaman özellikle birden çok işaretleri colocalization eğitimi, düşük duyarlılık confocal mikroskobu ile karşılaştırıldığında için unutmayın (20 x mikroskop büyütme, yaklaşık 0,5 µm için piksel başına 0,1 µm karşı confocal, marka bağlı olarak) ve kontrol fluorophore yayılma için (aşağıdaki kritik adımları içinde iletişim kuralı için bakınız).

Tekniğin büyük bir sınırlama ham veri biçimidir. Ham veri kullanmak için zor olabilir .txt dosyalarıdır. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı için fenotip CI görüntüsüyle başına bir .txt dosyası verir gibi büyük bir dizi hasta başına 5 dosyaların her birini el ile tedavisinde çok zahmetli. Biyoinformatik uzmanı bir istatistiksel yazılım tüm verileri hesaplamak için gereklidir.

Önemi ile ilgili mevcut yöntemler:

Çoğaltılmış boyama analiz kolayca mümkündür. Taze örnekleri analiz eder, Akış Sitometresi için karşılaştırıldığında bu teknik bir hızlı sayım farklı hücre alt kümeleri içinde Donmuş numuneler ile bir otomatik işlemi26 büyük tabur tümör microenvironment mevcut tekrarlanabilir bir yöntem sağlar ,27. Otomatik olarak CD8 infiltre güvenebileceği+ T hücreleri ifade PD-1 ve ortak ifade Tim-3 veya RCC ortamda değil. Otomatik Sayı göz yorgunluğu ve tekrarlanabilir sigara sayısı gibi çeşitli önyargıları önler ve zaman alıcı değil.

Okudu büyük kohort donmuş örneğe bağlı olduğu gibi mutlak sayı veya yüzde olarak CD8 bağlantı olabilir retrospektif veri yoktu,+ T hücre alt biyolojik parametreleri ve klinik sonuç kümeleri. Başka bir28bir hastadan infiltrasyon bağışıklık önemli bir heterojen olduğundan, bu raporları yalnızca MFI ve yüzde ancak infiltrasyon sınıfa olmaz fluorocytometry göre bir avantaj temsil eder.

Floresan yoğunluğu kantitatif her hücre için bildirilir ve farklı hücre bölmeleri (membran/sitoplazma/çekirdek), PD-1 MFI tarafından membran boyama düzeyini değerlendirmek olabilir. Bu Akış Sitometresi için benzer başka bir ilginç bir araç temsil eder. PD-1+ CD8 bulduk+ T hücreleri Tim-3 ifade PD-1'in yüksek ifade vardı ve kötü prognoz (ilerleme ücretsiz sağkalıma etkisi) ile ilişkili bulunmuştur. Bilgimizi, belirli hücre alt klinik önemi gösterir bu yöntemi kullanarak ilk çalışmadır.

Gelecekteki uygulamalar:

Büyük bir uygulama alanıdır. Biz de başka bir belirli hücre alt akciğer kanser tümörü'nın microenvironment içinde vurgulanan: denilen TRM doku sakin bellek T hücreleri (CD103+ CD49a+), ve bir daha iyi genel sağkalım21ile,29 correlated ,30. Başka bir çalışmada, bu tekniği kullanarak bizim takım PD-L1 overexpressed tümör hücreleri üzerinde yapılan alt türü bir Anaplastik lenfoma kinaz (ALK) düzenlenmesi ile akciğer kanseri olan ve bu ifade CD8 ile korelasyon bulundu+ T10sızmak. Bu teknik kritik biyolojik parametrelerin çeşitli bağlamlarda değerlendirilmesi için uygundur ve biyomarker keşif için değerli bir araç temsil edebilir. Xy koordinatları verilen beri ve topografya çalışma ve hücre/etkileşimleri kolaylığı31' le ilk araçlardan biridir.

Protokol içindeki kritik adımlar:

Önemli adımlardan birini ortak boyama, en iyi duruma getirme hangi zaman alıcı olabilir olduğunu. İyi bir antikor seçimi çok önemlidir, örneğin birden çok klonlar Tim-3 için mevcut durumda sınanmıştır. Ayrıca, çeşitli kombinasyonları denemek önemlidir bu yüzden aynı işaretçi için farklı fluorophores farklı sonuçlar verebilir. Boyama özgüllük ile birlikte tepki antikorlar incelenmesi tavsiye edilir. Aynı anda birkaç fluorophores analiz imkanı rağmen mono-lekeli slaytlar ile yayılma denetimi önerilir. Başka bir önemli adım kılavuzu dikkatle gerçekleştirmek için eğitim üzerinde dayanır fenotipleme adımdır.

Toplamda, usta bir operatör tarafından çoğaltılmış bu tekniğin kullanımı periferik kan analizi yerel tümör temsilcisi olamaz beri önemi olan yerel bağışıklık infiltrat, birden çok hücre alt kümeleri analiz etmek için zarif bir araç temsil eder çevre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Tüm yazarlar hiçbir bildirmek için çıkar çatışması var.

Acknowledgments

Bu eser hibe Institut National du kanser (Inca) (ET), Ligue contre le kanser (ET), Université Sorbonne Paris Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex IMMUNO-Onkoloji (ET), SIRIC CARPEM (CG, ET) tarafından desteklenmiştir. EdG Fondation ARC Kardeşliği tarafından finanse edildi. EV ve CD APHP (bourse année recherche) Kardeşliği tarafından finanse edilmiştir. Will Université Sorbonne Paris Cité (Kervansaray'a doktora) Kardeşliği tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar Bristol Myers Squibb kendi bu projede finansman için teşekkür ederiz. Yazarlar bölümü patoloji nörölojisi Européen Georges Pompidou ve Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel ve Gisèle Legall) teşekkür ederim. Yazar PARCC, nörölojisi Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre) Histoloji platformunun teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging  Perkin Elmer CLS142338
inForm cell analysis 2.1. Perkin Elmer CLS135781
R software https://www.r-project.org
Dakopen delimiting pen Dako S2002
Tris Buffer Salin TBS Tablets Takara, Bio Inc. TAKT9141Z pH7.6 100 tablet
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) Takara, Bio Inc. TAKT9142Z pH 7.6 100 tablets
Biotin blocking system Dako X0590 Avidin 0.1% and Biotin 0.01%
normal donkey serum Jackson Immunoresearch 017-000-001 5% vol./vol. concentration
Fluoroshield with DAPI Sigma-aldrich F6057 1.5 µg/mL concentration
Knittel glass coverslip Knittel Gläser, 100039 24x60 mm 100 cover slips
Rabbit anti-CD8 Clone P17-V novus NBP1-79055 use at 4µg/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NAT abcam ab52587 use at 2 µg/mL
Goat anti-Tim-3 R&D AF2365 use at 3 µg/mL
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 Roche 7309457001 use at 1 µg/mL
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 Cell Signalling 4528 use at 0.5 µg/mL
Goat anti-human gal9 R&D AF2045 use at 0.3 µg/mL
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit Jackson Immunoresearch 711-175-152 use at 5 µg/mL
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 715-066-150 use at 3 µg/mL
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG abcam ab150133 use at 5 µg/mL
Cy3 labeled streptavidin Amersham PA43001 use at 3 µg/mL
negative control mouse IgG1 Dako X0931 use at 2 µg/mL
IgG from goat serum Sigma-aldrich I5256 use at 3 µg/mL
IgG from rabbit serum Sigma-aldrich I5006 use at 4µg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  2. Granier, C., et al. Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs. Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).
  3. Motzer, R. J., et al. Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial. J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).
  4. Robert, C., et al. Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation. N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).
  5. Robert, C., et al. Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).
  6. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
  7. Schadendorf, D., et al. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).
  8. Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. What does PD-L1 positive or negative mean? J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).
  9. Rizvi, N. A., et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science. 348 (6230), 124-128 (2015).
  10. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. OncoImmunology. 6 (4), e1286437 (2017).
  11. Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. Biomarqueurs prédictifs de réponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices. Bull Cancer. 103, Suppl 1. S151-S159 (2016).
  12. Tumeh, P. C., et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  13. Fourcade, J., et al. Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients. J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).
  14. Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501 (2016).
  15. Wherry, E. J., Kurachi, M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).
  16. Cai, C., et al. Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma. World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).
  17. Sakuishi, K., et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity. J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).
  18. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  19. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).
  20. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).
  21. Nizard, M., et al. Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine. Nat Commun. 8, 15221 (2017).
  22. Nghiem, P. T., et al. PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).
  23. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. Oncoimmunology. (4), (2017).
  24. Woods, K., et al. Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma. J Immunother Cancer. 4, 10 (2016).
  25. Granier, C., et al. Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma. Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  26. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  27. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3, 47 (2015).
  28. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
  29. Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines. Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).
  30. Sandoval, F., et al. Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors. Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120 (2013).
  31. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nat Commun. 8, 15095 (2017).

Tags

İmmünoloji sayı 132 Multiplex in situ spektral görüntüleme ayirt tekniği dijital görüntüleme renal hücreli karsinom Tim-3 PD-1 tümör microenvironment denetim noktası inhibitörleri in situ tek hücre analizi
Multiplexed ayirt analizi ve Intratumoral PD-1<sup>+</sup> Tim-3<sup>+</sup> CD8 miktar<sup>+</sup> T hücreleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Granier, C., Vinatier, E., Colin,… More

Granier, C., Vinatier, E., Colin, E., Mandavit, M., Dariane, C., Verkarre, V., Biard, L., El Zein, R., Lesaffre, C., Galy-Fauroux, I., Roussel, H., De Guillebon, E., Blanc, C., Saldmann, A., Badoual, C., Gey, A., Tartour, É. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. J. Vis. Exp. (132), e56606, doi:10.3791/56606 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter