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Genetics

血管动力尾静脉注射对小鼠肝细胞基因本构和诱导系统的修饰

Published: February 2, 2018 doi: 10.3791/56613

Summary

水动力尾静脉注射转的融合载体, 可以稳定转染小鼠肝细胞在体内.在这里, 我们提出了一个实用的转染系统的协议, 使一个单一的转基因或联合本构和强力霉素诱导表达的转基因或和平 shRNA 在肝脏的长期本构表达。

Abstract

在肝癌的研究模式, 再生, 炎症和纤维化, 灵活的系统为体内基因表达和沉默是非常有用的。以转为基础的水动力尾静脉注射是一种有效的成年小鼠肝细胞遗传操作方法。除了本构式转基因表达外, 该系统还可用于更先进的应用, 如 shRNA 介导的基因敲除, CRISPR/Cas9 系统诱导基因突变或诱导系统的暗示。将本构 CreER 表达与转基因或 shRNA 选择的诱导表达结合起来, 作为这一技术的一个例子。我们涵盖了多步骤的过程, 从准备的睡美人-转结构, 注射和治疗小鼠, 并准备肝组织进行分析的免疫。该系统是实现肝细胞复杂遗传操作的可靠而有效的方法。它是特别有用的结合与 loxP 的小鼠品系, 可用于各种模型的研究肝病。

Introduction

慢性肝病是一个主要的健康负担全球1。动物研究模型是肝脏疾病研究的重要工具, 有助于解答肝脏再生、肝脏炎症、脂肪以及肝癌2等复杂问题。大量的这些动物模型依赖于肝细胞的基因修饰。因此, 有效的工具, 操纵基因表达在肝细胞是有益的3。建立的方法, 如育种的基因工程小鼠菌株或病毒载体的生成肝细胞感染要么费时, 港口安全关注, 或屈服于肝细胞的不良转基因表达在体内4,5. 水动力尾静脉注射 (HTVI) 是一种替代方法的体内转染肝细胞允许方便, 快速, 和经济高效的基因功能的审讯。对于 HTVI, 携带所需 DNA 序列的载体被溶解在相当于注射动物体重10% 的盐水量中。然后在5-10 秒6内将该解决方案注入尾部静脉。超过心脏输出, 盐水从下腔静脉流入肝静脉, 导致肝脏扩张和肝细胞的水动力转染7。为了实现稳定的基因组集成, 该方法已与基于转的矢量 (如休眠美人-转系统) 相结合。该系统介导的重组的目标载体与基因组重组网站的催化睡美人-8,9。对于肝纤维化或癌变的模型, 在疾病模型的某些时间点过度或沉默基因往往是可取的。为此, 可诱导基因表达的工具, 如 LoxP 系统或四环素诱导基因表达系统 (春节) 可以使用10

在这里, 我们描述了一个协议的在体内转染小鼠肝细胞使用 HTVI 的睡美人转的系统。除了一个在肝脏特异启动子控制下的转基因的稳定、本构表达的协议外, 我们还描述了一种更先进的向量系统, 它将本构型他莫昔芬重组 (CreER) 表达与可诱导表达的转基因或 rna 适应的 shRNA (和平 shRNA), 称为 pTC 的春节系统11。在这个向量系统中, 可诱导的转基因或和平 shRNAs 为四环素相关的表达被克隆到骨干载体与重组克隆系统, 允许快速和容易生成新的载体12。本视频指南包括制备合适的载体, 注射和治疗小鼠, 以实现诱导转基因/和平 shRNA 表达, 最后准备肝脏组织进行分析。本协议中描述的方法旨在使任何选择的基因 loxP 介导的小鼠系统的表达或击倒, 使得它成为一种广泛适用的肝病研究系统。

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Protocol

所有动物实验都是根据实验室动物的护理和使用指南进行的, 并得到主管当局的批准 (Regierung Oberbayern、慕尼黑、德国和斯坦福机构动物保育和使用委员会,斯坦福, 加利福尼亚, 美国)。在补充表 S1 中提供了所有用于克隆的质粒的清单 (步骤1至 4)。

1. 本构基因表达的转基因克隆

  1. 设计引物为转基因放大13,14
  2. 将总署 (TTAATTAA) 的限制站点添加到前引物的5末端。将 AscI (GGCGCGCC) 或 FseI (GGCCGGCC) 的限制站点添加到反向底漆的5端。
  3. 利用优化的条件为所需的转基因14放大转基因。使用商业上可用的 DNA 纯化试剂盒进行净化。
    注: 退火时间取决于在步骤1.1 中设计的底漆, 伸长时间取决于构造的长度。例如, 为 1000 bp 长度的结构使用六十年代伸长时间。
  4. 本构基因表达的消化转基因和载体15与各自的制约核酸 (参见步骤 1.2) 和缓冲在总容量50µL 在37° c 隔夜。例如, 在适当的情况下, 5 单元总署和5单元 FseI 的摘要构造 (参见步骤 1.2)。
  5. 凝胶净化消化载体和插入使用商业凝胶提取试剂盒根据制造商的指示。在14° c 下使用 400 U T4 连接, 在65° c 下执行一个标准结扎 100 ng 向量和 100–1,000 ng, 16 h。
  6. 使用标准的热休克协议16转换合格的细菌。
  7. 琼脂板上含有100µg/毫升氨苄西林。孵育在30° c 为24小时。
  8. 选择单一的殖民地, 纯化质粒 DNA 使用商业 miniprep 套件根据制造商的说明和验证序列的桑格排序17 (测序底漆: 5 "TGCTGGAGTTCTTCGCC 3")。
  9. 使用阳性菌落的最大规模扩增的质粒 DNA 和纯化使用无内毒素质粒准备试剂盒18根据制造商的说明。
  10. 构造已准备好注入, 从而继续执行步骤5。

2. 转基因诱导基因表达的克隆

  1. 设计引物为转基因放大13,14
  2. 将倡议 (GAGCTC)、SpeI (ACTAGT) 或 KpnI (GGTACC) 的限制站点添加到前引物的5末端。将 NotI (GCGGCCGC) 或 XhoI (CTCGAG) 的限制站点添加到反向底漆的5端。
  3. 利用优化的条件为所需的转基因14放大转基因。使用商业 DNA 纯化试剂盒进行净化。
  4. 消化纯净的转基因和4µg 词条传染媒介 (pEN_TTmcs-传染媒介, 看见材料表)19分开地与适当的制约核酸 (参见步骤 2.2) 和缓冲在总容量50µL 在37° c 隔夜。
  5. 凝胶净化消化载体和插入使用商业凝胶提取试剂盒根据制造商的指示。使用 400 U T4 连接在14° c 下进行标准结扎, 100 ng 100–1,000, 16 h. 热钝化在65° c 为10分钟。
  6. 使用标准的热休克协议16转换合格的细菌。
  7. 在琼脂板上含有15µg/毫升庆大霉素。孵育在37° c 为16小时。
  8. 选择单一菌落, 纯化质粒 DNA, 并通过测序17使用 pCEP 前引物验证插入: 5 "AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3"。
    注: PCR 在单一殖民地可以执行, 无需预先纯化与引物 pCEP 向前和 pCEP 反向 (5 ' AAG CTG GGT CTA ATC TCG 3 ')。这一步可以用来预先选择积极的殖民地。
  9. 继续执行步骤4。

3. shRNA 用于诱导基因敲击的克隆

  1. 根据 pSLIK 克隆协议19设计 shRNA 寡核苷酸。退火和纯化寡核苷酸和稀释 1:20 在 ddH2O。
  2. 文摘3µg 的入口向量与 5 U BfuAI 在50° c 为 3 h, 然后钝化反应在65° c 为 20 min。
    注意: 如果需要绿色荧光蛋白 (GFP) 的 co 表达式, 请使用 pEN_TTGmiRc19作为输入向量, 否则使用 pEN_TTmiRc219
  3. 凝胶纯化消化载体, 如步骤2.5。执行标准结扎 100 ng 载体和1µL 纯化和稀释 shRNA 寡核苷酸 (步骤 3.1) 使用 400 U T4 连接在室温下 1 h. 热钝化在65° c 为10分钟。
  4. 使用标准的热休克协议16转换合格的细菌。
  5. 在琼脂板上含有15µg/毫升庆大霉素。孵育在37° c 为16小时。
  6. 选取单个菌落, 纯化质粒 DNA, 并通过桑格测序17 (测序底漆: 5 "TAGTCGACTAGGGATAACAG 3")。
  7. 继续执行步骤4。

4. 重组克隆以生成现成的注射克隆

  1. 混合 150 ng 输入向量 (从步骤2或步骤 3) 和 150 ng 的 pTC 春节向量20
  2. 将 TE 缓冲区添加到总容量为8µL (pH=8)。
  3. 将 LR-clonase 酶混合 II (见材料表) 转化为冰, 孵育2分钟涡旋两次。
  4. 添加2µL 的 LR-clonase 酶混合 II 的反应和孵化25° c 为1小时。
  5. 通过添加1µL 蛋白酶 K 溶液来停止反应。孵育在37° c 为10分钟。
  6. 利用标准的热休克协议16将 Stbl3 2 µL 的重组克隆混合菌转化为合格细菌。
  7. 琼脂板上含有100µg/毫升氨苄西林。孵育在30° c 为24小时。
  8. 选择单个菌落, 用无内毒素质粒制备试剂盒纯化质粒 DNA 根据制造商的说明,18 , 并通过桑格测序17 (测序底漆 5 ' 确认向量完整性AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3 ')。
  9. 构造已准备好注入, 请继续执行步骤5。

5. 水动力尾静脉注射液的制备

注: 在步骤1、2、3和4中描述了本构和诱导基因表达结构的制备。

  1. 准备无菌0.9% 盐水注射 (不要使用 PBS). 使用体积相当于10% 左右的鼠标体重。示例: 对于重20克的鼠标, 准备2毫升的溶液。
  2. 准备使用无内毒素质粒纯化试剂盒纯化的注射载体18 (分别参见步骤1.8 或 4.8)。
  3. 添加10µg 或15µg 内毒素-免费的睡美人向量结构 (从步骤1使用10µg, 从步骤4使用15µg, 分别) 和1µg 内毒素-免费 pc-HSB521每毫升无菌盐水。
  4. 存储解决方案可达4小时, 在4° c。不要冻结。

6. 执行水力尾静脉注射

  1. 使用抑制剂的尾巴静脉注射 (商业或准备从50毫升锥管与孔呼吸和尾巴)。用纸巾把管子的底部填满。
  2. 对于注射, 使用大约8-10 周龄的小鼠与重量 20-25 g。
  3. 在注射前称小鼠, 并根据体重 (相当于10% 的体重) 准备注射量 (见步骤 5.1)。准备一个无菌3毫升注射器与27克针注射和填写所需的数量。
  4. 将鼠标放入抑制剂。调整卫生纸的数量 (见步骤 6.1), 只留下最小的运动空间, 但有足够的空间进行呼吸。
  5. 确保鼠标定期呼吸。
  6. 用红外线灯加热尾部30-60 秒小心注意过热的迹象。
  7. 用酒精擦拭尾巴。
  8. 将针几乎水平地插入两个侧向尾脉中的一个, 靠近尾部的底部。
    注: 如果成功放置, 少量的血液可能会回流到针头的锥体。不建议积极吸气, 因为任何额外的针头运动都可能导致其移位和/或静脉损伤。
  9. 在8-10 秒内将总容积注入尾静脉。
  10. 立即从抑制剂中取出鼠标。压缩注射伤口至少三十年代或直到任何出血消退。
  11. 将鼠标置于单独的笼子中。一旦鼠标从过程中恢复 (约30-60 分钟), 将鼠标移回原来的笼子。在接下来的24小时中定期检查鼠标。
    注: 在注射后2小时内常规观察小鼠的轻度镇静。
  12. 在继续进行进一步的实验之前 (, 步骤 7), 等待10-15 天来清除非集成向量。

7. 转染 CreER 与他莫昔芬的诱导

注意: 他莫昔芬是有害的, 可能是致癌或损害生育力。请参阅安全数据表。

  1. 连续三天计划腹腔他莫昔芬注射。
  2. 在1天, 溶解10毫克他莫昔芬在40µL 乙醇。在55° c 下孵育10分钟涡流几次, 直到他莫昔芬溶解。
  3. 加960µL 玉米油。在55° c 孵育5分钟。涡数倍, 以得到一个明确的解决方案。
  4. 准备一个1毫升的胰岛素注射器与27克针的解决方案。
  5. 用拇指和第二个手指小心翼翼地抓住鼠标的颈部, 在手的底座和第四和第五手指之间固定尾巴。
  6. 注射0.1 毫升 (= 1 毫克的他莫昔芬) 的溶液腹腔到左下腹腹。
  7. 在2和三天重复注射

8. 诱导四环素相关基因或 shRNA 表达

注意: 强力霉素可能有害。请参阅安全数据表。

注: 根据试验的类型和持续时间, 强力霉素可在饮用水 (步骤 8.1) 或 chow (步骤 8.2) 中提供。

  1. 短期试验 (< 10 天) 使用以下协议通过饮用水管理强力霉素。
    1. 在100毫升的自来水中溶解5克蔗糖。釜.
    2. 将100毫克的强力霉素-盐酸在5毫升的蔗糖溶液 (步 8.1.1) 中溶解于15毫升的锥形管中。
    3. 使用10毫升注射器, 无菌过滤器的解决方案通过0.2 µm 过滤器。添加到步骤8.1.1 中的蔗糖溶液中。
    4. 供应强力霉素-蔗糖溶液作为饮用的水对老鼠。每天检查并更换当溶液变为多云时显示细菌过度生长 (最迟在三天后更换清除溶液)。
  2. 对于长期的实验 (> 10 天) 或对新陈代谢变化敏感的实验, 使用商业强力霉素周 (例如, 强力霉盐酸周0.625 克/千克), 以避免脱水和/或蔗糖引起的动物肝脏的变化。

9. 小鼠肝免疫的制备

警告: 甲醛可能有害。请参阅安全数据表。

注意: timepoint 时, 老鼠会被分析, 这取决于实验。建议在不少于三天的强力霉素治疗后分析肝组织, 以确保充分诱导转基因或 shRNA 表达。

  1. 准备一个1毫升注射器与27克针1毫升的4% 甲醛溶液 (粉煤灰)。
  2. 根据批准的动物协议, 用适当的方法安乐鼠标。
    注: 安乐死的适当方法的指导方针可能会因机构而异。
  3. 使用解剖剪刀和解剖钳, 小心打开腹腔与中间剖腹手术暴露肝脏。将小肠移到右侧以暴露门静脉和下腔静脉。
  4. 插入准备好的注射器的针 (参见步骤 9.1) 入下腔和切开门静脉。注入1毫升的粉煤灰慢慢进入下腔静脉灌注肝组织和删除自动荧光红细胞 (可取的, 如果荧光染色将执行)。
  5. 取出肝脏在水中冲洗, 并转移到5-10 毫升的4% 粉煤灰溶液。
  6. 石蜡切片, 修复组织 36-48 h. 组织准备好脱水和石蜡嵌入。
  7. 对于冰冻切片, 在4% 粉煤灰中固定1小时组织。
    1. 冻, 转移到10% 蔗糖溶液。孵育60分钟。
    2. 转移到20% 蔗糖溶液。孵育60分钟。
    3. 转移到30% 蔗糖溶液。在-20 ° c 的冷冻切片中, 孵育12-16 嵌入化合物中。

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Representative Results

水动力尾静脉注射转染效果:单次注射转染水力的小鼠肝细胞百分比是可变的, 取决于注射量、注射时间、注入 DNA 量和注入结构的大小等多个参数6, 22,23。此外, 转染效率一般较低, 在较大的动物, 较大的血管直径, 以及较大的正弦面积导致整体压力下降。为了直观地显示转染效率, CreER 转结构的 HTVI 在小鼠中进行, 在Rosa26mTmG 报告基因之后, 再用他莫昔芬介导的 CreER 构造激活。由于技术原因, 注射量低或注射时间长, 导致转染效率降低, 只有少数肝细胞可检测到整个肝脏, 而最佳注射条件导致转染率较高在 HTVI CreER 转 (图 1A) 后, 记者染色所描述的效率。为了评估转染的效果, 免疫的转基因或-如 CreER 的情况下, 一个合适的记者基因强烈建议。此外, 转染转基因的 mRNA 表达分析也可以估计其转移效率。

转染 pericentral 肝细胞:在流体动力注射后, 沿正弦空间的压力梯度--压力是最接近中心静脉和最低的 periportal 区域--可能会导致 pericentral 区的首选转染。我们分析了低比例的肝脏转基因表达肝细胞和评估他们的相对位置在肝小叶免疫谷氨酰胺合成酶 (GS), 一个标记为 pericentral 肝细胞。有趣的是, 大多数的肝细胞显示记者基因表达后, HTVI 的 CreER 构造聚集在中心静脉周围, 但不是门户区域 (图 1B), 表明在中心静脉周围的转染效率较高。

在体内荧光转 HTVI 后的成像:为了评估在转构造 HTVI 后观察到的单拷贝集成是否足够用于 活体成像, 我们在肝脏特定的控制下注入了一个转构造, 窝藏荧光表达式卡带启动子构造。在 HTVI (图 2A) 后两周内, 使用活体成像系统向小鼠注射了素和影像。影像显示, 在注射后15天和以后的时间点 (图 2B和未显示的数据) 中, 肝脏的荧光生物发光是稳定的。这些结果表明, 该系统可以成功地用于跟踪转染细胞的存在,在体内的生物发光成像。

联合 CreER 和诱导转基因或 shRNA 表达:我们以前产生了一个转结构, 结合了诱导型综合重组 (CreER) 的本构表达式与转基因的诱导表达或 shRNA 的选择20 (图 3A)。将此构造注入到Rosa26mTmG-记者小鼠和他莫昔芬的 CreER 激活表明, 报告基因的稳健表达与转单转基因表达的结果相媲美 (图 3B)。在强力霉素治疗后, 可诱导的转基因表达可以通过适当的抗体在转染肝细胞 (图 3C)。对于可诱导的 shRNA 表达, 建议使用 gfp-shRNA 结构, 因为免疫检测到的细胞质 gfp 表达式可以用作 shRNA 表达式的代理标记 (图 3D)。值得注意的是, 转基因或 shRNA 的表达, 分别是在肝细胞的一个子集中被检测到, 这可能是由于免疫20检测所需的蛋白质表达水平相对较高。

Figure 1
图 1: 由 HTVI 转染肝细胞.(a) HTVI CreER 转后的转染效率为小鼠, 窝藏Rosa26mTmG/+ 报告员, 然后用他莫昔芬治疗。转染肝细胞是阳性的膜结合绿色荧光蛋白 (GFP, 绿色)。(B)在小鼠中 CreER 活化肝细胞 (绿色) 的 Co 染色, 与中央静脉标记谷氨酰胺合成酶 (GS, 红) 的Rosa26mTmG 报告。这里 PV: 门静脉, CV: 中央静脉。刻度线代表100µm.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2:在体内荧光的成像。(a)转构造包含荧光表达式卡带 (不按比例绘制)。肝脏荧光表达的注射和治疗方案。某人: 睡美人识别网站, HTVI: 水动力尾静脉注射。(B)肝荧光生物发光的代表性图像15天后, HTVI 转-荧光结构与 pHSB5 一起使用活体成像系统。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 组合 CreER 和诱导基因/shRNA 表达。(a)转结构, 用于表达诱导型综合重组和四环素诱导的转基因或 shRNA (pTC 春节) 的表达, 而不是按比例绘制。(B)绿色膜染色表明, 在注射 pTC 春节后, 将肝细胞转染为Rosa26mTmG/+ 报告鼠和 CreER 激活与他莫昔芬。缩放条代表100µm. (C)诱导基因表达在强力霉素治疗后5天可以通过免疫对转染肝细胞的转基因 (狂吠, 红色) 进行可视化。(D)可诱导的和平 shRNA 表达在强力霉素治疗后5天, 细胞质绿色荧光蛋白 (gfp) 染色的 gfp-shRNA 结构。转染的肝细胞用膜结合 GFP 描述。C) 和 D 中的刻度线代表50µm.请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

水动力尾静脉注入肝细胞的转染已成为15年前6以来建立的一种方法。注入的体积超过心脏输出, 从下腔静脉流向肝脏的窦7, 导致转染约 10-20%, 在某些情况下多达40% 的肝细胞25,26。成功转染的预测因子是每次注入时间的注入量22,23。因此, 低转染效率 (图 1A, 左面板) 通常是由于在过程7过程中无法保持注入速度。然而, 即使采用了最佳的技术, HTVI 的转染效率仍将低于病毒感染与腺或腺相关病毒所获得的速率, 其速度可达近 100%5,27.为了获得成功的尾静脉注射, 这是至关重要的, 以确保一个稳定的定位针在血管。这是很容易实现的静脉与更大的直径更接近底部的尾巴。另外, 强烈建议通过加热尾巴来扩张静脉。最好的结果是使用红外线灯, 但非红外线热灯或浸泡在温水中的尾巴也可以使用。在某些情况下, 在 HTVI 前30分钟内通过腹腔注射补充多达200µL 的生理盐水, 可以改善动物的水合状态, 从而导致血管扩张。为了保持恒定的注射速度, 应彻底克制鼠标尾部, 以避免尾部的任何移动, 这会导致针的移位。为了验证目的, 我们建议使用可以通过免疫检测到的构造。另外, 基因转染功效可通过 mRNA 表达分析或基因组测序来估计28

我们的数据表明, 转融合是最好的观察在 pericentral 地区的肝脏小叶。主要转染肝细胞周围中央静脉可能是由于独特的血流动力学 HTVI, 因为它也在非转基转染29。这一发现可能与某些应用相关, 如由 CCl4诱导急性肝损害, 主要影响 pericentral 肝细胞。在低转染效率的情况下, 覆铜板4治疗可以导致肝细胞数量的显著减少。此外, HTVI 是有限的目标 periportal 细胞, 包括胆管细胞15

除了利用 HTVI 转结构来实现单一转基因的稳定表达的系统外, 我们最近还提出了一个系统, 允许一个基因的 CreER 和诱导表达与一个单一的矢量的 shRNA11.该系统特别适用于对基于 LoxP 的小鼠品系的特异基因进行询问。由于转基因或 shRNA 结构是由一个快速和可靠的重组克隆程序引入的, 该系统可以很容易地适应筛选方法。向量系统介导可靠的诱导表达式在体内完全依赖于强力霉素的传递11,30。本实用的视频指南提供了一步一步的指导, 从克隆适当的载体超过诱导的基因表达, 以分析肝脏组织。

然而, 为了确保系统的效率, 应牢记以下几个方面: 为了保持长期的表达, 基因组集成是由睡美人811在 TA 站点上进行介导的。由于集成效率取决于转大小, 所以在设计矢量31时要牢记转基因结构的大小是很重要的。此外, 肝脏中诱导基因产物的表达效率取决于 rtTA3-promoter 的11。对于最佳表达结果, 使用一个向量结构与肝脏特定的载脂蛋白. HCR. hAAT-启动子推荐 (Addgene #85578), 因为它在三助剂11的比较中显示了最高的效率。通过优化的启动子结构, 可诱导的转基因/shRNA 表达可以检测到免疫在多达30% 的转染细胞20。如果诱导蛋白水平存在于免疫检测所需的某个阈值以下, 则需要确定。重要的是, 没有转基因/shRNA 表达可以检测到免疫在小鼠没有治疗的强力霉素。最后, 在四环素应答元件控制下的基因表达依赖于强力霉素的剂量32,33。对于短期试验, 通过饮用水的强力霉素管理已建立34,35。通常添加蔗糖是为了使口感更好。然而, 这可能导致烦和脱水, 并强烈建议使用强力霉素 chow 长期实验36,37

总之, 水动力尾静脉注射是一种广泛建立的肝脏研究方法。其应用范围从乙型肝炎到肝纤维化或肝癌模型的研究38,39,40,41。本文所描述的系统在 LoxP 的肝病模型中特别适用于对特定靶基因的讯问。此外, 在肝脏中过度表达也可用于血液病的研究42,43或解决免疫问题44,45。除了对特定的基因感兴趣的分析之外, 所提出的系统也可以很容易地适应筛选或复用方法。因此, 这个基于视频的指南将有助于研究人员的大量社区。

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Disclosures

作者没有透露

Acknowledgments

这项工作得到德国德意志 Krebshilfe (111289 号至 ue)、露西尔的儿童健康基金会的支持 (欧内斯特和阿米莉亚-奖授予博士后奖学金-UL1 RR025744 至 ue)。我们感谢马克. 凯博士的向量结构和实验建议和朱利安博士鼠和实验支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
General Material
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder Thermo Fisher #SM1331 DNA ladder for electrophoresis
Tissue-Tek O.C.T. Sakura 4583 embedding of cryo-sections
Biozym LE Agarose Biozym 840004
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
D(+)-Saccharose Carl Roth 4621.1 For sweetening of the doxycyline solution
Ampicillin Sodium Salt AppliChem A0839,0010 For selection of Amp-resistant clones
LB Agar (Luria/Miller) Carl Roth X969.1
LB Broth (Luria/Miller) Carl Roth X968.1
S.O.C. Medium Thermo Fischer 15544034
Gentamicin sulfate AppliChem A1492,0001 For selection of Gentamicin-resistant clones
Roti-Histofix 4 % Fa. Roth P087.6 para-formaldehyde solution
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix invitrogen/ThermoFisher 11791-020 contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K
DB3.1 Competent Cells Thermo Fisher 11782-018
Stbl3 Chemically Competent E. coli Thermo Fisher C737303
Name Company Catalog Number Comments
Restriction Enzymes
PacI New England BioLabs R0547S
AscI New England BioLabs R0558S
FseI New England BioLabs R0588S
SacI New England BioLabs R0156S
SpeI New England BioLabs R0133S
KpnI New England BioLabs R0142S
NotI New England BioLabs R0189S
XhoI New England BioLabs R0146S
BfuAI New England BioLabs R0701S
Name Company Catalog Number Comments
Kits
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For DNA Extraction from gel
NucleoSpin Gel and PCR Clean Up Macherey & Nagel 740609.10
NucleoBond PC20 Macherey & Nagel 740571 Plasmid extraction (Mini prep)
NucleoBond PC500 Macherey & Nagel 740574 Plasmid extraction (Maxi prep)
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher F530S
Name Company Catalog Number Comments
Materials for Mouse Experiments
Injekt Syringe F 1 ml Braun 9166017V For intraperitoneal injection
Omnifix Luer 3 ml Braun 4616025V For intravenous injection
Sterican Cannula 24G Braun 4657675
Sterican Cannula 27G Braun 4657705
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648-1G For CreER activation
Corn oil Sigma-Aldrich C8267-500ML Carrier for tamoxifen injections
Doxycycline hyclate AppliChem A2951,0025 Activation of tetracycline-dependent expression
Injekt 10 ml Syringe Braun 4606108V
Filtropur S 0.2 Sarstedt 831,826,001 For filtration of doxycycline
NaCl 0,9% Braun 3200905 Carrier for intravenous injections
Falcon Conical Tube 50ml Corning Life Science 352095
Infrared Lamp N/A N/A For warming of mouse tail
IVIS Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.
pTC n/a Vector for constitutive gene expression, ref. 15
pEN_TTmcs Addgene #25755 Entry vector for inducible gene expression, ref. 19
pEN_TTGmiRc2 Addgene #25753 Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19
pEN_TTmiRc2 Addgene #25752 Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19
pTC ApoE-Tet Addgene #85578 Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11
pTC-CMV-Tet Addgene #85577 Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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