Summary
Injection dans la veine des vecteurs d’intégration axée sur le transposon queue hydrodynamique permet une transfection stable d’hépatocytes murins in vivo. Nous présentons ici un protocole pratique pour les systèmes de transfection qui permet l’expression constitutive à long terme d’un transgène seule ou combinée expression constitutive et doxycycline-induisible d’un transgène ou miR-shARN dans le foie.
Abstract
Dans les modèles de recherche d’un cancer du foie, régénération, l’inflammation et la fibrose, systèmes flexibles pour in vivo l’expression des gènes et silencieux d’échappement sont très utiles. Injection dans la veine queue hydrodynamiques de constructions axée sur le transposon est une méthode efficace de manipulation génétique des hépatocytes chez la souris adulte. En plus de l’expression du transgène constitutive, ce système peut servir pour des applications plus avancées, telles que l’implication de précipitation, de gènes shARN du système CRISPR/Cas9 pour induire des mutations du gène, ou systèmes inductibles. Ici, la combinaison de l’expression constitutive de CreER avec expression inductible d’un transgène ou miR-shARN de choix est présenté comme un exemple de cette technique. Nous couvrons la procédure plusieurs étape à partir de la préparation de la belle au bois dormant-transposon constructions, à l’injection et le traitement de souris et la préparation des tissus hépatiques pour analyse par immunohistochimie. Le système proposé est une approche fiable et efficace pour réaliser des manipulations génétiques complexes dans les hépatocytes. Il est particulièrement utile en combinaison avec Cre/loxP-basée des souches de souris et peut être appliqué à une variété de modèles dans la recherche d’une maladie du foie.
Introduction
Hépatopathie chronique présente un fardeau de majeurs pour la santé dans le monde1. Les modèles de recherche sur les animaux sont des outils essentiels dans l’étude des maladies du foie et ont aidé à répondre à des questions complexes dans la régénération du foie, inflammation hépatique et stéatose ainsi que le cancer du foie2. Un nombre important de ces modèles animaux reposent sur la modification génétique des cellules du foie. Par conséquent, des outils efficaces pour manipuler l’expression des gènes dans les hépatocytes sont utile3. Des méthodes reconnues telles que l’élevage de lignées de souris génétiquement modifiées ou la génération de vecteurs viraux pour infection hépatocytes sont soit harbor chronophage, problèmes de sécurité, ou rendement médiocre transgene expression dans les hépatocytes en vivo 4 , 5. injection dans la veine queue hydrodynamique (HTVI) est une méthode alternative pour la transfection de in vivo des hépatocytes permettant une interrogation simple, rapide et rentable de la fonction du gène dans le foie. Pour HTVI, un vecteur transportant la séquence d’ADN désirée est dissoute dans un volume de solution saline correspondant à 10 % du poids corporel de l’animal injecté. La solution est ensuite injectée dans la veine caudale dans 5-10 s6. Dépassant le débit cardiaque, la solution saline se jette de la veine cave inférieure dans les veines hépatiques, conduisant à l’élargissement du foie et de transfection hydrodynamique des hépatocytes7. Pour parvenir à une intégration génomique stable, la méthode a été combinée avec des vecteurs axée sur le transposon, tels que le système de transposon sleeping beauty. Ce système intervient dans la recombinaison des vecteurs de la cible avec les sites de recombinaison génomique catalysées par un sleeping beauty -transposase8,9. Pour les modèles de la fibrose du foie ou de la cancérogenèse, il est souvent souhaitable d’overexpress ou du silence des gènes à certains moments du modèle de la maladie. À cette fin, des outils pour l’expression des gènes inductibles tels que le Cre/LoxP-system ou le système d’expression de gène inductible par la tétracycline (Tet-On) peut être utilisé10.
Nous décrivons ici un protocole pour la transfection de in vivo des hépatocytes murins à l’aide de HTVI d’un système transposon belle au bois dormant . Outre un protocole pour l’expression stable, constitutive d’un transgène sous le contrôle d’un promoteur spécifique du foie, les auteurs décrivent un système de vecteur plus avancé qui combine l’expression constitutive tamoxifène dépendant Cre recombinase (CreER) avec la expression inductible d’un transgène ou adaptés microARN shARN (miR-shARN), appelé le pTC TET-système11. Dans ce système de vecteur, inductible transgènes ou miR-interférents pour expression dépendant de tétracycline sont clonés dans le vecteur de la colonne vertébrale avec un système de clonage de recombinaison, permettant la génération rapide et facile de nouveaux vecteurs12. Ce guide vidéo couvre la préparation de vecteurs appropriés, injection et le traitement de souris pour atteindre l’expression de transgènes/miR-shARN inductible et enfin la préparation du tissu hépatique pour l’analyse. La méthode décrite dans le présent protocole a été conçue pour permettre la combinaison de n’importe quel système de souris Cre/loxP médiée par l’expression ou la précipitation de n’importe quel gène de choix, ce qui en fait un système largement applicable dans la recherche d’une maladie du foie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux lignes directrices pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par les autorités responsables (Regierung von Oberbayern, Munich, Allemagne et Stanford Institutional Animal Care et utiliser Comité, Stanford, CA, é.-u.). Une liste de tous les plasmides de clonage (étapes 1 à 4) est fournie dans une table supplémentaire S1.
1. clonage d’un transgène pour l’Expression des gènes constitutifs
- Concevoir des amorces pour le transgène amplification13,14.
- Ajouter des sites de restriction pour PacI (TTAATTAA) à l’extrémité 5' de l’amorce vers l’avant. Ajouter des sites de restriction pour AscI (GGCGCGCC) ou FseI (GGCCGGCC) à l’extrémité 5' de l’amorce de marche arrière.
- Amplifier le transgène par PCR à l’aide de conditions optimisées pour le transgène désiré14. Purifier à l’aide d’un kit de purification ADN disponible dans le commerce.
Remarque : Recuit temps dépend des amorces conçues à l’étape 1.1., allongement temps dépend de la longueur de la construction. Par exemple, pour une construction de 1 000 bp longueur utilisation 60 s de temps de l’élongation. - Digérer transgene et vecteur d’expression de gène constitutif15 nucléases de restriction respectifs (Voir l’étape 1.2) et un tampon dans un volume total de 50 µL à 37 ° C pendant la nuit. Par exemple, digérer construct avec 5 unités PacI et 5 unités FseI le cas échéant (voir étape 1.2).
- Gel de purifier vecteur digérée et insérer à l’aide d’un kit d’extraction gel commercial selon les instructions du fabricant. Effectuer une ligature standard de 100 ng du vecteur et de 100 à 1 000 ng de l’insert à l’aide de 400 U T4 ligase à 14 ° C pendant 16 h. chaleur inactiver à 65 ° C pendant 10 min.
- Transformer des bactéries compétentes en utilisant une chaleur-choc-protocole standard16.
- Plaque sur la gélose plaques contenant 100 ampicilline de µg/mL. Incuber à 30 ° C pendant 24 h.
- Prélever des colonies unique, purifier l’ADN de plasmide utilisant un kit de miniprep commerciale selon les instructions du fabricant et vérifier la séquence de séquençage Sanger17 (amorce de séquençage : 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').
- Utilisation positive de colonies pour maxi échelle d’amplification d’ADN plasmidique et purifient à l’aide d’un plasmide exempte d’endotoxine préparation kit18 selon les instructions du fabricant.
- Construction est prête pour l’injection, donc passez à l’étape 5.
2. le clonage d’un transgène pour l’Expression des gènes inductibles
- Concevoir des amorces pour le transgène amplification13,14.
- Ajouter des sites de restriction pour SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT) ou KpnI (GGTACC) à l’extrémité 5' de l’amorce vers l’avant. Ajouter des sites de restriction pour NotI (GCGGCCGC) ou XhoI (CTCGAG) à l’extrémité 5' de l’amorce de marche arrière.
- Amplifier le transgène par PCR à l’aide de conditions optimisées pour le transgène désiré14. Purifier à l’aide d’une trousse commerciale de purification ADN.
- Digérer le transgène purifié et 4 µg du vecteur d’entrée (pEN_TTmcs-vecteur, voir Table des matières)19 séparément avec les nucléases de restriction appropriée (Voir l’étape 2.2) et un tampon dans un volume total de 50 µL à 37 ° C pendant la nuit.
- Gel de purifier vecteur digérée et insérer à l’aide d’un kit d’extraction gel commercial selon les instructions du fabricant. Effectuer une ligature standard avec 100 ng du vecteur et de 100 à 1 000 ng de l’insert à l’aide de 400 U T4 ligase à 14 ° C pendant 16 h. chaleur inactiver à 65 ° C pendant 10 min.
- Transformer des bactéries compétentes en utilisant une chaleur-choc-protocole standard16.
- Plaque sur la gélose plaques contenant gentamicine 15 µg/mL. Incuber à 37 ° C pendant 16 h.
- Prélever des colonies unique, purifier l’ADN plasmidique et vérifier les insérer par séquençage de17 à l’aide de l’apprêt avant de pCEP : 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'.
NOTE : PCR sur des colonies individuelles peut être effectuée sans purification préalable avec amorces pCEP avant et pCEP inverser (AGA AAG CTG GGT LTC GAT ATC TCG 3' 5'). Cette étape peut utile pour la présélection des colonies positives. - Passez à l’étape 4.
3. clonage d’un miR-shARN de gènes inductibles par précipitation
- Concevoir des oligonucléotides de miR-shARN selon la pSLIK clonage Protocole19. Recuire et purifier les oligonucléotides et diluer à 01:20 dans ddH2O.
- Digest 3 µg du vecteur d’entrée avec 5 U BfuAI à 50 ° C pendant 3 h, puis inactiver la réaction à 65 ° C pendant 20 min.
Remarque : Si vous souhaitez la co-expression de la protéine fluorescente verte (GFP), utilisation pEN_TTGmiRc19 comme vecteur d’entrée, sinon utilisez pEN_TTmiRc219. - Gel de purifier digérée vecteur comme au point 2.5. Effectuer une ligature standard de 100 ng du vecteur et 1 µL de purifié et dilué shARN oligonucléotides (étape 3.1) à l’aide de 400 U T4 ligase à température ambiante pendant 1 h. chaleur inactiver à 65 ° C pendant 10 min.
- Transformer des bactéries compétentes en utilisant une chaleur-choc-protocole standard16.
- Plaque sur la gélose plaques contenant gentamicine 15 µg/mL. Incuber à 37 ° C pendant 16 h.
- Prélever des colonies unique, purifier l’ADN plasmidique et vérifier les insérer par Sanger séquençage17 (amorce de séquençage : 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').
- Passez à l’étape 4.
4. recombinaison de clonage pour produire des Clones de prêt-à-Injection
- Mix 150 ng du vecteur d’entrée (de l’étape 2 ou 3) et 150 ng de pTC TET-vecteur20.
- Ajoute un volume total de 8 µL de tampon TE (pH = 8).
- Transférer le mélange enzymatique clonase LR II (voir Table des matières) à la glace, incuber pendant 2 min. Vortex deux fois.
- Ajouter 2 µL de mélange enzymatique de LR-clonase II dans la réaction et incuber à 25 ° C pendant 1 h.
- Arrêter la réaction en ajoutant 1 µL de protéinase K-solution. Incuber à 37 ° C pendant 10 min.
- Transformer Stbl3 bactéries compétentes avec 2 µL de recombinaison clonage mélangent à l’aide d’une norme de chaleur-choc-protocole16.
- Plaque sur la gélose plaques contenant 100 ampicilline de µg/mL. Incuber à 30 ° C pendant 24 h.
- Prélever des colonies unique, purifier l’ADN de plasmide utilisant un plasmide exempte d’endotoxine préparation kit18 selon les instructions du fabricant et vérifier l’intégrité de vecteur par Sanger séquençage17 (amorce de séquençage 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3').
- Construction est prête pour injection, passez à l’étape 5.
5. préparation de Solution pour Injection dans la veine queue hydrodynamique
NOTE : Préparation des constructions pour l’expression des gènes inductibles et constitutive sont décrits à l’étape 1, 2, 3 et 4.
- Préparer la solution saline 0,9 % stérile pour injection (font pas usage PBS). Utiliser le volume correspondant à environ 10 % du poids de la souris. Exemple : pour une souris pesant 20 g, préparer 2 mL de solution.
- Préparer les vecteurs d’injection qui ont été purifiés à l’aide d’un plasmide exempte d’endotoxine purification kit18 (Voir l’étape 1.8 ou 4.8, respectivement).
- Ajouter 10 µg ou 15 µg d’endotoxine libres dormant vector construction (de l’étape 1, utilisez 10 µg, d’après l’étape 4 utilisation 15 µg, respectivement) et 1 µg d’endotoxine-free pc-HSB521 / mL de sérum physiologique stérile.
- Solution de boutique pendant 4 h à 4 ° C. Ne pas congeler.
6. effectuer l’Injection dans la veine queue hydrodynamique
- Utiliser une drisse pour injection dans la veine queue (commerciale ou préparée à partir d’un tube de 50 mL conique avec trous pour respirer et pour la queue). Remplissez le fond du tube avec papier de soie.
- Pour injection, utilisez souris d’environ 8 – 10 semaines d’âge avec des poids de 20 à 25 g.
- Peser la souris avant l’injection et de préparer le volume d’injection selon le poids corporel (correspondant à 10 % du poids corporel, reportez-vous à l’étape 5.1). Préparer une stérile 3 mL-seringue avec une aiguille à 27 G à injection et remplissez-le avec le volume requis.
- Placez la souris sur la drisse. Ajuster la quantité de papier de soie (Voir l’étape 6.1) de laisser seulement un minimum d’espace pour le mouvement mais assez d’espace pour respirer.
- Veiller à ce que la souris est respirer régulièrement.
- Chaud la queue en utilisant une lampe infrarouge pour 30 à 60 s. soigneusement attentif aux signes de surchauffe.
- Nettoyer la queue avec un tampon imbibé d’alcool.
- Insérez l’aiguille presque horizontalement dans l’un des deux nervures latérales arrière près de la base de la queue.
NOTE : S’il est placé avec succès, une petite quantité de sang peut couler dans le cône de l’aiguille. Il n’est pas recommandé d’aspirer activement comme n’importe quel mouvement supplémentaire de l’aiguille peut entraîner son déplacement et/ou des blessures de la veine. - Injecter le volume total dans la veine caudale dans 8-10 s.
- Retirez immédiatement la souris de la drisse. Compresser les injection enroulé pendant au moins 30 s ou jusqu'à ce que tout saignement disparaisse.
- Placez la souris dans une cage séparée. Une fois que la souris a récupéré de la procédure (environ 30 à 60 min), transférer la souris vers sa cage originale. Vérifier sur la souris régulièrement pour les prochaines 24 heures.
Remarque : Un sédatif léger de la souris est régulièrement observé jusqu'à 2 h après l’injection. - Avant de procéder à davantage d’expériences (p. ex., étape 7), attendez 10 à 15 jours pour le dédouanement des vecteurs non intégrées.
7. induction de CreER transfectée avec le tamoxifène
ATTENTION : Tamoxifène est-il dangereux, peut être cancéreux ou endommager la fertilité. Veuillez vous reporter à la fiche de données de sécurité.
- Plan des injections intrapéritonéales de tamoxifène sur trois jours consécutifs.
- Jour 1, dissoudre 10 mg de tamoxifène dans l’éthanol 40 µL. Incuber à 55 ° C pendant 10 min. Vortex plusieurs fois jusqu'à ce que le tamoxifène a dissous.
- Ajouter l’huile de maïs 960 µL. Incuber 5 min à 55 ° C. Vortex plusieurs fois pour obtenir une solution claire.
- Préparer la solution dans une seringue de 1 mL insuline avec une aiguille de 27 G.
- Scruff la souris en saisissant le cou de la souris délicatement avec le pouce et la deuxième, la queue entre la base de la main et le quatrième et cinquième doigt de fixation.
- Injecter par voie intrapéritonéale 0,1 mL (= 1 mg de tamoxifène) de la solution dans le quadrant inférieur gauche de l’abdomen.
- Répéter les injections deux et trois jours.
8. induction de tétracycline-dépendant du gène ou de shARN Expression
ATTENTION : La Doxycycline peut être nocif. Veuillez vous reporter à la fiche de données de sécurité.
Remarque : Selon le type et la durée de l’expérience, doxycycline peut être fourni en eau potable (étape 8.1) ou chow (étape 8.2)
-
Pour des expériences de courte durée (< 10 jours) administrer la doxycycline par l’eau potable en utilisant le protocole suivant.
- Dissoudre 5 g de saccharose dans 100 mL d’eau du robinet. Autoclave.
- Dissoudre 100 mg de doxycycline-hyclate dans 5 mL de solution de saccharose (point 8.1.1) dans un tube conique de 15 mL.
- À l’aide d’une seringue de 10 mL, filtre stérile, la solution à travers un filtre à 0,2 µm. Ajoutez à la solution de saccharose préparée à l’étape 8.1.1.
- Fournir une solution de sucrose-doxycycline comme l’eau potable à la souris. Vérifier tous les jours et les remplacer quand la solution devient trouble indiquant la pullulation microbienne (remplacer la solution claire après trois jours au plus tard).
- Pour les expériences à long terme (> 10 jours) ou expériences sensibles aux changements métaboliques, utiliser la doxycycline-chow commerciale (p. ex., Doxycycline Hyclate Chow 0,625 g/kg) pour éviter la déshydratation et/ou les changements induits par le saccharose dans le foie des animaux traités.
9. préparation du foie de souris pour l’analyse par immunomarquage
ATTENTION : Paraformaldéhyde peut être nocif. Veuillez vous reporter à la fiche de données de sécurité.
Remarque : Le validant quand les souris seront analysées dépend de l’expérience. Il est recommandé d’analyser le tissu hépatique après pas moins de trois jours de traitement doxycycline pour assurer suffisamment induction de l’expression de transgènes ou shARN.
- Préparez une seringue de 1 mL avec une aiguille de 27 G avec 1 mL de solution à 4 % paraformaldéhyde (PFA).
- Euthanasier la souris par une méthode appropriée selon un protocole approuvé animale.
Remarque : Les lignes directrices pour les méthodes d’euthanasie appropriées peuvent varier selon l’établissement. - À l’aide de ciseaux de dissection et pince anatomique, ouvrez avec précaution la cavité abdominale avec une laparotomie médiane pour exposer le foie. Déplacer l’intestin grêle vers la droite pour exposer la veine porte et la veine cave inférieure (VCI).
- Insérer l’aiguille de la seringue préparée (voir étape 9.1) dans la VCI et couper la veine porte. Injecter 1 mL de PFA lentement dans la VCI pour perfuse le tissu hépatique et supprimer auto-fluorescent culots globulaires (souhaitables si immunofluorescence sera effectué).
- Retirez le foie. Rincer à l’eau et transfert à 5 – 10 mL de solution PFA de 4 %.
- Pour les sections de paraffine, fix tissu pour 36 – 48 h. tissu est prêt pour déshydratation et enrobage de paraffine.
-
Pour les coupes congelées, Difficulté tissu chez 4 % PFA pendant 1 h.
- Pour cryoprotection, transférer à une solution de 10 % de saccharose. Incuber 60 min.
- Transfert à la solution de sucrose à 20 %. Incuber 60 min.
- Transfert à la solution de sucrose à 30 %. Incuber les 12 et 16 h. Embed en enrobage composé pour coupes congelées et congeler à-20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efficacité de transfection par injection dans la veine queue hydrodynamique : Le pourcentage des hépatocytes murins qui sont transfectées hydrodynamique en une seule injection est variable et dépend de plusieurs paramètres tels que le volume d’injection, le temps d’injection, la quantité d’ADN injecté et la taille de la construction injecté6, 22,23. En outre, l’efficacité de la transfection est généralement plus faible chez les animaux plus gros, où un plus grand diamètre vasculaire, mais aussi les plus vaste sinusoïdale conduit à une diminution de la pression globale. Afin de visualiser l’efficacité de la transfection, HTVI d’une construction de transposon CreER a été réalisée chez les souris ayant un gène rapporteur de Rosa26mTmG suivi par l’activation induite par le tamoxifène de la construction de CreER. Volume d’injection faible ou temps d’injection prolongée pour résultats de raisons techniques dans l’efficacité de transfection réduite avec seulement quelques hépatocytes transfectés détectables dans le foie entier, même si les conditions optimales d’injection transfection supérieure gains d’efficacité tel que représenté par le journaliste coloration après HTVI d’un transposon CreER (Figure 1 a). À évaluer l’efficacité de la transfection, immunomarquage du transgène transfectée ou – comme dans le cas de CreER - d’un gène rapporteur adapté est fortement recommandée. Alternativement, l’efficacité de transfection pourrait être estimée à partir analyse ADN messagère de l’expression du transgène transfectée.
La transfection des hépatocytes péricentraux : Après l’injection hydrodynamique, un gradient de pression le long de l’espace sinusoïdal - où la pression est plus élevée près de la veine centrale et plus faible dans le périportale areal - pourrait conduire à la transfection préférée dans la région de péricentraux. Nous avons analysé les foies avec un faible pourcentage des hépatocytes exprimant le transgène et évalué leur position relative dans le lobule hépatique par co-immunostaining pour la glutamine synthétase (GS), un marqueur des hépatocytes péricentraux. Fait intéressant, la plupart des hépatocytes qui a montré de reporter l’expression des gènes après que HTVI d’une construction de CreER regroupés autour de la veine centrale, mais pas le portail espace (Figure 1 b) qui indique une plus grande efficacité de transfection autour de la veine centrale.
In vivo après HTVI d’un transposon luciférase d’imagerie : Afin d’évaluer si l’intégration de l’exemplaire unique observée après que HTVI du transposon constructions24 est suffisante pour in vivo de l’imagerie, nous avons injecté une construction transposon nourrissait une cassette d’expression luciférase sous le contrôle d’un foie spécifique construction de promoteur. Les souris ont été injectés avec la luciférine et photographié en utilisant un en vivo système d’imagerie, deux semaines après l’HTVI (Figure 2 a). L’imagerie a montré bioluminescence luciférase robuste et stable dans le foie 15 jours après l’injection et à des moments plus tard (Figure 2 b et données non présentées). Ces résultats montrent que le système peut être utilisé avec succès pour suivre la présence de cellules transfectées in vivo par imagerie de bioluminescence.
CreER combinée et l’expression de transgènes ou shARN inductible : Nous avons généré précédemment une construction transposon qui associe l’expression constitutive d’une recombinase inductible de Cre (CreER) expression inductible d’un transgène ou un shARN de choix20 (Figure 3 a). L’injection de cette construction dans Rosa26mTmG-journaliste souris et CreER l’activation par le tamoxifène a montré robuste expression du gène rapporteur comparables aux résultats obtenus avec une construction de transposon unique transgene expression ( Figure 3 b). Après le traitement de la doxycycline, l’expression inductible TRANSGENIQUE peut être visualisée par anticorps appropriés dans les hépatocytes transfectées (Figure 3). Pour l’expression inductible shRNA, l’utilisation d’une construction de GFP-shARN est recommandée comme expression de la GFP cytoplasmique détectée par immunohistochimie peut être utilisée comme marqueur pour l’expression de shARN (Figure 3D). À noter, expression de transgènes ou shRNA, respectivement, n’est détectable dans un sous-ensemble des hépatocytes, qui pourrait s’expliquer par le niveau relativement élevé d’expression de protéines nécessaire à la détection par immunomarquage20.
Figure 1 : Transfection des hépatocytes par HTVI. (A) efficacité de transfection Variable après HTVI d’un transposon-CreER chez des souris ayant une Rosa26mTmG / + journaliste et suivi du traitement par le tamoxifène. Transfectées hépatocytes sont positifs pour membranaires de la protéine fluorescente verte (GFP, vert). (B) conjointement une coloration pour CreER a activé les hépatocytes (vertes) pour la souris associées à un journaliste Rosa26mTmG avec la veine centrale marqueur glutamine synthétase (GS, rouge). Ici, PV : veine porte, CV : veine centrale. Barres d’échelle représentent 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : In vivo l’imagerie de la luciférase. (A) Transposon construire contenant une cassette d’expression luciférase (ne pas dessinée à l’échelle). Régime d’injection et le traitement pour la visualisation de l’expression de la luciférase hépatique. SB : sites de reconnaissance de beauté, HTVI de couchage : injection dans la veine queue hydrodynamique. (B) l’image représentative de la bioluminescence 15 jours après HTVI d’une construction de transposon-luciférase avec pHSB5 en utilisant un en vivo système d’imagerie de la luciférase hépatique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : CreER et expression de gène inductible/shRNA combinés. (A) construction de Transposon pour l’expression inductible recombinase Cre ainsi que l’expression d’un transgène inductible par la tétracycline ou shARN (pTC Tet), pas dessiné à l’échelle. (B) une coloration vert membrane indique hépatocytes transfectés après l’injection du CTP construct Tet dans Rosa26mTmG / + souris journaliste et activation de CreER par le tamoxifène. Barre d’échelle représente 100 µm. expression de la gène inductible (C) 5 jours après que traitement doxycycline peut être visualisé par immunomarquage pour le transgène (YAP, rouge) dans les hépatocytes transfectés. (D) l’expression inductible miR-shARN 5 jours après traitement doxycycline indiqué par cytoplasmique protéine fluorescente verte (GFP), coloration de la construction de GFP-shARN. Transfectées hépatocytes sont dépeints par membrane-bondissent GFP. Échelle de barres en ut) et D) représentent 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transfection d’hépatocytes avec injection dans la veine queue hydrodynamique est devenu une méthode établie depuis son introduction il y a plus de 15 ans6. Le volume injecté dépasse le débit cardiaque et coule de la veine cave inférieure dans les sinusoïdes du foie7, conduisant à la transfection d’environ 10 à 20 %, dans certains cas jusqu'à 40 % des hépatocytes25,26. Facteurs prédictifs d’une transfection réussie sont le volume injecté par temps injecté22,23. Par conséquent, une efficacité de transfection faible (Figure 1 a, volet de gauche) est généralement due à l’incapacité de maintenir la vitesse d’injection élevée au cours de la procédure7. Cependant, même avec une technique optimale, l’efficacité de transfection qui peut être réalisée en HTVI restera inférieure à la vitesse obtenue par une infection virale à adénovirus ou virus adéno-associés qui peuvent atteindre presque 100 %5,27 . Pour réaliser des injections de veine queue réussie, il est essentiel de s’assurer un positionnement stable de l’aiguille dans le vaisseau sanguin. Ceci est facilement réalisé dans les veines de plus grand diamètre au plus près à la base de la queue. En outre, la dilatation de la veine par échauffement de la queue est fortement recommandée. Les meilleurs résultats sont obtenus à l’aide d’une lampe à infrarouge, mais une lampe de chaleur infrarouge non ou l’immersion de la queue dans l’eau chaude peut également être utilisée. Dans certains cas, complétant jusqu'à 200 µL de solution saline par injection intrapéritonéale environ 30 minutes avant de HTVI permettra d’améliorer l’état d’hydratation des animaux ce qui entraîne une dilatation des vaisseaux sanguins. Pour maintenir une vitesse constante d’injection, la queue de la souris doit être immobilisée soigneusement afin d’éviter tout mouvement de la queue, ce qui peut entraîner le déplacement de l’aiguille. À des fins de validation, nous vous suggérons d’utiliser une construction qui peut être détectée par immunohistochimie. Alternativement, on peut estimer l’efficacité de transfection par analyse ADN messagère de l’expression ou intégré de séquençage d’ADN28.
Nos données montrent que l’intégration transposon est préférence dans la région de péricentraux du lobule hépatique. La transfection prédominante des hépatocytes autour de la veine centrale est probablement due à l’hémodynamique unique de HTVI comme on l’observe aussi dans la transfection basée non-transposon29. Cette conclusion peut être utile pour certaines applications, telles que l’induction d’atteinte hépatique aiguë par la CCl4, qui affecte principalement les hépatocytes péricentraux. Dans le cadre de l’efficacité de transfection faible, CCl4 traitement pourrait donc conduire à une réduction significative du nombre des hépatocytes transfectés. En outre, HTVI est d’une utilité limitée pour cibler les cellules périportale dont canal cholédoque cellules15.
En plus des systèmes qui utilisent des HTVI de constructions de transposons pour atteindre l’expression stable d’un transgène unique, nous avons récemment présenté un système qui permet la co-expression de CreER et expression inductible d’un gène ou un miR-shARN d’un unique vecteur11 . Ce système est particulièrement utile d’interroger des gènes spécifiques dans la base de Cre/LoxP des souches de souris. Constructions de transgènes ou shARN sont introduites par une procédure de clonage de recombinaison rapide et fiable, le système peut facilement être adapté pour les approches de dépistage. Le système vectoriel négocie l’expression inductible fiable en vivo qui dépend entièrement de la livraison de doxycycline11,30. Ce guide pratique axée sur la vidéo fournit des instructions détaillées du clonage des vecteurs appropriés au fil de l’induction de l’expression génique à l’analyse du tissu hépatique.
Toutefois, afin d’assurer l’efficacité du système, plusieurs aspects devraient garder à l’esprit : pour maintenir l’expression à long terme, intégration génomique est véhiculée à TA-sites de la belle au bois dormant transposase8,11. Puisque l’efficacité de l’intégration dépend de la taille du transposon, il est important de garder la taille de la construction du transgène à l’esprit lorsque vous concevez le vecteur31. En outre, l’efficacité du produit dans le foie des gènes inductibles par expression dépend de la rtTA3-promoteur11. Pour un résultat optimal expression, utilisation d’une structure vector avec un foie ApoE.HCR.hAAT-promoteur spécifique est recommandé (Addgene #85578), car il montre le rendement le plus élevé en comparaison des trois promoteurs,11. Par une construction optimisée promoteur, expression inductible de transgene/shRNA peut être détectée par immunomarquage chez 30 % des cellules transfectées20. Si des niveaux de protéine inductible existent sous un certain seuil qui est nécessaire pour la détection par immunomarquage, cela doit être déterminé. Ce qui est important, aucune expression du transgène/shRNA ne peut être détectée par immunomarquage chez les souris qui n’étaient pas traités avec la doxycycline. Enfin, l’expression de gènes sous contrôle de l’élément de réponse de tétracycline (TRE) dépend de la dose de doxycycline32,,33. Pour des expériences de courte durée, administration de doxycycline par l’eau potable est bien établie34,35. Saccharose est habituellement ajouté pour donner un meilleur goût. Toutefois, cela peut conduire à la polydipsie et la déshydratation, et l’utilisation de chow doxycycline est fortement recommandée à long terme des expériences36,37.
En résumé, injection dans la veine queue hydrodynamique est une méthode largement établie dans la recherche sur le foie. Ses gammes de demande d’études de l’hépatite B pour le carcinome hépatocellulaire ou de fibrose hépatique modèles38,39,40,41. Le système décrit dans ce manuscrit est particulièrement utile dans les interrogatoires des gènes cibles spécifiques dans les modèles Cre/LoxP-basée de l’hépatopathie. En outre, surexpression dans le foie peut également être utilisée pour la recherche de maladies hématologiques42,43 ou d’aborder des questions immunologique44,45. Au-delà de l’analyse de gènes spécifiques d’intérêt, le système présenté également facilement adaptable au dépistage ou approches de multiplexage. Ce guide sur vidéo sera donc très utile pour une grande communauté de chercheurs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Deutsche Krebshilfe, Allemagne (numéro de licence 111289 à l’UE), le Lucile Packard Foundation pour la santé enfantile (Ernest et Amelia Gallo doué bourse de recherche postdoctorale - numéro de licence de CSTC UL1 RR025744 à l’UE). Nous remercions le Dr Mark A. Kay constructions vectorielles et conseils expérimentaux et Dr Julien Sage pour les souris et expérimentale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Material | |||
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
| Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
| LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
| LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
| Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
| Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
| DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
| Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction Enzymes | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | New England BioLabs | R0156S | |
| SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
| KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| NotI | New England BioLabs | R0189S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for Mouse Experiments | |||
| Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
| Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
| Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
| Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
| Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
| Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
| NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
| Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
| Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
| pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
| pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
| pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |
References
- Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159 (2014).
- Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
- Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236 (2014).
- Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Kanefuji, T., et al. Hemodynamics of a hydrodynamic injection. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029 (2014).
- Ivics, Z., Izsvak, Z. Sleeping Beauty Transposition. Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).
- Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
- Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
- Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
- Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
- Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
- Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
- Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50 (2007).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
- Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
- Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
- Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
- Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
- Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
- Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
- Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
- Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
- Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
- Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
- Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894 (2016).
- Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
- Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
- Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
- Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
- Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936 (2015).
- Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
- Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
- Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
- Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79 (2014).
- Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023 (2014).
- Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).
