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Genetics

गठन और Inducible सिस्टम के लिए आनुवंशिक Vivo में संशोधन माउस हेपैटोसाइट्स का उपयोग Hydrodynamic टेल नस इंजेक्शन

Published: February 2, 2018 doi: 10.3791/56613
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Medicine II, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Pneumology, Center for Medicine, Medical Center University of Freiburg

Summary

transposon-आधारित एकीकरण वैक्टर के Hydrodynamic टेल नस इंजेक्शन vivo में murine हेपैटोसाइट्स के स्थिर अभिकर्मक को सक्षम बनाता है । यहां, हम अभिकर्मक प्रणालियों के लिए एक व्यावहारिक प्रोटोकॉल है कि एक एकल transgene या संयुक्त गठन और जिगर में एक transgene या मीर-shRNA की doxycycline-inducible अभिव्यक्ति की लंबी अवधि के गठन की अभिव्यक्ति सक्षम बनाता है के लिए प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

यकृत कैंसर के अनुसंधान मॉडल में, पुनर्जनन, सूजन, और फाइब्रोसिस, vivo जीन अभिव्यक्ति और मुंह में के लिए लचीला प्रणालियों अत्यधिक उपयोगी होते हैं । transposon के Hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन-आधारित constructs वयस्क चूहों में हेपैटोसाइट्स के आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक कुशल तरीका है । गठन transgene अभिव्यक्ति के अलावा, इस प्रणाली ऐसे shRNA के रूप में और अधिक उंनत अनुप्रयोगों, के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जीन दस्तक नीचे, CRISPR/Cas9 प्रणाली के निहितार्थ को जीन उत्परिवर्तनों, या inducible प्रणालियों प्रेरित । यहां, एक transgene या मीर की inducible अभिव्यक्ति के साथ मिलकर गठित CreER अभिव्यक्ति का संयोजन-पसंद के shRNA इस तकनीक का एक उदाहरण के रूप में प्रस्तुत किया है । हम बहु कदम प्रक्रिया को कवर स्लीपिंग ब्यूटी-transposon निर्माण की तैयारी से शुरू, इंजेक्शन और चूहों के उपचार के लिए, और immunostaining द्वारा विश्लेषण के लिए जिगर ऊतक की तैयारी. प्रस्तुत प्रणाली हेपैटोसाइट्स में जटिल आनुवंशिक जोड़तोड़ को प्राप्त करने के लिए एक विश्वसनीय और कुशल दृष्टिकोण है । यह विशेष रूप से Cre/loxP-आधारित माउस उपभेदों के साथ संयोजन में उपयोगी है और जिगर की बीमारी के अनुसंधान में मॉडलों की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

जीर्ण जिगर की बीमारी एक प्रमुख स्वास्थ्य बोझ दुनिया भर में1प्रस्तुत करता है । पशु अनुसंधान मॉडल जिगर की बीमारी के अध्ययन में आवश्यक उपकरण है और जिगर पुनर्जनन, यकृत शोथ, और steatosis के रूप में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जिगर कैंसर2में जटिल सवालों के जवाब में मदद मिली है । इन जानवरों के मॉडल की एक पर्याप्त संख्या जिगर की कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन पर भरोसा करते हैं । इसलिए, कुशल उपकरण हेपैटोसाइट्स में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए सहायक है3। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस उपभेदों या hepatocyte संक्रमण के लिए वायरल वैक्टर की पीढ़ी के प्रजनन के रूप में स्थापित तरीकों या तो समय लेने वाले हैं, बंदरगाह सुरक्षा चिंताओं, या हेपैटोसाइट्स में उपज गरीब transgene अभिव्यक्ति में vivo 4 , 5. Hydrodynamic टेल नस इंजेक्शन (HTVI) जिगर में जीन समारोह के आसान, तेज, और लागत कुशल पूछताछ के लिए अनुमति हेपैटोसाइट्स के vivo अभिकर्मक में एक वैकल्पिक तरीका है । HTVI के लिए, एक वेक्टर वांछित डीएनए अनुक्रम ले जाने इंजेक्शन जानवर के शरीर के वजन का 10% करने के लिए इसी खारा की मात्रा में भंग कर रहा है । समाधान तो 5-10 एस के भीतर पूंछ नस में इंजेक्शन है6। हृदय उत्पादन से अधिक, वेना कावा से खारा बहती जिगर की नसों में, जिगर के विस्तार के लिए अग्रणी और हेपैटोसाइट्स के hydrodynamic अभिकर्मक7. स्थिर जीनोमिक एकीकरण प्राप्त करने के लिए विधि को transposon आधारित वैक्टर के साथ जोड़ा गया है, जैसे कि स्लीपिंग ब्यूटी-transposon सिस्टम । यह सिस्टम जीनोमिक पुनर्संयोजन साइटों के साथ लक्ष्य वैक्टर के संयोजन मध्यस्थता एक सोने की सुंदरतासे catalyzed-transposase8,9. जिगर फाइब्रोसिस या कैंसरजनन के मॉडलों के लिए, यह अक्सर व्यक्त या रोग मॉडल के कुछ समय बिंदुओं पर मौन जीन के लिए वांछनीय है । इस प्रयोजन के लिए, inducible जीन व्यंजक जैसे Cre/LoxP-प्रणाली या टेट्रासाइक्लिन-inducible जीन अभिव्यक्ति प्रणाली (Tet-On) के लिए उपकरण10का उपयोग किया जा सकता है ।

यहां, हम एक सो सौंदर्य transposon आधारित प्रणाली के HTVI का उपयोग कर murine हेपैटोसाइट्स के vivo अभिकर्मक में के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । के लिए एक प्रोटोकॉल के अलावा स्थिर, एक जिगर के नियंत्रण के तहत एक transgene के गठन की अभिव्यक्ति विशेष प्रमोटर, हम एक और अधिक उंनत वेक्टर प्रणाली है कि गठन tamoxifen-निर्भर Cre recombinase (CreER) अभिव्यक्ति के साथ जोड़ती है का वर्णन एक transgene या microRNA के inducible अभिव्यक्ति-अनुकूलित shRNA (मीर-shRNA), pTC TET-प्रणाली11कहा जाता है । इस वेक्टर प्रणाली में, inducible transgenes या मीर-shRNAs टेट्रासाइक्लिन-निर्भर अभिव्यक्ति के लिए एक पुनर्संयोजनीय क्लोनिंग प्रणाली के साथ रीढ़ वेक्टर में क्लोन कर रहे हैं, की अनुमति तेजी से और आसान पीढ़ी के नए वैक्टर12। इस वीडियो आधारित गाइड उपयुक्त वैक्टर, इंजेक्शन और चूहों के उपचार inducible transgene/मीर-shRNA अभिव्यक्ति को प्राप्त करने की तैयारी को शामिल किया गया है, और अंत में विश्लेषण के लिए जिगर ऊतक की तैयारी । इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि किसी भी Cre के संयोजन को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था/loxP मध्यस्थता माउस प्रणाली अभिव्यक्ति के साथ या किसी भी पसंद के जीन की दस्तक, यह जिगर की बीमारी के अनुसंधान में एक व्यापक रूप से लागू प्रणाली बना रही है.

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया और जिंमेदार अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गया (Regierung वॉन Oberbayern, म्यूनिख, जर्मनी और स्टैनफोर्ड संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति, स्टैनफोर्ड, सीए, यूएसए) । क्लोनिंग (चरण 1 से 4) के लिए सभी plasmids की एक सूची अनुपूरक तालिका एस 2 में प्रदान की गई है ।

1. गठित जीन अभिव्यक्ति के लिए एक Transgene की क्लोनिंग

  1. डिजाइन transgene प्रवर्धन13,14के लिए प्राइमर ।
  2. आगे प्राइमर के 5 ' अंत करने के लिए PacI (TTAATTAA) के लिए प्रतिबंध साइटों जोड़ें । एएससीआई (GGCGCGCC) या FseI (GGCCGGCC) के लिए प्रतिबंध साइटों को रिवर्स प्राइमर के 5 ' अंत तक जोड़ें ।
  3. पीसीआर द्वारा बढ़ाना transgene वांछित transgene14के लिए अनुकूलित शर्तों का उपयोग करके । एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए शोधन किट का उपयोग कर शुद्ध ।
    नोट: एनीलिंग समय १.१ कदम में डिजाइन प्राइमरों पर निर्भर करता है., बढ़ाव समय निर्माण की लंबाई पर निर्भर करता है । उदाहरण के लिए, एक के निर्माण के लिए १,००० बीपी लंबाई का उपयोग ६० के बढ़ाव समय एस ।
  4. डाइजेस्ट transgene और गठित जीन अभिव्यक्ति के लिए वेक्टर15 संबंधित प्रतिबंध के साथ nucleases (१.२ कदम देखें) और ५० µ एल की कुल मात्रा में बफर ३७ डिग्री सेल्सियस रात भर में । उदाहरण के लिए, डाइजेस्ट 5 इकाइयों के साथ निर्माण PacI और 5 इकाइयों FseI अगर उचित (१.२ कदम देखें) ।
  5. जेल शुद्ध पचा वेक्टर और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर डालें । एक मानक बंधाव के १०० एनजी के सदिश और 100-1000 के लिए 14 डिग्री सेल्सियस पर ४०० यू टी-4 ligase का उपयोग कर डालने के एनजी 15 एच. हीट 10 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय ।
  6. एक मानक हीट शॉक-प्रोटोकॉल16का उपयोग कर सक्षम बैक्टीरिया को बदलने ।
  7. १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन युक्त प्लेटों पर प्लेट आगर । 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर मशीन
  8. एकल कालोनियों उठाओ, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक miniprep किट का उपयोग कर प्लाज्मिड डीएनए शुद्ध और सैंज sequencing द्वारा अनुक्रम की पुष्टि17 (sequencing प्राइमर: 5 ' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3 ') ।
  9. प्लाज्मिड डीएनए के मैक्सी स्केल प्रवर्धन के लिए सकारात्मक कालोनियों का उपयोग करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक endotoxin मुक्त प्लाज्मिड तैयारी किट18 का उपयोग कर शुद्ध ।
  10. निर्माण इंजेक्शन के लिए तैयार है, इस प्रकार 5 कदम के साथ जारी है ।

2. Inducible जीन अभिव्यक्ति के लिए एक Transgene की क्लोनिंग

  1. डिजाइन transgene प्रवर्धन13,14के लिए प्राइमर ।
  2. आगे प्राइमर के 5 ' अंत करने के लिए SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT), या KpnI (GGTACC) के लिए प्रतिबंध साइटों जोड़ें । नोटि (GCGGCCGC) या XhoI (CTCGAG) के लिए प्रतिबंध साइटों को रिवर्स प्राइमर के 5 ' अंत में जोड़ें ।
  3. पीसीआर द्वारा बढ़ाना transgene वांछित transgene14के लिए अनुकूलित शर्तों का उपयोग करके । एक वाणिज्यिक डीएनए शोधन किट का उपयोग कर शुद्ध ।
  4. शुद्ध transgene और प्रवेश वेक्टर के 4 µ जी डाइजेस्ट (pEN_TTmcs-वेक्टर, सामग्री की तालिकादेखें)19 अलग उचित प्रतिबंध के साथ nucleases (२.२ कदम देखें) और ५० µ एल की कुल मात्रा में बफर ३७ डिग्री सेल्सियस रात भर में ।
  5. जेल शुद्ध पचा वेक्टर और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर डालें । १०० के साथ मानक बंधाव प्रदर्शन वेक्टर के एनजी और 100-डालने के एनजी ४०० यू टी-4 ligase पर 14 ° c 16 h. Heat के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए निष्क्रिय का उपयोग कर ।
  6. एक मानक हीट शॉक-प्रोटोकॉल16का उपयोग कर सक्षम बैक्टीरिया को बदलने ।
  7. 15 µ g/mL gentamicin वाली प्लेट्स पर प्लेट आगर. 16 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
  8. , एकल कालोनियों उठाओ प्लाज्मिड डीएनए शुद्ध, और sequencing द्वारा डालने की पुष्टि17 का उपयोग कर pCEP आगे प्राइमर: 5 ' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3 ' ।
    नोट: सिंगल कालोनियों पर पीसीआर को प्राइमरी pCEP फॉरवर्ड और pCEP रिवर्स (5 ' आगा AAG CTG GGT CTA गात एटीसी TCG 3 ') के साथ बिना पूर्व शुद्धि के प्रदर्शन किया जा सकता है । यह चरण धनात्मक कालोनियों के पूर्व-चयन के लिए उपयोगी हो सकता है ।
  9. चरण 4 पर जाएं ।

3. एक मीर की क्लोनिंग-shRNA के लिए Inducible जीन नॉक-डाउन

  1. डिजाइन मीर-shRNA oligonucleotides pSLIK क्लोनिंग प्रोटोकॉल के अनुसार19। ddH2ओ में ऐनी और शुद्ध oligonucleotides और पतला 1:20 ।
  2. 3 एच के लिए ५० ° c पर 5 U BfuAI के साथ प्रवेश वेक्टर के µ g को डाइजेस्ट करें, फिर 20 मिनट के लिए ६५ ° c पर प्रतिक्रिया को निष्क्रिय कर दीजिये ।
    नोट: यदि सह ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति (GFP) वांछित है, एक प्रवेश वेक्टर के रूप में pEN_TTGmiRc19 का उपयोग करें, अंयथा pEN_TTmiRc219का उपयोग करें ।
  3. जेल शुद्ध पचा वेक्टर के रूप में चरण २.५ में । १०० के मानक बंधाव प्रदर्शन वेक्टर और 1 µ l के शुद्ध और पतला shRNA oligonucleotides (चरण ३.१) के लिए कमरे के तापमान पर ४०० U टी-4 ligase का उपयोग कर 1 h. Heat 10 मिनट के लिए ६५ ° c पर निष्क्रिय ।
  4. एक मानक हीट शॉक-प्रोटोकॉल16का उपयोग कर सक्षम बैक्टीरिया को बदलने ।
  5. 15 µ g/mL gentamicin वाली प्लेट्स पर प्लेट आगर. 16 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
  6. एकल कालोनियों उठाओ, प्लाज्मिड डीएनए शुद्ध, और सैंज अनुक्रमण17 (अनुक्रमण प्राइमर: 5 ' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3 ') द्वारा डालने की पुष्टि करें ।
  7. चरण 4 पर जाएं ।

4. युग्मक क्लोनिंग तैयार करने के लिए इंजेक्शन क्लोन उत्पन्न करने के लिए

  1. मिक्स १५० प्रवेश सदिश के एनजी (से कदम 2 या चरण 3) और १५० pTC TET के एनजी-20।
  2. एक कुल वॉल्यूम 8 µ l के लिए ते बफ़र जोड़ें (pH = 8) ।
  3. LR-clonase एंजाइम मिक्स द्वितीय स्थानांतरण ( सामग्री की तालिकादेखें) बर्फ के लिए, 2 मिनट के भंवर के लिए दो बार गर्मी ।
  4. 1 एच के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया और मशीन के लिए LR-clonase एंजाइम मिश्रण द्वितीय के 2 µ एल जोड़ें
  5. Proteinase K-समाधान के 1 µ l को जोड़कर प्रतिक्रिया रोकें । 10 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
  6. एक मानक गर्मी सदमे-प्रोटोकॉल16का उपयोग कर संयोजन क्लोनिंग मिश्रण के 2 µ एल के साथ Stbl3 सक्षम बैक्टीरिया को बदलने.
  7. १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन युक्त प्लेटों पर प्लेट आगर । 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर मशीन
  8. एकल कालोनियों उठाओ, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक endotoxin मुक्त प्लाज्मिड तैयारी किट18 का उपयोग कर प्लाज्मिड डीएनए शुद्ध, और17 (sequencing प्राइमर 5 ' sequencer अनुक्रमण द्वारा वेक्टर अखंडता की पुष्टि करें AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3 ') ।
  9. निर्माण इंजेक्शन के लिए तैयार है, चरण 5 के साथ जारी है ।

5. Hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन के लिए समाधान की तैयारी

नोट: गठन और inducible जीन अभिव्यक्ति के लिए निर्माण की तैयारी चरण 1, 2, 3, और 4 में वर्णित हैं ।

  1. इंजेक्शन के लिए बाँझ ०.९% खारा तैयार (पंजाबियों का उपयोग नहीं करते हैं). माउस शरीर के वजन के बारे में 10% के लिए इसी मात्रा का उपयोग करें । उदाहरण: एक माउस 20 जी वजन के लिए, समाधान के 2 मिलीलीटर तैयार करते हैं ।
  2. इंजेक्शन वैक्टर कि एक endotoxin-मुक्त प्लाज्मिड शोधन किट का उपयोग कर शुद्ध थे तैयार18 (चरण १.८ या ४.८, क्रमशः देखें) ।
  3. जोड़ें 10 µ g या 15 µ g के endotoxin-नि: शुल्क स्लीपिंग ब्यूटी वेक्टर निर्माण (स्टेप 1 से 10 µ जी, स्टेप 4 से फीमेल 15 µ g, क्रमशः) और 1 µ जी का endotoxin-फ्री पीसी-HSB521 प्रति मिलीलीटर बाँझ खारा.
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए समाधान की दुकान । फ्रीज न करें ।

6. प्रदर्शन Hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन

  1. पूंछ नस इंजेक्शन (वाणिज्यिक या सांस लेने के लिए और पूंछ के लिए छेद के साथ एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब से तैयार) के लिए एक निरोधक का प्रयोग करें । टिशू पेपर के साथ ट्यूब के नीचे भरें ।
  2. इंजेक्शन के लिए, के बारे में 8 के चूहों का उपयोग करें – 10 के वजन के साथ उम्र के सप्ताह 20 – 25 जी.
  3. इंजेक्शन से पहले चूहों वजन और शरीर के वजन के अनुसार इंजेक्शन की मात्रा तैयार (शरीर के वजन के 10% के लिए इसी, कदम ५.१ देखें) । इंजेक्शन के लिए एक 27 जी सुई के साथ एक बाँझ 3 मिलीलीटर सिरिंज तैयार करने और आवश्यक मात्रा के साथ भरें ।
  4. छलनी में माउस रखें । ऊतक कागज की राशि (६.१ कदम देखें) को समायोजित करने के लिए आंदोलन के लिए केवल ंयूनतम जगह है लेकिन सांस लेने के लिए पर्याप्त जगह छोड़ दें ।
  5. सुनिश्चित करें कि माउस नियमित रूप से सांस ले रहा है ।
  6. 30-60 एस के लिए एक अवरक्त दीपक का उपयोग कर पूंछ गर्म ध्यान से overheating के संकेत के लिए देखो ।
  7. एक शराब झाड़ू के साथ पूंछ साफ ।
  8. एक दो पार्श्व पूंछ नसों की पूंछ के आधार के पास में या तो एक में लगभग क्षैतिज सुई डालें ।
    नोट: यदि सफलतापूर्वक रखा, रक्त की एक छोटी राशि वापस सुई के शंकु में प्रवाह हो सकता है । यह सुई के किसी भी अतिरिक्त आंदोलन के रूप में सक्रिय रूप से महाप्राण करने के लिए अनुशंसित नहीं है अपने विस्थापन में परिणाम कर सकते हैं और/या नस की चोट ।
  9. 8-10 s के भीतर पूंछ नस में कुल मात्रा इंजेक्षन ।
  10. तुरंत छलनी से माउस को हटा दें । न्यूनतम 30 या किसी भी खून बह रहा है जब तक के लिए घाव सेक इंजेक्शन ।
  11. माउस को एक अलग पिंजरे में रखें । एक बार माउस प्रक्रिया से बरामद किया है (के बारे में 30-60 मिनट), अपने मूल पिंजरे में वापस माउस हस्तांतरण । अगले 24 ज के लिए नियमित रूप से माउस पर जांच करें ।
    नोट: माउस के हल्के बेहोशी नियमित रूप से इंजेक्शन के बाद 2 घंटे के लिए मनाया जाता है ।
  12. आगे के प्रयोगों (यानी, चरण 7) के साथ कार्यवाही करने से पहले, गैर-एकीकृत वैक्टर की निकासी के लिए 10-15 दिनों तक प्रतीक्षा करें ।

7. Tamoxifen के साथ Transfected CreER की प्रेरण

चेतावनी: Tamoxifen हानिकारक है, हो सकता है कैंसर या नुकसान प्रजनन क्षमता । कृपया सुरक्षा डेटा पत्रक देखें ।

  1. लगातार तीन दिनों पर intraperitoneal tamoxifen इंजेक्शन लगाने की योजना है ।
  2. 1 दिन पर, भंग 10 ४० µ एल इथेनॉल में tamoxifen के मिलीग्राम । 10 मिनट के लिए ५५ ° c पर मशीन भंवर कई बार जब तक tamoxifen भंग कर दिया है ।
  3. जोड़ें ९६० µ एल मकई तेल । ५५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मशीन । भंवर एक स्पष्ट समाधान प्राप्त करने के लिए कई बार ।
  4. एक 27 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज में समाधान तैयार करते हैं ।
  5. माउस की गरदन को अंगूठे से और दूसरी अँगुली से सावधानीपूर्वक पकड़कर, हाथ के आधार और चौथी और पाँचवीं अँगुली के बीच की पूंछ को फिक्सिंग में कूड़ा.
  6. ०.१ मिलीलीटर सुई (= 1 tamoxifen के एमजी) पेट के बाएँ निचले वृत्त का चक्र में समाधान intraperitoneally की.
  7. दो और तीन दिनों पर इंजेक्शन दोहराएं ।

8. टेट्रासाइक्लिन-निर्भर जीन या shRNA अभिव्यक्ति की प्रेरण

सावधानी: Doxycycline हानिकारक हो सकता है । कृपया सुरक्षा डेटा पत्रक देखें ।

नोट: प्रकार और प्रयोग की अवधि के आधार पर, doxycycline पीने के पानी में आपूर्ति की जा सकती (८.१ कदम) या चाउ (चरण ८.२)

  1. अल्पावधि प्रयोगों के लिए (< 10 दिन) निम्न प्रोटोकॉल का उपयोग करके पीने के पानी के माध्यम से doxycycline का व्यवस्थापन ।
    1. नल का पानी १०० मिलीलीटर में 5 ग्राम सुक्रोज भंग । आटोक्लेव.
    2. भंग १०० मिलीग्राम doxycycline-hyclate के 5 मिलीलीटर में सुक्रोज समाधान (चरण 8.1.1) एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में ।
    3. एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करना, एक ०.२ µm फिल्टर के माध्यम से समाधान बाँझ फिल्टर. चरण 8.1.1 में तैयार सुक्रोज समाधान में जोड़ें ।
    4. आपूर्ति doxycycline-माउस को पीने के पानी के रूप में सुक्रोज समाधान । दैनिक जांच करें और बदलें जब समाधान जीवाणु अधिक वृद्धि का संकेत बादल बन जाता है (नवीनतम पर तीन दिनों के बाद स्पष्ट समाधान की जगह) ।
  2. लंबे समय तक प्रयोग (> 10 दिन) या चयापचय परिवर्तन के प्रति संवेदनशील प्रयोगों के लिए, वाणिज्यिक doxycycline-चाउ का उपयोग करें (उदा, doxycycline Hyclate चाउ ०.६२५ ग्राम/निर्जलीकरण और/या सुक्रोज से बचने के लिए इलाज जानवरों के जिगर में परिवर्तन प्रेरित ।

9. Immunostaining द्वारा विश्लेषण के लिए माउस जिगर की तैयारी

सावधानी: Paraformaldehyde हानिकारक हो सकता है । कृपया सुरक्षा डेटा पत्रक देखें ।

नोट: timepoint जब चूहों का विश्लेषण किया जाएगा प्रयोग पर निर्भर करता है । यह transgene या shRNA अभिव्यक्ति की पर्याप्त प्रेरण सुनिश्चित करने के लिए doxycycline उपचार के कोई कम से तीन दिन के बाद जिगर के ऊतकों का विश्लेषण करने के लिए सिफारिश की है ।

  1. 4% paraformaldehyde समाधान (पीएफए) के 1 मिलीलीटर के साथ एक 27 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज तैयार करें ।
  2. एक अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार एक उपयुक्त विधि द्वारा माउस Euthanize ।
    नोट: इच्छामृत्यु के उपयुक्त तरीकों के लिए दिशानिर्देश संस्था के आधार पर भिन्न हो सकते हैं ।
  3. विच्छेदन कैंची और संरचनात्मक संदंश का उपयोग करना, ध्यान से उदर गुहा खोलने के लिए एक औसत laparotomy जिगर को बेनकाब करने के लिए. पोर्टल शिरा और अवर वेना कावा (IVC) को बेनकाब करने के लिए सही करने के लिए छोटी आंत ले जाएँ.
  4. तैयार सिरिंज की सुई डालें (चरण ९.१ देखें) IVC में और पोर्टल नस में कटौती. पीएफए के 1 मिलीलीटर सुई धीरे IVC में जिगर ऊतक perfuse और ऑटो फ्लोरोसेंट लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए (वांछनीय अगर immunofluorescent धुंधला प्रदर्शन किया जाएगा) ।
  5. जिगर निकालें । पानी में कुल्ला और 5 को हस्तांतरण-4% पीएफए समाधान के 10 मिलीलीटर ।
  6. तेल वर्गों के लिए, 36 के लिए ठीक ऊतक-48 ज. ऊतक निर्जलीकरण और आयल embedding के लिए तैयार है ।
  7. जमे हुए वर्गों के लिए, 1 एच के लिए 4% पीएफए में ऊतक तय ।
    1. cryoprotection के लिए, 10% सुक्रोज समाधान के लिए स्थानांतरण । ६० मिनट की मशीन ।
    2. 20% सुक्रोज समाधान के लिए स्थानांतरण । ६० मिनट की मशीन ।
    3. 30% सुक्रोज समाधान के लिए स्थानांतरण । 12-16 ज. जमे हुए वर्गों के लिए एंबेडिंग यौगिक में एंबेड और-20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज ।

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Representative Results

hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन द्वारा अभिकर्मक प्रभावकारिता: एक इंजेक्शन द्वारा hydrodynamically transfected रहे हैं कि murine हेपैटोसाइट्स का प्रतिशत चर है और इंजेक्शन की मात्रा, इंजेक्शन समय, इंजेक्शन डीएनए की मात्रा के रूप में कई मापदंडों पर निर्भर करता है, और इंजेक्शन का निर्माण6का आकार, 22,23. इसके अतिरिक्त, अभिकर्मक दक्षता आम तौर पर बड़ा पशुओं में कम है, जहां एक बड़ा संवहनी व्यास के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बड़ा sinusoidal क्षेत्र समग्र दबाव में कमी की ओर जाता है । अभिकर्मक दक्षता कल्पना करने के लिए, एक CreER transposon निर्माण के HTVI चूहों में प्रदर्शन किया गया था एक Rosa26mTmG रिपोर्टर tamoxifen द्वारा पीछा जीन-CreER निर्माण की मध्यस्थता सक्रियण के बाद. कम इंजेक्शन की मात्रा या तकनीकी कारणों से लंबे समय तक इंजेक्शन समय पूरे जिगर में केवल कुछ transfected हेपैटोसाइट्स detectable के साथ कम अभिकर्मक क्षमता में परिणाम है, जबकि उच्च अभिकर्मक में इष्टतम इंजेक्शन की स्थिति परिणाम एक CreER transposon (चित्र 1a) के HTVI के बाद रिपोर्टर धुंधला द्वारा दर्शाई गई क्षमता. अभिकर्मक प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए, transfected transgene के immunostaining या – के रूप में CreER के मामले में-एक उपयुक्त रिपोर्टर जीन अत्यधिक की सिफारिश की है. वैकल्पिक रूप से, अभिकर्मक क्षमता transfected transgene के mRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण से अनुमान लगाया जा सकता है ।

pericentral हेपैटोसाइट्स की अभिकर्मक: hydrodynamic इंजेक्शन के बाद, sinusoidal अंतरिक्ष के साथ एक दबाव ढाल-जहां दबाव सबसे अधिक केंद्रीय नस और periportal आरईएल में सबसे कम है-अभिकर्मक क्षेत्र में पसंदीदा pericentral के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हम transgene-व्यक्त हेपैटोसाइट्स के एक कम प्रतिशत के साथ जिगर का विश्लेषण और सह द्वारा जिगर छोटि में उनके रिश्तेदार की स्थिति का आकलन immunostaining glutamine synthetase (जी एस), pericentral हेपैटोसाइट्स के लिए एक मार्कर के लिए । दिलचस्प है, हेपैटोसाइट्स के बहुमत है कि एक CreER के HTVI के बाद रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति दिखाया केंद्रीय नस लेकिन नहीं पोर्टल क्षेत्र (चित्र 1b) केंद्रीय नस के आसपास उच्च अभिकर्मक क्षमता का संकेत के आसपास संकुल का निर्माण ।

vivo में इमेजिंग एक luciferase transposon के HTVI के बाद: का आकलन करने के लिए अगर एकल प्रतिलिपि एकीकरण transposon के HTVI के बाद मनाया24 का निर्माण vivo इमेजिंग में के लिए पर्याप्त है, हम एक transposon एक जिगर विशिष्ट के नियंत्रण में एक luciferase अभिव्यक्ति कैसेट बंदरगाह का निर्माण इंजेक्शन प्रवर्तक निर्माण होते. चूहों luciferin के साथ इंजेक्शन और एक vivo इमेजिंग प्रणाली में दो सप्ताह के बाद HTVI (चित्रा 2a) का उपयोग कर imaged थे । इमेजिंग जिगर में मजबूत और स्थिर luciferase bioluminescence दिखाया 15 दिनों के इंजेक्शन के बाद और बाद में समय अंक (आंकड़ा b और डेटा नहीं दिखाया गया है) । इन परिणामों से पता चलता है कि सिस्टम सफलतापूर्वक bioluminescence इमेजिंग द्वारा vivo में transfected कोशिकाओं की उपस्थिति का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

संयुक्त CreER और inducible transgene या shRNA अभिव्यक्ति: हम पहले एक transposon निर्माण कि एक CreER की inducible अभिव्यक्ति या पसंद की एक transgene के साथ एक inducible Cre recombinase (shRNA) के गठन की अभिव्यक्ति को जोड़ती है20 (चित्र 3ए) । इस के इंजेक्शन Rosa26mTmGमें निर्माण-रिपोर्टर चूहों और CreER सक्रियण tamoxifen द्वारा रिपोर्टर जीन की मजबूत अभिव्यक्ति एक transposon अभिव्यक्ति के लिए निर्माण के साथ प्राप्त परिणामों के लिए तुलनीय दिखाया ( चित्र बी) । doxycycline उपचार के बाद, inducible transgene अभिव्यक्ति transfected हेपैटोसाइट्स (चित्रा 3सी) में उपयुक्त एंटीबॉडी द्वारा visualized किया जा सकता है । inducible shRNA अभिव्यक्ति के लिए, एक GFP-shRNA के निर्माण का उपयोग cytoplasmic GFP द्वारा पता लगाया अभिव्यक्ति immunostaining अभिव्यक्ति के लिए एक किराए मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में सिफारिश की है (चित्रा 3d) । नोट की, transgene या shRNA अभिव्यक्ति, क्रमशः, हेपैटोसाइट्स के एक सबसेट में केवल detectable है, जो प्रोटीन अभिव्यक्ति के अपेक्षाकृत उच्च स्तर immunostaining द्वारा पता लगाने के लिए आवश्यक के कारण हो सकता है20।

Figure 1
चित्र 1: HTVI द्वारा हेपैटोसाइट्स का अभिकर्मक. (क) चर अभिकर्मक क्षमता एक CreER के HTVI के बाद चूहों में transposon एक Rosa26mTmG बंदरगाह और tamoxifen के साथ उपचार के बाद । Transfected हेपैटोसाइट्स झिल्ली बंधे ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP, ग्रीन) के लिए सकारात्मक हैं । (ख) सह केंद्रीय नस मार्कर glutamine synthetase (जी एस, लाल) के साथ एक Rosa26mTmG रिपोर्टर हार्बर चूहों में CreER सक्रिय हेपैटोसाइट्स (ग्रीन) के लिए दाग । यहां पीवी: पोर्टल नस, CV: केंद्रीय नस । स्केल बार्स १०० µm का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: luciferase के vivo में इमेजिंग. (क) Transposon एक luciferase अभिव्यक्ति कैसेट युक्त निर्माण (पैमाने पर तैयार नहीं) । यकृत luciferase अभिव्यक्ति के दृश्य के लिए इंजेक्शन और उपचार योजना । SB: सो रही है सौंदर्य मांयता साइटें, HTVI: hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन । (ख) यकृत luciferase bioluminescence के प्रतिनिधि छवि एक transposon के HTVI के बाद 15 दिन luciferase के साथ मिलकर निर्माण pHSB5 के साथ एक vivo इमेजिंग प्रणाली में एक का उपयोग कर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: संयुक्त CreER और inducible जीन/shRNA अभिव्यक्ति । (क) Transposon की अभिव्यक्ति के लिए inducible Cre recombinase एक साथ एक टेट्रासाइक्लिन की अभिव्यक्ति के लिए निर्माण-inducible transgene या shRNA (पीटीसी Tet), पैमाने के लिए तैयार नहीं । (ख) हरी झिल्ली धुंधला transfected हेपैटोसाइट्स के इंजेक्शन के बाद pTC Tet का निर्माण Rosa26mTmG में/ रिपोर्टर चूहों और CreER सक्रियण के साथ tamoxifen । स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है १०० µm. (ग) Inducible जीन अभिव्यक्ति 5 दिनों के बाद doxycycline उपचार transgene याप में transfected (हेपैटोसाइट्स, लाल) के लिए immunostaining द्वारा visualized किया जा सकता है । (घ) Inducible मीर-shRNA अभिव्यक्ति 5 दिनों के बाद doxycycline उपचार cytoplasmic ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) GFP-shRNA के धुंधला का निर्माण द्वारा संकेत दिया । Transfected हेपैटोसाइट्स झिल्ली बंधे GFP से चित्रित कर रहे हैं । सी में स्केल बार्स) और D) ५० µm का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन के साथ हेपैटोसाइट्स के अभिकर्मक अपने परिचय से अधिक 15 साल पहले6से एक स्थापित विधि बन गया है । इंजेक्शन मात्रा कार्डियक आउटपुट से अधिक है और जिगर के sinusoids में अवर वेना कावा से बहती है7, के बारे में 10-20% की अभिकर्मक करने के लिए अग्रणी, कुछ मामलों में हेपैटोसाइट्स25,26के ४०% तक । एक सफल अभिकर्मक के भविष्यवक्ताओं इंजेक्शन समय22,23प्रति इंजेक्शन मात्रा रहे हैं । इसलिए, एक कम अभिकर्मक दक्षता (आंकड़ा 1a, बाएँ पैनल) आमतौर पर प्रक्रिया7के दौरान इंजेक्शन की गति को बनाए रखने के लिए विफलता के कारण है. हालांकि, यहां तक कि एक इष्टतम तकनीक के साथ, अभिकर्मक क्षमता है कि HTVI द्वारा प्राप्त किया जा सकता है एडिनोवायरस या adeno-जुड़े वायरस के साथ वायरल संक्रमण द्वारा प्राप्त दर से नीचे रह जाएगा कि लगभग १००%5तक पहुंच सकता है,27 . सफल पूंछ नस इंजेक्शन प्राप्त करने के लिए, यह रक्त वाहिनियों में सुई की एक स्थिर स्थिति सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह आसानी से बड़े व्यास के साथ नसों में पूंछ के आधार के करीब हासिल की है । इसके अतिरिक्त, पूंछ वार्मिंग द्वारा नस के फैलाव अत्यधिक की सिफारिश की है । सबसे अच्छा परिणाम एक अवरक्त लैंप का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं, लेकिन एक गैर अवरक्त गर्मी लैंप या गर्म पानी में पूंछ के विसर्जन भी इस्तेमाल किया जा सकता है । कुछ मामलों में, 30 मिनट के आसपास intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा खारा के २०० µ एल को पूरक करने से पहले HTVI रक्त वाहिकाओं के फैलाव में जिसके परिणामस्वरूप जानवरों की जलयोजन स्थिति में सुधार होगा । लगातार इंजेक्शन की गति को बनाए रखने के लिए, माउस की पूंछ पूरी तरह से पूंछ के किसी भी आंदोलन से बचने के लिए रोका जाना चाहिए, जो सुई के विस्थापन में परिणाम कर सकते हैं । मांयता प्रयोजनों के लिए, हम एक निर्माण है कि immunostaining द्वारा पता लगाया जा सकता का उपयोग सुझाव है । वैकल्पिक रूप से, अभिकर्मक प्रभावकारिता mRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण या एकीकृत डीएनए के अनुक्रमण द्वारा अनुमान लगाया जा सकता28.

हमारे डेटा से संकेत मिलता है कि transposon एकीकरण अधिमानतः जिगर छोटि के pericentral क्षेत्र में मनाया जाता है । मध्य शिरा के आसपास हेपैटोसाइट्स के प्रमुख अभिकर्मक HTVI के अनूठे hemodynamics के कारण होने की संभावना है क्योंकि यह भी गैर-transposon आधारित अभिकर्मक में मनाया जाता है29. इस खोज प्रासंगिकता के कुछ अनुप्रयोगों के लिए हो सकता है, CCl द्वारा तीव्र जिगर की क्षति के प्रेरण के रूप में4, जो मुख्य रूप से pericentral हेपैटोसाइट्स को प्रभावित करता है । कम अभिकर्मक दक्षता के संदर्भ में, CCl4 उपचार इसलिए transfected हेपैटोसाइट्स की संख्या में उल्लेखनीय कमी करने के लिए नेतृत्व कर सकता है । साथ ही, HTVI पित्त वाहिनी कोशिकाओं15सहित periportal कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए सीमित उपयोग की है ।

प्रणालियों के अलावा कि transposon के HTVI का उपयोग करने के लिए एक एकल transgene के स्थिर अभिव्यक्ति प्राप्त करने का निर्माण, हम हाल ही में एक प्रणाली है कि सह की अनुमति देता है प्रस्तुत एक जीन या एक मीर के CreER और inducible अभिव्यक्ति की अभिव्यक्ति-shRNA से एक सदिश11 . यह प्रणाली विशेष रूप से Cre/LoxP-आधारित माउस उपभेदों में विशिष्ट जीन पूछताछ उपयोगी है । के रूप में transgenes या shRNA constructs एक तेजी से और विश्वसनीय पुनर्संयोजनीय क्लोनिंग प्रक्रिया द्वारा पेश कर रहे हैं, प्रणाली आसानी से स्क्रीनिंग दृष्टिकोण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । वेक्टर प्रणाली vivo में विश्वसनीय inducible अभिव्यक्ति है कि पूरी तरह से doxycycline11,30की डिलीवरी पर निर्भर है मध्यस्थता । यह व्यावहारिक वीडियो आधारित गाइड कदम दर कदम निर्देश के जिगर ऊतक के विश्लेषण के लिए जीन अभिव्यक्ति की प्रेरण पर उपयुक्त वैक्टर की क्लोनिंग से प्रदान करता है ।

हालांकि, इस प्रणाली की दक्षता सुनिश्चित करने के लिए, कई पहलुओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए: दीर्घकालिक अभिव्यक्ति बनाए रखने के लिए, जीनोमिक एकीकरण स्लीपिंग ब्यूटी transposase8,11द्वारा टीए-साइटों पर मध्यस्थता है । के बाद से एकीकरण दक्षता transposon आकार पर निर्भर है, यह महत्वपूर्ण है transgene के आकार रखने के मन में निर्माण जब वेक्टर31डिजाइन । इसके अलावा, जिगर में inducible जीन उत्पाद की अभिव्यक्ति दक्षता rtTA3-प्रमोटर11पर निर्भर है । इष्टतम अभिव्यक्ति परिणामों के लिए, एक सदिश का उपयोग एक जिगर के साथ निर्माण विशिष्ट ApoE. HCR. हाट-प्रमोटर (Addgene #85578) की सिफारिश की है, क्योंकि यह तीन मोटरों की तुलना में उच्चतम दक्षता से पता चलता है11. एक अनुकूलित प्रमोटर के निर्माण के साथ, inducible transgene/shRNA अभिव्यक्ति immunostaining द्वारा transfected कोशिकाओं के 30% तक में पाया जा सकता है20। यदि inducible प्रोटीन का स्तर immunostaining द्वारा पता लगाने के लिए आवश्यक है कि एक निश्चित सीमा के नीचे मौजूद हैं, यह निर्धारित किया जाना चाहिए । महत्वपूर्ण रूप से, कोई transgene/shRNA अभिव्यक्ति चूहों में immunostaining द्वारा पता लगाया जा सकता है कि doxycycline के साथ इलाज नहीं किया गया । अंत में, टेट्रासाइक्लिन प्रतिक्रिया तत्व (TRE) के नियंत्रण में जीन की अभिव्यक्ति doxycycline३२,३३की खुराक पर निर्भर है । अल्पावधि प्रयोगों के लिए, पीने के पानी के माध्यम से doxycycline प्रशासन अच्छी तरह से स्थापित है३४,३५। सुक्रोज आमतौर पर एक बेहतर स्वाद देने के लिए जोड़ा जाता है । हालांकि, इस polydipsia और निर्जलीकरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और doxycycline चाउ के उपयोग अत्यधिक लंबी अवधि के प्रयोगों३६,३७के लिए सिफारिश की है ।

संक्षेप में, hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन जिगर अनुसंधान में एक व्यापक रूप से स्थापित विधि है । इसके आवेदन हेपेटाइटिस बी के अध्ययनों से जिगर फाइब्रोसिस या hepatocellular कार्सिनोमा मॉडल३८,३९,४०,४१के लिए पर्वतमाला । इस पांडुलिपि में वर्णित प्रणाली विशेष रूप से Cre/LoxP में विशिष्ट लक्ष्य जीन की पूछताछ में उपयोगी है जिगर की बीमारी के मॉडल आधारित है । इसके अतिरिक्त, जिगर में एक्सप्रेस भी hematologic रोगों के अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है४२,४३ या से निपटने के लिए immunologic प्रश्न४४,४५। ब्याज की विशिष्ट जीन के विश्लेषण के अलावा, प्रस्तुत प्रणाली को भी आसानी से स्क्रीनिंग या मल्टीप्लेक्स दृष्टिकोण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इस वीडियो आधारित गाइड इसलिए शोधकर्ताओं के एक बड़े समुदाय के लिए उपयोगी हो जाएगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

इस कार्य को ड्यूश Krebshilfe, जर्मनी (अनुदान संख्या १११२८९ यत), Lucile पैकार्ड फाउंडेशन फॉर चिल्ड्रन हेल्थ (अर्नेस्ट एण्ड अमेलिया Gallo संपन्न Postdoctoral फैलोशिप-CTSA अनुदान संख्या UL1 RR025744 से यत) का समर्थन प्राप्त था. हम dr मार्क A. Kay के लिए वेक्टर का निर्माण और प्रयोगात्मक सलाह और चूहों और प्रयोगात्मक समर्थन के लिए डॉ जुलिएन ऋषि धन्यवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
General Material
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder Thermo Fisher #SM1331 DNA ladder for electrophoresis
Tissue-Tek O.C.T. Sakura 4583 embedding of cryo-sections
Biozym LE Agarose Biozym 840004
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
D(+)-Saccharose Carl Roth 4621.1 For sweetening of the doxycyline solution
Ampicillin Sodium Salt AppliChem A0839,0010 For selection of Amp-resistant clones
LB Agar (Luria/Miller) Carl Roth X969.1
LB Broth (Luria/Miller) Carl Roth X968.1
S.O.C. Medium Thermo Fischer 15544034
Gentamicin sulfate AppliChem A1492,0001 For selection of Gentamicin-resistant clones
Roti-Histofix 4 % Fa. Roth P087.6 para-formaldehyde solution
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix invitrogen/ThermoFisher 11791-020 contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K
DB3.1 Competent Cells Thermo Fisher 11782-018
Stbl3 Chemically Competent E. coli Thermo Fisher C737303
Name Company Catalog Number Comments
Restriction Enzymes
PacI New England BioLabs R0547S
AscI New England BioLabs R0558S
FseI New England BioLabs R0588S
SacI New England BioLabs R0156S
SpeI New England BioLabs R0133S
KpnI New England BioLabs R0142S
NotI New England BioLabs R0189S
XhoI New England BioLabs R0146S
BfuAI New England BioLabs R0701S
Name Company Catalog Number Comments
Kits
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For DNA Extraction from gel
NucleoSpin Gel and PCR Clean Up Macherey & Nagel 740609.10
NucleoBond PC20 Macherey & Nagel 740571 Plasmid extraction (Mini prep)
NucleoBond PC500 Macherey & Nagel 740574 Plasmid extraction (Maxi prep)
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher F530S
Name Company Catalog Number Comments
Materials for Mouse Experiments
Injekt Syringe F 1 ml Braun 9166017V For intraperitoneal injection
Omnifix Luer 3 ml Braun 4616025V For intravenous injection
Sterican Cannula 24G Braun 4657675
Sterican Cannula 27G Braun 4657705
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648-1G For CreER activation
Corn oil Sigma-Aldrich C8267-500ML Carrier for tamoxifen injections
Doxycycline hyclate AppliChem A2951,0025 Activation of tetracycline-dependent expression
Injekt 10 ml Syringe Braun 4606108V
Filtropur S 0.2 Sarstedt 831,826,001 For filtration of doxycycline
NaCl 0,9% Braun 3200905 Carrier for intravenous injections
Falcon Conical Tube 50ml Corning Life Science 352095
Infrared Lamp N/A N/A For warming of mouse tail
IVIS Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.
pTC n/a Vector for constitutive gene expression, ref. 15
pEN_TTmcs Addgene #25755 Entry vector for inducible gene expression, ref. 19
pEN_TTGmiRc2 Addgene #25753 Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19
pEN_TTmiRc2 Addgene #25752 Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19
pTC ApoE-Tet Addgene #85578 Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11
pTC-CMV-Tet Addgene #85577 Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11

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References

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जेनेटिक्स इश्यू १३२ लिवर transposon सिस्टम्स स्लीपिंग ब्यूटी Tet-ऑन hydrodynamic टेल नस इंजेक्शन vivo अभिकर्मक वीडियो गाइड में ।
गठन और Inducible सिस्टम के लिए आनुवंशिक <em>Vivo में </em>संशोधन माउस हेपैटोसाइट्स का उपयोग Hydrodynamic टेल नस इंजेक्शन
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