Summary
Iniezione della vena della coda idrodinamica di vettori di integrazione basata su trasposone consente trasfezione stabile di epatociti murini in vivo. Qui, presentiamo un protocollo pratico per sistemi di transfezione che consente l'espressione costitutiva a lungo termine di un transgene singolo o combinato espressione costitutiva e doxiciclina-viscoelastico di un transgene o miR-shRNA nel fegato.
Abstract
Nei modelli di ricerca di cancro del fegato, di rigenerazione, di infiammazione e di fibrosi, sistemi flessibili per in vivo l'espressione genica e silenziamento sono molto utili. Iniezione della vena della coda idrodinamica dei costrutti basati su trasposone è un metodo efficiente per la manipolazione genetica degli epatociti in topi adulti. Oltre l'espressione costitutiva del transgene, questo sistema può essere utilizzato per applicazioni più avanzate, come implicazione di colpo, di shRNA-mediata del gene del sistema CRISPR/Cas9 per indurre mutazioni del gene, o sistemi di viscoelastici. Qui, la combinazione dell'espressione costitutiva CreER insieme espressione inducibile di un transgene o miR-shRNA di scelta si presenta come un esempio di questa tecnica. Copriamo la procedura multi-step a partire dalla preparazione della bella addormentata-trasposone costruisce, per l'iniezione e il trattamento dei topi e la preparazione del tessuto del fegato per analisi immunostaining. Il sistema presentato è un approccio affidabile ed efficiente per realizzare complesse manipolazioni genetiche negli epatociti. È particolarmente utile in combinazione con ceppi di topi Cre/loxP-based e può essere applicato ad una varietà di modelli nella ricerca dell'affezione epatica.
Introduction
L'affezione epatica cronica presenta un onere importante di salute nel mondo1. Modelli di ricerca sugli animali sono strumenti essenziali nello studio delle malattie epatiche e hanno contribuito a rispondere alle domande complesse nella rigenerazione del fegato, infiammazione epatica e steatosi, così come il cancro del fegato2. Un numero considerevole di questi modelli animali si basa sulla modificazione genetica delle cellule del fegato. Efficienti strumenti per manipolare l'espressione genica in epatociti sono pertanto utili3. Metodi consolidati come l'allevamento di ceppi di topi geneticamente o la generazione di vettori virali per l'infezione dell'epatocita sono entrambi harbor richiede tempo, problemi di sicurezza, o cedere l'espressione del transgene poveri in epatociti in vivo 4 , 5. iniezione della vena della coda idrodinamica (HTVI) è un metodo alternativo per la transfezione in vivo degli epatociti che consente per l'interrogatorio di facile, veloce e conveniente di funzione del gene nel fegato. Per HTVI, un vettore contenente la sequenza di DNA desiderata è dissolto in un volume di soluzione fisiologica corrispondente al 10% del peso corporeo dell'animale iniettato. La soluzione allora è iniettata nella vena della coda entro 5-10 s6. Superiore a gittata cardiaca, le saline scorre dalla vena cava inferiore nelle vene del fegato, che porta all'espansione del fegato e idrodinamica transfezione di epatociti7. Per realizzare l'integrazione genomica stabile, il metodo è stato combinato con vettori basati su trasposone, quali il sistema di trasposone dormire bellezza. Sistemi di questo media la ricombinazione dei vettori di destinazione con i siti di ricombinazione genomica catalizzate da un sonno bellezza -transposase8,9. Per i modelli di fibrosi del fegato o di carcinogenesi, è spesso desiderabile ai geni iperesprimere o silenzio determinati intervalli di tempo del modello di malattia. Per questo scopo, strumenti per l'espressione genica viscoelastica come Cre/LoxP-sistema o il sistema di espressione del gene tetraciclina-inducibile (Tet-On) può essere usato10.
Qui, descriviamo un protocollo per la transfezione in vivo di epatociti murini utilizzando HTVI di un sistema basato su trasposone addormentata . Oltre a un protocollo per l'espressione stabile, costitutiva di un transgene sotto il controllo di un promotore di fegato-specific, descriviamo un sistema più avanzato di vettore che unisce l'espressione costitutiva di tamoxifen-dipendente Cre ricombinasi (CreER) con la induzione dell'espressione genica di un transgene o shRNA adattato microRNA (miR-shRNA), chiamato il pTC TET-sistema11. In questo sistema vettoriale, transgeni inducibile o miR-shRNA per espressione tetraciclina-dipendente vengono clonati nel vettore backbone con un sistema di clonazione recombinational, permettendo la generazione facile e veloce di nuovi vettori12. Questa guida basate su video descrive la preparazione di opportuni vettori, iniezione e il trattamento dei topi per ottenere l'espressione del transgene/miR-shRNA viscoelastica ed infine la preparazione del tessuto del fegato per l'analisi. Il metodo descritto in questo protocollo è stato progettato per consentire la combinazione di qualsiasi sistema di topo Cre/loxP mediato con l'espressione o knock-down di qualsiasi gene di scelta, che lo rende un sistema ampiamente applicabile nella ricerca dell'affezione epatica.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dalle autorità responsabili (Regierung von Oberbayern, Monaco di Baviera, Germania e Stanford istituzionale Animal Care e utilizzare Comitato, Stanford, CA, USA). In tabella supplementare S1 viene fornito un elenco di tutti i plasmidi per la clonazione (passo 1 a 4).
1. clonazione di un Transgene per espressione genica costitutiva
- Disegnare primers per transgene amplificazione13,14.
- Aggiungere siti di restrizione per PacI (TTAATTAA) all'estremità 5' del primer in avanti. Aggiungere siti di restrizione per AscI (GGCGCGCC) o FseI (GGCCGGCC) all'estremità 5' del reverse primer.
- Amplificare il transgene mediante PCR utilizzando condizioni ottimizzate per il transgene desiderato14. Purificare utilizzando un kit di purificazione di DNA commercialmente disponibile.
Nota: Tempo di ricottura dipende il primer disegnati al punto 1.1., tempo di allungamento dipende dalla lunghezza del costrutto. Ad esempio, per un costrutto di 1.000 bp durata uso 60 s di tempo di allungamento. - Digerire il transgene e vettore per gene costitutivo espressione15 con nucleasi di restrizione rispettivi (Vedi punto 1.2) e buffer in un volume totale di 50 µ l a 37 ° C durante la notte. Ad esempio, digerire costrutto con 5 unità PacI e 5 unità FseI se appropriato (Vedi punto 1.2).
- Gel di purificare vettore digerito e inserimento utilizzando un kit di estrazione del gel commerciale secondo le istruzioni del produttore. Eseguire una legatura standard di 100 ng di vettore e 100 – 1.000 ng di inserimento mediante 400 U T4 ligasi a 14 ° C per 16 h. calore inattivare a 65 ° C per 10 min.
- Trasformare batteri competenti utilizzando standard calore-shock-protocollo16.
- Piastra su agar piastre contenenti 100 ampicillina di µ g/mL. Incubare a 30 ° C per 24 h.
- Scegliere singole colonie, purificare il DNA plasmidico utilizzando un kit commerciale miniprep secondo le istruzioni del produttore e verificare la sequenza di sequenziamento Sanger17 (primer di sequenziamento: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').
- Utilizzare positivo colonie per maxi scala amplificazione del DNA del plasmide e purificano utilizzando un plasmide privo di endotossina preparazione kit18 secondo le istruzioni del produttore.
- Costrutto è pronto per l'iniezione, quindi continuare con il passaggio 5.
2. clonazione di un Transgene per l'espressione genica viscoelastica
- Disegnare primers per transgene amplificazione13,14.
- Aggiungere siti di restrizione per SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT) o KpnI (GGTACC) all'estremità 5' del primer in avanti. Aggiungere siti di restrizione per NotI (GCGGCCGC) o XhoI (CTCGAG) all'estremità 5' del reverse primer.
- Amplificare il transgene mediante PCR utilizzando condizioni ottimizzate per il transgene desiderato14. Purificare utilizzando un kit di purificazione di DNA commerciale.
- Digerire il transgene purificato e 4 µ g di vettoriale voce (pEN_TTmcs-vettoriale, Vedi Tabella materiali)19 separatamente con nucleasi di restrizione appropriato (Vedi punto 2.2) e buffer in un volume totale di 50 µ l a 37 ° C durante la notte.
- Gel di purificare vettore digerito e inserimento utilizzando un kit di estrazione del gel commerciale secondo le istruzioni del produttore. Eseguire la legatura standard con 100 ng di vettore e 100 – 1.000 ng di inserto utilizzando 400 U T4 ligasi a 14 ° C per 16 h. calore inattivare a 65 ° C per 10 min.
- Trasformare batteri competenti utilizzando standard calore-shock-protocollo16.
- Piastra su agar piastre contenenti gentamicina 15 µ g/mL. Incubare a 37 ° C per 16 h.
- Scegliere singole colonie, purificare il DNA del plasmide e verificare inserto di sequenziamento17 utilizzando il primer forward pCEP: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'.
Nota: PCR sulle singole colonie può essere eseguita senza previa purificazione con primer pCEP avanti e pCEP inversa (AGA AAG CTG GGT CTA GAT ATC GCC 3' 5'). Questo passaggio può essere utile per la pre-selezione di colonie positive. - Procedere al passaggio 4.
3. clonazione di un miR-shRNA per Inducible Gene Knock-down
- Progettare oligonucleotidi miR-shRNA secondo il pSLIK clonazione protocollo19. Tempri e purificare oligonucleotidi e diluire 01:20 in ddH2O.
- Digest 3 µ g del vettore di ingresso con 5 U BfuAI a 50 ° C per 3 h, quindi inattivare la reazione a 65 ° C per 20 min.
Nota: Se si desidera co-espressione della proteina fluorescente verde (GFP), uso pEN_TTGmiRc19 come vettore di entrata, altrimenti usare pEN_TTmiRc219. - Gel di purificare digerito vettoriale come descritto al punto 2.5. Eseguire la legatura standard di 100 ng di vettore e 1 µ l di purificato diluito shRNA oligonucleotidi (punto 3.1) utilizzando 400 U T4 ligasi a temperatura ambiente per 1 h. calore inattivare a 65 ° C per 10 min.
- Trasformare batteri competenti utilizzando standard calore-shock-protocollo16.
- Piastra su agar piastre contenenti gentamicina 15 µ g/mL. Incubare a 37 ° C per 16 h.
- Scegliere singole colonie, purificare il DNA del plasmide e inserto per verificare di sequenziamento Sanger17 (primer di sequenziamento: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').
- Procedere al passaggio 4.
4. recombinational clonazione per generare cloni pronto per l'iniezione
- Mix 150 ng del vettore di ingresso (da passo 2 o 3) e 150 ng di pTC TET-vector20.
- Aggiungere buffer di TE per un volume totale di 8 µ l (pH = 8).
- Trasferire il mix di enzima di LR-clonase II (Vedi Tabella materiali) per il ghiaccio, incubare per 2 min Vortex due volte.
- Aggiungere 2 µ l di miscela di enzima LR-clonase II alla reazione e incubare a 25 ° C per 1 h.
- Fermare la reazione aggiungendo 1 µ l di proteinasi K-soluzione. Incubare a 37 ° C per 10 min.
- Trasformare Stbl3 batteri competenti con 2 µ l di recombinational clonazione mescolano utilizzando standard calore-shock-protocollo16.
- Piastra su agar piastre contenenti 100 ampicillina di µ g/mL. Incubare a 30 ° C per 24 h.
- Scegliere singole colonie, purificare il DNA plasmidico utilizzando un plasmide privo di endotossina preparazione kit18 secondo le istruzioni del produttore e confermare l'integrità vettoriale da di sequenziamento Sanger17 (primer di sequenziamento 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3').
- Costrutto è pronto per l'iniezione, continuare con il passaggio 5.
5. preparare la soluzione per iniezione della vena della coda idrodinamica
Nota: Preparazione di costrutti per l'espressione genica costitutiva e inducibile sono descritti nel passaggio 1, 2, 3 e 4.
- Preparare soluzione fisiologica 0,9% sterile iniettabile (fare non uso PBS). Utilizzare il volume corrispondente a circa il 10% del peso corporeo del mouse. Esempio: per un mouse peso 20 g, preparare 2 mL di soluzione.
- Preparare i vettori di iniezione che sono stati purificati utilizzando un kit di purificazione plasmide privo di endotossina18 (Vedi punto 1.8 o 4.8, rispettivamente).
- Aggiungere 10 µ g o 15 µ g di endotossina-libero addormentata vettore costrutto (da passo 1 uso 10 µ g, da passo 4 uso 15 µ g, rispettivamente) e 1 µ g di endotossina-free pc-HSB521 per mL di soluzione fisiologica sterile.
- Conservare la soluzione per fino a 4 h a 4 ° C. Non congelare.
6. esecuzione di iniezione della vena della coda idrodinamica
- Utilizzare un dispositivo di ritenuta per iniezione della vena della coda (commerciale o preparati da un tubo conico da 50 mL con fori per la respirazione e per la coda). Riempire il fondo del tubo con la carta velina.
- Per l'iniezione, è possibile utilizzare topi di circa 8 – 10 settimane di età con pesi di 20 – 25 g.
- Pesare i topi prima dell'iniezione e preparare il volume di iniezione secondo il peso corporeo (corrispondente al 10% del peso corporeo, vedi punto 5.1). Preparare un 3 mL-siringa sterile con un 27 G-ago per iniezione e riempire con il volume richiesto.
- Posizionare il mouse nel dispositivo di ritenuta. Regolare la quantità di carta velina (Vedi punto 6.1) di lasciare solo un minimo spazio per il movimento ma abbastanza spazio per respirare.
- Assicurarsi che il mouse è respirando regolarmente.
- Caldo la coda utilizzando una lampada a raggi infrarossi per 30-60 s. attentamente attenzione ai segni di surriscaldamento.
- Pulire la coda con un tampone imbevuto di alcool.
- Inserire l'ago quasi orizzontalmente in uno delle due vene coda laterale vicino alla base della coda.
Nota: Se posizionato correttamente, una piccola quantità di sangue potrebbe fluire nuovamente dentro il cono dell'ago. Non è consigliabile per aspirare attivamente come qualsiasi ulteriore movimento dell'ago può provocare la sua cilindrata e/o lesioni della vena. - Iniettare il volume totale in vena caudale entro 8-10 s.
- Rimuovere immediatamente il mouse dal dispositivo di ritenuta. Comprimere iniezione ferita per almeno 30 s o fino alla scomparsa del qualsiasi sanguinamento.
- Posizionare il mouse in una gabbia separata. Una volta che il mouse ha recuperato dalla procedura (circa 30 – 60 minuti), è possibile trasferire il mouse torna alla sua gabbia originale. Controllare il mouse regolarmente per il prossimo 24 h.
Nota: Lieve sedazione del mouse ordinariamente è osservato per fino a 2 h dopo l'iniezione. - Prima di procedere con ulteriori esperimenti (cioè, passaggio 7), attendere 10-15 giorni per la liquidazione dei vettori non integrati.
7. induzione di CreER trasfettate con il tamoxifene
Attenzione: Il tamoxifene è nocivo, può essere cancerose o nuocere alla fertilità. Fare riferimento alla scheda di dati di sicurezza.
- Pianificare le iniezioni intraperitoneali tamoxifen per tre giorni consecutivi.
- Il giorno 1, sciogliere 10 mg di tamoxifene in etanolo al 40 µ l. Incubare a 55 ° C per 10 min. vortice più volte fino a sciolta il tamoxifen.
- Aggiungere olio di mais 960 µ l. Incubare per 5 minuti a 55 ° C. Vortice diverse volte per ottenere una soluzione limpida.
- Preparare la soluzione in una siringa da insulina 1 mL con ago 27G.
- Collottola del mouse afferrando il collo del mouse attentamente con il pollice e il secondo dito, la coda tra la base della mano e il quarto e il quinto dito di fissaggio.
- Iniettare 0,1 mL (= 1 mg di tamoxifene) della soluzione per via intraperitoneale nel quadrante inferiore sinistro dell'addome.
- Ripetere le iniezioni in giorni due e tre.
8. induzione del Gene tetraciclina-dipendente o shRNA espressione
Attenzione: Doxiciclina può essere dannosa. Fare riferimento alla scheda di dati di sicurezza.
Nota: A seconda del tipo e la durata dell'esperimento, doxiciclina possa essere fornita in acqua potabile (punto 8.1) o chow (punto 8.2)
-
Per esperimenti di breve termine (< 10 giorni) amministrare doxiciclina via acqua potabile utilizzando il seguente protocollo.
- Sciogliere 5 g di saccarosio in 100 mL di acqua di rubinetto. Sterilizzare in autoclave.
- Sciogliere 100 mg di doxiciclina-hyclate in 5 mL di soluzione di saccarosio (punto 8.1.1) in una provetta conica da 15 mL.
- Utilizzando una siringa 10 mL, filtro sterile la soluzione attraverso un filtro di 0,2 µm. Aggiungere alla soluzione di saccarosio preparata al punto 8.1.1.
- Fornitura di doxiciclina-saccarosio soluzione come acqua potabile per il mouse. Controllare tutti i giorni e sostituirlo quando la soluzione diventa torbida che indica la crescita eccessiva batterica (sostituire la soluzione limpida dopo tre giorni al più tardi).
- Per gli esperimenti a lungo termine (> 10 giorni) o esperimenti sensibili a cambiamenti metabolici, utilizzare doxiciclina-chow commerciale (ad es., Doxycycline Hyclate Chow 0,625 g/kg) per evitare la disidratazione e/o cambiamenti indotti da saccarosio nei fegati degli animali trattati.
9. preparazione del fegato del topo per analisi immunostaining
Attenzione: Paraformaldeide può essere dannoso. Fare riferimento alla scheda di dati di sicurezza.
Nota: Il timepoint quando saranno analizzati topi dipende l'esperimento. Si raccomanda di analizzare il tessuto del fegato dopo non meno di tre giorni di trattamento doxiciclina per garantire sufficiente induzione dell'espressione del transgene o shRNA.
- Preparare una siringa da 1 mL con ago 27G con 1 mL di soluzione di paraformaldeide 4% (PFA).
- Eutanasia il mouse mediante un metodo appropriato secondo un protocollo approvato animale.
Nota: Le linee guida per i metodi appropriati di eutanasia possono variare a seconda dell'istituzione. - Con delle forbici per dissezione, pinze anatomiche, aprire con cautela la cavità addominale con una laparotomia mediana per esporre il fegato. Spostare il piccolo intestino a destra per esporre la vena porta e la vena cava inferiore (IVC).
- Inserire l'ago della siringa preparata (Vedi punto 9.1) nell'IVC e taglio della vena portale. Iniettare 1 mL di PFA lentamente nella VCI per irrorare il tessuto del fegato e rimuovere auto-fluorescente globuli rossi (auspicabile se macchiatura immunofluorescente verrà eseguita).
- Rimuovere il fegato. Risciacquare in acqua e trasferire al 5 – 10 mL di soluzione al 4% PFA.
- Per sezioni di paraffina, tessuto di correzione per 36 – 48 h. tessuto è pronto per disidratazione e inclusione in paraffina.
-
Per sezioni congelate, difficoltà del tessuto in 4% PFA per 1 h.
- Per crioprotezione, trasferire alla soluzione di saccarosio al 10%. Incubare per 60 minuti.
- Trasferimento a soluzione di saccarosio al 20%. Incubare per 60 minuti.
- Trasferimento a soluzione di saccarosio al 30%. Incubare per 12 – 16 h. Embed in incorporamento composto per sezioni congelate e congelare a-20 ° C.
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Representative Results
L'efficacia di transfezione di iniezione della vena della coda idrodinamica: La percentuale di epatociti murini che transfected idrodinamicamente tramite una singola iniezione è variabile e dipende da diversi parametri come il volume di iniezione, il tempo di iniezione, la quantità di DNA iniettato e dimensione del costrutto iniettato6, 22,23. Inoltre, l'efficienza di trasfezione è generalmente più bassa in animali più grandi, dove un più grande diametro vascolare come pure maggiore superficie sinusoidale conduce ad una diminuzione nella pressione globale. Per visualizzare l'efficienza di trasfezione, HTVI di un costrutto di trasposone CreER è stato effettuato in topi che harboring un gene reporter Rosa26mTmG seguito da tamoxifene-ha mediato l'attivazione del costrutto CreER. Volume di iniezione basso o tempo prolungato iniezione per motivi tecnici risultati nell'efficienza di trasfezione ridotta con solo pochi epatociti trasfettati rilevabili nel fegato intero, mentre condizioni di iniezione ottimale risultato nella transfezione superiore efficienze come raffigurato da reporter colorazione dopo HTVI di un trasposone CreER (Figura 1A). Per valutare l'efficacia di transfezione, immunostaining del transgene trasfettato o – come nel caso di CreER - un gene reporter adatto è altamente raccomandato. In alternativa, l'efficienza di trasfezione potrebbe essere stimato dall'analisi di espressione di mRNA del transgene trasfettato.
Transfezione degli epatociti pericentrale: Dopo l'iniezione idrodinamica, un gradiente di pressione lungo lo spazio sinusoidale - dove la pressione è più alta vicino alla vena centrale e più basso nel periportal areal - potrebbe portare a transfezione preferita in zona pericentrale. Abbiamo analizzato fegati con una bassa percentuale di epatociti di espressione del transgene e valutata la loro posizione relativa nel lobulo epatico co-immunostaining per glutamina sintetasi (GS), un marcatore per gli epatociti pericentrale. È interessante notare che, la maggior parte degli epatociti che ha mostrato il reporter espressione genica dopo HTVI di un costrutto CreER raggruppati intorno alla vena centrale ma non l'area del portale (Figura 1B) che indica una maggiore efficienza di trasfezione intorno alla vena centrale.
In vivo imaging dopo HTVI di un trasposone luciferasi: Per valutare se l'integrazione di copia singola osservata dopo HTVI del trasposone costruisce24 è sufficiente per in vivo imaging, abbiamo iniettato un trasposone costrutto che harboring una cassetta di espressione di luciferasi sotto il controllo di un fegato specifico costruzione del promotore. I topi sono stati iniettati con luciferina e imaging utilizzando un in vivo imaging sistema due settimane dopo HTVI (Figura 2A). Formazione immagine ha mostrato bioluminescenza luciferasi robusto e stabile nel fegato 15 giorni dopo l'iniezione e a intervalli di tempo successivi (Figura 2B e dati non mostrati). Questi risultati indicano che il sistema può essere utilizzato con successo a seguire la presenza di cellule transfected in vivo da bioluminescenza imaging.
Combinato CreER ed espressione inducibile di transgene o shRNA: In precedenza abbiamo generato un costrutto trasposone che combina l'espressione costitutiva di un viscoelastico Cre ricombinasi (CreER) con induzione dell'espressione genica di un transgene o un shRNA di scelta20 (Figura 3A). Iniezione di questo costrutto in topi reporter Rosa26mTmG-e attivazione CreER dal tamoxifene ha mostrato robusta espressione del gene reporter paragonabile ai risultati ottenuti con un costrutto trasposone per espressione del transgene singolo ( Figura 3B). Dopo il trattamento doxiciclina, l'espressione del transgene viscoelastica possa essere visualizzato dagli anticorpi adatti negli epatociti trasfettati (Figura 3). Per l'espressione inducibile shRNA, l'uso di un costrutto di GFP-shRNA è raccomandato come espressione citoplasmica di GFP rilevato immunostaining può essere usato come un indicatore sostitutivo per l'espressione di shRNA (Figura 3D). Della nota, espressione del transgene o shRNA, rispettivamente, solo è rilevabile in un sottoinsieme degli epatociti, che potrebbe essere dovuto il livello relativamente alto di espressione della proteina necessaria per il rilevamento di immunostaining20.
Figura 1: transfezione di epatociti da HTVI. Efficienza di trasfezione variabile (A) dopo HTVI di un trasposone CreER-in topi che harboring un Rosa26mTmG / + reporter e seguita dal trattamento con il tamoxifene. Gli epatociti trasfettati sono positivi per la proteina fluorescente verde (GFP, verde) di membrana-limitano. (B) co-macchiatura per CreER attivato epatociti (verdi) in topi che harboring un reporter Rosa26mTmG con la vena centrale marcatore glutamina sintetasi (GS, rosso). Qui PV: vena portale, CV: vena centrale. Barre della scala rappresentano 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: In vivo imaging della luciferasi. (A) trasposone costruire contenente una cassetta di espressione di luciferase (non disegnata in scala). Schema di iniezione e trattamento per la visualizzazione di espressione epatica luciferasi. SB: dormire siti di riconoscimento di bellezza, HTVI: iniezione della vena della coda idrodinamica. (B) immagine rappresentativa della bioluminescenza luciferasi epatica 15 giorni dopo HTVI di un costrutto di trasposoni-luciferasi insieme a pHSB5 utilizzando un in vivo imaging system. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: combinato CreER ed espressione genica viscoelastica/shRNA. (A) costrutto trasposone per l'espressione di viscoelastico Cre ricombinasi insieme espressione di un transgene tetraciclina-inducibile o shRNA (pTC Tet), non disegnata in scala. (B) membrana verde colorazione indica trasfettati epatociti dopo l'iniezione del pTC costrutto Tet in Rosa26mTmG / + topi reporter e CreER attivazione con il tamoxifene. Barra della scala rappresenta 100 µm. (C) Inducible gene espressione 5 giorni dopo trattamento doxiciclina possa essere visualizzato immunostaining per il transgene (YAP, rosso) negli epatociti trasfettati. Espressione inducibile miR-shRNA (D) 5 giorni dopo il trattamento doxiciclina indicato dalla macchiatura citoplasmica proteina fluorescente verde (GFP) del costrutto GFP-shRNA. Trasfettate epatociti sono raffigurati da GFP membrana-limitano. Scala bar in C) e D) rappresentano 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Transfezione di epatociti con l'iniezione della vena della coda idrodinamica è diventato un metodo stabilito sin dalla sua introduzione più di 15 anni fa6. Il volume iniettato supera la gittata cardiaca e confluisce dalla vena cava inferiore i sinusoids del fegato7, che conduce alla trasfezione di circa 10-20%, in alcuni casi fino al 40% di epatociti25,26. Predittori di una riuscita transfezione sono il volume iniettato per tempo iniettato22,23. Quindi, un'efficienza di trasfezione basso (Figura 1A, pannello di sinistra) è di solito a causa dell'impossibilità di mantenere la velocità di iniezione durante la procedura7. Tuttavia, anche con una tecnica ottima, l'efficienza di trasfezione che può essere ottenuta da HTVI rimarrà sotto il tasso ottenuto tramite l'infezione virale da adenovirus o virus adeno-associato che può raggiungere quasi 100%5,27 . Per ottenere iniezioni della vena della coda di successo, è fondamentale per garantire un posizionamento stabile dell'ago nel vaso sanguigno. Questo è facilmente ottenibile nelle vene con diametro maggiore più vicino alla base della coda. Inoltre, la dilatazione della vena con il riscaldamento la coda è altamente raccomandata. I risultati migliori si ottengono utilizzando una lampada a raggi infrarossi, ma un non-infrared heat lamp o immersione della coda in acqua calda può anche essere utilizzati. In alcuni casi, che integra fino a 200 µ l di soluzione fisiologica tramite l'iniezione intraperitoneale circa 30 minuti prima di HTVI migliorerà lo stato di idratazione degli animali con conseguente dilatazione dei vasi sanguigni. Per mantenere una velocità di iniezione costante, la coda del mouse dovrebbe essere trattenuta accuratamente per evitare qualsiasi movimento della coda, che può provocare lo spostamento dell'ago. Ai fini della convalida, si consiglia di utilizzare un costrutto che può essere rilevato immunostaining. In alternativa, l'efficacia di transfezione può essere stimato mediante analisi di espressione di mRNA o integrato di sequenziamento del DNA28.
I nostri dati indicano che integrazione trasposone è osservato preferibilmente in zona pericentrale del lobulo del fegato. La transfezione predominante degli epatociti intorno alla vena centrale è probabilmente dovuto l'emodinamica unica di HTVI come inoltre è osservato in non-trasposone basato transfezione29. Questa scoperta potrebbe essere rilevante per alcune applicazioni, come l'induzione di danno epatico acuto di CCl4, che colpisce principalmente gli epatociti pericentrale. Nel contesto dell'efficienza di trasfezione basso, CCl4 trattamento pertanto potrebbe portare a una riduzione significativa del numero di epatociti trasfettati. Inoltre, HTVI è di uso limitato alle cellule periportal bersaglio cui dotto biliare cellule15.
Oltre ai sistemi che utilizzano HTVI del trasposone costrutti per ottenere l'espressione stabile di un transgene singolo, abbiamo recentemente presentato un sistema che permette la co-espressione di CreER e dell'espressione genica di un gene o un shRNA miR da un singolo vettore11 . Questo sistema è particolarmente utile per interrogare i geni specifici in ceppi di topi Cre/LoxP-basato. Come costrutti di transgeni o shRNA vengono introdotti da una procedura di clonazione recombinational veloce e affidabile, il sistema può essere facilmente adattato per approcci di screening. Il sistema vector media affidabile dell'espressione genica in vivo che dipende interamente la consegna di doxiciclina11,30. Questa guida pratica basate su video istruzioni dettagliate da clonazione degli opportuni vettori sopra induzione dell'espressione genica all'analisi del tessuto del fegato.
Tuttavia, per garantire l'efficienza del sistema, diversi aspetti dovrebbero essere tenuti a mente: per mantenere a lungo termine espressione, integrazione genomica è mediato in TA-siti dalla bella addormentata nel bosco transposase8,11. Poiché l'efficienza di integrazione dipende dalla dimensione del trasposone, è importante mantenere la dimensione del costrutto transgene in mente quando si progetta il vettore31. Inoltre, l'efficienza di espressione del prodotto del gene inducibile nel fegato è dipenda rtTA3-promotore11. Per ottenere risultati ottimali espressione, utilizzare di un costrutto di vettore con un fegato specifici ApoE.HCR.hAAT-promotore è consigliato (Addgene #85578), come dimostra la massima efficienza in un confronto di tre promotori11. Con un costrutto promotore ottimizzato, espressione inducibile transgene/shRNA può essere rilevato immunostaining in fino al 30% di cellule trasfettate20. Se i livelli della proteina inducibile esistano sotto una certa soglia che è necessario per il rilevamento di immunostaining, questo deve essere determinata. D'importanza, non può essere rilevata alcuna espressione del transgene/shRNA immunostaining in topi che non sono stati trattati con doxiciclina. Infine, l'espressione dei geni sotto il controllo dell'elemento di risposta di tetraciclina (TRE) è dipendente dalla dose di doxiciclina32,33. Per gli esperimenti di breve termine, la gestione del doxycycline via acqua potabile è affermata34,35. Saccarosio è aggiunto solitamente per dare un gusto migliore. Tuttavia, questo può portare a disidratazione e polidipsia, e l'uso di chow doxiciclina è altamente raccomandato per lungo termine esperimenti36,37.
In sintesi, iniezione della vena della coda idrodinamica è un metodo ampiamente stabilito nella ricerca del fegato. La sua varia applicazione dagli studi di epatite B a carcinoma del fegato, fibrosi o epatocellulare modello38,39,40,41. Il sistema descritto in questo manoscritto è particolarmente utile negli interrogatori dei geni target specifici nei modelli basati su Cre/LoxP dell'affezione epatica. Inoltre, sovraespressione nel fegato può essere utilizzata anche per la ricerca di malattie ematologiche42,43 o per affrontare domande immunologici44,45. Oltre l'analisi di specifici geni di interesse, il sistema presentato può anche essere facilmente adattato a screening o approcci di multiplexing. Questa guida video basati su pertanto sarà utile per una vasta comunità di ricercatori.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da Deutsche Krebshilfe, Germania (codice di autorizzazione 111289 per UE), il Lucile Packard Foundation per salute dei bambini (Ernest e Amelia Gallo dotato Postdoctoral Fellowship - numero di concessione CTSA UL1 RR025744 per UE). Grazie Dr Mark A. Kay per vettore costrutti e consulenza sperimentale e Dr Julien Sage per topi e sperimentali supportano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Material | |||
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
| Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
| LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
| LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
| Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
| Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
| DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
| Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction Enzymes | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | New England BioLabs | R0156S | |
| SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
| KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| NotI | New England BioLabs | R0189S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for Mouse Experiments | |||
| Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
| Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
| Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
| Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
| Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
| Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
| NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
| Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
| Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
| pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
| pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
| pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |
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