Summary
유체역학 꼬리 정 맥 주입 transposon 기반 통합 벡터의 수 murine hepatocytes의 안정 되어 있는 transfection vivo에서. 여기, 우리는 단일 transgene의 장기 제정 식 또는 결합 된 제정 및 doxycycline 유도할 수 있는 표현의 transgene 또는 간에서 미르 shRNA 있도록 transfection 시스템을 위한 실용적인 프로토콜 제시.
Abstract
간 암, 재생, 염증, 섬유 증의 연구 모델에서 vivo에서 유전자 발현 및 침묵에 대 한 유연한 시스템은 매우 유용 합니다. 유체역학 꼬리 정 맥 주입의 transposon 기반 구문 성인 쥐 hepatocytes의 유전자 조작에 대 한 효율적인 방법입니다. 제정 transgene 식 이외에 유전자 돌연변이 유도 하는 CRISPR/Cas9 시스템 또는 유도할 수 있는 시스템의 shRNA 중재 유전자 노크 다운, 의미 같은 고급 응용 프로그램에 대 한이 시스템을 사용할 수 있습니다. 여기는 transgene의 유도할 수 있는 표정과 함께 제정 있다 식의 조합 또는 선택의 미르 shRNA이 기술의 예로 제공 됩니다. 우리는 잠자는 미녀의준비에서 시작 하는 다단계 절차를 커버-transposon, 주입 및 마우스의 처리 및 분석에 대 한 간 조직 준비 하 여 구성 immunostaining. 제시 하는 시스템은 hepatocytes에서 복잡 한 유전자 조작을 달성 하기 위해 안정적이 고 효율적인 접근 이다. 그것은 Cre/loxP 기반 마우스 종자와 함께에서 특히 유용 하 고 다양 한 간 질환의 연구에서 모델에 적용할 수 있습니다.
Introduction
만성 간 질환 주요 건강 부담 전세계1를 선물 한다. 동물 연구 모델 간 질환의 연구에 필수적인 도구 이며, 간 재생, 간 염증, steatosis 뿐만 아니라 간 암2에 복잡 한 질문에 대답 하는 데 도움이. 이러한 동물 모델의 상당수는 간 세포의 유전 수정에 의존합니다. 따라서, hepatocytes에 유전자 발현을 조작 하는 효율적인 도구는 도움이3. 유전자 조작된 마우스 종자의 번 식 또는 hepatocyte 감염에 대 한 바이러스 성 벡터의 생성 등 설립된 방법 중 시간이 걸리고, 항구 안전 우려, 또는 vivo에서 hepatocytes에서 가난한 transgene 식 양보 4 , 5. 유체역학 꼬리 정 맥 주입 (HTVI) 간에서 유전자 기능, 빠른, 쉽고 비용 효율적인 심문 허용 hepatocytes의 transfection 비보에 대 한 대체 방법입니다. HTVI에 대 한 원하는 DNA 시퀀스를 들고 벡터 주입 된 동물의 몸 무게의 10%에 해당 하는 염 분의 볼륨에 녹입니다. 솔루션은 다음 5-10의6이내 꼬리 정 맥에 주입 됩니다. 심장 출력을 초과, 고 염 분에서에서 흐름 열 등 한 베 나 정 맥 간 확장 및 hepatocytes7의 유체역학 transfection 간 정 맥으로. 안정적인 게놈 통합을 달성 하기 위해 메서드 자 아름다움-transposon 시스템 등 transposon 기반 벡터와 결합 하고있다. 이 시스템 게놈 재결합 사이트 자 아름다움-transposase8,9에 의해 촉매와 대상 벡터의 재결합을 중재 한다. 간 섬유 증 또는 발암 모델, 그것은 종종 overexpress 또는 침묵 유전자 질병 모델의 특정 시간 지점에서 하는 것이 좋습니다. 이 목적에 대 한 Cre/LoxP 시스템 등 항생물질을 유도할 수 있는 유전자 표현 시스템 유도할 수 있는 유전자 발현에 대 한 도구 (Tet에서) 사용된10될 수 있습니다.
여기, 우리가 잠자는 미녀 transposon-기반 시스템의 HTVI를 사용 하 여 murine hepatocytes의 transfection 비보에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 우리가 제정 tamoxifen 종속 Cre recombinase (크리스챤) 식으로 결합 하는 고급 벡터 시스템을 설명 하는 간 전용 모터의 제어 transgene의 안정적이 고 구성 적인 표현 위한 프로토콜 이외에 유도할 수 있는 표현의 transgene 또는 예측에 관한 적응 shRNA (미르-shRNA), pTC 라는 TET 시스템11. 이 벡터 시스템에서 유도할 수 있는 transgenes 또는 항생물질 종속 식 미르-shRNAs recombinational 복제 시스템, 새로운 벡터12의 신속 하 고 쉽게 생성 수 있도록 백본 벡터에 복제 됩니다. 이 비디오 기반 가이드 유도할 수 있는 transgene/미르-shRNA 식 달성에 적합 한 벡터, 주입 및 쥐의 치료의 준비 그리고 마지막으로 간 조직 분석에 대 한 준비를 다루고 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 식과 Cre/loxP 중재 마우스 시스템의 조합 또는 간 질환의 연구에 널리 적용 가능한 시스템을 만드는 선택의 어떤 유전자의 노크 다운 수 있도록 설계 되었습니다.
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Protocol
모든 동물 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 지침에 따라 수행 하 고 (Regierung 폰 오베르 바이 엠, 뮌헨, 독일 및 스탠포드 기관 동물 관리 및 사용 위원회 책임 당국에 의해 승인 했다 스탠포드, 캘리포니아, 미국)입니다. (단계 1-4) 복제에 대 한 모든 플라스 미드의 목록이 보충 테이블 s 1에에서 제공 됩니다.
1. 제정 유전자 발현에 있는 Transgene의 복제
- 디자인 transgene 증폭13,14를 위한 뇌관.
- PacI (TTAATTAA)에 대 한 앞으로 뇌관의 5' 끝에 금지 사이트를 추가 합니다. 반전 뇌관의 5' 끝에 AscI (GGCGCGCC) 또는 FseI (GGCCGGCC)에 대 한 금지 사이트를 추가 합니다.
- Transgene 원하는 transgene14에 최적화 된 조건을 사용 하 여 PCR에 의해 증폭. 상업적으로 이용 가능한 DNA 정제 키트를 사용 하 여 정화.
참고: 시간을 어 닐 링 단계 1.1에서에서 설계 뇌관에 따라 달라 집니다., 신장 시간 구성의 길이에 따라 달라 집니다. 예: 신장 시간 1000 bp 길이 사용 60 s의 생성 합니다. - 밤새 소화 transgene 및 제정 진 식15 각각 금지 nucleases (단계 1.2 참조)와 37 ° C에서 50 µ L의 전체 볼륨에 버퍼에 대 한 벡터. 예를 들어 소화 5 단위 PacI 구문 5 단위 FseI 적절 한 경우 (단계 1.2 참조).
- 젤 정화 소화 벡터 및 제조업체의 지침에 따라 상업 젤 추출 키트를 사용 하 여 삽입. 100 벡터의 ng와 65 ° C에서 10 분 동안 400 U t 4 리가 14 ° C 16 헤 열에서 비활성화를 사용 하 여 삽입의 100-1000 ng의 표준 결 찰을 수행 합니다.
- 유능한 박테리아16표준 열-충격-프로토콜 사용 하 여 변환.
- Agar에 접시 접시 포함 100 µ g/mL 암 피 실린. 24 h 30 ° C에서 품 어.
- 단일 식민지를 선택 하 고, 제조업체의 지침에 따라 상업 miniprep 키트를 사용 하 여 플라스 미드 DNA를 정화 하 고 생어 시퀀싱17 에 의해 순서를 확인 (시퀀싱 뇌관: 5' 3' TGCTGGAGTTCTTCGCC).
- 긍정적인 식민지 맥시에 대 한 플라스 미드 DNA의 증폭을 조정 하 고 제조업체의 지침에 따라도 무료 플라스 미드 준비 키트18 를 사용 하 여 정화를 사용 합니다.
- 구문 주입에 대 한 준비가 되어, 따라서 5 단계를 계속.
2. 복제는 Transgene의 유도할 수 있는 유전자 발현에 대 한
- 디자인 transgene 증폭13,14를 위한 뇌관.
- 앞으로 뇌관의 5' 끝에 SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT), 또는 KpnI (GGTACC)에 대 한 금지 사이트를 추가 합니다. 반전 뇌관의 5' 끝에 노트 (GCGGCCGC) 또는 XhoI (CTCGAG)에 대 한 금지 사이트를 추가 합니다.
- Transgene 원하는 transgene14에 최적화 된 조건을 사용 하 여 PCR에 의해 증폭. 상업적인 DNA 정제 키트를 사용 하 여 정화.
- 순화 transgene 항목 벡터의 4 µ g를 소화 (pEN_TTmcs-벡터, 재료의 표참조) 적절 한 제한 nucleases (단계 2.2 참조)와 하룻밤에 37 ° C에서 50 µ L의 전체 볼륨에 버퍼 별도로19 .
- 젤 정화 소화 벡터 및 제조업체의 지침에 따라 상업 젤 추출 키트를 사용 하 여 삽입. 100 벡터의 ng와 65 ° C에서 10 분 동안 400 U t 4 리가 14 ° C 16 헤 열에서 비활성화를 사용 하 여 삽입의 100-1000 ng 표준 결 찰을 수행 합니다.
- 유능한 박테리아16표준 열-충격-프로토콜 사용 하 여 변환.
- Agar에 접시 포함 15 µ g/mL gentamicin 접시. 16 h 37 ° C에서 품 어.
- 단일 식민지를 선택 하 고, 플라스 미드 DNA를 정화 하 고 시퀀싱17 pCEP 앞으로 뇌관을 사용 하 여 삽입을 확인: 5' 3' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG.
참고: 단일 식민지에 PCR 뇌관 pCEP 앞으로와 이전 정화 없이 수행할 수 있습니다 그리고 pCEP 리버스 (5' 아가 아 그 CTG GGT CTA GAT ATC TCG 3'). 이 단계는 긍정적인 식민지의 사전 선택에 대 한 유용한 할 수 있다. - 4 단계로 진행 합니다.
3. 복제 미르 shRNA 유도할 수 있는 유전자 때 려 눕에 대 한의
- 복제 프로토콜19pSLIK에 따르면 미르 shRNA oligonucleotides 디자인. Anneal oligonucleotides 정화 하 고 희석 ddH2오 1시 20분
- 3 h 50 ° C에서 5 U BfuAI 항목 벡터의 다이제스트 3 µ g 다음 20 분 동안 65 ° C에서 반응 비활성화.
참고: 녹색 형광 단백질 (GFP)의 공동 식 바란다면 그렇지 않으면 사용 pEN_TTmiRc219, 항목 벡터로 pEN_TTGmiRc19 을 사용 합니다. - 젤 정화 단계 2.5에서 소화 벡터. 100의 표준 결 찰 수행 벡터의 ng와 1 µ L의 정화 및 희석 shRNA oligonucleotides (3.1 단계) 400 U t 4를 사용 하 여 리가 1 헤 열에 대 한 실 온에서 10 분 동안 65 ° C에서 비활성화.
- 유능한 박테리아16표준 열-충격-프로토콜 사용 하 여 변환.
- Agar에 접시 포함 15 µ g/mL gentamicin 접시. 16 h 37 ° C에서 품 어.
- 선택 단일 식민지, 플라스 미드 DNA를 정화 하 고 생어 시퀀싱17 에 의해 삽입을 확인 (시퀀싱 뇌관: 5' 3' TAGTCGACTAGGGATAACAG).
- 4 단계로 진행 합니다.
4. recombinational 복제 준비에 대 한 주입 클론을 생성 하
- (2 단계 또는 3 단계)에서 입력 벡터의 믹스 150 ng, 150 pTC의 ng TET 벡터20.
- TE 버퍼 8 µ L의 총 볼륨을 추가 (pH = 8).
- LR clonase 효소 혼합 II ( 재료의 표참조), 얼음에 품 어 2 분 소용돌이 대 한 두 번 전송 합니다.
- 반응에 LR clonase 효소 혼합 II 2 µ L을 추가 하 고 1 시간에 25 ° C에서 품 어.
- 가수분해 K-솔루션의 1 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다. 10 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 유능한 박테리아 recombinational 복제의 2 µ L 혼합16표준 열-충격-프로토콜 사용 하 여 Stbl3를 변환.
- Agar에 접시 접시 포함 100 µ g/mL 암 피 실린. 24 h 30 ° C에서 품 어.
- 선택 단일 식민지, 제조업체의 지침에 따라도 무료 플라스 미드 준비 키트18 를 사용 하 여 플라스 미드 DNA를 정화 하 고 벡터 무결성 생어 시퀀싱17 (시퀀싱 뇌관 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3')입니다.
- 구조는 주입에 대 한 준비, 5 단계를 계속.
5. 유체역학 꼬리 정 맥 주입에 대 한 솔루션을 준비합니다.
참고: 제정 및 유도할 수 있는 유전자 발현에 대 한 구문의 준비 단계 1, 2, 3, 및 4에에서 설명 되어 있습니다.
- 살 균 0.9% 식 염 수 주입에 대 한 준비 (사용 PBS 하지 않습니다). 마우스 몸 무게의 약 10%에 해당 하는 볼륨을 사용 합니다. 예: 마우스 무게 20 g, 2 mL 솔루션의 준비.
- (각각 1.8 또는 4.8, 단계 참조)도 무료 플라스 미드 정화 키트18 을 사용 하 여 정화 된 주입 경로 준비 합니다.
- 10 µ g 또는 잠자는 미녀 도 무료 벡터 구문의 15 µ g 추가 (단계 1 사용 10 µ g에서에서 단계 4 사용 15 µ g, 각각)와 무료 pc-HSB521 살 균 염 분의 mL 당 1 µ g.
- 최대 4 h 4 ° c.에 대 한 저장소 솔루션 고정 하지 마십시오.
6. 수행 유체역학 꼬리 정 맥 주입
- restrainer를 사용 하 여 꼬리 정 맥 주입 (상업적 또는 구멍 호흡 및 꼬리 50 mL 원뿔 튜브에서 준비). 휴지로 튜브의 하단을 채우십시오.
- 주입, 20-25 g의 무게와 나이의 약 8-10 주의 마우스를 사용 합니다.
- 주입 하기 전에 마우스 무게와 몸 무게에 따라 주입 볼륨 준비 (몸 무게의 10%를 해당 단계 5.1 참조). 27 G-바늘으로 살 균 3 mL 주사기 주입 및 필요한 볼륨을 채우기 위한 준비.
- restrainer에 마우스를 놓습니다. 휴지의 양을 조절 (단계 6.1 참조) 호흡에 대 한 충분 한 공간이 있지만 운동에 대 한 최소한의 공간을 두고.
- 마우스 정기적으로 호흡을 확인 합니다.
- 따뜻한 신중 하 게 30-60 미에 대 한 적외선 램프를 사용 하 여 꼬리의 과열 징후에 대 한 감시.
- 꼬리는 알코올 면봉으로 청소 합니다.
- 거의 수평으로 꼬리의 기지에 가까운 두 측면 꼬리 정 맥 중 하나에 바늘을 삽입 합니다.
참고: 성공적으로 배치, 바늘의 콘에 다시 혈액의 작은 양의 흐름 수 있습니다. 그것은 적극적으로 발음으로 바늘의 어떤 추가적인 움직임의 변위 및 정 맥의 상해에 발생할 수 있습니다 권장 하지 않습니다. - 총 볼륨 8-10 s 내 꼬리 정 맥에 주사.
- 즉시는 restrainer에서 마우스를 제거 합니다. 적어도 30에 대 한 상처는 사출 압축 s 또는 출혈이 라 앉 다 때까지.
- 별도 감 금 소에 마우스를 놓습니다. 마우스는 절차 (약 30-60 분)에서 회복 하 고, 일단 마우스 다시 전송 그것의 원래 감 금. 정기적으로 다음 24 h에 대 한 마우스에 확인 하십시오.
참고: 마우스의 온화한 진정은 정기적으로 관찰 2 h까지 주입 후. - (즉, 7 단계) 추가 실험을 계속 하기 전에 통합 되지 않은 벡터의 10-15 일을 기다립니다.
7입니다. Tamoxifen Transfected 크리스챤의 유도
주의: Tamoxifen은 유해한, 수 암 또는 다 산을 손상. 안전 데이터 시트를 참조 하십시오.
- 3 일에 복 tamoxifen 주사를 계획 한다.
- 1 일, 40 µ L 에탄올에 tamoxifen의 10 mg을 디졸브. 품 어 55 ° C 10 분 소용돌이에서 여러 번은 tamoxifen 해산 했다 때까지.
- 960 µ L 옥수수 오일을 추가 합니다. 55 ° c.에 5 분 동안 품 어 소용돌이 명확한 솔루션을 여러 번.
- 27 G 바늘 1 mL 인슐린 주사기에 솔루션을 준비 합니다.
- 아저씨 엄지와 두 번째 손가락으로 신중 하 게 마우스의 목 잡아서 마우스 손 기지와 넷째와 다섯째 손가락 사이 꼬리를 고정.
- 솔루션의 0.1 mL (= tamoxifen의 1mg) 주사 intraperitoneally 복 부의 왼쪽된 하단 사분면에.
- 2-3 일에 주사를 반복 합니다.
8. 항생물질 종속 유전자 또는 shRNA 식의 유도
주의: Doxycycline 해로울 수 있습니다. 안전 데이터 시트를 참조 하십시오.
참고: 형식 실험의 기간에 따라, doxycycline 공급 될 수 있다 식용 수 (8.1 단계) 또는 차 (8.2 단계)
-
짧은 기간 실험 (< 10 일) 다음 프로토콜을 사용 하 여 식 수를 통해 doxycycline 관리.
- 수도 물 100 mL에 5 g 자당 분해. 오토 클레이 브.
- 100mg doxycycline-hyclate 15 mL 원뿔 튜브에 자당 솔루션 (단계 8.1.1) 5 mL에 용 해.
- 살 균 필터 0.2 µ m 필터를 통해 솔루션 10 mL 주사기를 사용 하 여. 8.1.1 단계에서 준비 된 자당 솔루션에 추가 합니다.
- 마우스에 식용 수로 doxycycline 자당 솔루션을 제공 합니다. 솔루션 세균성 무성 (늦어도 3 일 후 바꾸기 명확한 솔루션)을 나타내는 흐린 때 매일 및 대체를 확인 합니다.
- 장기 실험에 대 한 (> 10 일) 또는 실험 신진 대사 변화에 민감한 상업 doxycycline-차 우 사용 (예를 들어, Doxycycline Hyclate 차 우 0.625 g/kg) 탈수 또는 치료 동물의 간에서 자당 유도 된 변화를 피하기 위해.
9. Immunostaining 분석에 대 한 마우스 간의 준비
주의: Paraformaldehyde 해로울 수 있습니다. 안전 데이터 시트를 참조 하십시오.
참고: 마우스를 분석할 것 이다 때 timepoint 실험에 따라 달라 집니다. 3 일 이상 transgene 또는 shRNA 식의 충분 한 유도 되도록 doxycycline 치료 후 간 조직을 분석 하는 것이 좋습니다.
- 4 %paraformaldehyde 솔루션 (PFA)의 1 mL를 27g 바늘 1 mL 주사기를 준비 합니다.
- 승인 된 동물 프로토콜에 따라 적절 한 방법으로 마우스를 안락사.
참고: 안락사의 적절 한 방법에 대 한 지침 교육 기관에 따라 달라질 수 있습니다. - 해가 위와 집게를 해 부 사용, 신중 하 게 노출 간 중간 개복 술과 복 부 구멍을 열어. 소장 포털 정 맥와 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC)를 오른쪽으로 이동 합니다.
- 준비 된 주사기의 바늘을 삽입 (단계 9.1 참조)는 IVC와 포털 정 맥으로. 간 조직 perfuse (바람직한 수행 됩니다 immunofluorescent 얼룩 경우) 자동 형광 적혈구를 제거 하 IVC로 PFA의 1 mL를 천천히 주사.
- 간을 제거 합니다. 물에 헹 구 고 4 %PFA 솔루션의 5-10 mL을 전송.
- 파라핀 섹션, 36-48 h. 조직에 대 한 수정 조직 탈수 및 파라핀 포함에 대 한 준비입니다.
-
냉동된 섹션에 대 한 수정 조직 4%에서 PFA 1 h.
- Cryoprotection에 대 한 10% 자당 해결책에 전송 합니다. 60 분을 품 어.
- 20% 자당 해결책을 전송. 60 분을 품 어.
- 30% 자당 해결책에 전송 합니다. 12-16 h. 소스 포함에 냉동된 섹션에 대 한 복합 incubate 고-20 ° c.에 동결
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Representative Results
유체 꼬리 정 맥 주입 하 여 transfection 효능: Hydrodynamically 단일 주사로 페는 murine hepatocytes의 비율 변수 이며 여러 매개 변수 주입 량, 주입 시간, 주입 된 DNA의 양과 주입된 구성6,의 크기에 따라 달라 집니다. 22,23. 또한, transfection 효율 큰 정현파 지역 뿐만 아니라 더 큰 혈관 직경 전체 압력에 있는 감소에 지도 한다 더 큰 동물에 일반적으로 낮습니다. Transfection 효율을 시각화, 크리스챤 transposon 구문 HTVI Rosa26mTmG 취재 원 유전자 있다 구조물의 tamoxifen 중재 활성화 하 여 다음을 은닉 하는 쥐에서 수행 되었다. 낮은 사출 볼륨 또는 감소 transfection 효율만 몇 transfected hepatocytes 감지, 전체에 최적의 주입 조건 높은 transfection에 발생 하는 동안에 기술적인 이유로 결과 대 한 머리말 붙인된 주입 시간 효율성 기자 크리스챤 transposon (그림 1A)의 HTVI 후 얼룩에 의해 묘사 된 대로. Transfection 효능 평가, immunostaining 있다-적당 한 취재 원 유전자의의 경우-또는 transfected transgene의 좋습니다. 또는, transfection 효율 transfected transgene의 mRNA 표정 분석에서 추정 될 수 있습니다.
Pericentral hepatocytes의 transfection: 유체역학 주입 후 압력 기울기는 정현파 공간-압력 중앙 정 맥 가까이 최고 및 최저 면적 periportal에-따라 선호 transfection pericentral 지역에서 발생할 수 있습니다. 우리 간 transgene 표현 hepatocytes의 낮은 비율을 분석 하 고 글루타민 합성 (GS), pericentral hepatocytes에 대 한 표식에 대 한 공동-immunostaining에 의해 간 lobule에서의 상대 위치를 평가. 흥미롭게도, hepatocytes는 리포터 유전자 발현 후 있다 구성의 HTVI 중앙 정 맥 그러나 하지 포털 영역 (그림 1B) 중앙 정 맥 주위 높은 transfection 효율을 나타내는 클러스터의 대부분.
Vivo에서 HTVI luciferase transposon의 후 이미징: 경우 단일 복사본 통합 transposon의 HTVI24 생성 후 관찰 평가 하 비보에 이미징에 대 한 충분 한 우리 주입 간 특정 통제 luciferase 식 카세트를 은닉 하는 transposon 구문 발기인 구성 합니다. 마우스 소 주사 했다 그리고는 vivo에서 이미징 시스템 HTVI (그림 2A) 후 2 주를 사용 하 여 몇 군데. 이미징 강력 하 고 안정적인 luciferase 생물 발광에서에서 보였다 간 15 일 주입 후 고 나중 시간 포인트 (그림 2B 와 데이터 표시 되지 않음). 이 결과 시스템 성공적으로 사용할 수 비보에 transfected 세포의 존재에 따라 생물 발광 영상으로 보여준다.
크리스챤 결합 및 유도할 수 있는 transgene 또는 shRNA 식: 우리는 이전 또는 선택20 (그림 3A)의 한 shRNA는 transgene의 유도할 수 있는 식을 유도할 수 있는 Cre recombinase (크리스챤)의 제정 식 결합 하는 transposon 구문 생성. Rosa26mTmG-기자 마우스 및 tamoxifen에 의해 크리스챤 활성화에이 구문의 주입이 했다 취재 원 유전자의 강력한 표현 단일 transgene 식 ( 는 transposon 구문으로 얻은 결과를 비교 그림 3B). Doxycycline 치료 후, 유도할 수 있는 transgene 식 transfected hepatocytes (그림 3C)에 적합 한 항 체에 의해 구상 될 수 있다. 유도할 수 있는 shRNA 식의 GFP shRNA 구문의 사용은 immunostaining에 의해 감지 하는 세포질 GFP 식 shRNA 식 (그림 3D)에 대 한 대리 표식으로 사용할 수 있는 권장 됩니다. 메모의 transgene 또는 shRNA 식, 각각,입니다만 immunostaining20탐지에 필요한 단백질 발현의 상대적으로 높은 수준으로 인해 있을 hepatocytes의 하위 집합에서 감지.
그림 1: HTVI에 의해 hepatocytes의 Transfection. 은닉 쥐로 크리스챤 transposon의 HTVI 후 (A) 가변 transfection 효율을 Rosa26mTmG / + 기자 tamoxifen 치료를 선행. Transfected hepatocytes는 막 도약 녹색 형광 단백질 (GFP, 녹색)에 대 한 긍정적 이다. (B) 공동 크리스챤에 대 한 얼룩 (녹색) 중앙 정 맥 마커 글루타민 합성 (GS, 빨간색)와 Rosa26mTmG 기자를 은닉 하는 쥐에서 hepatocytes 활성화. 여기에 태양광 발전: 문맥, CV: 중앙 정 맥. 스케일 바 대표 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: vivo에서 이미지 luciferase의입니다. (A) Transposon luciferase 식 카세트 (규모 하지 그려) 포함 된 구성. 간장 luciferase 식의 시각화에 대 한 주입 및 치료 체계. SB: 자 아름다움 인식 사이트, HTVI: 유체역학 꼬리 정 맥 주입. (B) 간장 luciferase 생물 발광은 vivo에서 이미징 시스템을 사용 하 여 pHSB5 함께 transposon luciferase 구성의 HTVI 후에 15 일의 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 크리스챤 및 유도할 수 있는 유전자/shRNA 식 결합. (A) 항생물질을 유도할 수 있는 transgene의 shRNA 식 함께 유도할 수 있는 Cre recombinase 표현 위한 Transposon 구문 (pTC Tet), 하지를 그려. (B)는 pTC의 주입 후 transfected hepatocytes 나타냅니다 녹색 막 얼룩에 Tet 구문 Rosa26mTmG / + 기자 마우스 및 tamoxifen과 크리스챤 활성화. 눈금 막대는 5 일 후 doxycycline 치료 transfected hepatocytes에서 transgene (얍, 레드)에 대 한 immunostaining에 의해 구상 될 수 있다 100 µ m. (C) 유도할 수 있는 유전자 발현을 나타냅니다. (D) 유도할 수 있는 미르 shRNA 식 세포질 녹색 형광 단백질 (GFP) 얼룩 GFP shRNA 구문으로 표시 doxycycline 치료 후 5 일. Transfected hepatocytes 막 도약 GFP에 의해 묘사 된다. C에서 바 스케일) 및 D) 대표 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
유체역학 꼬리 정 맥 주사로 hepatocytes의 transfection 되고있다 설립된 방법 그것의 소개부터 15 년 이상 전6. 주입 된 볼륨 심장 출력을 초과 하 고 간7, 어떤 경우에 약 10-20%의 transfection hepatocytes25,26의 40%까지 이어지는의 사인으로 열 등 한 베 나 정 맥에서 흐른다. 예언자는 성공적인 transfection 주입된 시간22,23당 주입 된 볼륨입니다. 따라서, 낮은 transfection 효율 (그림 1A, 왼쪽된 패널) 일반적으로 실패는 절차7동안 사출 속도 유지 하기 때문입니다. 그러나, 최적의 기술도 함께 HTVI에 의해 얻을 수 있는 transfection 효율 adenoviruses 또는 거의 1005,27 도달할 수 있는 adeno 관련 바이러스와 함께 바이러스 성 감염에 의해 얻은 속도 아래 유지 됩니다. . 성공적인 꼬리 정 맥 주사를 위해 혈관에 바늘의 안정적인 위치를 보장 하기 위해 중요 하다. 이것은 꼬리의 기지에 가까운 더 큰 직경을 가진 혈관에 쉽게 달성 된다. 또한, 꼬리를 온난 하 여 정 맥의 팽창이 좋습니다. 적외선 램프를 사용 하 여 최상의 결과 달성 하지만 비 적외선 열 램프 또는 따뜻한 물에 꼬리의 침수도 사용할 수 있습니다. 어떤 경우에 보충 염 분의 최대 200 µ L 복 주사로 약 30 분 전에 HTVI 혈관의 팽창에 따른 동물의 수 분 상태를 향상 시킬 것입니다. 일정 한 주입 속도 유지 하려면 마우스의 꼬리 해야 될 철저 하 게 제 지 바늘의 변위에 발생할 수 있습니다 꼬리의 모든 움직임을 피하기 위해. 유효성 검사를 위해, immunostaining에 의해 검출 될 수 있는 구문을 사용 하 여 하는 것이 좋습니다. 또는, transfection 효능 mRNA 표정 분석에 의해 추정 수 또는 시퀀싱의 DNA28통합.
우리의 데이터는 transposon 통합 선호 간 lobule의 pericentral 지역에서 관찰 된 나타냅니다. 그것은 또한 비 transposon 근거한 transfection29관찰 중앙 정 맥 주위 hepatocytes의 주된 transfection는 HTVI의 독특한 hemodynamics 때문일. 유도 하 여 CCl4, 주로 pericentral hepatocytes에 영향을 미치는 급성 간 손상의 같은 일부 응용 프로그램에 대 한 관련성의이 발견 될 수도 있습니다. 낮은 transfection 효율의 맥락에서 CCl4 치료 따라서 transfected hepatocytes의 수의 상당한 감소 발생할 수 있습니다. 또한, HTVI 담 관 세포15를 포함 하 여 대상 periportal 셀에 제한 된 사용입니다.
단일 transgene의 안정적인 식 달성 하기 transposon 구문 HTVI을 활용 하는 시스템, 뿐만 아니라 우리는 크리스챤의 공동 식과 유전자 또는 단일 벡터11에서에서 미르 shRNA 유도할 수 있는 식 수 있는 시스템을 최근 제시 . 이 시스템은 Cre/LoxP 기반 마우스 긴장에 특정 유전자가 특히 유용 합니다. Transgenes 또는 shRNA 구조는 신속 하 고 안정적인 recombinational 복제 절차에 의해 도입, 시스템 쉽게 접근 차단에 대 한 적용할 수 있습니다. 벡터 시스템을 신뢰할 수 있는 유도할 수 있는 식에 비보에 doxycycline11,30의 배달에 전적으로 의존 하는 중재. 이 실용적인 비디오 기반 안내 유도 간 조직의 유전자 발현 분석을 통해 적합 한 벡터의 클로닝에서 단계별 지침을 제공 합니다.
그러나, 시스템의 효율성을 보장 하기 위해, 여러 가지 측면에에서 보관 해야 마음: 장기 식 유지, 게놈 통합은 중재 타 사이트에서 잠자는 미녀 transposase8,11. 통합 효율성 transposon 크기에 의존 때문에, 그것은 벡터31를 설계할 때 염두에서 transgene 구조물의 크기를 유지 하는 것이 중요. 또한, 식이 효율에에서 유도할 수 있는 유전자 제품의 rtTA3 발기인11에 따라 달라 집니다. 최적의 식 결과 사용 하 여 간 가진 벡터 구조물의 특정 ApoE.HCR.hAAT-발기인은 권장 (Addgene #85578), 그것은 3 promotors11의 비교에서 최고 효율을 보여줍니다. 최적화 된 발기인 구성으로 유도할 수 있는 transgene/shRNA 식 transfected 세포20의 최대 30%까지에 immunostaining에 의해 감지할 수 있습니다. 유도할 수 있는 단백질 레벨 immunostaining에 의해 감지에 필요한 특정 임계값 아래 있으면이 결정 될 필요가 있다. 중요 한 것은, 아니 transgene/shRNA 식 doxycycline 치료 하지 않을 했다 쥐에 immunostaining에 의해 감지할 수 있습니다. 마지막으로, 항생물질 응답 요소 (트 레)의 통제 유전자의 표현 doxycycline32,33의 복용량에 따라 달라 집니다. 단기 실험에 대 한 식 수를 통해 doxycycline 관리 잘 설립된34,35입니다. 자당은 일반적으로 더 나은 맛을 줄에 추가 됩니다. 그러나,이 조 갈증과 탈수, 이어질 수 있습니다 그리고 장기 실험36,37doxycycline 차 사용이 좋습니다.
요약 하면, 유체역학 꼬리 정 맥 주입 간 연구에 널리 설립 방법입니다. 그것의 응용 범위는 B 형 간염의 연구에서 간 섬유 증 또는 간세포 암 모델38,39,,4041입니다. 이 원고에 설명 된 시스템 간 질환의 Cre/LoxP 기반 모델에서 특정 대상 유전자의 심문에 특히 유용 합니다. 또한, 간에서 overexpression 혈액 질환42,43 의 또는 면역학 질문44,45대처 연구에 대 한 또한 사용할 수 있습니다. 관심의 특정 유전자의 분석을 넘어 제시 시스템 수 있습니다 또한 쉽게 적응 시킬 심사 또는 접근을 멀티플렉싱. 이 비디오 기반 가이드 따라서 연구자의 큰 지역 사회에 대 한 도움이 됩니다.
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Disclosures
저자 공개할 게 없다
Acknowledgments
이 작품은 독일 Krebshilfe, 독일 (부여 번호 111289 UE), 어린이 건강 (어니스트와 아멜리아 Gallo 부여 박사 원정대-CTSA 보조금 번호 UL1 RR025744 UE)의 루 패 커드 재단에 의해 지원 되었다. 우리는 벡터 구문에 대 한 박사 마크 A. 케이 감사 하 고 실험 조언과 박사 줄리앙 세이 지 마우스이 고 실험적인 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Material | |||
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
| Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
| LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
| LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
| Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
| Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
| DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
| Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction Enzymes | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | New England BioLabs | R0156S | |
| SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
| KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| NotI | New England BioLabs | R0189S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for Mouse Experiments | |||
| Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
| Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
| Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
| Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
| Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
| Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
| NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
| Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
| Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
| pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
| pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
| pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |
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