Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Учредительные и индуцибельной систем для генетических в естественных условиях изменения мыши гепатоцитов, используя инъекции Вену гидродинамических хвост

Published: February 2, 2018 doi: 10.3791/56613

Summary

Гидродинамические хвост инъекции Вену векторов интеграции на основе transposon позволяет Трансфекция стабильная мышиных гепатоцитов в vivo. Здесь мы представляем практический протокол transfection систем, позволяющий долгосрочный учредительный выражение одного трансген или комбинированных учредительных и доксициклин индуцибельной выражение трансген или мир индуцируемый в печени.

Abstract

В модели исследования рака печени, регенерации, воспаление и фиброз гибкие системы в vivo экспрессии генов и глушителей являются весьма полезными. Гидродинамические хвост инъекции Вену конструкций на основе transposon является эффективным методом для генетических манипуляций гепатоцитов в взрослых мышей. Помимо выражения учредительный трансген эта система может использоваться для более сложных приложений, таких как индуцируемый опосредованной генов нокдаун, последствия ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы, чтобы вызвать мутации гена, или индуцибельной систем. Здесь сочетание учредительный CreER выражения вместе с индуцибельной выражение трансген или мир индуцируемый выбора представлен как пример этой техники. Мы покрываем многоступенчатого процедуры, начиная от подготовки Спящая красавица-transposon конструкции, инъекции и лечении мышей и подготовка ткани печени для анализа на иммуноокрашивания. Представлена система-это надежный и эффективный подход к достижению сложных генетических манипуляций в гепатоцитах. Он специально полезна в сочетании с КРР/loxP основанный мыши штаммов и может применяться для различных моделей в исследовании болезни печени.

Introduction

Хронические заболевания печени представляет основных медицинских бремя мира1. Исследования животных моделей являются важнейшими инструментами в исследовании болезни печени и помогли ответить на сложные вопросы в регенерации печени, печеночная воспаление и стеатоз, а также рака печени2. Значительное количество этих животных моделей полагаются на генетической модификации клеток печени. Таким образом эффективные инструменты для манипулирования экспрессии генов в гепатоцитах являются полезным3. Установленные методы селекции штаммов генетически модифицированные мыши или поколения вирусных векторов для гепатоцитов инфекции являются либо времени, гавань проблем безопасности, или дают бедным трансген выражение в гепатоциты в естественных условиях 4 , 5. инъекции Вену гидродинамических хвост (HTVI)-это альтернативный метод для в vivo трансфекции гепатоцитов, позволяя легко, быстро и экономически эффективных допрос функции гена в печени. Для HTVI вектор, перевозящих желаемой последовательности ДНК растворяется в объеме физраствора, соответствует 10% от массы тела животного вводят. Решение затем вводят в Вену хвост в течение 5-10 s6. Превышение сердечного выброса, солевой раствор вытекает из нижней полой вены в печени Вены, ведущих к расширению печени и гидродинамические трансфекции гепатоцитов7. Для достижения стабильного геномной интеграции, метод была объединена с transposon основе векторов, например Спящая красота -transposon системы. Эта систем опосредует рекомбинации целевой векторов с сайтов геномной рекомбинации, катализируемые Спящая красота -Транспозаза8,9. Для моделей фиброз печени или канцерогенеза желательно часто overexpress или молчание генов в определенные моменты времени модели болезни. Для этой цели, инструменты для экспрессии генов индуцибильный как LoxP/Cre системы или тетрациклин inducible gene выражение системы (тет-на) может быть используемые10.

Здесь мы описываем протокол в vivo трансфекции мышиных гепатоцитов, используя HTVI системы на базе transposon Спящая красавица . Помимо протокола для стабильного, учредительный выражение трансген под контролем печени конкретной промоутера, мы опишем более продвинутые векторная система, которая объединяет учредительный тамоксифен зависимых Cre рекомбиназа (CreER) выражение с индуцибельной выражение трансген или адаптированных микроРНК индуцируемый (мир индуцируемый), называется pTC тет системы11. В этой системе вектор в основу вектор с recombinational клонирования системы, что позволяет быстро и легко поколения новых векторов12клонируются индуцибельной трансгенов или мир процессируются тетрациклин зависимой выражения. Это видео на основе руководство охватывает подготовку подходящих векторов, инъекции и лечения мышей для достижения индуцибельной трансген/мир индуцируемый выражение и, наконец, подготовка ткани печени для анализа. Чтобы включить сочетание любых Cre/loxP при посредничестве системы мыши с выражением или нокдаун гена любого выбора, что делает его широко применяются системы исследований заболеваний печени был разработан метод, описанный в настоящем Протоколе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами для ухода и использования лабораторных животных и были утверждены ответственные власти (Oberbayern фон Regierung, Мюнхен, Германия и Стэнфорд институциональный уход за животными и использовать Комитет, Стэнфорд, Калифорния, США). Список всех плазмиды для клонирования (шаг 1 до 4) предоставляется в дополнительной таблице S1.

1. клонирование трансген для экспрессии генов учредительного

  1. Дизайн праймеров для трансген амплификации13,14.
  2. Добавление места ограничения для Голд (TTAATTAA)' конец 5 праймера вперед. Добавьте ' конец 5 праймера обратный места ограничения для AscI (GGCGCGCC) или ФГОУ (GGCCGGCC).
  3. Усилить трансген методом ПЦР с использованием условий, оптимизированный для желаемого трансген14. Очищают, использование коммерчески доступных комплект очистки ДНК.
    Примечание: Отжиг время зависит грунты, предназначенные на этапе 1.1., удлинение времени зависит от длины конструкции. Например для построения 1000 bp длины использования 60 s удлинение времени.
  4. Дайджест трансген и вектор для учредительного ген выражение15 с nucleases соответствующих ограничений (см. шаг 1.2) и буфер в суммарный объем 50 мкл при 37 ° C на ночь. Например, дайджест конструкция с 5 единиц Голд и 5 единиц ФГОУ при необходимости (см. шаг 1.2).
  5. Гель Очистить переваривается вектор и вставки с помощью набора извлечения коммерческих гель согласно инструкциям производителя. Выполнение стандартного лигирование 100 ng вектора и 100 – 1000 ng вставки с помощью 400 U T4 инактивирует лигаза на 14 ° C для 16 h. тепла при 65 ° C для 10 мин.
  6. Трансформировать компетентным бактерий, используя стандартный тепло шок протокол16.
  7. Плиты на агаре пластины содержащий ампициллина 100 мкг/мл. Инкубируйте на 30 ° C в течение 24 ч.
  8. Выбрать один колоний, очищают плазмида ДНК с использованием коммерческих алкалический комплекта согласно инструкциям производителя и проверить последовательность Сэнгер последовательности17 (секвенирование грунтовка: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').
  9. Использование положительных колоний для макси масштаб амплификации плазмидной ДНК и очистить с помощью свободных эндотоксина плазмидные комплект подготовки18 согласно инструкциям производителя.
  10. Конструкция готова для инъекций, таким образом, перейдите к шагу 5.

2. клонирование трансген для экспрессии генов индуцибильный

  1. Дизайн праймеров для трансген амплификации13,14.
  2. Добавление места ограничения для SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT) или KpnI (GGTACC)' конец 5 праймера вперед. Добавьте ' конец 5 праймера обратный места ограничения для персо (GCGGCCGC) или XhoI (CTCGAG).
  3. Усилить трансген методом ПЦР с использованием условий, оптимизированный для желаемого трансген14. Очищают с помощью коммерческого kit очистка ДНК.
  4. Дайджест очищенный трансген и 4 мкг вектора входа (pEN_TTmcs-вектор, смотрите Таблицу материалы)19 отдельно с соответствующим ограничением nucleases (см. шаг 2.2) и буфер в суммарный объем 50 мкл при 37 ° C в одночасье.
  5. Гель Очистить переваривается вектор и вставки с помощью набора извлечения коммерческих гель согласно инструкциям производителя. Выполнение стандартных перевязки с 100 ng вектора и 100 – 1000 ng вставки с помощью 400 U T4 инактивирует лигаза на 14 ° C для 16 h. тепла при 65 ° C для 10 мин.
  6. Трансформировать компетентным бактерий, используя стандартный тепло шок протокол16.
  7. Плиты на агаре пластины содержащего гентамицин 15 мкг/мл. Инкубируйте при 37 ° C для 16 h.
  8. Выбрать один колоний, очищают плазмида ДНК и проверить вставка последовательности17 с использованием pCEP вперед грунтовка: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'.
    Примечание: ПЦР на одной колонии могут выполняться без предварительной очистки с грунтовки pCEP вперед и обратного pCEP (5' Ага AAG КТГ GGT CTA Гат УВД ВРЧ 3'). Этот шаг может полезно для предварительного отбора положительных колоний.
  9. Перейдите к шагу 4.

3. клонирование из мир индуцируемый для Inducible Gene НОК-Даун

  1. Дизайн мир индуцируемый олигонуклеотиды согласно pSLIK клонирования19протокола. Отжиг и очищают олигонуклеотиды и разбавить 1:20 в ddH2O.
  2. Дайджест 3 мкг вектора входа с 5 U BfuAI при 50 ° C, 3 часа, затем инактивирует реакции при 65 ° C для 20 мин.
    Примечание: Если совместное выражение зеленого флуоресцентного белка (КГВ), использование pEN_TTGmiRc19 как вектор входа, в противном случае использовать pEN_TTmiRc219.
  3. Гель Очистить переваривается вектор как шаг 2,5. Выполнение стандартных лигирование 100 ng вектора и 1 мкл очищенной и разбавляют индуцируемый олигонуклеотиды (шаг 3.1) с помощью 400 U T4 лигаза при комнатной температуре в течение 1 ч. тепловой инактивации при 65 ° C для 10 мин.
  4. Трансформировать компетентным бактерий, используя стандартный тепло шок протокол16.
  5. Плиты на агаре пластины содержащего гентамицин 15 мкг/мл. Инкубируйте при 37 ° C для 16 h.
  6. Выбрать один колоний, очищают плазмида ДНК и проверить Вставка, Сэнгер последовательности17 (секвенирование грунтовка: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').
  7. Перейдите к шагу 4.

4. recombinational клонирования для создания клонов готова для инъекций

  1. Смесь 150 ng вектора входа (от шаг 2 и шаг 3) и 150 нг pTC тет вектор20.
  2. Добавьте буфер TE суммарный объем 8 мкл (рН = 8).
  3. Передача смеси ферментов LR-clonase II (см. Таблицу материалы) на лед, проинкубируйте 2 мин Vortex дважды.
  4. 2 мкл LR-clonase фермент смесь II реакции и инкубировать при 25 ° C в течение 1 ч.
  5. Остановите реакции, добавив 1 мкл протеиназы K-решения. Инкубируйте при 37 ° C за 10 мин.
  6. Преобразование Stbl3 компетентным бактерий с 2 мкл recombinational клонирования смешать с использованием стандартной тепло шок протокол16.
  7. Плиты на агаре пластины содержащий ампициллина 100 мкг/мл. Инкубируйте на 30 ° C в течение 24 ч.
  8. Выбрать один колоний, очищают плазмида ДНК с помощью свободных эндотоксина плазмидные комплект подготовки18 согласно инструкциям производителя и подтвердить целостность вектор Сэнгер последовательности17 (секвенирование грунтовка 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3').
  9. Конструкция готова для инъекций, перейдите к шагу 5.

5. Подготовка раствор для инъекции Вену гидродинамических хвост

Примечание: Подготовка конструкций для экспрессии генов учредительных и индуцибельной описаны в шаге 1, 2, 3 и 4.

  1. Подготовить стерильного 0,9% физиологического раствора для инъекций (делать не использовать PBS). Используйте том, соответствующий около 10% от массы тела мыши. Пример: для мыши, массой 20 г, подготовьте 2 мл раствора.
  2. Подготовьте инъекции векторов, которые были очищены с помощью свободных эндотоксина плазмидные очистки комплект18 (см. шаг 1.8 или 4,8, соответственно).
  3. Добавить 10 мкг или 15 мкг эндотоксинов бесплатно Спящая красавица конструкции вектора (из шага 1 использование 10 мкг, от шаг 4 Использование 15 мкг, соответственно) и 1 мкг эндотоксинов бесплатные pc-HSB521 мл стерильного физиологического раствора.
  4. Хранят раствор для до 4 ч при 4 ° C. Не замораживать.

6. выполнение гидродинамических хвост инъекции Вену

  1. Используйте фиксатор для инъекции Вену хвост (коммерческие или подготовленных от 50 мл Конические трубки с отверстиями для дыхания и хвост). Заполните нижней части трубки с папиросной бумаги.
  2. Для инъекций Используйте мышь около 8 – 10 недель возраста с весом 20-25 г.
  3. Взвешивание мышей до инъекции и подготовить объем впрыска в зависимости от веса (соответствует 10% от веса тела, см. шаг 5.1). Подготовьте стерильные 3 мл шприц с иглой 27 G для инъекций и залейте требуемый объем.
  4. Поместите указатель мыши в фиксатор. Регулировать количество папиросной бумаги (см. шаг 6.1) оставить только минимальное пространство для движения, но достаточно места для дыхания.
  5. Убедитесь, что мышь дышать регулярно.
  6. Теплый хвост, с помощью инфракрасных ламп для 30-60 s. тщательно следите за признаки перегрева.
  7. Очистите хвост с спиртом.
  8. Вставьте иглу почти горизонтально либо один из двух боковых хвост вен близко к основанию хвоста.
    Примечание: Если установлен успешно, небольшое количество крови может вытекать обратно в конус иглы. Не рекомендуется активно аспирационная как любое дополнительное движение иглы может привести к его перемещения и/или травмы Вены.
  9. Придать общий объем в Вену хвост в течение 8-10 s.
  10. Немедленно удалите мышь из фиксатор. Сжимать инъекции раной для по крайней мере 30 s или до тех пор, пока любое кровотечение спадает.
  11. Поместите указатель мыши в отдельной клетке. Как только мышь оправился от процедуры (около 30-60 мин), передача мыши обратно в его оригинальной клетку. Проверить на мыши регулярно для последующих 24 часов.
    Примечание: Умеренный седативный эффект мыши обычно наблюдается до 2 ч после инъекции.
  12. Прежде чем продолжить дальнейшие эксперименты (т.е., шаг 7), подождите 10-15 дней для оформления неинтегрированный векторов.

7. индукция Transfected CreER тамоксифен

Предупреждение: Тамоксифен вредно, могут быть злокачественными или нанести ущерб плодовитости. Пожалуйста, обратитесь к лист данным по безопасности.

  1. План тамоксифен внутрибрюшинной инъекции в течение трех дней подряд.
  2. День 1 Растворите 10 мг тамоксифен в 40 мкл этанола. Инкубируйте на 55 ° C для 10 min. Vortex несколько раз, пока не растворится тамоксифен.
  3. Добавление 960 мкл кукурузное масло. Инкубируйте на 5 минут при температуре 55 ° C. Вихревой несколько раз, чтобы получить ясное решение.
  4. Приготовляют раствор в 1-мл инсулина шприц с иглой 27 G.
  5. Загривок мыши, захватывая шею мыши тщательно с пальца и второй палец, фиксации хвост между база руки и четвертый и пятый палец.
  6. Inject 0,1 мл (= 1 мг тамоксифен) решения внутрибрюшинно в левом нижнем квадранте живота.
  7. Повторяйте инъекции на дни 2 и 3.

8. всасывание тетрациклина зависимых генов или индуцируемый выражение

Предупреждение: Доксициклин может быть вредным. Пожалуйста, обратитесь к лист данным по безопасности.

Примечание: В зависимости от вида и продолжительности эксперимента, Доксициклин может поставляться в питьевой воде (шаг 8.1) или Чоу (шаг 8.2)

  1. Для краткосрочных экспериментов (< 10 дней) администрирование доксициклин через питьевую воду, используя следующий протокол.
    1. Растворяют 5 г сахарозы в 100 мл воды. Автоклав.
    2. Растворите 100 мг доксициклина гиклат в 5 мл раствора сахарозы (шаг 8.1.1) в 15 мл Конические трубки.
    3. С помощью 10-мл шприц, стерильные фильтр решение через фильтр 0.2 мкм. Добавьте в решение сахарозы, подготовленную на этапе 8.1.1.
    4. Поставка раствора сахарозы доксициклин качестве питьевой воды с помощью мыши. Проверьте ежедневно и заменить, когда решение становится мутным, указывающее бактериальных разрастание (заменить прозрачный раствор после трех дней позднее).
  2. Для долгосрочных экспериментов (> 10 дней) или эксперименты, чувствительных к метаболические изменения, используйте коммерческих доксициклин Чоу (например, доксициклин гиклат Чоу 0,625 г/кг) чтобы избежать обезвоживания и/или сахароза индуцированные изменения в печени лечение животных.

9. Подготовка мыши печени для анализа иммуноокрашивания

Предупреждение: Параформальдегида может быть вредным. Пожалуйста, обратитесь к лист данным по безопасности.

Примечание: Timepoint когда будут проанализированы мышей зависит от эксперимента. Рекомендуется для анализа тканей печени после не менее трех дней лечения доксициклин для обеспечения достаточной индукции трансген или индуцируемый выражения.

  1. Готовим 1 мл шприц с иглой 27 G с 1 мл 4% раствора параформальдегида (PFA).
  2. Усыпить мыши, соответствующий метод согласно утвержденным животных протокол.
    Примечание: Руководящие принципы для соответствующих методов эвтаназии может варьироваться в зависимости от учреждения.
  3. Тщательно с использованием рассечения ножницы и анатомический пинцет, откройте брюшной полости с средний лапаротомия подвергать печени. Переместите в тонком кишечнике право подвергать воротной вены и нижней полой вены (IVC).
  4. Вставьте иглу подготовленный шприц (см. шаг 9.1) в МКВ и вырезать воротной вены. Inject 1 мл PFA медленно в МКВ perfuse ткани печени и удалить auto люминесцентные красные кровяные клетки (желательно, если будет выполняться immunofluorescent окрашивание).
  5. Удаление печени. Прополощите в воде и передача на 5 – 10 мл 4% раствора PFA.
  6. Для парафиновых срезах исправить ткани для 36-48 ч. ткани готова для обезвоживания и встраивание парафина.
  7. Для замороженных секций, исправить ткани в 4% ПФА за 1 час.
    1. Для криозащиты передать раствор 10% сахарозы. Инкубируйте 60 мин.
    2. Переезд в 20% раствора сахарозы. Инкубируйте 60 мин.
    3. Переезд в 30% раствора сахарозы. Инкубировать 12 – 16 h. встроить в внедрение комплекса для замороженной секции и заморозить при температуре-20 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эффективность трансфекции путем инъекции Вену гидродинамических хвост: Процент мышиных гепатоцитов, которые являются transfected эжекции путем однократной инъекции является переменной и зависит от нескольких параметров, таких как объем впрыска, время впрыска, количество введенного ДНК, а размер вводят конструкцию6, 22,23. Кроме того эффективность трансфекции обычно ниже в более больших животных, где большего диаметра сосудов, а также крупных синусоидального области приводит к снижению общего давления. Чтобы визуализировать эффективность трансфекции, HTVI конструкции transposon CreER была исполнена в мышей, укрывательство Rosa26mTmG Репортер ген следуют тамоксифен опосредованной активации CreER конструкции. Объем впрыска низкого или время длительного впрыска для технических причин результаты эффективности сокращения трансфекции с только несколько transfected гепатоцитов, обнаруживаемая в целом печени, в то время как условия оптимального инъекции приводят к выше трансфекции эффективность как репортер, пятнать после HTVI CreER transposon (рис. 1A). Чтобы оценить эффективность трансфекции, настоятельно рекомендуется иммуноокрашивания из transfected трансген, или – как в случае CreER - подходящий репортер гена. Кроме того эффективность трансфекции могут быть оцененные мРНК выражение анализа transfected трансген.

Transfection pericentral гепатоцитов: После инъекции гидродинамических градиент давления вдоль синусоидального пространства, - где давление является высоким, недалеко от центральной жилки и самые низкие в ареал перипортальный - может привести к предпочтительным трансфекции в районе pericentral. Мы проанализировали печень с низким процентом трансген выражая гепатоцитов и оценку их относительное положение в печени долька co иммуноокрашивания для глютамина синтетаза (GS), маркер для pericentral гепатоцитов. Интересно, что большинство гепатоцитов, которые показали репортер экспрессии генов, после HTVI конструкцию CreER группируются вокруг центральной вены, но не портала области (Рисунок 1B) более высокую эффективность трансфекции вокруг центральной жилки.

В естественных условиях изображений после HTVI Люцифераза transposon: Оценить, если интеграция единой копии, наблюдается после HTVI transposon конструирует24 достаточно для в vivo imaging, мы вводили transposon конструкцию, укрывательство Люцифераза выражение кассету под контролем печени конкретных Промоутер конструкции. Мыши были введены с люциферин и образы, используя в vivo imaging системы через две недели после HTVI (рисунок 2A). Томографии показали надежные и стабильные Люцифераза биолюминесценции в печени 15 дней после инъекции и позднее момента времени (Рисунок 2B и данные не показаны). Эти результаты показывают, что система может успешно использоваться для следовать присутствие transfected клеток в естественных условиях у Вообразимый биолюминесценции.

Комбинированный CreER и индуцибельной трансген или индуцируемый выражение: Мы ранее созданных transposon конструкция, которая комбинирует учредительного выражение индуцибельной Cre рекомбиназа (CreER) с индуцибельной выражение трансген или индуцируемый выбор20 (рис. 3A). Инъекции этой конструкции в Rosa26mTmG-репортер мышей и активации CreER тамоксифен показан надежный экспрессия гена репортера сопоставимые результаты, полученные с помощью transposon конструкции для одного трансген выражение ( Рисунок 3B). После лечения доксициклин индуцибельной трансген выражения могут быть визуализированы на подходящие антител в transfected гепатоцитов (рис. 3 c). Для выражения индуцибельной индуцируемый рекомендуется использовать конструкцию GFP-индуцируемый как цитоплазматическая экспрессия гена GFP, обнаруженных иммуноокрашивания может использоваться в качестве суррогатной маркера для индуцируемый выражение (Рисунок 3D). Следует отметить трансген или индуцируемый выражение, соответственно, обнаружен только в подмножестве гепатоцитов, которые могут быть из-за относительно высокого уровня экспрессии белков, необходимых для обнаружения иммуноокрашивания20.

Figure 1
Рисунок 1: Transfection гепатоцитов, HTVI. (A) переменной трансфекции эффективность после HTVI CreER-transposon в мышах укрывательство Rosa26mTmG / + репортер и следуют лечения тамоксифен. Transfected гепатоцитов являются позитивными для мембраны прыгните Зеленый флуоресцентный белок (GFP, зеленый). (B) совместно пятная для CreER активирован гепатоцитов (зеленый) в мышей, укрывательство Rosa26mTmG репортер с центральной жилки синтетаза маркер глютамина (GS, красный). Здесь PV: воротной вены, CV: центральной жилки. Масштаб бары представляют 100 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: В vivo изображений Люцифераза. (A) Transposon построить, содержащий Люцифераза выражение кассету (не обращается к шкале). Инъекции и лечения схема для визуализации печени Люцифераза выражения. SB: Спящая красоты признание сайтов, HTVI: инъекции Вену гидродинамических хвост. (B) представитель образ печени Люцифераза биолюминесценции через 15 дней после HTVI transposon Люцифераза конструкции вместе с pHSB5 с помощью в vivo imaging системы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: комбинированный CreER и индуцибельной гена/индуцируемый выражение. (A) Transposon конструкции для выражения индуцибельной рекомбиназа КРР вместе с выражение тетрациклин индуцибельной трансген или индуцируемый (pTC тет), не обращается в масштабе. (B) зеленый мембраны пятнать указывает transfected гепатоцитов после инъекции pTC тет конструкции в Rosa26mTmG / + репортер мышей и активации CreER тамоксифен. Линейки шкалы представляет собой 100 µm. (C) Inducible gene выражение 5 дней после того, как доксициклин лечения могут быть визуализированы на иммуноокрашивания для трансген (яп, красный) в transfected гепатоцитов. (D) выражения индуцибельной мир Индуцируемый 5 дней после лечения доксициклин, обозначается цитоплазматических Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) пятная GFP-индуцируемый конструкции. Transfected гепатоцитов изображены на мембраны прыгните GFP. Масштаб баров в C) и D) представляют собой 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Трансфекция гепатоцитов с гидродинамическим хвост инъекции Вену стал установленным метод с момента ее введения более чем 15 лет назад6. Введенный объем превышает сердечного выброса и перетекает из нижней полой вены в синусоид печени7, ведущих к трансфекции около 10-20%, в некоторых случаях до 40% гепатоцитов25,26. Предикторы успешных трансфекции являются от закачанного объема вводили время22,23. Таким образом низкий трансфекции эффективность (рис. 1A, левая панель) — обычно из-за неспособности поддерживать скорость инъекции во время процедуры7. Однако даже с оптимальным методом, эффективность трансфекции, что может быть достигнуто путем HTVI будет оставаться ниже ставка, полученная вирусной инфекцией с аденовирусов или аденоассоциированный вирусов, которые могут достигать практически 100%5,27 . Для достижения успешного хвост инъекции Вену, важно обеспечить стабильные позиционирование иглы в кровеносный сосуд. Это легко достигается в венах с большего диаметра, ближе к основанию хвоста. Кроме того настоятельно рекомендуется расширение вен путем нагревать хвост. Наилучшие результаты достигаются с помощью инфракрасных ламп, но может также использоваться без инфракрасного тепла лампы или погружения хвоста в теплой воде. В некоторых случаях дополняющего до 200 мкл раствора внутрибрюшинной инъекцией около 30 минут, прежде чем HTVI улучшит состояние гидрации животных, что приводит к расширение кровеносных сосудов. Для поддержания постоянного инъекций скорости, хвост мыши должны удерживаться тщательно избегать любого движения хвоста, который может привести к перемещению иглы. Для целей проверки мы предлагаем использовать конструкцию, которая может быть обнаружена иммуноокрашивания. Кроме того эффективность трансфекции может быть оценена путем анализа выражение mRNA или секвенирование ДНК28интегрированы.

Наши данные показывают, что transposon интеграции желательно наблюдается в pericentral области печени дольки. Преобладающим трансфекции гепатоцитов вокруг центральной жилки, вероятно, благодаря уникальной гемодинамики HTVI как она наблюдается также в не transposon основе трансфекции29. Этот вывод может иметь значение для некоторых приложений, таких как индукция острого повреждения печени, "ККЛ"4, которая затрагивает главным образом pericentral гепатоцитов. В контексте трансфекции низкой эффективности "ККЛ"4 лечения таким образом может привести к значительному сокращению числа transfected гепатоцитов. Кроме того HTVI имеет ограниченное использование для целевого перипортальный клеток, включая клетки желчных протоков15.

Помимо систем, которые используют HTVI transposon конструкций для достижения стабильной выражение одного трансген мы недавно представил систему, которая позволяет совместно выражение CreER и индуцибельной выражение гена или мир индуцируемый от одного вектора11 . Эта система особенно полезна для опрос конкретных генов в основанные на КРР/LoxP штаммов мыши. Как быстро и надежно recombinational процедура клонирования вводятся трансгенов или индуцируемый конструкции, система может быть легко адаптирована для скрининга подходы. Вектор системы опосредует надежный индуцибельной выражение в естественных условиях , полностью зависит от доставки доксициклин11,30. Этот путеводитель видео содержит пошаговые инструкции от клонирования подходящих векторов над индукции экспрессии генов для анализа тканей печени.

Однако, для обеспечения эффективности системы, некоторые аспекты следует иметь в виду: для поддержания долгосрочной перспективе выражение, геномных интеграции при посредничестве в TA-сайтов Спящая красавица Транспозаза8,11. Так как эффективность интеграции зависит размер transposon, важно сохранить размер трансген конструкции в виду при проектировании вектор31. Кроме того выражение эффективность продукта индуцибельной гена в печени зависит от rtTA3-промоутер11. Для оптимального выражение результатов, используйте конструкции вектора с печенью конкретных ApoE.HCR.hAAT промоутер рекомендуется (Addgene #85578), как это показывает высокую эффективность в сравнении трех промоторов11. С конструкцией оптимизированное промоутер индуцибельной трансген/индуцируемый выражение может быть обнаружены иммуноокрашивания до 30% transfected клеток20. Если уровни индуцибельной белка существует ниже определенного порогового значения, необходимые для обнаружения, иммуноокрашивания, это необходимо определить. Важно отметить, что выражение не трансген/индуцируемый могут быть обнаружены иммуноокрашивания в мышей, которые были не получавших доксициклин. И наконец выражение генов под контролем элемента реагирования Тетрациклин (TRE) зависит от дозы доксициклин32,33. Для краткосрочных экспериментов доксициклин администрации через питьевой воды является хорошо установленным34,35. Сахароза обычно добавляется дают лучший вкус. Однако это может привести к полидипсия и обезвоживания и для долгосрочных экспериментов36,37настоятельно рекомендуется использовать доксициклин Чоу.

В резюме гидродинамические хвост инъекции Вену является широко создан метод в печени исследований. Его применение колеблется от исследований гепатита b в печени фиброз или гепатоцеллюлярной карциномы модели38,,3940,41. Система, описанная в этой рукописи особенно полезен в опрос конкретных целевых генов в модели на основе Cre/LoxP заболеваний печени. Кроме того Избыточная экспрессия в печени может также использоваться для научных исследований, гематологические заболевания42,43 или решать вопросы иммунологические44,45. Помимо анализа специфических генов интерес представлена система также может быть легко адаптирована к скрининг или мультиплексирование подходы. Поэтому это видео на основе руководство будет полезно для большого сообщества исследователей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Deutsche Krebshilfe, Германия (номер 111289 Грант для UE), Люсиль Паккард для здоровья детей (Эрнест и Амелия Галло наделены докторантура стипендий - CTSA номер гранта УЛ1 RR025744 для UE). Мы благодарим д-р Марк а. Кей для векторных конструкций и экспериментальной советы и д-р Жюльен Sage для мышей и экспериментальной поддержки.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
General Material
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder Thermo Fisher #SM1331 DNA ladder for electrophoresis
Tissue-Tek O.C.T. Sakura 4583 embedding of cryo-sections
Biozym LE Agarose Biozym 840004
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
D(+)-Saccharose Carl Roth 4621.1 For sweetening of the doxycyline solution
Ampicillin Sodium Salt AppliChem A0839,0010 For selection of Amp-resistant clones
LB Agar (Luria/Miller) Carl Roth X969.1
LB Broth (Luria/Miller) Carl Roth X968.1
S.O.C. Medium Thermo Fischer 15544034
Gentamicin sulfate AppliChem A1492,0001 For selection of Gentamicin-resistant clones
Roti-Histofix 4 % Fa. Roth P087.6 para-formaldehyde solution
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix invitrogen/ThermoFisher 11791-020 contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K
DB3.1 Competent Cells Thermo Fisher 11782-018
Stbl3 Chemically Competent E. coli Thermo Fisher C737303
Name Company Catalog Number Comments
Restriction Enzymes
PacI New England BioLabs R0547S
AscI New England BioLabs R0558S
FseI New England BioLabs R0588S
SacI New England BioLabs R0156S
SpeI New England BioLabs R0133S
KpnI New England BioLabs R0142S
NotI New England BioLabs R0189S
XhoI New England BioLabs R0146S
BfuAI New England BioLabs R0701S
Name Company Catalog Number Comments
Kits
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For DNA Extraction from gel
NucleoSpin Gel and PCR Clean Up Macherey & Nagel 740609.10
NucleoBond PC20 Macherey & Nagel 740571 Plasmid extraction (Mini prep)
NucleoBond PC500 Macherey & Nagel 740574 Plasmid extraction (Maxi prep)
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher F530S
Name Company Catalog Number Comments
Materials for Mouse Experiments
Injekt Syringe F 1 ml Braun 9166017V For intraperitoneal injection
Omnifix Luer 3 ml Braun 4616025V For intravenous injection
Sterican Cannula 24G Braun 4657675
Sterican Cannula 27G Braun 4657705
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648-1G For CreER activation
Corn oil Sigma-Aldrich C8267-500ML Carrier for tamoxifen injections
Doxycycline hyclate AppliChem A2951,0025 Activation of tetracycline-dependent expression
Injekt 10 ml Syringe Braun 4606108V
Filtropur S 0.2 Sarstedt 831,826,001 For filtration of doxycycline
NaCl 0,9% Braun 3200905 Carrier for intravenous injections
Falcon Conical Tube 50ml Corning Life Science 352095
Infrared Lamp N/A N/A For warming of mouse tail
IVIS Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.
pTC n/a Vector for constitutive gene expression, ref. 15
pEN_TTmcs Addgene #25755 Entry vector for inducible gene expression, ref. 19
pEN_TTGmiRc2 Addgene #25753 Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19
pEN_TTmiRc2 Addgene #25752 Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19
pTC ApoE-Tet Addgene #85578 Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11
pTC-CMV-Tet Addgene #85577 Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159 (2014).
  2. Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
  3. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
  4. Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236 (2014).
  5. Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
  6. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
  7. Kanefuji, T., et al. Hemodynamics of a hydrodynamic injection. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029 (2014).
  8. Ivics, Z., Izsvak, Z. Sleeping Beauty Transposition. Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).
  9. Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
  10. Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
  11. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
  12. Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
  13. Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  15. Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
  16. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  17. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  18. Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
  19. Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
  20. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
  21. Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50 (2007).
  22. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
  23. Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
  24. Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
  25. Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
  26. Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
  27. Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
  28. Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
  29. Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
  30. Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
  31. Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
  32. Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
  33. Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
  34. Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894 (2016).
  35. Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
  36. Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
  37. Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
  38. Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
  39. Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936 (2015).
  40. Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
  41. Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
  42. Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
  43. Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79 (2014).
  44. Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023 (2014).
  45. Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).

Tags

Генетика выпуск 132 печень transposon систем Спящая красавица инъекции Вену тет на гидродинамические хвост в естественных условиях трансфекции видео гид.
Учредительные и индуцибельной систем для генетических <em>в естественных условиях </em>изменения мыши гепатоцитов, используя инъекции Вену гидродинамических хвост
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hubner, E. K., Lechler, C.,More

Hubner, E. K., Lechler, C., Rösner, T. N., Kohnke-Ertel, B., Schmid, R. M., Ehmer, U. Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection. J. Vis. Exp. (132), e56613, doi:10.3791/56613 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter