Summary
Inyección en la vena hidrodinámica cola de vectores de integración basado en el transposón permite la transfección estable de hepatocitos murinos en vivo. Aquí, presentamos un protocolo práctico para sistemas de transfección que permite la expresión constitutiva a largo plazo de un solo transgen o expresión constitutiva e inducible de doxiciclina combinada de un transgén o miR-shRNA en el hígado.
Abstract
En modelos de investigación de cáncer de hígado, inflamación, regeneración y fibrosis, flexible para en vivo gene expresión y silenciamiento son muy útiles. Inyección en la vena hidrodinámica cola de construcciones basadas en el transposón es un método eficiente para la manipulación genética de hepatocitos en ratones adultos. Además la expresión del transgen constitutiva, este sistema puede utilizarse para aplicaciones más avanzadas, como consecuencia de precipitación, shRNA-mediado del gene del sistema CRISPR/Cas9 para inducir mutaciones genéticas, o sistemas inducibles. Aquí, la combinación de la expresión constitutiva de CreER junto con la expresión inducible de un transgen o miR-shRNA de elección se presenta como un ejemplo de esta técnica. Cubrimos el procedimiento de varios paso a partir de la preparación de la bella durmiente-transposon construye, a la inyección y el tratamiento de ratones y la preparación del tejido hepático para su análisis por immunostaining. El sistema presentado es un acercamiento confiable y eficiente para lograr complejas manipulaciones genéticas en los hepatocitos. Es especialmente útil en combinación con cepas de ratón basados en Cre/loxP y puede aplicarse a una variedad de modelos en la investigación de la enfermedad hepática.
Introduction
Enfermedad del higado crónica presenta una carga de salud importante en todo el mundo1. Modelos de investigación animal son herramientas esenciales en el estudio de la enfermedad hepática y han ayudado a responder preguntas complejas en la regeneración del hígado, inflamación hepática, esteatosis como cáncer de hígado2. Un número considerable de estos modelos animales se basan en la modificación genética de las células del hígado. Por lo tanto, herramientas eficaces para manipular genes en los hepatocitos están útil3. Métodos establecidos, tales como la cría de las cepas de ratón modificados genéticamente o la generación de vectores virales para la infección del hepatocito son o puerto mucho tiempo, preocupaciones de seguridad o rendimiento pobre transgene expresión en hepatocitos en vivo 4 , 5. inyección en la vena hidrodinámica cola (HTVI) es un método alternativo para en vivo de la transfección de hepatocitos permitiendo interrogatorio fácil, rápido y eficiente de la función génica en el hígado. Para HTVI, un vector con la secuencia de ADN deseada se disuelve en un volumen de solución salina correspondiente al 10% del peso corporal del animal inyectado. La solución entonces se inyecta en la vena de la cola dentro de 5-10 s6. Exceder el gasto cardiaco, la solución salina fluye de la vena cava inferior en las venas hepáticas, hacia la expansión del hígado y la hidrodinámica de la transfección de hepatocitos7. Para lograr la integración genómica estable, el método se ha combinado con vectores transposon-basados, tales como el sistema de transposon dormir belleza. Este sistema interviene en la recombinación de vectores objetivo con los sitios de recombinación genómica catalizados por transposasa dormir belleza-8,9. Para los modelos de fibrosis hepática o carcinogénesis, a menudo es deseable que sobrexpresan o silencio genes en ciertos momentos del modelo de la enfermedad. Para ello, herramientas para la expresión de genes inducibles como el sistema Cre/LoxP o el sistema de expresión del gen inducible por tetraciclina (Tet-) pueden ser usados10.
Aquí, describimos un protocolo de la transfección en vivo de hepatocitos murinos utilizando HTVI de un durmiente transposon-sistema. Además de un protocolo de expresión constitutiva, estable de un transgen bajo el control de un promotor específico de hígado, describimos un sistema de vectores más avanzado que combina la expresión constitutiva de recombinase (CreER) de Cre de tamoxifeno-dependiente con la expresión inducible de un transgén o shRNA adaptado de microARN (miR-shRNA), llamado el pTC TET-system11. En este sistema de vectores, los transgenes inducibles o miR-shRNAs de expresión dependiente de la tetraciclina son clonados en el vector de la columna vertebral con un sistema de clonación recombinational, permitiendo la fácil y rápida generación de nuevos vectores12. Esta guía de video abarca la preparación de vectores adecuados, inyección y tratamiento de los ratones para lograr la expresión del transgen/miR-shRNA inducible y finalmente la preparación de tejido hepático para su análisis. El método descrito en este protocolo fue diseñado para permitir la combinación de cualquier sistema Cre/loxP mediada del ratón con la expresión o la precipitación de cualquier gen de elección, lo que es un sistema ampliamente aplicable en la investigación de la enfermedad hepática.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron según las pautas para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por las autoridades responsables (Regierung von Oberbayern, Munich, Alemania y Stanford institucional Animal cuidado y Use Comité, Stanford, CA, USA). Se proporciona una lista de todos los plásmidos para la clonación (paso 1 a 4) en la tabla suplementaria S1.
1. clonación de un transgen para la expresión del gen constitutivo
- Diseño de cebadores para el transgen amplificación13,14.
- Agregar a sitios de restricción para PacI (TTAATTAA) en el extremo 5' del primer avance. Añadir sitios de restricción para AscI (GGCGCGCC) o FseI (GGCCGGCC) en el extremo 5' del primer revés.
- Amplificar el transgén por PCR usando condiciones optimizadas para el transgen deseado14. Purificar mediante un kit de purificación de DNA disponible comercialmente.
Nota: Tiempo del recocido depende de los cebadores diseñados en el paso 1.1., tiempo de alargamiento depende de la longitud de la construcción. Por ejemplo, para una construcción de 1.000 bp longitud uso 60 s tiempo de elongación. - Digerir el transgen y vector de expresión constitutiva del gen15 con nucleasas de restricción respectivas (ver paso 1.2) y tampón en un volumen total de 50 μl a 37 ° C durante la noche. Digerir por ejemplo, construir con PacI de 5 unidades y 5 unidades FseI si procede (consulte el paso 1.2).
- Gel de purificar el vector digerido e insertar usando un kit de extracción de gel comercial según las instrucciones del fabricante. Realizar una ligadura estándar de 100 ng del vector y 100 – 1.000 ng de insertar usando 400 U T4 ligasa a 14 ° C por 16 h. calor inactivar a 65 ° C durante 10 minutos.
- Transformar las bacterias competentes usando un estándar de protocolo de shock de calor16.
- Placa en agar las placas que contienen ampicilina 100 de μg/mL. Incubar a 30 ° C por 24 h.
- Pick solo colonias, purificar DNA plasmídico utilizando un kit comercial miniprep según las instrucciones del fabricante y verificar la secuencia de secuenciación de Sanger17 (cartilla de la secuencia: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').
- Uso positivo de colonias para maxi escalan de amplificación de ADN plásmido y purifican mediante un plásmido libre de endotoxina preparación kit18 según las instrucciones del fabricante.
- Construcción está lista para la inyección, por lo tanto continúe con el paso 5.
2. clonación de un transgen para expresión génica Inducible
- Diseño de cebadores para el transgen amplificación13,14.
- Agregar sitios de restricción de KpnI (GGTACC), SacI (GAGCTC) y SpeI (ACTAGT) al extremo 5' del primer avance. Añadir sitios de restricción NotI (GCGGCCGC) o XhoI (CTCGAG) en el extremo 5' del primer revés.
- Amplificar el transgén por PCR usando condiciones optimizadas para el transgen deseado14. Purificar mediante un kit comercial de purificación de ADN.
- Digerir el transgén purificado y 4 μg del vector de entrada (pEN_TTmcs-Vector, véase Tabla de materiales)19 por separado con nucleasas de restricción apropiado (véase el paso 2.2) y tampón en un volumen total de 50 μl a 37 ° C durante la noche.
- Gel de purificar el vector digerido e insertar usando un kit de extracción de gel comercial según las instrucciones del fabricante. Realizar ligadura estándar con 100 ng de vector y 100 – 1.000 ng de insertar usando 400 U T4 ligasa a 14 ° C por 16 h. calor inactivar a 65 ° C durante 10 minutos.
- Transformar las bacterias competentes usando un estándar de protocolo de shock de calor16.
- Placa en agar las placas que contienen Gentamicina 15 μg/mL. Incubar a 37 ° C por 16 h.
- Pick solo colonias, purificar DNA plasmídico y verificar inserción secuenciación17 utilizando la cartilla adelante pCEP: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'.
Nota: PCR sobre colonias solo puede realizarse sin una previa purificación con cartillas pCEP adelante y atrás pCEP (5' AGA AAG CTG GGT CTA GAT ATC TCG 3'). Este paso puede útil para la selección de las colonias positivas. - Proceda al paso 4.
3. clonación de un miR-shRNA Inducible Gene Knock-down
- Diseño de oligonucleótidos de miR-shRNA según pSLIK clonación protocolo19. Recocido y purificar oligonucleótidos y diluir 1:20 en el ddH2O.
- Recopilación 3 μg de vectores de entrada con 5 BfuAI de U a 50 ° C por 3 h, luego inactivar la reacción a 65 ° C por 20 min.
Nota: Si se desea la coexpresión de la proteína verde fluorescente (GFP), use el pEN_TTGmiRc19 como un vector de entrada, si no uso pEN_TTmiRc219. - Gel de purificar el vector digerido como en el paso 2.5. Realizar ligadura estándar de 100 ng del vector y 1 μl de purificada y diluida shRNA oligonucleótidos (paso 3.1) con 400 U T4 ligasa a temperatura ambiente durante 1 h. calor inactivar a 65 ° C durante 10 minutos.
- Transformar las bacterias competentes usando un estándar de protocolo de shock de calor16.
- Placa en agar las placas que contienen Gentamicina 15 μg/mL. Incubar a 37 ° C por 16 h.
- Pick solo colonias, purificar DNA plasmídico y verificar inserción por Sanger secuenciación17 (cartilla de la secuencia: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').
- Proceda al paso 4.
4. recombinational de clonación para generar Clones listos para la inyección
- Mezcla 150 ng del vector de entrada (del paso 2 o del paso 3) y 150 ng de pTC TET-vector20.
- Añadir buffer TE a un volumen total de 8 μl (pH = 8).
- Transferir la mezcla de enzima clonase LR II (véase Tabla de materiales) para hielo, Incube por 2 minutos vórtice dos veces.
- Añadir 2 μl de mezcla de enzima clonase LR II a la reacción e incubar a 25 ° C durante 1 hora.
- Detener la reacción agregando 1 μl de proteinasa K solución. Incubar a 37 ° C durante 10 minutos.
- Transformar Stbl3 bacterias competentes con 2 μl de clonación recombinational mezclan utilizando un estándar de protocolo de shock de calor16.
- Placa en agar las placas que contienen ampicilina 100 de μg/mL. Incubar a 30 ° C por 24 h.
- Seleccionar colonias solo, purificar DNA plasmídico utilizando un plásmido libre de endotoxina preparación kit18 según las instrucciones del fabricante y confirmar la integridad de vector por Sanger secuenciación17 (cartilla de la secuencia 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3').
- Construcción está lista para la inyección, continúe con el paso 5.
5. preparación de solución para inyección en la vena hidrodinámica cola
Nota: Preparación de construcciones para expresión génica inducible y constitutiva se describen en el paso 1, 2, 3 y 4.
- Preparación de solución salina 0.9% estéril para inyección (hacer no uso PBS). Utilice el volumen correspondiente a cerca del 10% del peso corporal de ratón. Ejemplo: para un ratón de 20 g de peso, preparar 2 mL de solución.
- Preparación de vectores de inyección que se purificaron usando un plásmido libre de endotoxina purificación kit18 (ver paso 1.8 o 4.8, respectivamente).
- Añadir 10 μg o 15 μg del constructo de vector libre de endotoxina de la bella durmiente (del paso 1 Utilice 10 μg, de paso 4 uso 15 μg, respectivamente) y 1 μg de endotoxina libre pc-HSB521 por mL de solución salina estéril.
- Solución para un máximo de 4 h a 4 ° C. No congelar.
6. realizar la inyección en la vena hidrodinámica cola
- Utilizar un limitador para la inyección de la vena de la cola (comercial o preparada de un tubo cónico de 50 mL con agujeros de respiración y de la cola). Llene el fondo del tubo con papel de seda.
- Para la inyección, utilizar ratones de unos 8 – 10 semanas de edad con pesos de 20-25 g.
- Pesar ratones antes de la inyección y preparar el volumen de inyección según el peso corporal (correspondiente al 10% del peso corporal, consulte el paso 5.1). Preparar una estéril 3 mL-jeringa con una aguja de 27 G para inyección y relleno con el volumen requerido.
- Coloque el ratón en el limitador. Ajustar la cantidad de papel de seda (ver paso 6.1) para dejar un mínimo espacio para el movimiento pero suficiente espacio para respirar.
- Asegúrese de que el ratón está respirando regularmente.
- Caliente la cola con una lámpara infrarroja para 30-60 s. con cuidado para observar signos de sobrecalentamiento.
- Limpiar la cola con un algodón embebido en alcohol.
- Inserte la aguja casi horizontalmente en una de las dos venas laterales de la cola cerca de la base de la cola.
Nota: Si coloca con éxito, una pequeña cantidad de sangre puede fluir hacia el cono de la aguja. No se recomienda aspirar activamente ya que cualquier movimiento adicional de la aguja podría provocar su desplazamiento y/o lesiones de la vena. - Inyectar el volumen total en la vena de la cola en s 8-10.
- Inmediatamente Quite el ratón el limitador. Comprimir la inyección de la herida para menos de 30 s o hasta que el sangrado ceda.
- Coloque el ratón en una jaula separada. Una vez que el ratón se ha recuperado del procedimiento (unos 30-60 min), transferir el ratón a su jaula original. Compruebe en el ratón regularmente para las próximas 24 horas.
Nota: Sedación suave del ratón se observa rutinariamente hasta 2 h después de la inyección. - Antes de proceder a los experimentos adicionales (es decir, paso 7), espere 10 a 15 días para el despacho de vectores no integradas.
7. inducción de CreER Transfected con tamoxifeno
PRECAUCIÓN: El tamoxifeno es perjudicial, puede ser canceroso o dañar la fertilidad. Por favor consulte la hoja de datos de seguridad.
- Plan de inyecciones intraperitoneales de tamoxifeno durante tres días consecutivos.
- El día 1, disolver 10 mg de tamoxifeno en etanol al 40 μl. Incubar a 55 ° C durante 10 minutos Vortex varias veces hasta que se disuelva el tamoxifeno.
- Añadir el aceite de maíz μl 960. Incubar por 5 minutos a 55 ° C. Vórtice varias veces para obtener una solución clara.
- Preparar la solución en una jeringa de insulina 1 mL con una aguja de 27 G.
- Pescuezo del ratón agarrando el cuello del ratón cuidadosamente con el pulgar y el dedo segundo, fijar la cola entre la base de la mano y los dedos cuarto y quinto.
- Inyectar 0.1 mL (= 1 mg de tamoxifeno) de la solución por vía intraperitoneal en el cuadrante inferior izquierdo del abdomen.
- Repetir las inyecciones en los días dos y tres.
8. inducción de genes dependientes de la tetraciclina o shRNA expresión
PRECAUCIÓN: La doxiciclina puede ser perjudicial. Por favor consulte la hoja de datos de seguridad.
Nota: Dependiendo del tipo y duración del experimento, doxiciclina puede suministrarse en el agua potable (paso 8.1) o chow (paso 8.2)
-
Para los experimentos a corto plazo (< 10 días) administrar doxiciclina a través de agua potable utilizando el siguiente protocolo.
- Disolver el sacarosa 5 g en 100 mL de agua. Autoclave.
- Disolver 100 mg de Doxiciclina hiclato en 5 mL de solución de sacarosa (paso 8.1.1) en un tubo cónico de 15 mL.
- Utilizando una jeringa de 10 mL, filtro estéril la solución mediante filtro 0.2 μm. Añadir a la solución de sacarosa preparada en el paso 8.1.1.
- Suministro de solución de sacarosa de doxiciclina como agua potable para el ratón. Compruebe diariamente y reemplazar cuando la solución se vuelve turbia indicando crecimiento excesivo bacteriano (Reemplace la solución clara después de tres días a más tardar).
- Para los experimentos de largo plazo (> 10 días) o experimentos sensibles a los cambios metabólicos, uso comercial doxiciclina-chow (por ejemplo, Doxiciclina hiclato Chow 0,625 g/kg) para evitar la deshidratación y los cambios inducidos por la sacarosa en los hígados de los animales tratados.
9. preparación de hígado de ratón para análisis por inmunotinción
PRECAUCIÓN: Paraformaldehído puede ser perjudicial. Por favor consulte la hoja de datos de seguridad.
Nota: El punto cuando se analizarán de ratones depende el experimento. Se recomienda analizar el tejido del hígado después de no menos de tres días de tratamiento doxiciclina para garantizar suficiente inducción de la expresión del transgen o shRNA.
- Preparar una jeringa de 1 mL con una aguja de 27 G con 1 mL de solución al 4% paraformaldehido (PFA).
- Eutanasia el ratón mediante un método adecuado según un protocolo aprobado del animal.
Nota: Las directrices para los métodos adecuados de la eutanasia pueden variar dependiendo de la institución. - Con tijeras de disección y pinzas anatómicas, abra cuidadosamente la cavidad abdominal con una laparotomía mediana para exponer el hígado. Mover el intestino delgado hacia la derecha para exponer la vena porta y la vena cava inferior (IVC).
- Inserte la aguja de la jeringa preparada (ver paso 9.1) en la vena cava inferior y corte la vena porta. Inyectar 1 mL de PFA lentamente en la vena cava inferior para inundar el tejido del hígado y quitar auto-fluorescente glóbulos rojos (deseables si se realizará la coloración inmunofluorescente).
- Retirar el hígado. Enjuague con agua y traslado a 5 – 10 mL de solución 4% de la PFA.
- Para secciones de parafina, parche tejido para 36 a 48 h. tejido está listo para la deshidratación y la inclusión en parafina.
-
Para secciones congeladas, fijar tejido en 4% PFA durante 1 hora.
- Para crioprotección, transferencia a la solución de sacarosa al 10%. Incubar 60 min.
- Traslado a la solución de sacarosa al 20%. Incubar 60 min.
- Traslado a la solución de sacarosa al 30%. Incubar 12 – 16 h. Embed en la encajadura para secciones congeladas y congelar a-20 ° C.
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Representative Results
Eficacia de transfección por inyección en la vena hidrodinámica cola: El porcentaje de hepatocitos murinos que son transfectadas hidrodinámico de una sola inyección es variable y depende de varios parámetros tales como volumen de inyección, tiempo de inyección, cantidad de ADN inyectado y el tamaño de la construcción inyectado6, 22,23. Además, la eficiencia de transfección es generalmente menor en animales más grandes, donde un diámetro vascular, así como la mayor superficie sinusoidal conduce a una disminución en la presión total. Para visualizar la eficiencia de transfección, HTVI de una construcción de transposon CreER fue realizado en ratones albergar un gen reportero de Rosa26mTmG seguido por la activación mediada por el tamoxifeno de la construcción de CreER. Volumen de inyección de baja o tiempo prolongado para obtener resultados de razones técnicas en la eficiencia de transfección reducido con sólo unos pocos hepatocitos transfected detectables en el hígado entero, mientras que las condiciones de inyección óptimo lugar mayor transfección eficiencia como reportero la coloración después de HTVI de un transposón de CreER (figura 1A). Evaluar la eficacia de transfección, immunostaining del transgén transfected o – como en el caso de CreER - de un gen reportero adecuada es muy recomendable. Como alternativa, eficiencia de transfección puede estimar a partir de análisis de la expresión del mRNA del transgén transfected.
Transfección de hepatocitos pericentrales: Después de la inyección hidrodinámica, puede producir un gradiente de presión en el espacio sinusoidal - donde la presión es mayor cerca de la vena central y menor en el área periportal - recomendado: transfección de la zona pericentral. Analizados los hígados con un bajo porcentaje de hepatocitos expresar transgenes y evaluaron su posición relativa en el lóbulo hepático co-immunostaining para la glutamina sintetasa (GS), un marcador para hepatocitos pericentrales. Curiosamente, la mayoría de los hepatocitos que reportero gene expresión demostrada después de HTVI de una construcción de CreER agrupadas alrededor de la vena central pero no el espacio porta (figura 1B) que indica una mayor eficiencia de transfección alrededor de la vena central.
En vivo de imagen después de HTVI de un transposón de luciferasa: Para evaluar si la integración solo ejemplar observada después de HTVI de transposon construye24 es suficiente para que en vivo la proyección de imagen, inyectamos una construcción de transposon que un cassette de expresión de luciferasa bajo el control de un hígado específico construcción del promotor. Ratones fueron inyectados con luciferin y reflejada usando un en vivo sistema de imagen dos semanas después de HTVI (figura 2A). Proyección de imagen demostró bioluminiscencia luciferase robusto y estable en el hígado 15 días después de la inyección y en más puntos del tiempo (figura 2B y datos no mostrados). Estos resultados muestran que el sistema puede utilizarse con éxito para seguir la presencia de células transfected en vivo por proyección de imagen de bioluminiscencia.
CreER combinado y expresión del transgén o shRNA inducible: Previamente hemos generado una construcción de transposon que combina la expresión constitutiva de un recombinase de Cre inducible (CreER) con la expresión inducible de un transgen o un shRNA opción20 (Figura 3A). Inyección de este constructo en Rosa26mTmG-reportero ratones y activación de CreER por tamoxifeno demostró sólida expresión del gen reportero comparable a los resultados obtenidos con una construcción de transposones de expresión del transgen sola ( Figura 3B). Después del tratamiento del doxycycline, expresión transgénica inducible puede visualizarse por anticuerpos adecuados en los hepatocitos transfected (figura 3). Para la expresión inducible de shRNA, se recomienda el uso de una construcción de GFP-shRNA como expresión de GFP citoplásmico detectado immunostaining puede ser utilizado como un marcador sustituto para la expresión de shRNA (figura 3D). De nota, expresión del transgen o shRNA, respectivamente, sólo es detectable en un subconjunto de hepatocitos, que puede ser debido al relativamente alto nivel de expresión de la proteína necesaria para la detección por inmunotinción20.
Figura 1: transfección de hepatocitos por HTVI. (A) eficacia de transfección Variable después de HTVI de un transposon CreER en ratones que un Rosa26mTmG / + reportero y seguida por el tratamiento con tamoxifeno. Hepatocitos transfected son positivas para proteína fluorescente verde (GFP, verde) de membrana-limitan. (B) Co coloración para CreER activa de hepatocitos (verdes) en ratones que un reportero Rosa26mTmG con la vena central marcador glutamina sintetasa (GS, rojo). Aquí PV: vena porta, CV: vena central. Barras de escala representan 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: En vivo la proyección de imagen de luciferasa. (A) construcción de transposón que contiene un cassette de expresión de luciferasa (no dibujado a escala). Esquema de inyección y el tratamiento para la visualización de la expresión de luciferasa hepática. SB: dormir sitios de reconocimiento de belleza, HTVI: inyección en la vena hidrodinámica cola. (B) imagen representativa de bioluminescence de luciferase hepática 15 días después de HTVI de una construcción de transposon-luciferase junto con pHSB5 usando un en vivo sistema de imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: CreER y expresión inducible gene/shRNA combinados. (A) construcción de transposones de expresión inducible recombinase de Cre junto con la expresión de un transgen inducible por tetraciclina o shRNA (pTC Tet), no dibujado a escala. (B) tinción de membrana verde indica transfected hepatocitos después de la inyección de la pTC construcción TTE en Rosa26mTmG / + reportero ratones y activación de CreER con tamoxifeno. Barra de escala representa 100 μm. (C) Inducible gene expresión 5 días después de tratamiento de doxiciclina puede visualizarse por immunostaining para el transgén (YAP, rojo) en los hepatocitos transfected. (D) expresión de miR-shRNA Inducible 5 días después del tratamiento de doxiciclina indicadas por la coloración citoplásmica proteína verde fluorescente (GFP) de la construcción de GFP-shRNA. Hepatocitos transfected son representados por GFP unida a la membrana. Escala de barras en C) y D) representan 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Transfección de hepatocitos con inyección en la vena hidrodinámica cola se ha convertido en un método establecido desde su introducción hace más de 15 años6. El volumen inyectado excede gasto cardiaco y fluye de la vena cava inferior en los sinusoides del hígado7, llevando a la transfección de unos 10-20%, en algunos casos hasta el 40% de hepatocitos25,26. Predictores de una exitosa transfección son el volumen inyectado por tiempo inyectado22,23. Por lo tanto, una eficacia de transfección baja (figura 1A, panel izquierdo) es generalmente debido a la falta de mantener la velocidad de inyección durante el procedimiento7. Sin embargo, incluso con una técnica óptima, la eficiencia de transfección que puede lograrse por HTVI permanecerá por debajo de la tasa obtenida por la infección viral por adenovirus o virus adeno-asociado que pueden llegar a casi 100%5,27 . Para conseguir las inyecciones de vena de cola exitoso, es fundamental para asegurar una colocación estable de la aguja en el vaso sanguíneo. Esto se consigue fácilmente en las venas con un diámetro más grande más cercano a la base de la cola. Además, la dilatación de la vena por el calentamiento de la cola es muy recomendable. Los mejores resultados se consiguen utilizando una lámpara infrarroja, pero una lámpara de calor infrarrojo no o inmersión de la cola en agua caliente también puede ser utilizado. En algunos casos, suplir hasta 200 μL de solución salina por inyección intraperitoneal de unos 30 minutos antes de HTVI mejorará el estado de hidratación de los animales dando por resultado la dilatación de los vasos sanguíneos. Para mantener una velocidad constante de la inyección, la cola del ratón debe ser refrenada cuidadosamente para evitar cualquier movimiento de la cola, que puede resultar en el desplazamiento de la aguja. Para la validación, se sugiere utilizar una construcción que puede ser detectada immunostaining. Por otra parte, eficacia de transfección puede estimarse por el análisis de la expresión de mRNA o integrado de secuenciación de ADN28.
Nuestros datos indican que integración de transposon se observa preferentemente en la zona pericentral del lóbulo hepático. La transfección predominante de hepatocitos alrededor de la vena central es probablemente debido a la hemodinámica única de HTVI como también se observa en el transposón no basado en la transfección29. Este hallazgo podría ser de importancia para algunas aplicaciones, tales como inducción de daño hepático agudo por CCl4, que afecta principalmente a los hepatocitos pericentrales. En el contexto de la eficacia de transfección baja, CCl4 tratamiento por lo tanto, podría conducir a una reducción significativa del número de hepatocitos transfected. Además, HTVI es de uso limitado a periportal dianocitos incluyendo de las células del conducto biliar15.
Además de los sistemas que utilizan la HTVI de transposon construcciones para lograr una expresión estable de un transgen sola, nos presentó recientemente un sistema que permite la expresión conjunta de CreER y expresión inducible de un gen o un shRNA miR de un solo vector11 . Este sistema es especialmente útil para cuestionar determinados genes en cepas de ratón basados en Cre/LoxP. Como construcciones transgenes o shRNA se introducen por un procedimiento de clonación recombinational rápido y confiable, el sistema puede ser fácilmente adaptado para la detección de enfoques. El sistema vector media fiable expresión inducible en vivo que es enteramente dependiente de la entrega de doxiciclina11,30. Esta guía práctica de vídeo ofrece instrucciones paso a paso de la clonación de vectores adecuados sobre la inducción de la expresión génica análisis de tejido del hígado.
Sin embargo, para asegurar la eficiencia del sistema, varios aspectos se deben tener en cuenta: para mantener la expresión a largo plazo, integración genómica está mediada en TA-sitios del durmiente transposasa8,11. Puesto que la eficiencia de integración es dependiente en tamaño de transposones, es importante mantener el tamaño de la construcción del transgén en mente al diseñar el vector31. Además, eficacia de la expresión del producto del gene inducible en el hígado depende de la rtTA3-promotor11. Para obtener resultados óptimos de la expresión, el uso de una construcción de vectores con un hígado ApoE.HCR.hAAT-promotor específico se recomienda (Addgene #85578), ya que muestra la mayor eficiencia en una comparación de tres promotores11. Con una construcción optimizada promotor, expresión transgen/shRNA inducible puede detectarse mediante inmunotinción en hasta un 30% de células transfected20. Si existen niveles de proteína inducible por debajo de cierto umbral que se requiere para la detección de immunostaining, esto debe ser determinado. Lo importante, ninguna expresión del transgen/shRNA puede detectarse mediante inmunotinción en ratones que no fueron tratados con doxiciclina. Por último, expresión de genes bajo el control del elemento de respuesta de tetraciclina (TRE) es dependiente de la dosis de doxiciclina32,33. Para los experimentos a corto plazo, administración de la doxiciclina por vía de agua potable es bien establecido34,35. Sacarosa se agrega generalmente para dar un mejor sabor. Sin embargo, esto puede producir polidipsia y deshidratación, y el uso de chow de doxiciclina es muy recomendable a largo plazo experimentos36,37.
En Resumen, inyección en la vena hidrodinámica cola es un método ampliamente establecido en la investigación de hígado. Sus campos de aplicación de los estudios de hepatitis B en hígado fibrosis o hepatocelular carcinoma modelos38,39,40,41. El sistema descrito en este manuscrito es especialmente útil en el interrogatorio de genes específicos en Cre/LoxP basado en modelos de enfermedad hepática. Además, la sobreexpresión en el hígado también puede utilizarse para la investigación de enfermedades hematológicas42,43 o abordar cuestiones inmunológicas44,45. Más allá del análisis de genes específicos de interés, el sistema presentado también puede ser fácilmente adaptado a proyección o métodos de multiplexación. Esta guía basada en video por lo tanto será útil para una gran comunidad de investigadores.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Deutsche Krebshilfe, Alemania (número de licencia 111289 a UE), la Lucile Packard Foundation para la salud de los niños (Ernest y Amelia Gallo dotado Beca Postdoctoral - número de la concesión de la CTSA UL1 RR025744 a UE). Agradecemos a Dr. Mark A. Kay vector construcciones y asesoramiento experimental y Dr. Julien Sage para los ratones experimentales y apoyan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Material | |||
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
| Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
| LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
| LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
| Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
| Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
| DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
| Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction Enzymes | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | New England BioLabs | R0156S | |
| SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
| KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| NotI | New England BioLabs | R0189S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for Mouse Experiments | |||
| Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
| Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
| Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
| Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
| Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
| Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
| NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
| Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
| Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
| pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
| pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
| pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |
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