Summary
Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon transposon dayalı Tümleştirme vektörlerin sağlar fare tetkikine istikrarlı transfection içinde vivo. Burada, tek bir transgene uzun vadeli kurucu ifade veya kombine kurucu ve Doksisiklin indüklenebilir ifade bir transgene veya miR-shRNA karaciğerde sağlayan pratik bir protokol transfection sistemler mevcut.
Abstract
Karaciğer kanseri, rejenerasyon, inflamasyon ve fibrozis araştırma modelleri esnek sistemler içinde vivo gen ekspresyonu ve susturmak için son derece yararlıdır. Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon transposon tabanlı yapıları, hepatositlerin yetişkin farelerde genetik manipülasyon için verimli bir yöntemdir. Kurucu transgene ifade ek olarak, bu sistem shRNA-aracılı gen knock-down, dolaylı, gen mutasyonlarının ikna etmek için CRISPR/Cas9 sistem veya indüklenebilir sistemleri gibi daha gelişmiş uygulamalar için kullanılabilir. Burada, bünye CreER ifade ile birlikte bir transgene indüklenebilir ifade birleşimi veya miR-shRNA tercih Bu teknik bir örnek olarak sunulur. Uyuyan güzelhazırlanması başlangıç Multi-step yordamı kapak-transposon oluşturur, enjeksiyon ve tedavi farelerin ve analiz için karaciğer dokusu hazırlanması için immunostaining tarafından. Sunulan sistem tetkikine karmaşık genetik manipülasyon elde etmek için güvenilir ve etkili bir yaklaşımdır. Cre/loxP tabanlı fare suşları ile birlikte özellikle yararlıdır ve karaciğer hastalığının araştırmasında modeller çeşitli uygulanabilir.
Introduction
Kronik karaciğer hastalığı önemli sağlık yük dünya çapında1sunar. Hayvan araştırma modelleri karaciğer hastalığı çalışmanın temel araçlar ve karaciğer rejenerasyonu, karaciğer iltihabı ve yağlanma yanı sıra karaciğer kanseri2karmaşık sorulara cevap yardımcı oldu. Bu hayvan modellerin önemli bazı karaciğer hücreleri genetik değişiklik olmasına bağlıdır. Bu nedenle, yararlı3gen ekspresyonu tetkikine içinde işlemek için verimli araçlar bulunmaktadır. Kurulan yolu üreme genetiği fare suşları veya viral vektörler oluşturulmasında Hepatosit enfeksiyon gibi zaman alıcı, her iki liman güvenlik endişeleri, veya tetkikine vivo içinde zavallı transgene ifade verim 4 , 5. hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon (HTVI) bırakmak için kolay, hızlı ve maliyet-etkin sorgu karaciğerde gen işlevinin tetkikine vivo içinde transfection için alternatif bir yöntem olduğunu. HTVI için istenen DNA dizisi taşıyan bir vektör serum enjekte hayvanın vücut ağırlığının % 10'una karşılık gelen bir birimdeki feshedilmiştir. Çözüm sonra 5-10 s6içinde kuyruk damar içine enjekte edilir. Kardiyak çıkış aşan, serum karaciğer genişlemesi ve hidrodinamik transfection tetkikine7' nin önde gelen karaciğer damarlar içine inferior vena kava akar. İstikrarlı genomik entegrasyonu sağlamak için yöntem transposon tabanlı vektörel çizimler, güzellik - uykutransposon sistemi gibi ile birleştirilmiştir. Bu sistemler bir güzellik - uykutransposase8,9tarafından katalize genomik rekombinasyon siteleri ile hedef vektörel çizimler rekombinasyon aracılık. Karaciğer fibrozis ya da karsinojenezis modeller için bu kez overexpress veya sessizlik genlerin hastalık modeli belirli zaman noktalarda için arzu edilir. Bu amaçla indüklenebilir gen ekspresyonu Cre/LoxP-sistem veya tetrasiklin-indüklenebilir gen ifade system için araçları kullanılan10(Tet-On) olabilir.
Burada, HTVI bir uyuyan güzel transposon tabanlı sistemi kullanarak fare tetkikine vivo içinde transfection için bir protokol açıklayın. Bir karaciğer özgü organizatörü kontrol altında bir transgene istikrarlı, kurucu ifade bir protokolüne ek olarak, biz bünye tamoxifen bağımlı Cre recombinase (CreER) ifade ile birleştirir daha gelişmiş bir vektör sistemi tarif bir transgene veya shRNA (miR-shRNA), mikroRNA adapte indüklenebilir ifade denilen pTC TET-sistem11. Bu vektör sisteminde indüklenebilir transgenes veya miR-shRNAs tetrasiklin bağımlı ifade için bir recombinational klonlama sisteminde, yeni vektörel çizimler12hızlı ve kolay nesil ile omurga vektör içine klonlanır. Bu video tabanlı kılavuz indüklenebilir transgene/miR-shRNA ifade ulaşmak için hazırlanması uygun vektörel çizimler, enjeksiyon ve farelerde tedavi ve sonunda analiz için karaciğer dokusunun hazırlık kapsar. Bu protokol için açıklanan yöntemi fare sistemiyle ifade Cre/loxP aracılı herhangi bir kombinasyonu veya knock-down tercih, yapım o bir yerde geçerli sistem karaciğer hastalığı araştırmada herhangi bir gen etkinleştirmek için tasarlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri için bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanım esaslarına göre gerçekleştirilen ve sorumlu yetkilileri (Regierung von Oberbayern, Münih, Almanya ve Stanford hayvan Kurulusları ve kullanma, Komitesi tarafından kabul edildi Stanford, CA, Amerika Birleşik Devletleri). (Adım 1'den 4) klonlama için tüm plazmid listesi ek tablosunda S1 sağlanır.
1. kurucu gen ekspresyonu için bir Transgene klonlama
- Astar transgene amplifikasyon13,14için tasarım.
- Kısıtlama siteleri PacI (TTAATTAA için) 5' uç ileri astar için ekleyin. Kısıtlama siteleri ASCI (GGCGCGCC) veya FseI (GGCCGGCC) için 5' uç ters astar için ekleyin.
- Tarafından istenen transgene14için optimize edilmiş koşullar kullanarak PCR transgene yükseltmek. Piyasada bulunan bir DNA arıtma kit kullanarak arındırmak.
Not: Saat tavlama adım 1.1 tasarlanmış astar bağlıdır., uzama süresi inşa uzunluğuna bağlıdır. Örneğin, bir 1000 bp uzunluğu kullanım 60 s uzama zaman yapısı için. - Transgene ve vektör bünye gen ifade15 (bkz. Adım 1.2) ilgili kısıtlama nükleaz ve 37 ° C'de 50 µL toplam hacmi arabellek için gecede sindirmek. Örneğin, 5 adet PacI sahip yapı ve 5 adet FseI uygunsa sindirmek (bkz. Adım 1.2).
- Jel arındırmak sindirilir vektör ve üreticinin yönergelerine göre ticari jel ekstraksiyon kiti kullanarak ekle. Bir standart tüp ligasyonu 100 ng vektör ve 100 – 1000 ng 400 U T4 ligaz 14 ° c 16 h. ısı için devre dışı bırakabilirsiniz 65 ° C'de 10 dakikadır kullanarak ekleme gerçekleştirin.
- Yetkili bakteri bir standart ısı şok protokol16kullanarak dönüştürmek.
- Plaka üzerinde agar içeren 100 µg/mL Ampisilin tabaklar. 24 h 30 ° C'de kuluçkaya.
- Tek kolonileri almak, üreticinin yönergelerine göre bir ticari miniprep kit kullanarak plazmid DNA arındırmak ve sıra Sanger sıralama17 tarafından doğrulayın (sıralama astar: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').
- Koloniler maxi için plazmid DNA amplifikasyon ölçeği ve üreticinin yönergelerine göre endotoksin-Alerjik plazmid hazırlık seti18 kullanarak arındırmak olumlu kullanın.
- Yapı enjeksiyon için hazır olduğunu, böylece adım 5 ile devam edin.
2. bir Transgene ile indüklenebilir gen ekspresyonu için klonlama
- Astar transgene amplifikasyon13,14için tasarım.
- Kısıtlama siteleri sacı (GAGCTC), SpeI (ACTAGT) veya KpnI (GGTACC) için 5' uç ileri astar için ekleyin. Kısıtlama siteleri NotI (GCGGCCGC) veya XhoI (CTCGAG) için 5' uç ters astar için ekleyin.
- Tarafından istenen transgene14için optimize edilmiş koşullar kullanarak PCR transgene yükseltmek. Bir ticari DNA arıtma kit kullanarak arındırmak.
- Arıtılmış transgene ve giriş vektörünün 4 µg sindirmek (pEN_TTmcs-vektör, Tablo malzemelerigörmek) ayrıca (bkz: adım 2.2) uygun kısıtlama nükleaz ve arabellekte bir gecede 37 ° C'de 50 µL hacmi ile19 .
- Jel arındırmak sindirilir vektör ve üreticinin yönergelerine göre ticari jel ekstraksiyon kiti kullanarak ekle. 100 ng vektör ve 100 – 1000 ng 400 U T4 ligaz 14 ° c 16 h. ısı için devre dışı bırakabilirsiniz 65 ° C'de 10 dakikadır kullanarak ekleme ile standart ligasyonu gerçekleştirin.
- Yetkili bakteri bir standart ısı şok protokol16kullanarak dönüştürmek.
- Plaka üzerinde agar içeren 15 µg/mL gentamisin tabaklar. 16 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
- Tek kolonileri alın, plazmid DNA arındırmak ve pCEP ileri astar kullanarak sıralama17 tarafından INSERT doğrulayın: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'.
Not: Astar pCEP ileri ile ön arıtma olmadan PCR tek koloniler üzerinde gerçekleştirilen ve pCEP ters (5' AGA AAG CTG GGT CTA GAT ATC TCG 3'). Bu adım olumlu kolonilerin ön seçim için yararlı olabilir. - Adım 4'e geçin.
3. klonlama, miR shRNA indüklenebilir Gene Knock-down için
- MiR-shRNA oligonucleotides protokolü19klonlama pSLIK göre dizayn. Tavlama ve oligonucleotides arındırmak ve 1:20 GKD2O. seyreltik
- Özet 3 µg giriş vektörünün 5 U BfuAI 3 h için 50 ° c ile sonra 20 dk 65 ° C'de tepki devre dışı.
Not: yeşil flüoresan protein (GFP) ortak ifade isterseniz bir giriş vektör olarak, aksi takdirde kullanım pEN_TTmiRc219pEN_TTGmiRc19 kullanın. - Jel adım 2,5 olduğu gibi sindirilir vektör arındırmak. 100 standart birleştirmesini gerçekleştirmek vektör ng ve 1 µL saflaştırılmış ve shRNA oligonucleotides (Adım 3.1) seyreltilmiş ligaz 1 h. ısı için oda sıcaklığında devre dışı 65 ° c 10 dk 400 U T4 kullanarak.
- Yetkili bakteri bir standart ısı şok protokol16kullanarak dönüştürmek.
- Plaka üzerinde agar içeren 15 µg/mL gentamisin tabaklar. 16 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
- Tek kolonileri alın, plazmid DNA arındırmak ve INSERT Sanger sıralama17 tarafından doğrulayın (sıralama astar: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').
- Adım 4'e geçin.
4. recombinational enjeksiyon için hazır klonlar oluşturmak için klonlama
- Mix 150 ng giriş vektörünün (--dan adım 2 veya 3. adım) ve 150 ng pTC TET-vektör20.
- TE arabellek 8 µL toplam bir birime eklemek (pH = 8).
- II ( Tablo malzemelerigörmek) buz için kuluçkaya 2 dk. girdap için iki kere LR-clonase enzim karışımı aktarın.
- LR-clonase enzim karışımı II 2 µL için tepki ekleyin ve 1 h için 25 ° C'de kuluçkaya.
- Reaksiyon İndinavir K-çözüm 1 µL ekleyerek durdurmak. 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
- Bir standart ısı şok protokol16kullanarak yetkili bakteri recombinational klonlama 2 µL ile karıştırın Stbl3 dönüşümü.
- Plaka üzerinde agar içeren 100 µg/mL Ampisilin tabaklar. 24 h 30 ° C'de kuluçkaya.
- Tek kolonileri almak, üreticinin yönergelerine göre endotoksin-Alerjik plazmid hazırlık seti18 kullanarak plazmid DNA arındırmak ve vektör bütünlük Sanger sıralama17 tarafından (sıralama astar 5' onaylamak AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3').
- Yapı enjeksiyon için hazır olduğunu, adım 5'e geçin.
5. çözüm hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon için hazırlanması
Not: Kurucu ve indüklenebilir gen ekspresyonu için hazırlık yapıları, 1, 2, 3 ve 4. adımda açıklanan.
- Enjeksiyon için steril % 0,9 serum hazırlamak (yapmak değil kullanma PBS). Fare vücut ağırlığının yaklaşık % 10'una karşılık gelen ses kullanın. Örnek: 20 g ağırlığında bir fare için 2 mL çözeltisi hazırlamak.
- Endotoksin-Alerjik plazmid arıtma seti18 (bkz. Adım 1.8 veya 4.8, sırasıyla) kullanarak saf enjeksiyon vektörel çizimler hazır olun.
- 10 µg veya 15 µg endotoksin ücretsiz uyuyan güzel vektör yapı ekleme (Adım 1 kullanım 10 µg gelen 4 kullanım 15 µg, sırasıyla adım) ve 1 µg endotoksin ücretsiz pc-HSB5 mL steril serum21 .
- Çözüm için en fazla 4 saat 4 ° C'de depolayın Dondurma değil.
6. performans gösteren hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon
- Bir restrainer kuyruk ven enjeksiyon (ticari veya 50 mL konik tüp delik nefes ve kuyruk ile hazırlanmış) için kullanın. Tüp alt doku kağıt ile doldurun.
- Enjeksiyon için yaklaşık 8-10 hafta-in yaş fareler ile 20-25 g ağırlık kullanın.
- Enjeksiyon önce fareler tartmak ve enjeksiyon hacmi vücut ağırlığına göre hazırlamak (vücut ağırlığının % 10'una karşılık gelen bkz: adım 5.1). Steril 3 mL-şırıngayla 27 G iğneyle enjeksiyon ve dolgu gerekli birim ile hazırlayın.
- Fare restrainer yerleştirin. Kağıt mendil miktarını ayarlayın (bkz. Adım 6.1) nefes için yeterli alan ama hareket için sadece minimum boşluk bırakmayı.
- Fare düzenli olarak nefes olun.
- Sıcak bir Kızılötesi lamba 30-60 s. için dikkatli bir şekilde kullanarak kuyruk, aşırı ısınma işaretlere dikkat.
- Kuyruk bir alkol bez ile temizleyin.
- İğne neredeyse yatay kuyruk tabanına yakın iki yanal kuyruk damarlar birini takın.
Not: Eğer başarıyla yerleştirilmişse iğne koni geri az miktarda kan akışı. Bu iğne ek herhangi bir hareketi, yer değiştirme ve/veya yaralanma damarın içinde neden olabileceğinden aktif Aspire için tavsiye edilmez. - Toplam hacim içinde 8-10 s kuyruk damar içine enjekte.
- Hemen fareyi restrainer kaldırın. En az 30 için yara enjeksiyon sıkıştırmak s veya herhangi bir kanama azalır kadar.
- Fare ayrı bir kafesin içine yerleştirin. Fare yordam (yaklaşık 30-60 dakika) kurtarıldı sonra fare orijinal kafese geri aktarın. Fareyi bir sonraki 24 h için düzenli olarak kontrol edin.
Not: Fare hafif sedasyon enjeksiyon sonra en fazla 2 saat için rutin olarak görülmektedir. - Daha fazla deney (Yani, adım 7) ile devam etmeden önce izni olmayan entegre vektörlerin 10-15 gün bekleyin.
7. indüksiyon Tamoxifen ile Transfected CreER
Dikkat: Tamoxifen zararlıdır, kanserli veya olabilir doğurganlık zarar. Güvenlik bilgi formu için bakınız.
- Mayi tamoxifen enjeksiyonları üç gün üst üste planlayın.
- 1 günde 10 mg 40 µL etanol tamoxifen geçiyoruz. 10 dk. girdap için 55 ° C'de tamoxifen eriyene kadar birkaç kez kuluçkaya.
- 960 µL mısır yağı ekleyin. 55 ° C'de 5 dakika için kuluçkaya Girdap net bir çözüm elde etmek için birkaç kez.
- 1-mL insülin şırınga çözümde bir 27 G iğne ile hazırlayın.
- Scruff fareyi fare dikkatli bir şekilde baş ve ikinci parmak ile boyun kapma tarafından el altyapı ve dördüncü ve beşinci parmak arasında kuyruk sabitleme.
- 0.1 mL (tamoxifen 1 mg =) çözümü intraperitoneally karın sol alt çeyrekte enjekte.
- Enjeksiyonlar ikinci ve üçüncü günlerinde tekrarlayın.
8. indüksiyon tetrasiklin bağımlı gen veya shRNA ifade
Uyarı: Doksisiklin zararlı olabilir. Güvenlik bilgi formu için bakınız.
Not: türüne ve deneme süresi bağlı olarak Doksisiklin içme suyu (Adım 8.1) veya chow (Adım 8.2) sağlanabilir
-
Kısa süreli deneyler için (< 10 gün) Doksisiklin içme suyu aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak aracılığıyla yönetmek.
- 5 g Sükroz dokunun su 100 ml geçiyoruz. Basınçlı kap.
- 100 mg Doksisiklin-hyclate 5 mL sukroz çözeltisi (Adım 8.1.1) bir 15 mL konik tüp içinde çözülür.
- Bir 10 mL şırınga steril filtre solution'ı 0.2 µm filtre kullanarak. 8.1.1. adımda hazırlanan Sükroz çözüm ekleyin.
- Fare için içme suyu olarak Doksisiklin Sükroz çözüm kaynağı. Çözüm Bakteriyel büyüme (değiştir net çözüm en geç üç gün sonra) gösteren bulutlu olduğunda günlük ve Değiştir kontrol edin.
- Uzun süreli deneyler için (> 10 gün) veya metabolik değişiklikler için hassas deneyler ticari Doksisiklin-chow kullanın (örneğin, doksisiklin Hyclate Chow 0.625 g/kg) dehidratasyon ve/veya sukroz kaynaklı değişiklikleri tedavi hayvanların karaciğerleri önlemek için.
9. Immunostaining göre analiz için fare karaciğer hazırlanması
Uyarı: Paraformaldehyde zararlı olabilir. Güvenlik bilgi formu için bakınız.
Not: ne zaman fare incelenecek timepoint deney üzerinde bağlıdır. Bu karaciğer dokusu Doksisiklin tedavi yeterli indüksiyon transgene veya shRNA ifade emin olmak için en az üç gün sonra analiz etmek için tavsiye edilir.
- 27 G iğne 1 mL % 4 paraformaldehyde çözeltisi (PFA) ile 1 mL şırınga hazırla.
- Fare tarafından onaylanmış bir hayvan protokolüne göre uygun bir yöntem ötenazi.
Not: Yönergeleri için uygun yöntemleri ötenazi kurum bağlı olarak değişebilir. - Diseksiyon makası ve anatomik forseps kullanarak, karın boşluğu dikkatle karaciğer ortaya çıkarmak için medyan laparatomi ile açın. İnce bağırsak portal ven ve inferior vena kava (IVC) ortaya çıkarmak için sağa taşır.
- Hazır şırınga iğne takın (bkz. adım 9.1) IVC ve kesim portal ven içine. İngiltere'de yılın 1 mL yavaş yavaş karaciğer dokusu sıvı ve auto-floresan kırmızı kan hücreleri (immünfloresan boyama yapılır eğer arzu) kaldırmak için IVC enjekte.
- Karaciğer kaldırın. Suyla durulayın ve 5-10 mL % 4 İngiltere'de yılın çözeltisi için transfer.
- Parafin kesitler için 36-48 h. doku için düzeltme doku dehidratasyon ve parafin katıştırma için hazırdır.
-
Donmuş bölümleri için % 4 dokusunda düzeltmek PFA 1 h için.
- Cryoprotection için % 10 Sükroz eriyik-e doğru nakletmek. 60 dk kuluçkaya.
- % 20 Sükroz eriyik-e doğru nakletmek. 60 dk kuluçkaya.
- % 30 Sükroz eriyik-e doğru nakletmek. 12-16 katıştırma olarak h. Embed donmuş bölümleri için bileşik kuluçkaya ve -20 ° C'de dondurmak
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transfection etkinliği hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyonla: Hydrodynamically tarafından tek bir enjeksiyon transfected fare tetkikine yüzdesi değişkendir ve enjeksiyon hacmi, enjeksiyon zaman, enjekte DNA miktarı ve enjekte yapı6boyutu gibi birden çok parametre bağlıdır, 22,23. Ayrıca, transfection verimliliği genellikle nerede bir büyük damar çapı yanı sıra daha büyük sinüsoidal alan açar genel Basınç azalmasına büyük hayvanlarda düşüktür. Transfection verimliliği görselleştirmek için HTVI bir CreER transposon yapı CreER yapı tarafından tamoxifen aracılı aktivasyonu takip Rosa26mTmG muhabir gen yataklık farelerde gerçekleştirildi. Düşük enjeksiyon birim veya uzun süreli enjeksiyon zaman azaltılmış transfection verimliliği ile sadece bir kaç transfected tetkikine en uygun enjeksiyon koşullar içinde daha yüksek transfection neden iken bütün karaciğerde tespit teknik nedenlerden sonuç için CreER transposon (şekil 1A) HTVI sonra boyama muhabiri tarafından gösterildiği gibi verimliliği. Transfection etkinliğini değerlendirmek için immunostaining transfected transgene veya -CreER - uygun muhabir gen yapısında olduğu gibi son derece tavsiye edilir. Alternatif olarak, transfection verim transfected transgene mRNA ifade analizinden tahmin.
Pericentral tetkikine transfection: Hidrodinamik enjeksiyon sonra basınç gradyan - basınç merkezi ven yakın en yüksek ve en düşük alansal periportal nerede - sinüsoidal alanı boyunca pericentral alanında tercih edilen transfection yol açabilir. Biz karaciğerleri transgene ifade tetkikine düşük oranı olan analiz ve karaciğer lobül içindeki göreli konumlarını co-immunostaining için glutamin sentetaz (GS), pericentral tetkikine bir marker tarafından değerlendirildi. İlginçtir, bir CreER yapı HTVI Merkez ven ama daha yüksek transfection verimlilik Merkezi damar çevresinde gösteren değil portal alanı (şekil 1B) çevresinde kümelenmiş sonra bu muhabir gen ekspresyonu gösterdi tetkikine çoğunluğu.
Vivo luciferase transposon HTVI sonra görüntüleme: Transposon HTVI24 oluşturur sonra gözlenen tek kopya Tümleştirme olup olmadığını değerlendirmek için yeterli görüntüleme- vivo içinde için biz bir luciferase ifade kaset bir karaciğer belirli kontrol altında barındıran bir transposon yapı enjekte organizatörü yapısı. Fare biyoluminesans ile enjekte edildi ve bir iki hafta sonra HTVI (şekil 2A) görüntüleme sistemi içinde vivo kullanarak yansıma. Görüntüleme, sağlam ve istikrarlı luciferase bioluminescence karaciğerde 15 gün sonra enjeksiyon ve daha sonra zaman puan (şekil 2B ve veri gösterilmez) gösterdi. Bu sonuçlar sistem başarıyla transfected hücreleri içinde vivo varlığı takip etmek bioluminescence görüntüleme tarafından kullanılabileceğini gösterir.
Birlikte CreER ve indüklenebilir transgene veya shRNA ifade: Biz daha önce bir indüklenebilir Cre recombinase (CreER) kurucu ifade bir transgene indüklenebilir ifadesi veya bir shRNA seçim20 (şekil 3A) ile birleştirir bir transposon yapısı oluşturulur. Bu yapıyı enjeksiyon Rosa26mTmG-muhabir fareler ve CreER etkinleştirme tamoxifen tarafından muhabir gen güçlü ifade karşılaştırılabilir bir transposon inşa etmek için tek transgene ifade ( ile elde edilen sonuçlar gösterdi Şekil 3B). Doksisiklin tedavi sonrası indüklenebilir transgene ifade transfected tetkikine (şekil 3 c) uygun antikor tarafından görüntülenmeyecektir. İmmunostaining tarafından algılanan sitoplazmik GFP ifade shRNA ifade (3D şekil) bir vekil marker olarak kullanılabilir gibi indüklenebilir shRNA ifade için bir GFP-shRNA yapı kullanılması önerilir. Belirtmek gerekirse transgene veya shRNA, sırasıyla, sadece bir alt kümesi için algılama immunostaining20tarafından gereken protein ifadesi nispeten yüksek seviyede nedeniyle olabilir tetkikine tespit ifadesidir.
Şekil 1: hepatositler tarafından HTVI Transfection. CreER transposon HTVI sonra (A) değişken transfection verimliliği yataklık fareler içine bir Rosa26mTmG / + muhabir ve tedavi tamoxifen ile izledi. Transfected tetkikine membran bağlı yeşil flüoresan protein için (GFP, yeşil) olumludur. (B) CreER için ortak boyama tetkikine (yeşil) Merkezi ven marker glutamin sentetaz (GS, kırmızı) Rosa26mTmG gazeteci yataklık farelerde aktif. Burada PV: portal ven, CV: Orta damar. Ölçek çubukları temsil 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: In vivo görüntüleme luciferase. (A) Transposon oluşturmak (Ölçekle çizilmiş değil) bir luciferase ifade kaset içeren. Enjeksiyon ve tedavi şeması görüntüleme hepatik luciferase ifade için. SB: Güzellik tanıma siteleri, HTVI uyku: hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon. (B) temsilcisi görüntüsü hepatik luciferase bioluminescence 15 gün sonra bir vivo içinde görüntüleme sistemi kullanarak bir transposon-luciferase yapısı ile birlikte pHSB5 HTVI. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: kombine CreER ve indüklenebilir gen/shRNA ifade. (A) Transposon yapı indüklenebilir Cre recombinase ile birlikte bir tetrasiklin-indüklenebilir transgene veya shRNA ifade ifade (pTC Tet), değil ölçeklemek için çizilmiş. (B) yeşil membran boyama transfected tetkikine pTC enjeksiyon sonra gösterir Tet yapı içine Rosa26mTmG / + muhabir fareler ve CreER harekete geçirmek tamoxifen ile. Ölçek çubuğu 100 µm. (C) indüklenebilir gen ekspresyonu 5 gün sonra Doksisiklin tedavi immunostaining transfected tetkikine (YAP, kırmızı) transgene için tarafından görüntülenmiştir temsil eder. (D) indüklenebilir miR-shRNA ifade GFP-shRNA yapı sitoplazmik yeşil flüoresan protein (GFP) Boyama tarafından belirtilen Doksisiklin tedaviden sonra 5 gün. Transfected tetkikine membran bağlı GFP tarafından tasvir edilmektedir. Ölçek çubukları C) ve D) 50 µm. temsil Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tetkikine hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyonlu transfection sunulmasından bu yana daha 15 yıl önce kurulan bir yöntem olmuştur6. Enjekte birimi kardiyak çıkış aşıyor ve inferior vena kava karaciğer7transfection, yaklaşık 10-%20, bazı durumlarda tetkikine25,%2640 kadar önde gelen, sinusoids akar. Başarılı bir transfection belirleyicileri enjekte birim başına eklenen saat22,23vardır. Bu nedenle, bir düşük transfection verimliliği (şekil 1A, sol panelde) genellikle sırasında yordamı7enjeksiyon hızı korumak için başarısız olduğunu. Ancak bir en uygun tekniği ile HTVI tarafından elde edilebilir transfection verimliliği adenovirüse bakın veya neredeyse %1005,27 ulaşabilirsiniz adeno ilişkili virüs ile viral enfeksiyon tarafından elde edilen oranı aşağıda devam edecektir . Başarılı kuyruk ven enjeksiyonları elde etmek için kan damarı iğnede bir istikrarlı konumlandırma sağlamak için önemlidir. Bu kolayca kuyruk tabanına yakın daha büyük çaplı damarlar içinde gerçekleştirilir. Ayrıca, kuyruğunu ısınma tarafından damar otu şiddetle tavsiye edilir. En iyi sonuçlar bir Kızılötesi lamba kullanarak elde edilir ama bir sigara-kızılötesi ısı lamba veya daldırma kuyruk sıcak suda da kullanılabilir. Bazı durumlarda, en fazla 200 µL serum mayi iğne ile HTVI içinde kan damarlarının genişlemesi sonucu hayvanlar hidrasyon durumu artıracak önce yaklaşık 30 dakika ilave. Sürekli enjeksiyon hızı korumak için iyice iğne deplasman neden olabilir kuyruk herhangi bir hareketi önlemek için fare kuyruğu ölçülü. Doğrulama amacıyla, immunostaining tarafından tespit edilebilir bir yapı kullanmanızı öneririz. Alternatif olarak, transfection etkinlik mRNA ifade analizi tarafından tahmin edilebilir veya nın DNA28entegre.
Bizim veri transposon entegrasyon tercihen karaciğer kulak pericentral alanda gözlenen gösterir. Bu da transposon tabanlı transfection29görülmektedir gibi tetkikine orta damar çevresinde hakim transfection HTVI benzersiz hemodinami nedeniyle muhtemeldir. Bu bulgu akut karaciğer hasarı CCl4öncelikle pericentral tetkikine etkiler, indüksiyon gibi bazı uygulamalar için konu ile ilgili olabilir. Düşük transfection verimliliği bağlamında CCl4 tedavi bu nedenle transfected tetkikine sayısı önemli azalma neden olabilir. Ayrıca, hedef periportal hücrelere safra kanalını hücreleri15de dahil olmak üzere sınırlı kullanım HTVI biridir.
HTVI transposon yapıları, tek bir transgene istikrarlı ifade ulaşmak için kullanmak sistemlerinin yanı sıra, son zamanlarda CreER ortak bir ifade ve bir gen veya miR shRNA tek vektör11 dan indüklenebilir ifade veren bir sistem sundu . Bu sistem Cre/LoxP tabanlı fare suşları belirli genler sorguya çekmek özellikle yararlıdır. Transgenes veya shRNA yapıları bir hızlı ve güvenilir recombinational klonlama yordam tarafından tanıtıldı gibi sistem kolayca yaklaşımlar eleme için adapte edilebilir. Vektör sistemi tamamen Doksisiklin11,30Teslimde bağlıdır güvenilir indüklenebilir ifade içinde vivo aracılık eder. Bu pratik video tabanlı kılavuz üzerinde karaciğer doku analizi için gen ifadesinin indüksiyon uygun vektörlerinin klonlama üzerinden adım adım yönergeler sağlar.
Ancak, sistemin verimliliği sağlamak için çeşitli yönleri akılda tutulmalıdır: uzun vadeli ifade korumak için genomik Tümleştirme uyuyan güzel transposase8,11' TA-sitelerinde aracılık ettiği. Entegrasyon verimliliği transposon boyutuna bağımlı olduğundan, transgene yapı boyutu vektör31tasarlarken göz önünde bulundurun önemlidir. Ayrıca, karaciğerde indüklenebilir gen ürünü verimliliğini ifade rtTA3-organizatörü11tarihinde bağlıdır. En iyi ifade sonucu elde etmek için bir karaciğer sahip bir vektör yapı kullanım belirli ApoE.HCR.hAAT-organizatörü tavsiye edilir (Addgene #85578), üç promotors11Karşılaştırmada en yüksek verimliliği gösterdiği gibi. Bir en iyi duruma getirilmiş organizatörü yapı ile indüklenebilir transgene/shRNA ifade transfected hücreleri%2030'immunostaining tarafından tespit edilebilir. Algılama için immunostaining tarafından gerekli olan belirli bir eşiğin altına indüklenebilir protein düzeyleri varsa, bu belirlenmesi gerekiyor. Önemlisi, herhangi bir transgene/shRNA ifade immunostaining Doksisiklin ile tedavi değil farelerde tarafından tespit edilebilir. Son olarak, genler kontrol (TRE) tetrasiklin yanıt öğesinin altında Doksisiklin32,33doz bağımlı ifadedir. Kısa süreli deneyler için içme suyu üzerinden Doksisiklin yönetim iyi kurulmuş34,35' tir. Sükroz genellikle daha iyi bir tat vermek için eklenir. Ancak, bu polidipsi ve dehidratasyon yol açabilir ve Doksisiklin chow kullanılması son derece uzun süreli deneyler36,37için tavsiye edilir.
Özetle, hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon yaygın olarak kurulan karaciğer araştırma yöntemidir. Hepatit B çalışmaları, uygulama aralıkları karaciğer fibrozis ya da Hepatosellüler karsinom modelleri38,39,40,41. Açıklanan bu elyazması sistemi sorgulama Cre/LoxP tabanlı modelleri karaciğer hastalığının belirli hedef genlerin özellikle yararlıdır. Ayrıca, overexpression karaciğerde de araştırma hematolojik hastalıklar42,43 veya immünolojik sorular44,45mücadele için kullanılabilir. İlgi belirli genlerin analizine, sunulan sistem aynı zamanda kolayca eleme veya yaklaşımlar çoğullama için adapte edilebilir. Bu video tabanlı kılavuz bu nedenle araştırmacılar büyük bir topluluk için yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa yoktur
Acknowledgments
Bu eser Deutsche Krebshilfe, Almanya (grant sayıya 111289 UE), Çocuk Sağlığı (Ernest ve Amelia Gallo donatılmış doktora sonrası bursu - CTSA grant sayıya UL1 RR025744 UE) Lucile Packard Vakfı tarafından desteklenmiştir. Vektör yapıları için Dr Mark A. Kay teşekkür ediyoruz ve deneysel tavsiye ve Dr Julien Sage fareler için ve deneysel destek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Material | |||
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
| Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
| LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
| LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
| Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
| Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
| DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
| Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction Enzymes | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | New England BioLabs | R0156S | |
| SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
| KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| NotI | New England BioLabs | R0189S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for Mouse Experiments | |||
| Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
| Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
| Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
| Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
| Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
| Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
| NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
| Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
| Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
| pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
| pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
| pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |
References
- Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159 (2014).
- Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
- Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236 (2014).
- Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Kanefuji, T., et al. Hemodynamics of a hydrodynamic injection. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029 (2014).
- Ivics, Z., Izsvak, Z. Sleeping Beauty Transposition. Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).
- Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
- Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
- Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
- Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
- Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
- Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
- Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50 (2007).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
- Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
- Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
- Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
- Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
- Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
- Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
- Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
- Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
- Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
- Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
- Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894 (2016).
- Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
- Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
- Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
- Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
- Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936 (2015).
- Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
- Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
- Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
- Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79 (2014).
- Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023 (2014).
- Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).
