Summary
Biomaterialen doped met bot morfogenetische eiwit 2 (BMP2) zijn gebruikt als een nieuwe therapeutische strategie om non-adhesie botbreuken genezen. Om te overwinnen bijwerkingen als gevolg van een oncontroleerbare release van de factor, stellen wij voor een nieuwe strategie aan site-direct immobiliseren de factor, waardoor materialen met verbeterde mogelijkheden voor osteogenic.
Abstract
Verschillende therapeutische strategieën voor de behandeling van niet-genezende lang bot gebreken zijn intensief onderzocht. Momenteel gebruikt behandelingen aanwezig verschillende beperkingen die hebben geleid tot het gebruik van biomaterialen in combinatie met osteogenic groeifactoren, zoals bot morfogenetische eiwitten (BMP's). Veelgebruikte methoden voor absorptie of inkapseling vereisen supra-fysiologische hoeveelheden BMP2, typisch resulterend in een zogenaamde eerste uitbarsting release effect dat diverse ernstige nadelige bijwerkingen lokt. Covalent het eiwit te koppelen aan het schavot zou een mogelijke strategie om deze problemen te overwinnen. Koppeling, moet bovendien, teneinde een reproduceerbare product resultaat op een specifieke wijze te worden uitgevoerd. Dus we gemaakt een BMP2 variant, waarin een kunstmatige aminozuur (propargyl-L-lysine) werd geïntroduceerd in het volwassen deel van de BMP2 proteïne door codon gebruik expansie (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk werd gekoppeld aan matiemaatschappij kralen door koper gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC). De biologische activiteit van de gekoppelde BMP2-K3Plk in vitro werd bewezen, en de osteogenic activiteit van de BMP2-K3Plk-matiemaatschappij parels werd bewezen in cellen gebaseerd. De functionalized kralen in contact met C2C12 cellen konden voor het opwekken van expressie van het alkalisch fosfatase (ALP) in de nabijheid van het lokaal beperkt van de parel. Dus, door deze techniek, matiemaatschappij steigers kunnen worden geproduceerd dat kan leiden tot celdifferentiatie naar een osteogenic afstamming. Bovendien, volstaan lagere BMP2 doses als gevolg van de gecontroleerde oriëntatie van plaats-geleide gekoppelde BMP2. Met deze methode worden de BMP's altijd blootgesteld aan hun receptoren op het celoppervlak in de juiste oriëntatie, die niet het geval is als de factoren zijn gekoppeld via niet-plaats-geleide koppeling technieken. Het resultaat van het product is zeer controleerbaar en dus resultaten in materialen met homogene eigenschappen, verbetering van hun toepasbaarheid voor de reparatie van kritische omvang bot gebreken.
Introduction
Het uiteindelijke doel van bot weefselregeneratie engineering en bot is het overwinnen van de nadelen en beperkingen die zich voordoen tijdens voorkomende behandelingen van non-adhesie fracturen. Auto - of allo-transplantaties worden voornamelijk gebruikt als huidige therapie strategieën, ook al ze beide verschillende nadelen hebben. De ideale bottransplantatie moet induceren osteogenesis door zowel osteoinduction als osteoconduction, wat leidt tot de osteointegration van de prothese in het bot. Alleen auto-transplantatie wordt tegenwoordig beschouwd als de "gouden standaard" omdat het voorziet alle karakteristieken van een ideale bottransplantatie. Helaas presenteert het ook belangrijke negatieve aspecten, zoals lange chirurgie times, en een tweede trauma site dien meestal meer complicaties (bijvoorbeeldchronische pijn, hematoom formaties, infecties, cosmetische defecten, enz.). Allogene transplantaten, hebben aan de andere kant suboptimaal kenmerken voor alle algemene aspecten1. Alternatieve bone graft technologieën zijn verbeterd in de afgelopen jaren, met als doel het produceren van steigers die osteo-inductief, osteoconductive, biocompatibel, en bioresorbable. Aangezien veel biomaterialen niet al deze osteogenic kenmerken vertonen, zijn verschillende groeifactoren, voornamelijk BMP2 en BMP7, ter verbetering van het osteogenic potentieel van de bijzondere steiger2opgenomen.
Als een essentieel criterium dienen dergelijke groeifactor levering systemen een release van de gecontroleerde dosis na verloop van tijd ter vergemakkelijking van de essentiële gebeurtenissen zoals cel aanwerving en bijlage, cel ingroei en angiogenese. Echter BMP's evenals andere osteogenic groeifactoren zijn vaak geïmmobiliseerd non-covalent3. Entrapment en adsorptie technieken vereisen het gebruik van supra-fysiologische hoeveelheden eiwit door de vrijval van een eerste uitbarsting, die tot ernstige nadelen in vivo meestal invloed op de omliggende weefsels leidt door het inducerende bot begroeiing, Osteolyse, zwelling en ontsteking4. Dus, het behoud van groeifactoren op de site van de levering voor langere perioden kan worden bereikt door covalente immobilisatie methoden. Chemisch gewijzigd BMP2 (succinylated5, geacetyleerd6 of biotinyleerd7) heterodimers8ontworpen, of BMP2 afgeleide oligopeptides9 zijn ontworpen en gebruikt voor het overwinnen van de beperkingen met betrekking tot absorptie. De bio-activiteit van deze constructies is echter niet voorspelbaar omdat de regeling mogelijk de binding van de geïmmobiliseerdet ligand aan de cellulaire receptoren remt. Als eerder is laten zien is het essentieel dat alle vier receptor ketens die betrokken zijn bij de vorming van complexen van de geactiveerde ligand-receptor interactie met de geïmmobiliseerdet BMP2 om alle downstream signalering cascades10volledig te activeren.
Om de problemen van een inhomogene product resultaat met beperkingen in termen van topicale, stabiliteit en biologische beschikbaarheid van de geïmmobiliseerdet factor, ontwierpen we een BMP variant kan covalent verbindend steigers in een plaats-geleide manier. Deze variant, aangeduid als BMP2-K3Plk, bestaat uit een kunstmatige aminozuur werd geïntroduceerd door genetische codon uitbreiding11. Deze variant is met succes gekoppeld aan steigers met behulp van een covalente koppeling strategie met behoud van de biologische activiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. de productie van de BMP2 Variant BMP2-K3Plk
- Klonen van BMP2-K3Plk door plaats-geleide mutagenese met behulp van PCR 12
- Versterken van menselijke volwassen BMP2 (hmBMP2) van een p25N-hmBMP2-vector (Zie Tabel van materialen) met een voorwaartse primer (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') en een omgekeerde primer (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') invoering van een amber stop codon ( Label) op de positie van de eerste lysine van volwassen deel van de BMP2´s. Uitvoeren van de PCR-reactie met 33.5 µL van H2O, 10 µL van het PCR reactie mix, 1.5 µL van 10 µM dNTP stockoplossing, 1.5 µL voorste primer (10 pmol/µL), 1.5 µL van omgekeerde primer (10 pmol/µL), 1 µL van p25N-hmBMP2 (10 ng/µL) , en 1 µL van polymerase van DNA (Zie Tabel van materialen) in een thermische cycler (denaturatie bij 95 ° C gedurende 5 min, 30 cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 1 min., gloeien bij 60 ° C gedurende 1 min, rek bij 72 ° C gedurende 1 minuut en een definitieve verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten).
- Zuiveren van het PCR-product met behulp van een commercieel beschikbare kit de aanbevelingen van de fabrikant (Zie Tabel van materialen).
- Het PCR-product met de restrictie-enzym NdeI bij 37 ° C gedurende 45 minuten met behulp van 16 µL van H2O, 3 µL van spijsvertering buffer, 10 µL van DNA verteren (20 ng/µL), en 1 µL van het restrictie-enzym. Warmte-inactivering van het enzym bij 65 ° C voor 5 min. verteren het PCR-product met de restrictie-enzym BamHI bij 37 ° C gedurende 1 h met gebruikmaking van 16 µL van H2O, 3 µL van spijsvertering buffer, 10 µL van DNA (20 ng/µL), en 1 µL van het restrictie-enzym. Inactivering van warmte enzym bij 80 ° C gedurende 5 min.
- De vector van de pET11a-pyrtRNA met NdeI bij 37 ° C gedurende 2 uur en 45 min met behulp van 16 µL van H2O, 3 µL van spijsvertering buffer, 10 µL van DNA verteren (20 ng / µL), en 1 µL van het restrictie-enzym. Warmte-inactivering van 65 ° c voor 5 min. verteren de vector van de pET11a-pyrtRNA met BamHI bij 37 ° C gedurende 1 h met gebruikmaking van 16 µL van H2O, 3 µL van spijsvertering buffer, 10 µL van DNA (20 ng/µL), en 1 µL van het restrictie-enzym. Warmte-inactivering bij 80 ° C gedurende 5 min.
- Scheiden van de verteerd vector van onverteerd vector en resten van de spijsvertering door agarose gel elektroforese (0,8% agarose, 60 min bij 100 V). Het verteerd BMP2-K3TAG insert met verteerd pET11a-pyrtRNA backbone bij kamertemperatuur (RT) voor 2 h met gebruikmaking van 100 afbinden ng van pET11a-pyrtRNA-backbone en 34,5 ng van BMP2-K3TAG insert (1:3 molaire ratio). Het reactiemengsel bevat de ruggengraat van DNA en invoegen, 2 µL van ligase buffer, 1 µL van DNA ligase en H2O tot een totaal volume van 20 µL.
- Voer een co transformatie van pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk en pSRF-duet-pyrtRNAsynth in BL21(DE3) bacteriën:
- Voeg 50 ng van elke plasmide aan de bacteriën, plaats het mengsel op het ijs gedurende 30 minuten, heat shock bij 42 ° C gedurende 50 s, plaats op het ijs gedurende 5 minuten, voeg 500 µL van lysogenie Bouillon (LB) medium in het mengsel, en schud op 300 rpm voor 60 min.
- Verspreiden van 100 µL van het bacteriële mengsel op voorverwarmde kanamycine (50 µg/mL) / ampicilline (100 µg/mL) platen, en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
- Meningsuiting en zuivering van BMP2-K3Plk 13 , 14
- Propageren een één kolonie overnachting in 50 mL LB voedingsbodem met 50 µg/mL kanamycine en 100 µg/mL ampicilline bij 37 ° C.
- Verdun overnachting culturen 1:20 in 800 mL van geweldige Bouillon (TB) medium aangevuld met 50 µg/mL kanamycine en 100 µg/mL ampicilline en groeien bij 37 ° C, totdat een OD600 van 0,7 is bereikt. Propargyl-L-lysine toevoegen om een eindconcentratie van 10 mM. Een 100 µL monster verzameld uit de cultuur voordat isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inductie.
- Induceren genexpressie door de toevoeging van IPTG aan een eindconcentratie van 1 mM. Het groeien van de cultuur bij 37 ° C gedurende 16 uur in een roteerschudapparaat bij 180 t/min. Verzamelen eenmonstervan 100 µL van de cultuur.
- Centrifugeer de hele cultuur bij 9000 x g gedurende 30 min. negeren het supernatant en resuspendeer de bacteriële pellet in 30 mL TBSE buffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA)) met 1:1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (vers toegevoegd).
Let op: Ingang 2-mercaptoethanol onder de zuurkast. Vermijd contact met huid en ogen. Vermijd inademen van damp of nevel. Alle resuspensie stappen uitvoeren met buffers met 2-mercaptoethanol onder de zuurkast. - Weeg een lege centrifuge bekerglas en overdracht van de geresuspendeerde pellet in het lege bekerglas. Centrifugeer bij 6,360 x g gedurende 20 min. negeren het supernatant en wegen van het bekerglas af met de pellet. Het gewicht van het lege bekerglas voor het berekenen van het gewicht van de pellet aftrekken.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Het bevriezen van de pellet bij-20 ° C op de korte termijn of bij-80 ° C op de lange termijn. Na het hervatten van het protocol, ontdooien de pellet op RT. - Resuspendeer de pellet in STE buffer (1 mM EDTA, 375 mM sacharose, 10 mM Tris pH 8,0; 150 mM NaCl; 1:1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (vers toegevoegd)). 200 mL STE buffer gebruiken voor elke 10 g pellet.
- Bewerk ultrasone trillingen ten de opschorting op ijs (10 min met 40 s puls, 20 s rem en 30% amplitude). Centrifugeer bij 6,360 x g gedurende 20 min. negeren het supernatant en weegt de pellet. Herhaal de stappen ultrasoonapparaat en centrifugeren 4 keer.
- Resuspendeer de pellet in 100 mL TBS buffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl). Centrifugeer bij 6,360 x g gedurende 20 min. negeren het supernatant en weeg pellet.
- Resuspendeer de pellet in nuclease buffer (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl2) met vers toegevoegd 80 U/mL nuclease (bijvoorbeeldBenzonase) met 10 mL/g pellet. Incubeer de schorsing 's nachts op RT op een opzwepende plaat (30 rpm).
- Toevoegen van Triton buffer (60 mM EDTA, 1.5 M NaCl, 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) fenyl-polyethyleenglycol) tot de schorsing. Het volume van Triton buffer toe komt overeen met een 0.5 volume deel van de schorsing. Incubeer gedurende 10 min op RT (niet roeren). Centrifugeer bij 6,360 x g gedurende 20 min. negeren het supernatant en weegt de pellet.
- Resuspendeer de pellet in TE buffer (100 mM Tris, 20 mM EDTA) gebruik 8 mL/g pellet. Centrifugeer bij 6,360 x g gedurende 20 min. negeren het supernatant en weegt de pellet.
- Resuspendeer de pellet door toevoeging van 4 mL/g 25 mM NaAc pH 5.0 en 5 mL/g van 6 M GuCl met 1 mM dithiothreitol (DTT) (vers toegevoegd). Incubeer de schorsing 's nachts bij 4 ° C op een opzwepende plaat (30 rpm).
- Centrifugeer bij 75.500 x g gedurende 20 min. De bovendrijvende vloeistof bevat nu het ongevouwen monomere BMP2 eiwit. De bovendrijvende vloeistof en concentraat dit extract tot 20 OD/mL met behulp van een membraan 3 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO) in een concentratie van de cel (Zie Tabel van materialen) verzamelen.
- De geconcentreerde monomeren in enkele druppels toevoegen aan de renaturatie buffer (2 M LiCl, 50 mM Tris, 25 mM CHAPS, 5 mM EDTA, 1 mM glutathion-disulfide (GSSG), 2 mM glutathion (GSH)) tijdens het roeren (30 rpm). Incubeer bij RT gedurende 120 h in het donker.
Opmerking: In deze incubatieperiode, uiteinde ontstaat. De oplossing van deze stap vanaf bevat de gevouwen dimeric BMP2-K3Plk. - Breng de pH van de oplossing naar 3.0 met behulp van geconcentreerd HCl. Dialyze de oplossing tegen 1 mM HCl. concentraat de dialyzed oplossing met behulp van een membraan van 10 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO) in een gecentraliseerd cel.
- Equilibreer de oplossing door het toevoegen van de buffer een (20 mM NaAc, 30% isopropanol). Het toevoegen van een volume van buffer A overeenkomt met een volume van 30% van de oplossing. Centrifugeer de oplossing bij 4700 x g gedurende 15 minuten.
- De kolom voor ionenwisseling op een snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) systeem15 met 150 mL buffer A. Load de eiwit-oplossing op de equilibrated kolom equilibreer. Elueer fracties met behulp van een lineair verloop van buffer B (20 mM NaAc, 30% isopropanol, 2 M NaCl) met behulp van 100 mL buffer B. verzamelen 2 mL breuken.
Opmerking: Concentreren het eiwit vóór het laden naar de kolom volgens het totaalkolom volume. Het volume van de definitieve eiwit moet < 5% van het totale kolom volume. - Analyseren 20 µL van elke breuk met SDS-Polyacrylamide gel (12%) elektroforese (SDS-PAGE) 16 en Coomassie briljant blauw kleuring17 (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: De Coomassie briljant blauw gekleurd SDS-pagina gel toont breuken met Dimeren (26 kDa) en breuken met monomeren (13 kDa). - Zwembad dimeer-bevattende breuken. Dialyze het zwembad van dimeer met breuken 's nachts bij 4 ° C tegen 1 mM HCl (5 liter volume). Het concentreren van het eindproduct met behulp van een 10 kDa concentreren centrifugaal filter eenheid (Zie Tabel van materialen). Analyseren van het eindproduct door SDS-Polyacrylamide (12%) Elektroforese van het gel (SDS-PAGE) en Coomassie briljant blauw kleuring.
Opmerking: De band op de Coomassie briljant blauw gekleurd SDS-pagina gel slechts één band op 26 kDa moet tonen. Dit is het eindproduct van de BMP2-K3Plk.
2. optimalisatie van koper (I)-gekatalyseerde alkyn-Azide cycloadditie (CuAAC) voorwaarden
- Effect van natrium ascorbaat (NaAsc) en koper (II) sulfaat (CuSO 4 ) op wild type BMP2 (BMP2-WT)
- Incubeer 20 µM BMP2-WT met verschillende verhoudingen van NaAsc naar CuSO4. 0,5 mM NaAsc en 0,5 mM CuSO4 (vanaf concentratie) in een 50 µL volume gebruiken. Ga door met de volgende verhoudingen van NaAsc naar CuSO4: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20: 1), de concentratie van de4 CuSO constant te houden op 0.5 mM en de concentratie van NaAsc dienovereenkomstig aan te passen. Uitvoeren van de reactie in H2O op een roterende mixer (20 rpm) 's nachts op RT.
- Bereiden van gereduceerde monsters door toevoeging van laden buffer met 5% 2-mercaptoethanol en incubeer monster bij 95 ° C voor 6 min. analyseren verminderd en monsters niet verlaagd door SDS-Polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) van het (12%) en Coomassie briljant blauw kleuring. De SDS-pagina gelen gekleurd Coomasie Toon bands in de range van 13 kDa (beperkte voorwaarden) 26 kDa en hoger molecuulgewicht (niet verlaagd voorwaarden).
-
Effect van Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) amine (THPTA) op de reactie van CuAAC
- Incubeer 20 µM BMP2-K3Plk met verschillende verhoudingen van THPTA naar CuSO4. Gebruik 5 mM NaAsc en 200 µM 3-Azido-7-hydroxycoumarin (Houd NaAsc en 3-Azido-7-hydroxycoumarin constant). Gebruik 50 µM THPTA en 0,5 mM voor CuSO4 als startende concentraties. Gebruik van verschillende verhoudingen van THPTA naar CuSO4: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). Voer reactie in H2O (50 µL totaalvolume) voor 24 h op RT op een roterende mixer (20 rpm).
- Bij koppeling wordt 3-Azido-7-hydroxycoumarin een fluorescente kleurstof. Monsters in verminderde en niet verlaagd omstandigheden voor te bereiden en analyseren door SDS-PAGE. Visualiseren van de gels onder de excitatie-kanaal met de specifieke golflengte voor de 3-Azido-7-hydroxycoumarin (λabs = 404 nm; λem = 477 nm).
3. covalente koppeling techniek van BMP2-K3Plk naar Azide matiemaatschappij Agarose kralen
- Incubeer 20 µM van BMP2-K3Plk of BMP2-WT (gebruikt als negatieve controle) met 20 µL van azide-geactiveerde agarose parels in een totaal volume van 500 µL in reactie buffer (0,1 M HEPES pH 7.0, 3.9 M ureum, 50 µM CuSO4, 250 µM THPTA, 5 mM natrium ascorbaat) voor 2 h op RT op een rotati ng mixer (20 rpm). Zet de reactie stop door toevoeging van 5 mM EDTA (eindconcentratie).
- Incubeer bij RT gedurende 15 minuten op een roterende mixer (20 rpm). Centrifugeer steekproeven bij 20.000 x g gedurende 1 minuut op RT. Collect het supernatant.
- Spoel de pellet bevattende de bolletjes driemaal met 1.000 µL van HBS500 buffer (50 mM HEPES, 500 mM NaCl), driemaal met 1.000 µL van 4 M MgCl2, en twee keer met 1.000 µL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Bij elke stap van wassen, centrifugeren bij 20.000 x g gedurende 1 minuut op RT en verzamelen supernatant. Winkel gekoppeld kralen in 1000 µL van PBS bij 4 ° C.
Let op: Niet storen de kraal pellet tijdens het verwijderen van de bovendrijvende substantie.
4. het valideren van de aanwezigheid en de biologische activiteit van geïmmobiliseerdet BMP2-K3Plk met behulp van Texas Red Label BMP Receptor ik een Ectodomain (BMPR-IA EG )
- Incubeer 50 µL van de BMP2-K3Plk matiemaatschappij parels met 1 µM van Texas Red Label BMPR-IAEG met 150 µL van HBS500 buffer (50 mM HEPES, 500 mM NaCl) op RT gedurende 1 uur op een roterende mixer (20 rpm).
- Centrifugeer de kralen bij 20.000 x g gedurende 1 minuut op RT. Discard het supernatant. Wassen van de kralen met 1000 µL van HBS500 buffer. Herhaalstap het wassen een extra 3 keer. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 1 minuut op RT na elk wassen stap.
- Resuspendeer de kralen in 500 µL van PBS en Pipetteer 50 µL op een glasplaatje dekking. De Microscoop filter tussen 561 of 594 nm instellen. Detecteren van Texas Red-BMPR-IAEG-BMP2-K3Plk matiemaatschappij kralen met behulp van fluorescentie microscopie en nemen foto's.
5. meting van de alkalische fosfatase (ALP) expressie om aan te tonen van de In Vitro topicale van de BMP2-K3Plk geproduceerd vóór en na de Coupling reactie.
-
Alkalische fosfatase (ALP) assay
- Cultuur promyoblastic C2C12 cellen (ATCC CRL-172) in Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM) met 10% foetale kalf Serum (FCS), 100 U/mL penicilline G en 100 µg/mL streptomycine bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer op 5% CO2.
- Zaad C2C12 cellen bij een dichtheid van 3 × 104 cellen per putje in een 96-Wells-microplate. Laat cellen koppelen overnachting. Verwijderen van middellange en incubeer C2C12 cellen in aanwezigheid van 0,5-200 nM BMP2-K3Plk of BMP2-WT in 100 µL per putje van DMEM (2% FCS, 100 U/mL penicilline G en 100 µg/mL streptomycine) bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer op 5% CO2 voor 72 uur.
- Verwijderen van middellange en wassen van cellen met PBS 100 µL per putje. Lyse cellen op RT voor 1 h met 100 µL per putje van lysis buffer (1% NP-40, 0,1 M glycine, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) op een schudden plaat (220 rpm).
- Voeg 100 µL per putje van ALP buffer (0,1 M glycine, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) met 1 mg/mL p-nitrophenylphosphate (vers toegevoegd) naar de cel lysate.
- Meten van de absorptie bij 405 nm in een multiplate lezer na het toevoegen van de ALP-buffer, en elke 5 minuten tot de ontwikkeling van de kleur voltooid is. Genereren van de dosis-respons-curven en EC50-waarden met behulp van een logistieke model, y = A2 + (A1-A2) / (1 + (x/x0)p).
-
Alkalische fosfatase (ALP) kleuring
- Cultuur promyoblastic C2C12 cellen (ATCC CRL-172) in Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) met 10% foetale kalf Serum (FCS), 100 U/mL penicilline G en 100 µg/mL streptomycine bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer op 5% CO2.
- Zaad C2C12 cellen bij een dichtheid van 3 × 104 cellen per putje in een 96-Wells-microplate. Laat cellen koppelen overnachting. Verwijder van middellange en Voeg 20 µL per putje van BMP2-K3Plk combinatie parels. BMP2-K3Plk combinatie kralen zijn in 1000 µL van een PBS-ophanging.
- Bereid een oplossing van 0,4% laag-smeltpunt agarose in DMEM. Smelten in de magnetron (600 W voor 3 min) en laat het afkoelen in een waterbad bij 37 ° C tot gebruik.
- Voeg 20 µL van 0,4% laag-smeltpunt agarose in elk putje (bekleding kralen en cellen). Centrifugeer bij 2000 x g gedurende 5 minuten bij 20 ° C. Voeg 80 µL DMEM (2% FCS, 100 U/mL penicilline G en 100 µg/mL streptomycine) en Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer op 5% CO2 voor 72 uur.
- Medium, dat evenwel niet tot het loskoppelen van de gestolde 0,4% agarose verwijderen. Voeg 100 µL per putje van 1-stap NBT/BVIE (Nitro-blauw tetrazolium chloride, 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluïdine zout) substraat oplossing.
- Analyseren alkalische fosfatase kleuring met behulp van de lichte microscopie, onmiddellijk nadat de paarse kleuring blijkt. Gebruik heldere veld microscopie en fotograferen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit artikel beschrijven we een methode om te koppelen covalent een nieuwe variant van de BMP2, BMP2-K3Plk, aan verkrijgbare azide matiemaatschappij agarose kralen (Figuur 1). De topicale van de geproduceerde BMP2-K3Plk-variant werd gevalideerd door de inductie van alkalische fosfatase (ALP) genexpressie in cellen van de C2C12. De in vitro -test toont vergelijkbare ALP expressie niveaus geïnduceerd door wild type BMP2 (BMP2-WT) en BMP2-K3Plk (Figuur 2).
De redoxreacties tussen koper (II) sulfaat (CuSO4) en natrium ascorbaat (NaAsc) genereren van reactieve zuurstof soorten die mogelijk van invloed zijn op de structurele integriteit en dus invloed op de topicale van BMP2-K3Plk. Om te controleren of de structurele integriteit van het eiwit, wij uitgevoerd een overnachting incubatie met CuSO4 en NaAsc, BMP2-WT afbraak in een concentratie-afhankelijke manier (gevisualiseerd door SDS-PAGE onder beperkte omstandigheden (figuur 3A1 tonen )) en de vorming van multimeren of aggregaten zichtbaar op ongeveer 40 kDa (voorwaarden niet verlaagd) (figuur 3A2). Om te voorkomen dat de aantasting van het eiwit, Tris (3-hydroxypropyltriazolyl-methyl) amine (THPTA) werd gebruikt als een beschermende agent (figuur 3B). Het gebruik van THPTA voorkomt versnippering van de BMP2, terwijl de vorming van hoger molecuulgewicht structuren niet worden door de toevoeging van THPTA voorkomen konden. Verdere verbeteringen van de reactie gericht de samenstelling van de reactie buffer de reactie temperatuur en reactietijd (gegevens niet worden weergegeven). Het protocol beschreven hier details de uiteindelijke resultaten met betrekking tot de reactie buffer samenstelling, temperatuur en reactietijd.
Om te bevestigen dat de BMP2-K3Plk topicale na koppeling behoudt, gebruikten we fluorescently geëtiketteerde receptor ectodomain eiwit van het type ik receptor (BMPR-IAEG) om aan te tonen dat de geïmmobiliseerdet proteïne is nog steeds in staat om te binden aan deze receptor. Kralen bedekt met BMP2-K3Plk via CuAAC chemie leverde fluorescentie wanneer geïncubeerd met de kleurstof-geëtiketteerden BMPR-IAEG (Figuur 4). In contrast, niet-gecoate parels of kralen die werden geïncubeerd met BMP2-WT toonde geen fluorescentie niveaus signaal boven achtergrond (gegevens niet worden weergegeven),14.
Na het bevestigen van receptor bindende mogelijkheden van de geïmmobiliseerdet ligand in vitro, we ook getest of biologische reacties kunnen worden geactiveerd door de functionalized kralen in een cel-gebaseerde assay. ALP gemedieerde kleuring gebeurde alleen in die cellen die in direct contact met de BMP2-K3Plk-matiemaatschappij kralen (Figuur 5). Dit bevestigt dat het eiwit is inderdaad covalent gekoppeld aan de kralen en niet alleen opgenomen, omdat een meer spread-out kleuring op grotere afstanden met de kralen zou anders zijn waargenomen.
Figuur 1: voorstelling van BMP2-K3Plk. (A) Afbeelding van de BMP2-K3Plk-variant met de lokalisatie van de geïntroduceerde aminozuur vervanging. (B) koppeling regeling: BMP2-K3Plk CuAAC reactie met azide matiemaatschappij kralen. (Aangepast) overgenomen met toestemming van Tabisz et al. (2017): plaats-geleide immobilisatie van BMP-2: twee benaderingen voor de productie van innovatieve osteo-inductief steigers. Biomacromoleculen. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: topicale van BMP2-varianten. Vergelijking van de bioactivities (ALP assay) van BMP2-K3Plk en wildtype BMP2 (BMP2-WT). De x-as staat voor de concentratie van BMP2-WT of BMP2-K3Plk gebruikt in de test. De EC50-gegevens vertegenwoordigen gemiddelden en standaardafwijkingen van 4 individuele experimenten (N = 4). (Aangepast) overgenomen met toestemming van Tabisz et al. (2017): plaats-geleide immobilisatie van BMP-2: twee benaderingen voor de productie van innovatieve osteo-inductief steigers. Biomacromoleculen. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Effect van de reductor op de integriteit van de BMP2. (A) BMP2-WT werd blootgesteld aan verschillende molaire verhoudingen van natrium ascorbaat (NaAsc) naar koper (II) sulfaat (CuSO4). De monsters werden geanalyseerd door SDS-pagina en Coomassie briljante blauwe vlekken onder verminderde (Figuur A1) niet verlaagd (Figuur A2). In de beperkte omstandigheden (A1) vertegenwoordigen de rode pijlen gekloofd BMP2-WT. In de niet verlaagd voorwaarden (A2) geven de rode pijlen multimeric BMP2-WT. De bands van gekloofd BMP2 soorten worden aangeduid met een blauwe pijl. Opschrift: NCR - verminderd BMP2-WT onbehandeld; NC - BMP2-WT onbehandeld; 1:1 tot 20:1 - toenemende molaire verhoudingen van natrium ascorbaat CuSO4. (B) BMP2-K3Plk gekoppeld is met 3-Azido-7-hydroxycoumarin CuAAC reactie voorwaarden aangevuld met THPTA gebruiken. Bij koppeling wordt 3-Azido-7-hydroxycoumarin een fluorescente kleurstof. Opschrift: NC - BMP2-WT reageerde met 3-Azido-7-hydroxycoumarin; 7:1 tot 20:1 het verhogen van de molaire verhoudingen van THPTA naar CuSO4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: topicale van geïmmobiliseerdet BMP2-K3Plk in vitro. Representatief beeld van de interactie van geïmmobiliseerdet BMP2-K3Plk met Texas-Red-geëtiketteerd BMPR-IAEG. (Aangepast) overgenomen met toestemming van Tabisz et al. (2017): plaats-geleide immobilisatie van BMP-2: twee benaderingen voor de productie van innovatieve osteo-inductief steigers. Biomacromoleculen. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: topicale van geïmmobiliseerdet BMP2-K3Plk in een cel-gebaseerde assay. (A) representatief beeld van alkalische fosfatase (ALP) vlekken op een behandeling met kralen gekoppeld aan BMP2-K3Plk matiemaatschappij kralen. (B) alkalisch fosfatase (ALP) vlekken op een behandeling met oplosbare 25 nM BMP2-K3Plk. herdrukt met toestemming van Tabisz et al.(aangepast). (2017): plaats-geleide immobilisatie van BMP-2: twee benaderingen voor de productie van innovatieve osteo-inductief steigers. Biomacromoleculen. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genereren van gecodeerde eiwit varianten door genetische codon expansie kan de invoering van verschillende niet-natuurlijke aminozuur-analogen voornamelijk op elke positie van de primaire eiwit sequentie. In het geval van BMP's zoals BMP2, gemeenschappelijke tags, zoals een 6-Histidine (zijn)-tag kan alleen worden aangebracht N-terminaal, sedert het einde van de protein´s C-terminal is begraven in de tertiaire eiwitstructuur, en dus niet toegankelijk vanaf de buitenkant is. Op andere posities, kan de grootte van de geïntroduceerde tag zeer waarschijnlijk leiden tot structurele wijzigingen die bijgevolg de BMP´s topicale vernietigen. Verder, invoering van een mutatie in de BMP2 reeks kan invloed hebben op de refolding werkzaamheid, en ook andere eiwit parameters zoals het elektrisch punt van de gemodificeerd eiwit kunt wijzigen. Dus, elke stap in een gevestigde eiwit productie protocol wellicht worden aangepast aan de veranderde eiwit variant´s kenmerken. De productie van de BMP2-K3Plk vereist inderdaad een wijziging van de bestaande methode voor de uitdrukking van wild type BMP2. Propargyl-L-lysine (Plk) concentraties of andere cultuur keer werden getest (gegevens niet worden weergegeven) om te komen tot de hoogst mogelijke opbrengst voor de expressie. Uiteinde, scheiding en opzuivering gelukkig niet meer vereist verdere aanpassingen. We hebben al gemeld dat in het geval van andere BMP2 varianten geproduceerd in ons lab, enkele kenmerken van de proteïne waren ingrijpend heeft gewijzigd, die de wijziging van de verschillende stappen van de BMP productie methode18vereist. De geproduceerde BMP2-K3Plk toonden een biologische activiteit vergelijkbaar met die van het wild type eiwit. Een verschil treedt op bij hoge concentraties van de BMP2, waarschijnlijk als gevolg van een lagere oplosbaarheid van de BMP2-K3Plk-variant in medium vergeleken met die van wild type BMP2.
Ondanks de bekende voordelen van koper-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC)19, moeten CuAAC reacties worden zorgvuldig aangepast aan specifieke toepassingen. Toonden we hoe BMP2 kunnen worden gefragmenteerd of aggregaten of multimeren als gevolg van de sterke vermindering reactie voorwaarden maken. Alle parameters van de reactie moest dus, in detail worden geanalyseerd om te vinden van voorwaarden die het eiwit onaangetast laat.
Onze benadering van de BMP2 variant aan azide-matiemaatschappij agarose kralen covalent door klik chemie te koppelen kan worden gerealiseerd met een hoog rendement, wat resulteert in matiemaatschappij kralen triggering osteogenic differentiatie in vitro. Toen wild type BMP2 eiwit werd gebruikt in de reactie met de kralen in plaats daarvan, konden we enige zwakke kleuring van ALP expressie, die aangeeft dat de koppeling inderdaad plaatsgevonden zeer specifiek via het propargyl-L-lysine residu van BMP2-K3Plk observeren.
De specificiteit van deze positionele koppeling weerspiegelt een grote verbetering ten opzichte van de procedures van de immobilisatie waarbij klassieke NHS/EDC chemie. In dergelijke gevallen optreedt willekeurige koppeling, vooral met betrekking tot de primaire amine groepen in lysine residuen aanwezig. De gekoppelde eiwit heeft een variabele osteogenic activiteit, als gevolg van de veelheid aan mogelijke verbindingen naar de steiger, wat leidt tot verschillende oriëntaties van het eiwit naar cel receptoren.
Het gebruik van site-direct geïmmobiliseerdet BMP2 kan de genoemde nadelen aan de hoge doses van oplosbare BMP2, die nodig zijn voor het opwekken van biomineralisatie gerelateerde overwonnen. Bovendien, uit de resultaten blijkt duidelijk dat bepaalde cellulaire reacties, zoals de osteogenic differentiatie van C2C12 cellen, worden volledig geïnitieerd door geïmmobiliseerdet BMP2, ondanks de recente studies beweren dat signaal transductie vereist endocytose van de ligand/ligand-receptor complex20,21. Onze bevindingen zijn in overeenstemming met andere onderzoeken die aantonen dat BMP2, die is gekoppeld covalent (maar niet plaats-geleide) op niet-endocytosable oppervlakken, nog steeds in staat is voor het opwekken van osteoblast differentiatie22.
Gezien het feit dat we de koppeling reactie supra-fysiologische concentraties van BMP2 hebben gebruikt, kan het bedrag van de geïmmobiliseerdet BMP2 verder worden teruggedrongen terwijl nog het behoud van de osteogenic eigenschappen van de parels. Voorafgaand aan dergelijke optimization stappen moet de BMP2-K3Plk-matiemaatschappij steiger echter worden getest in dierproeven te bewijzen zijn osteogenic potentiële in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Dr. M. Rubini (Konstanz, Duitsland) voor het verstrekken van de plasmide codering pyrrolysyl-tRNA en voor het verstrekken van pRSFduet-pyrtRNAsynth de overeenkomstige aminoacyl-tRNA synthetase-codering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1-Step NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Add solution to cells |
| 3-Azido-7-hydroxycoumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Chemical used for click reaction |
| Agarose low melting point | Biozym | 840101 | Agarose for ALP assay |
| Azide agarose beads | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Beads used for reaction |
| BamHI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriction enzyme |
| BMP receptor IA (BMPR-IAEC) | -- | -- | Produced in our lab |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE |
| Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Chemical used for click reaction |
| DNA Polymerase and reaction buffer | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Cell culture media |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Chemical used to stop click reaction |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bacteria induction (1mM final concentration) |
| NdeI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriction enzyme |
| NHS-activated Texas Red | Life technologies | T6134 | Coupled to receptor |
| P- Nitrophenyl Phosphate | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkaline Phosphatase |
| p25N-hmBMP2 | -- | -- | Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| propargyl-L-lysine (Plk) | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel Purification |
| Qiagen PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR Purification |
| Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Chemical used for click reaction |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligation |
| tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Chemical used for click reaction |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon concentrating cell 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Concentrating unit |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck KGaA | UFC901024 | Concentrating centrifugal unit |
| ÄKTA avant FPLC | ÄKTA | -- | FPLC machine |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge for bacterial culture |
| Bacterial Shaking Incubator | Infors HT | Shaking incubator for bacterial culture | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | -- | Imaging and analysis system for SDS-PAGE |
| Fluorescent miscroscope | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3- (M) | Merck KGaA | 116882 | Ion Exchange Chromatography column material |
| Greiner CELLSTAR® 96 well plates | Sigma | M5811-40EA | 96 well plates for cell culture (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | -- | Centrifuge |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoScientific | 75003624 | Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining |
| Microcentrifuge - 5417R | Eppendorf | -- | Centrifuge |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | -- | software for stastic analysis of ALP assay data |
| Polysine Slides | ThermoScientific | 10143265 | microscope slides |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Tecan infinite M200 multiplate reader | Tecan Deutschland GmbH | -- | Multiplate reader for ALP assay |
| Thermocycler - Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | -- | PCR |
| TxRed - microscope filter | Keyence | Filter for fluorescent microscope | |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
References
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: An update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27 (2005).
- Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations. Biofactors. 40 (5), 459-481 (2014).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., Merkle, H. P., Gander, B. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur J Pharm Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Haidar, Z. S., Hamdy, R. C., Tabrizian, M. Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part A: Current challenges in BMP delivery. Biotechnol Lett. 31 (12), 1817-1824 (2009).
- Hollinger, J. O., Uludag, H., Winn, S. R. Sustained release emphasizing recombinant human bone morphogenetic protein-2. Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 303-318 (1998).
- Uludag, H., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: A correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J Biomed Mater Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Uludag, H., Golden, J., Palmer, R., Wozney, J. M. Biotinated bone morphogenetic protein-2: In vivo and in vitro activity. Biotechnol Bioeng. 65 (6), 668-672 (1999).
- Aono, A., et al. Potent ectopic bone-inducing activity of bone morphogenetic protein-4/7 heterodimer. Biochem Biophys Res Commun. 210 (3), 670-677 (1995).
- Suzuki, Y., et al. Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo. J Biomed Mater Res. 50 (3), 405-409 (2000).
- Knaus, P., Sebald, W. Cooperativity of binding epitopes and receptor chains in the BMP/TGFbeta superfamily. Biol Chem. 382 (8), 1189-1195 (2001).
- Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 225-249 (2006).
- Costa, G. L., Weiner, M. P. Rapid PCR site-directed mutagenesis. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2. FEBS Lett. 468 (2-3), 215-219 (2000).
- Tabisz, B., et al. Site-directed immobilization of BMP-2: Two approaches for the production of innovative osteoinductive scaffolds. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708 (2017).
- Duong-Ly, K. C., Gabelli, S. B. Using ion exchange chromatography to purify a recombinantly expressed protein. Methods Enzymol. 541, 95-103 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II. EMBO J. 19 (13), 3314-3324 (2000).
- Hein, J. E., Fokin, V. V. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides. Chem Soc Rev. 39 (4), 1302-1315 (2010).
- Alborzinia, H., et al. Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists. J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).
- Paarmann, P., et al. Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling. Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).
- Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
