Summary
Biomatériaux dopé avec Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) ont servi d’une nouvelle stratégie thérapeutique pour guérir des fractures osseuses non syndiqués. Pour surmonter les effets secondaires résultant d’une incontrôlable libération du facteur, nous proposons une nouvelle stratégie au site-immobiliser directement au facteur, créant ainsi des matériaux avec des capacités améliorées d’ostéogéniques.
Abstract
Différentes stratégies thérapeutiques pour le traitement des défauts d’os longs non-guérison ont été intensivement étudiées. Actuellement utilisé traitements présentes plusieurs limites qui ont conduit à l’utilisation des biomatériaux en combinaison avec les facteurs de croissance ostéogéniques, tels que les protéines morphogénétiques osseuses (PGB). Méthodes couramment utilisées, absorption ou encapsulation requièrent des quantités supra-physiologique de BMP2, qui généralement donne un effet de sortie dite éclatement initial qui provoque plusieurs effets secondaires indésirables graves. Une stratégie possible de surmonter ces problèmes serait de façon covalente coupler la protéine à l’échafaud. En outre, couplage doit être effectuée d’une manière spécifique afin de garantir un résultat reproductible produit. Par conséquent, nous avons créé une variante de la BMP2, dans lequel un aminoacide artificiel (propargyle-L-lysine) a été introduit dans la partie mature de la protéine BMP2 par l’expansion de son utilisation de codon (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk a été couplé à des perles fonctionnalisés par cycloaddition cuivre azoture-alcyne catalysée (CuAAC). L’activité biologique de la BMP2-K3Plk couplé a été prouvée in vitro et l’activité ostéogénique des perles BMP2-K3Plk-fonctionnalisés a été prouvée dans des essais sur des cellules de base. Les perles fonctionnalisés en contact avec les cellules C2C12 étaient capables d’induire l’expression de la phosphatase alcaline (ALP) localement limitée près du talon. Ainsi, fonctionnalisés échafaudages peuvent être produites par cette technique, qui peut déclencher la différenciation des cellules vers une lignée ostéogénique. En outre, des doses plus faibles de BMP2 sont suffisantes en raison de l’orientation contrôlée du BMP2 couplés dirigée. Avec cette méthode, les PGB est toujours exposés à leurs récepteurs sur la surface de la cellule dans l’orientation appropriée, ce qui n’est pas le cas si les facteurs sont couplés via des techniques de couplage non-dirigée. Le résultat produit est très contrôlable et, ainsi, résultats en matériaux dotés de propriétés homogènes, améliorer leur applicabilité pour la réparation de taille critique OS défauts.
Introduction
Le but ultime de la régénération de génie et d’os tissulaire osseuse est de surmonter les inconvénients et les limites qui se produisent durant les traitements courants des fractures non syndiqués. Auto - ou allo-greffes sont utilisés principalement comme des stratégies de traitement actuelles, même s’ils ont plusieurs inconvénients. La greffe osseuse idéale doit inciter l’ostéogénèse par Ostéoinduction ainsi qu’osteoconduction, ce qui entraîne l’ostéointégration de la prothèse dans l’OS. De nos jours, seulement auto-transplantation est considérée comme le « gold standard » puisqu’elle offre toutes les caractéristiques d’un greffon osseux idéal. Malheureusement, il présente aussi des aspects négatifs importants, tels que la chirurgie long temps et un second site de traumatisme qui généralement entraîne plus de complications (par exemple, la douleur chronique, formations de l’hématome, infections, défauts cosmétiques, etc.). Les greffes allogènes, ont en revanche sous-optimale caractéristiques pour tous les aspects généraux1. Technologies de greffe d’OS alternatifs ont été améliorées dans les dernières années, dans le but de produire des échafaudages ostéo-inducteurs, ostéoconducteur, biocompatible, et biorésorbables. Étant donné que nombreux biomatériaux ne présente pas toutes ces caractéristiques ostéogéniques, différents facteurs de croissance, principalement la BMP2 et la BMP7, ont été incorporés afin d’améliorer le potentiel ostéogénique de l' échafaudage particulier2.
Comme un critère essentiel, ces vecteurs de facteur de croissance devrait fournir une dose contrôlée de libération au fil du temps afin de faciliter les événements essentiels comme la cellule recrutement et attachement, interposition cellulaire et l’angiogenèse. Cependant, PGB ainsi que d’autres facteurs de croissance ostéogéniques ont été généralement immobilisés façon non covalente3. Techniques de piégeage et d’adsorption nécessitent l’utilisation de quantités supra-physiologique de protéine suite à un communiqué de l’éclatement initial, qui entraîne des inconvénients graves in vivo, affectant généralement les tissus environnants en induisant la prolifération osseuse, 4ostéolyse, gonflement et l’inflammation. Ainsi, le maintien de facteurs de croissance sur le site de livraison pour des périodes plus longues sont possibles par des méthodes d’immobilisation covalente. Chimiquement modifiées BMP2 (succinylé5, acétylés6 ou biotinylé7), ingénierie des hétérodimères8ou BMP2 oligopeptides dérivées9 ont été conçues et utilisées pour surmonter les limitations liées à absorption. Toutefois, la bio-activité de ces constructions n’est pas prévisible puisque l’arrangement potentiellement inhibe la liaison du ligand immobilisé sur les récepteurs cellulaires. Comme indiqué précédemment, il est essentiel que tous les quatre chaînes de récepteurs impliqués dans la formation des complexes activés ligand-récepteur interagissent avec la BMP2 immobilisée afin d’activer pleinement tout en aval de cascades signalisation10.
Pour surmonter les problèmes de l’issue de produits non homogènes avec des limitations en termes de bioactivité, stabilité et la biodisponibilité du facteur "immobilisé", nous avons conçu une variante BMP capable de se lier par covalence échafaudages de façon dirigée. Cette variante, appelée BMP2-K3Plk, comprend un acide aminé artificiel qui a été présenté par codon génétique expansion11. Cette variante a été liée avec succès pour les échafaudages en utilisant une stratégie de couplage covalent tout en conservant son activité biologique.
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Protocol
1. production de la BMP2 variante BMP2-K3Plk
- Clonage de BMP2-K3Plk par mutagénèse dirigée par PCR 12
- Amplifier la BMP2 maturité humaine (hmBMP2) d’un vecteur de p25N-hmBMP2 (voir la Table des matières) avec une amorce vers l’avant (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') et une amorce de marche arrière (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') présentant une (de codon stop ambre TAG) à la position de la lysine première partie mature BMP2´s. Effectuer la réaction de PCR à l’aide de 33,5 µL d’H2O, 10 µL du mélange de réaction PCR, 1,5 µL de solution stock de 10 µM dNTP, 1,5 µL d’apprêt avant (10 pmol/µL), 1,5 µL d’apprêt inverse (10 pmol/µL), 1 µL de p25N-hmBMP2 (10 ng/µL) et 1 µL de l’ADN polymérase (voir Table des matières) dans un thermocycleur (dénaturation à 95 ° C pendant 5 min, 30 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 1 min, recuit à 60 ° C pendant 1 min, allongement à 72 ° C pendant 1 min et une extension finale à 72 ° C pendant 10 min).
- Purifier le produit de la PCR à l’aide d’un kit disponible dans le commerce suite aux recommandations du fabricant (voir Table des matières).
- Digérer le produit PCR avec l’enzyme Ndel à 37 ° C pendant 45 min à l’aide de 16 µL d’H2O, 3 µL de tampon de digestion, 10 µL de l’ADN (20 ng/µL) et 1 µL d’enzyme de restriction. Chaleur-inactiver l’enzyme à 65 ° C pour 5 min. digérer le produit PCR avec les enzymes de restriction BamHI à 37 ° C pendant 1 h à l’aide de 16 µL d’H2O, 3 µL de tampon de digestion, 10 µL de l’ADN (20 ng/µL) et 1 µL d’enzyme de restriction. Chaleur-inactiver les enzymes à 80 ° C pendant 5 min.
- Digérer le vecteur de pET11a-pyrtRNA avec Ndel à 37 ° C pendant 2 h et 45 min en utilisant 16 µL d’H2O, 3 µL de tampon de digestion, 10 µL de l’ADN (20 ng / µL) et 1 µL d’enzyme de restriction. Chaleur-inactiver à 65 ° C pour 5 min. digérer le vecteur de pET11a-pyrtRNA avec BamHI à 37 ° C pendant 1 h à l’aide de 16 µL d’H2O, 3 µL de tampon de digestion, 10 µL de l’ADN (20 ng/µL) et 1 µL d’enzyme de restriction. Chaleur-inactiver à 80 ° C pendant 5 min.
- Séparer le vecteur digéré de vecteur non digéré et restes de digestion par agarose gel électrophorèse (0,8 % d’agarose, 60 min à 100 V). Ligaturer l’insert BMP2-K3TAG digérée avec backbone digérées pET11a-pyrtRNA à température ambiante (RT) pendant 2 h à l’aide de 100 ng d’épine dorsale pET11a-pyrtRNA et 34,5 ng de BMP2-K3TAG insert (rapport molaire de 1:3). Le mélange réactionnel contient le squelette de l’ADN et insert, 2 µL de tampon de ligase, 1 µL de DNA ligase et H2O pour un volume total de 20 µL.
- Exécuter une transformation Co de pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk et le pSRF-Duo-pyrtRNAsynth chez les bactéries BL21 (DE3) :
- Ajouter 50 ng de chaque plasmide aux bactéries, placer le mélange sur la glace pendant 30 min, un choc thermique à 42 ° C pendant 50 s, placer sur la glace pendant 5 min, ajouter 500 µL de milieu lysogénie bouillon (LB) dans le mélange et la secouer à 300 tr/min pendant 60 min.
- Propagation de 100 µL du mélange bactérien sur préchauffé kanamycine (50 µg/mL) / plaques d’ampicilline (100 µg/mL) et incuber une nuit à 37 ° C.
- Expression et Purification de BMP2-K3Plk 13 , 14
- Propager une seule colonie pendant la nuit dans 50 mL de milieu LB avec 50 µg/mL de kanamycine et 100 µg/mL d’ampicilline à 37 ° C.
- Diluer une nuit cultures 01:20 dans 800 mL de milieu de formidable bouillon (TB) additionné de 50 µg/mL de kanamycine et 100 µg/mL d’ampicilline et se développer à 37 ° C jusqu'à atteindre une OD600 de 0,7. Ajouter propargylique-L-lysine à une concentration finale de 10 mM. Prélever un échantillon µL 100 de la culture avant l’induction isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).
- Induire l’expression des gènes par l’addition d’IPTG à une concentration finale de 1 mM. Cultiver la culture à 37 ° C pendant 16 h dans un agitateur orbital à 180 tr/min. Prélever un échantillon de 100 µL de la culture.
- Centrifuger à toute la culture à 9000 g pendant 30 min. jeter le surnageant et Resuspendre le culot bactérien dans 30 mL de tampon TBSE (10 mM Tris, 150 mM NaCl, l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 1 mM) à 1/1000 (v/v) 2-mercaptoéthanol (fraîchement ajouté).
ATTENTION : Poignée 2-mercaptoéthanol sous la hotte. Éviter tout contact avec la peau et les yeux. Évitez l’inhalation de vapeur ou de brouillard. Effectuez toutes les étapes de la remise en suspension avec des tampons contenant du 2-mercaptoéthanol sous la hotte. - Peser un gobelet vide centrifuge et transvaser l’extrait concentré dans le récipient vide. Centrifuger à 6 360 x g pendant 20 min. jeter le surnageant et peser le bécher avec le culot. Soustraire le poids du gobelet vide pour calculer le poids du projectile.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Congeler le culot à-20 ° C à court terme ou à-80 ° C à long terme. En reprenant le protocole, décongeler le culot à température ambiante. - Resuspendre le culot dans un tampon STE (10 mM Tris pH 8,0 ; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, saccharose 375 mM, 1/1000 (v/v) 2-mercaptoéthanol (fraîchement ajouté)). Utiliser 200 mL de tampon STE par 10 g de granulés.
- Laisser agir la suspension sur la glace (10 min à 40 impulsions s, 20 s frein et amplitude de 30 %). Centrifuger à 6 360 x g pendant 20 min. jeter le surnageant et peser le culot. Répétez les étapes sonication et centrifugation 4 fois.
- Resuspendre le culot dans 100 mL de tampon TBS (10 mM Tris, NaCl 150 mM). Centrifuger à 6 360 x g pendant 20 min. jeter le surnageant et pèsent pellet.
- Resuspendre le culot dans un tampon nucléase (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl2) avec fraîchement ajouté 80 U/mL une nucléase (p. ex., Benzonase) à l’aide de 10 mL/g de granulés. Incuber la suspension du jour au lendemain à ta sur un plateau vibrant (30 tr/min).
- Ajouter le tampon Triton (60 mM EDTA, 1,5 M de NaCl, 6 % (v/v) 4-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl) phényl-polyéthylène-glycol) à la suspension. Le volume de tampon Triton pour ajouter correspond à une partie de volume 0,5 de la suspension. Incuber pendant 10 min à RT (sans remuer). Centrifuger à 6 360 x g pendant 20 min. jeter le surnageant et peser le culot.
- Resuspendre le culot dans tampon TE (100 mM Tris, EDTA de 20 mM) à l’aide de 8 mL/g de granulés. Centrifuger à 6 360 x g pendant 20 min. jeter le surnageant et peser le culot.
- Resuspendre le culot en ajoutant 4 mL/g de 25 millimètres NaAc pH 5.0 et 5 mL/g de 6 M GuCl avec 1 mM le dithiothréitol (DTT) (fraîchement ajouté). Incuber la suspension pendant la nuit à 4 ° C sur une plaque en remuant (30 tr/min).
- Centrifuger à 75 500 x g pendant 20 min. Le surnageant contient maintenant la protéine BMP2 monomère dépliée. Récupérer le surnageant et le concentré de cet extrait à 20 OD/mL à l’aide d’une membrane de coupure (MWCO) de poids moléculaire 3 kDa dans une concentration de cellules (voir Table des matières).
- Ajouter les monomères concentrés en gouttes unique dans la mémoire tampon de Renaturation (2 M LiCl, 50 mM Tris, CHAPS de 25 mM, 5 mM EDTA, le disulfure de glutathion (GSSG), de 1 mM 2 mM glutathion (GSH)) en remuant (30 tr/min). Incuber à RT pendant 120 heures dans l’obscurité.
Remarque : au cours de cette période d’incubation, repliement survient. La solution de cette étape, contient la BMP2-K3Plk dimère plié. - Ajuster le pH de la solution de 3.0 à l’aide de concentré HCl. Dialyze la solution contre 1 mM HCl concentré la solution dialysée en utilisant une membrane de coupure (MWCO) de poids moléculaire de 10 kDa dans une cellule de concentration.
- Equilibrer la solution en ajoutant le tampon un (NaAc, 30 % isopropanol 20 mM). Ajouter un volume de tampons A correspondant à un volume de 30 % de la solution. Centrifuger la solution à 4700 x g pendant 15 min.
- Equilibrer la colonne échangeuse d’ions sur un système de chromatographie en phase liquide (FPLC) protéine rapide15 avec 150 mL de tampon A. charge la solution de protéines sur la colonne du milieu. Éluer les fractions à l’aide d’un dégradé linéaire de tampon B (20 mM NaAc, 30 % isopropanol, 2 M NaCl) à l’aide de 100 mL de fractions de tampon B. collecter 2 mL.
NOTE : Concentrer la protéine avant le chargement à la colonne en fonction du volume total de la colonne. Le volume final de protéine doit être < 5 % du volume total de la colonne. - Analyser les 20 µL de chaque fraction en SDS Polyacrylamide gel (12 %) l’électrophorèse (SDS-PAGE) 16 et coloration bleu de Coomassie brillant bleu17 (voir Table des matières).
Remarque : Le bleu de Coomassie brillant bleu teinté de fractions de spectacles gel SDS-PAGE contenant des dimères (26 kDa) et des fractions contenant des monomères (13 kDa). - Fractions contenant des dimères de piscine. Dialyser le pool du dimère contenant des fractions de nuit à 4 ° C, contre 1 mM HCl (contenance de 5 litres). Concentrer le produit final en utilisant un kDa 10 unité de filtration centrifuge de concentration (voir Table des matières). Analyser le produit final par électrophorèse sur gel de Polyacrylamide (12 %) de la SDS (SDS-PAGE) et coloration brillante bleu de Coomassie.
Remarque : La bande sur le bleu de Coomassie brillant bleu teinté SDS-PAGE gel devrait montrer qu’une bande de 26 kDa. C’est le produit final de la BMP2-K3Plk.
2. optimisation de cuivre (I)-catalysée de l’Azide-alcyne Cycloaddition (CuAAC) Conditions
- Effet de l’ascorbate de sodium (NaAsc) et le sulfate de cuivre (II) (CuSO 4 ) sur wild type BMP2 (BMP2-WT)
- Incuber 20 µM BMP2-WT avec différentes proportions de NaAsc à CuSO4. Utiliser 0,5 mM NaAsc et 0,5 mM CuSO4 (à partir de concentration) dans un volume de 50 µL. Procéder avec les ratios suivants de NaAsc à CuSO4: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20 : 1), gardant la CuSO4 concentration constante à 0,5 mM et ajustement de la concentration de NaAsc en conséquence. Effectuer la réaction en H2O sur un mélangeur rotatif (20 tr/min) pendant la nuit à température ambiante.
- Préparer les échantillons réduites par l’ajout de mémoire tampon de chargement contenant 5 % de 2-mercaptoéthanol et incuber échantillon à 95 ° C pendant 6 min. Analyze réduits et des échantillons non réduits par SDS Polyacrylamide gel électrophorèse (12 %) (SDS-PAGE) et coloration bleu de Coomassie brillant bleu. Le Coomasie teinté gels SDS-PAGE montrent des bandes dans la gamme de 13 kDa (conditons réduite) à 26 kDa et de poids moléculaire plus élevé (conditions non réduits).
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Effet de Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) amine (THPTA) sur la réaction de CuAAC
- Incuber 20 µM BMP2-K3Plk avec différentes proportions de THPTA à CuSO4. Utilisez 5 mM NaAsc et 200 µM 3-Azido-7-hydroxycoumarine (Gardez NaAsc et 3-Azido-7-hydroxycoumarine constant). Utilisez 50 µM THPTA et 0,5 mM de CuSO4 comme concentration de départ. Utiliser les différentes proportions de THPTA à CuSO4: (7:1) ; (10:1) ; (12:1) ; (15 / 1) ; (20:1). effectuer la réaction en H2O (volume total 50 µL) pendant 24 h à RT sur un mélangeur rotatif (20 tr/min).
- Après accouplement, 3-Azido-7-hydroxycoumarine devient un colorant fluorescent. Préparer les échantillons dans des conditions de réduction et non réduits et les analyser par SDS-PAGE. Visualiser les gels sous le canal de l’excitation avec la longueur d’onde spécifique pour le 3-Azido-7-hydroxycoumarine (λabs = 404 nm, λem = 477 nm).
3. Technique de couplage covalents de BMP2-K3Plk à l’Azide fonctionnalisés Agarose perles
- Incuber 20 µM de BMP2-K3Plk ou BMP2-WT (utilisé comme contrôle négatif) avec 20 µL d’azoture-activé d’agarose perles dans un volume total de 500 µL de tampon de réaction (0,1 M HEPES pH 7.0, 3,9 M urée, 50 µM CuSO4, 250 µM THPTA, ascorbate de sodium 5 mM) pendant 2 heures au RT sur une rotati table de mixage ng (20 tr/min). Arrêter la réaction en ajoutant 5 mM EDTA (concentration finale).
- Incuber à RT pendant 15 minutes dans un mélangeur rotatif (20 tr/min). Centrifuger les échantillons à 20 000 x g pendant 1 min à RT. récolter les surnageants.
- Laver le culot contenant les perles trois fois avec 1 000 µL de tampon de500 HBS (50 mM HEPES, 500 mM NaCl), trois fois avec 1 000 µL de 4 M du MgCl2et deux fois avec 1 000 µL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). À chaque étape de lavage, centrifuger à 20 000 x g pendant 1 min à ta et recueillir les surnageants. Perles de magasin couplé à 1 000 µL de PBS à 4 ° C.
ATTENTION : Ne pas déranger le culot de perle tout en retirant le surnageant.
4. validation de la présence et l’activité biologique du BMP2-K3Plk immobilisé à l’aide de Texas Red étiqueté BMP récepteur j’ai un ectodomaine (BMPR-IA EC )
- Incuber à 50 µL de perles BMP2-K3Plk fonctionnalisés avec 1 µM de Texas Red étiqueté BMPR-IAEC avec 150 µL de tampon de500 HBS (50 mM HEPES, 500 mM NaCl) à ta pendant 1 h sur un mélangeur rotatif (20 tr/min).
- Centrifuger les perles à 20 000 x g pendant 1 min à RT. jeter le surnageant. Laver les billes avec 1000 µL de tampon de500 HBS. Répétez l’étape de lavage supplémentaire 3 fois. Centrifuger à 20 000 x g pendant 1 min à ta après chaque étape de lavage.
- Remettre en suspension les perles dans 500 µL de PBS et distribuer 50 µL sur une lame de verre couvercle. Définissez le filtre microscope entre 561 ou 594 nm. Détecter le Texas Red – BMPR-IAEC– BMP2-K3Plk fonctionnalisés perles à l’aide de fluorescent microscopie et prendre des photos.
5. mesure de la phosphatase alcaline (ALP) Expression de prouver la bioactivité In Vitro du produit BMP2-K3Plk avant et après la réaction de couplage.
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Test de la phosphatase alcaline (ALP)
- La culture des cellules C2C12 promyoblastic (ATCC CRL-172) dans de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) avec 10 % de sérum de veau foetal (FCS), 100 U/mL de pénicilline G et 100 µg/mL de streptomycine à 37 ° C en atmosphère humidifiée à 5 % de CO2.
- Les semences C2C12 cellules à une densité de 3 × 104 cellules/puits dans une microplaque 96 puits. Laisser les cellules à fixer toute la nuit. Éliminer le milieu et incuber les cellules C2C12 en présence de 0,5 à 200 nM de la BMP2-WT ou BMP2-K3Plk de 100 µL/puits de DMEM (2 % FCS, 100 U/mL de pénicilline G et 100 µg/mL de streptomycine) à 37 ° C en atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 pendant 72 h.
- Éliminer le milieu et laver les cellules avec 100 µL de PBS / puits. Lyser les cellules à ta pendant 1 h avec 100 µL/puits de tampon de lyse (1 % NP-40, glycine de 0,1 M, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) sur une secousse de la plaque (220 tr/mn).
- Ajouter 100 µL/puits de tampon de l’ALP (glycine 0,1 M, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) avec 1 mg/mL p-nitrophénylphosphate (fraîchement ajouté) au lysat cellulaire.
- Mesurer l’absorption à 405 nm dans un lecteur de multiplate après avoir ajouté le tampon de l’ALP et toutes les 5 min jusqu'à ce que le développement de la couleur est terminé. Générer des courbes dose-réponse et valeurs de la CE50 à l’aide d’un modèle logistique, y = A2 + (A-1-A2) / (1 + (x/x0)p).
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Coloration de la phosphatase alcaline (ALP)
- La culture des cellules C2C12 promyoblastic (ATCC CRL-172) en de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) avec 10 % de sérum de veau foetal (FCS), 100 U/mL de pénicilline G et 100 µg/mL de streptomycine à 37 ° C en atmosphère humidifiée à 5 % de CO2.
- Les semences C2C12 cellules à une densité de 3 × 104 cellules/puits dans une microplaque 96 puits. Laisser les cellules à fixer toute la nuit. Éliminer le milieu et ajouter 20 µL/puits de perles BMP2-K3Plk couplé. BMP2-K3Plk couplé perles sont dans 1000 µL d’une suspension de PBS.
- Préparer une solution de 0,4 % faible point de fusion d’agarose en DMEM. Faire fondre au micro-ondes (600 W pendant 3 min) et laisser refroidir dans un bain d’eau à 37 ° C jusqu'à l’utilisation.
- Ajouter 20 µL de 0,4 % faible point de fusion d’agarose dans chaque puits (revêtement perles et cellules). Centrifuger à 2000 x g pendant 5 min à 20 ° C. Ajouter 80 µL DMEM (2 % FCS, 100 U/mL de pénicilline G et 100 µg/mL de streptomycine) et incuber à 37 ° C en atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 pendant 72 h.
- Éliminer le milieu, en veillant à ne pas détacher l’agarose solidifiée de 0,4 %. Ajouter 100 µL/puits de 1 étape NBT/solution de substrat BCIP (Nitro-bleu tetrazolium chlorure, sel 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidine).
- Analyser la phosphatase alcaline coloration au microscope photonique, immédiatement après que la coloration pourpre devient apparente. Utiliser la microscopie en champ clair et prendre des photos.
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Representative Results
Dans cet article, nous décrivons une méthode pour atteler par covalence une nouvelle variante de la BMP2, BMP2-K3Plk, à commercialement disponible azoture fonctionnalisé agarose perles (Figure 1). La bioactivité de la variante de BMP2-K3Plk produite a été validée par l’induction de l’expression génique dans les cellules C2C12 phosphatase alcaline (ALP). Le test in vitro montre des niveaux d’expression semblables ALP induites par le type sauvage BMP2 (BMP2-WT) et BMP2-K3Plk (Figure 2).
Les réactions d’oxydoréduction entre le sulfate de cuivre (II) (CuSO4) et d’ascorbate de sodium (NaAsc) génèrent des espèces réactives de l’oxygène qui pourraient compromettre l’intégrité structurale et affectent donc la bioactivité de la BMP2-K3Plk. Pour vérifier l’intégrité structurale de la protéine, nous avons effectué une incubation durant la nuit avec CuSO4 et NaAsc, montrant la dégradation BMP2-WT de manière dose-dépendante (visualisée par SDS-PAGE conditions réduites (Figure 3 a1 )) et la formation de multimères ou agrégats visibles à environ 40 kDa (dans des conditions non réduits) (Figure 3 a2). Pour éviter la dégradation des protéines, Tris (3-hydroxypropyltriazolyl-méthyl) amine (THPTA) a été utilisé comme agent de protection (Figure 3 b). L’utilisation de THPTA empêche la fragmentation de la BMP2, tandis que la formation de structures de poids moléculaire plus élevés ne pourra être empêchée par l’addition de THPTA. Nouvelles améliorations de la réaction adressée la composition de la mémoire tampon de réaction, la température de réaction et temps de réaction (données non présentées). Le protocole décrit ici détails les réalisations finales concernant la composition du tampon réaction, température et temps de réaction.
Pour confirmer que BMP2-K3Plk conserve une bioactivité après accouplement, nous avons utilisé le récepteur fluorescent étiquetés ectodomaine protéine du type j’ai récepteur (BMPR-IAEC) pour démontrer que la protéine immobilisée est encore capable de se lier à ce récepteur. Perles recouvertes de BMP2-K3Plk via CuAAC chimie donné fluorescence incubés avec le dye-labeled BMPR-IAEC (Figure 4). En contraste, les perles non couché ou les perles qui sont incubées avec la BMP2-WT ont montré aucune fluorescence signal au-dessus de fond niveaux (données non présentées)14.
Après la confirmation des fonctionnalités de liaison de récepteur du ligand immobilisé in vitro, nous avons aussi testé si les réponses biologiques peuvent être déclenchées par les perles fonctionnalisés dans un essai sur les cellules. ALP médiée par la coloration a eu lieu seulement dans les cellules qui ont été en contact direct avec les perles BMP2-K3Plk-fonctionnalisés (Figure 5). Cela confirme que la protéine est en effet par covalence lié aux talons et pas juste absorbée, car une coloration plus étalé à grandes distances aux talons aurait autrement été observée.
Figure 1 : représentation de la BMP2-K3Plk. (A) Représentation de la variante de la BMP2-K3Plk avec la localisation de la substitution de l’aminoacide introduites. (B) régime de couplage : BMP2-K3Plk CuAAC réaction avec azide fonctionnalisés perles. Réimprimé (adapté) avec la permission de Tabisz et al. (2017) : immobilisation dirigée du BMP-2 : deux approches pour la fabrication d’échafaudages de l’innovants ostéo-inducteurs. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : bioactivité des variantes de la BMP2. Comparaison des bioactivités (dosage de l’ALP) de BMP2-K3Plk et de type sauvage BMP2 (BMP2-WT). L’axe des abscisses représentant la concentration de BMP2-WT ou BMP2-K3Plk utilisé dans le test. Les données de la CE50 représentent des valeurs moyennes et écarts-types de 4 expériences individuelles (N = 4). Réimprimé (adapté) avec la permission de Tabisz et al. (2017) : immobilisation dirigée du BMP-2 : deux approches pour la fabrication d’échafaudages de l’innovants ostéo-inducteurs. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : effet de l’agent réducteur sur l’intégrité de la BMP2. (A) BMP2-WT a été exposé à divers rapports molaires d’ascorbate de sodium (NaAsc) au cuivre (II) sulfate (CuSO4). Les échantillons ont été analysés par SDS-PAGE et coloration brillante bleu de Coomassie dans des conditions non réduits (Figure A2) et réduite (Figure A1). Dans les conditions de réduction (A1), les flèches rouges représentent clivée BMP2-WT. Dans des conditions non réduits (A2), les flèches rouges indiquent les multimères BMP2-WT. Les bandes représentant clivées BMP2 espèces sont indiqués par une flèche bleue. Légende : NCR - réduit BMP2-WT non traitée ; NC - BMP2-WT non traitée ; 1:1 à 20:1 - croissante des rapports molaires d’ascorbate de sodium à CuSO4. (B) la BMP2-K3Plk a été couplé au 3-Azido-7-hydroxycoumarine à l’aide de conditions de réaction CuAAC additionnées de THPTA. Sur l’attelage 3-Azido-7-hydroxycoumarine devient un colorant fluorescent. Légende : NC - BMP2-WT ont réagi avec 3-Azido-7-hydroxycoumarine ; 7:1 à 20:1 augmentation des rapports molaires de THPTA à CuSO4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : bioactivité des immobilisés BMP2-K3Plk in vitro. Image représentative de l’interaction des immobilisés BMP2-K3Plk avec marqué au Texas-rouge BMPR-IAEC. Réimprimé (adapté) avec la permission de Tabisz et al. (2017) : immobilisation dirigée du BMP-2 : deux approches pour la fabrication d’échafaudages de l’innovants ostéo-inducteurs. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : bioactivité du BMP2-K3Plk immobilisée dans un essai sur les cellules. (A) l’image représentative de la phosphatase alcaline (ALP) coloration après traitement avec des perles couplé à perles BMP2-K3Plk fonctionnalisés. (B) la phosphatase alcaline (ALP) coloration après traitement avec solubles 25 nM BMP2-K3Plk. réimprimé (adapté) avec la permission de Tabisz et al. (2017) : immobilisation dirigée du BMP-2 : deux approches pour la fabrication d’échafaudages de l’innovants ostéo-inducteurs. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Générant des variants protéiques marqués par expansion de codon génétique permet l’introduction de divers acides aminés non naturels analogues, principalement dans la position de la séquence protéique primaire. Dans le cas de PGB comme BMP2, common tags comme une balise 6-Histidine (His) ne peut être introduit N-terminale, depuis la fin de protein´s C-terminal est enterrée au sein de la structure tertiaire protéique et n’est donc pas accessible de l’extérieur. En d’autres positions, la taille de la balise introduite risque très probablement des modifications structurales qui par conséquent oblitérer la bioactivité de la BMP´s. En outre, présentant une mutation dans la séquence de la BMP2 peut influer sur l’efficacité de repliement et peut également changer d’autres paramètres de protéines comme le point isoélectrique de la protéine modifiée. Ainsi, chaque étape dans un protocole de production de protéine établie devrez peut-être être adapté selon les caractéristiques de variant´s de protéine altérée. La production de la BMP2-K3Plk a en effet exigé une modification de la méthode établie pour l’expression de type sauvage BMP2. Temps de culture différente ou des concentrations de propargyle-L-lysine (Plk) ont été testées (données non présentées) afin d’atteindre le meilleur rendement de l’expression. Repliement, étapes de séparation et purification heureusement n’exigeaient pas des adaptations supplémentaires. Nous l’avons déjà signalé que dans le cas d’autres variantes de BMP2 produites dans notre laboratoire, certaines caractéristiques de la protéine ont été modifiées de manière significative, qui exigeait la modification de plusieurs étapes de la méthode de production du BMP18. La BMP2-K3Plk produit a montré une activité biologique comparable à celui de la protéine de type sauvage. Une différence se produit à des concentrations élevées de BMP2, probablement comme conséquence une plus faible solubilité du BMP2-K3Plk variant en moyenne par rapport à celle du type sauvage BMP2.
Malgré les avantages connus de l’azoture-alcyne catalysée par le cuivre cycloaddition (CuAAC)19, des réactions de CuAAC devraient être soigneusement adaptées à des applications particulières. Nous avons montré comment BMP2 peuvent être fragmentés ou créer des agrégats ou des multimères en raison des conditions de réaction réductrice forte. Ainsi, tous les paramètres de réaction devaient être analysé en détail afin de trouver des conditions qui laissent la protéine pas affectée.
Notre approche de façon covalente coupler la variante BMP2 sur fonctionnalisés azoture d’agarose perles par chimie de clic pourrait être réalisé avec une grande efficacité résultant en perles fonctionnalisés déclenchant la différenciation ostéogénique in vitro. Lorsque les protéines de type sauvage BMP2 a été utilisé dans la réaction avec les perles au lieu de cela, nous avons pu observer seulement faible coloration d’expression de l’ALP, indiquant qu’attelage a en effet eu lieu très précisément par le résidu de propargyle-L-lysine du BMP2-K3Plk.
Cette spécificité de couplage positionnel reflète une grande amélioration par rapport aux procédures d’immobilisation impliquant classique chimie NHS/EDC. Dans ce cas, couplage aléatoire se produit, impliquant principalement les groupes amine primaire présentes dans les résidus de lysine. La protéine couplée a une activité ostéogénique variable, en raison de la multiplicité des connexions possibles à l’échafaud, conduisant à des orientations différentes de la protéine vers les récepteurs des cellules.
L’utilisation du site-direct immobilisée BMP2 pourrait surmonter les inconvénients mentionnés, associés à des doses élevées de BMP2 solubles, qui sont nécessaires pour induire la formation osseuse. En outre, les résultats montrent clairement que certaines réponses cellulaires, tels que la différenciation ostéogénique des cellules C2C12, sont entièrement initié par BMP2 immobilisée, malgré de récentes études affirmant que le signal transduction exige endocytose de la complexe de ligand/ligand-récepteur20,21. Nos résultats sont en accord avec les autres études qui démontrent que la BMP2, qui est couplé de façon covalente (mais pas dirigée) sur des surfaces non-endocytosable, est encore capable d’induire de différenciation ostéoblastique22.
Étant donné que nous avons utilisé des concentrations supra-physiologique de BMP2 pour la réaction de couplage, le montant de la BMP2 immobilisée pourrait être encore réduit tout en conservant toujours les propriétés ostéogéniques des perles. Toutefois, avant les mesures d’optimisation, l’échafaud BMP2-K3Plk-fonctionnalisés doit être testé lors des expérimentations animales pour prouver son potentiel ostéogénique in vivo.
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Disclosures
Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Dr M. Rubini (Constance, Allemagne) pour fournir le plasmide codant pyrrolysyl-tRNA et de fournir des pRSFduet-pyrtRNAsynth, codant la correspondante aminoacyl-ARNt synthétase.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1-Step NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Add solution to cells |
| 3-Azido-7-hydroxycoumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Chemical used for click reaction |
| Agarose low melting point | Biozym | 840101 | Agarose for ALP assay |
| Azide agarose beads | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Beads used for reaction |
| BamHI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriction enzyme |
| BMP receptor IA (BMPR-IAEC) | -- | -- | Produced in our lab |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE |
| Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Chemical used for click reaction |
| DNA Polymerase and reaction buffer | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Cell culture media |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Chemical used to stop click reaction |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bacteria induction (1mM final concentration) |
| NdeI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriction enzyme |
| NHS-activated Texas Red | Life technologies | T6134 | Coupled to receptor |
| P- Nitrophenyl Phosphate | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkaline Phosphatase |
| p25N-hmBMP2 | -- | -- | Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| propargyl-L-lysine (Plk) | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel Purification |
| Qiagen PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR Purification |
| Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Chemical used for click reaction |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligation |
| tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Chemical used for click reaction |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon concentrating cell 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Concentrating unit |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck KGaA | UFC901024 | Concentrating centrifugal unit |
| ÄKTA avant FPLC | ÄKTA | -- | FPLC machine |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge for bacterial culture |
| Bacterial Shaking Incubator | Infors HT | Shaking incubator for bacterial culture | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | -- | Imaging and analysis system for SDS-PAGE |
| Fluorescent miscroscope | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3- (M) | Merck KGaA | 116882 | Ion Exchange Chromatography column material |
| Greiner CELLSTAR® 96 well plates | Sigma | M5811-40EA | 96 well plates for cell culture (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | -- | Centrifuge |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoScientific | 75003624 | Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining |
| Microcentrifuge - 5417R | Eppendorf | -- | Centrifuge |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | -- | software for stastic analysis of ALP assay data |
| Polysine Slides | ThermoScientific | 10143265 | microscope slides |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Tecan infinite M200 multiplate reader | Tecan Deutschland GmbH | -- | Multiplate reader for ALP assay |
| Thermocycler - Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | -- | PCR |
| TxRed - microscope filter | Keyence | Filter for fluorescent microscope | |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
References
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