Summary
생체 재료 뼈 Morphogenetic 단백질 2 (BMP2) 실수로 비-연합 뼈 골절을 치유 하 새로운 치료 전략으로 사용 되었습니다. 요인의 통제 자료에서 발생 하는 부작용을 극복 하기 위해 제안 하는 사이트를 새로운 전략-직접 따라서 향상 된 osteogenic 기능으로 자료를 만드는 요소를 고정.
Abstract
긴 뼈 결함 치료 비의 치료에 대 한 다른 치료 전략 집중적으로 조사 했습니다. 현재 치료 현재 뼈 morphogenetic 단백질 (BMPs) 같은 osteogenic 성장 인자와 함께에서 생체 재료의 사용에 지도 하는 몇 가지 제한이 사용 됩니다. 일반적으로 사용 되는 흡수 또는 캡슐화 방법 위에 생리 양의 BMP2, 소위 초기 버스트 출시 효과 몇 가지 심각한 부작용을 불러 일으키에 결과 일반적으로 필요 합니다. 이러한 문제를 극복 하는 전략 covalently 발판 단백질을 결합 하는 것입니다. 또한, 커플링 재현할 수 제품 결과 보장 하기 위해 특정 방식으로 수행 되어야 한다. 따라서, 우리는 인공 아미노산 (propargyl-L-리 신) codon 사용법 확장 (BMP2-K3Plk)에 의해 BMP2 단백질의 성숙한 부분에 도입 되었다 BMP2 변종을 만들었습니다. BMP2 K3Plk 기능성된 비즈 구리 촉매 아 지 드 alkyne cycloaddition (CuAAC)을 통해 결합 했다. 결합 된 BMP2 K3Plk의 생물 학적 활동 생체 외에서 입증 되었다 고 BMP2-K3Plk-기능성된 구슬의 osteogenic 활동 세포 기반 분석 실험에서 입증 되었다. C2C12 셀 접촉 기능성된 비즈 구슬의 로컬 제한에 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 식을 유도 할 수 있었다. 따라서,이 기술에 의해 공업화 건설 기계 생산 될 수 있는 osteogenic 혈통으로 세포 분화를 일으킬 수 있다. 또한, 더 낮은 BMP2 복용량 결합된 BMP2 사이트 감독의 제어 방향 때문에 충분 한 있습니다. 이 방법으로, Bmp는 항상 사실이 아닌 사이트 감독 비 커플링 기술을 통해 요소를 결합 하는 경우 적절 한 방향으로 세포 표면에 그들의 수용 체에 노출 됩니다. 제품 결과 매우 제어 하 고, 따라서, 중요 한 크기의 복구에 대 한 그들의 적응성 향상 균질 속성 자료에 결과 뼈 결함.
Introduction
뼈 조직 공학 및 뼈 재생의 궁극적인 목표는 단점 및 비-연합 골절의 일반적인 치료 중 발생 하는 한계를 극복 하는. 비록 그들은 둘 다 몇 가지 단점이 자동 또는 알 로스 간이식 주로 현재 치료 전략으로 사용 됩니다. 이상적인 골 이식 한다 osteoinduction 뼈에는 이식의 osteointegration에 지도 하는 osteoconduction에 의해 골을 유도 하 고 있다. 요즘만 자동 이식 이후 이상적인 뼈 이식의 모든 특성을 제공 하는 그것은 "금 표준"으로 간주 됩니다. 불행히도, 그것은 또한 긴 수술 시간, 그리고 일반적으로 더 많은 합병증 (예를 들어, 만성 통증, 혈 종 형성, 감염, 화장품 결함, 등)을 수반 하는 두 번째 외상 사이트 같은 중요 한 부정적인 측면을 선물 한다. Allogenic 이식, 다른 한편으로 모든 일반적인 측면1차선 특성 있다. 대체 뼈 이식 기술은 지난 몇 년 동안, osteoinductive, osteoconductive, 생체, 그리고 bioresorbable는 건설 기계를 생산 하는 목적으로 개선 되었습니다. 때문에 많은 바이오 이러한 osteogenic 특성 모두 표시 되지 않습니다, 다른 성장 인자, 주로 BMP2, BMP7, 특정 비 계2의 osteogenic 잠재력을 향상 시키기 위해 통합 되었습니다.
필수 조건으로 같은 성장 인자 전달 시스템 셀 모집 및 첨부 파일, 셀 ingrowth와 신생 같은 필수 이벤트를 촉진 하기 위해 시간이 지남에 제어 복용량 릴리스를 제공 해야 합니다. 그러나, BMPs 뿐만 아니라 다른 osteogenic 성장 요인 되었습니다 일반적으로 움직일 수 비 covalently3. 함정 및 흡착 기술 위에 생리 양의 심각한 단점 vivo에서, 일반적으로 자라 난 뼈를 유도 하 여 주변 조직에 영향을 미치는에 이르게 한 초기 버스트 출시로 인해 단백질의 사용을 필요로 osteolysis와 염증, 붓기,4. 따라서, 오랜 시간에 대 한 배달 사이트에 성장 요인의 보존 화학식 동원 정지 방법으로 얻을 수 있습니다. 화학적 BMP2 수정 (succinylated5, acetylated6 또는 biotinylated7), heterodimers8, 설계 또는 BMP2 파생된 펩타이드9 설계 하 고 한계를 극복 하는 데 사용 된 관련 흡수입니다. 그러나, 배치는 잠재적으로 세포질 수용 체에 고정된 ligand의 바인딩 억제 때문에 이러한 구문 중 바이오 활동 예측 되지 않습니다. 와 같이 이전에, 모든 4 개의 수용 체 체인 수용 체 ligand-활성화 단지의 형성에 관련 된 모든 다운스트림 신호 폭포10를 완전히 활성화 하려면 고정된 BMP2 상호 작용 필수적 이다.
Bioactivity, 안정성, 및 고정된 요인의 bioavailability 한계와 휘도가 제품 결과의 문제를 극복 하기 위해 우리는 BMP 이체를 covalently 사이트 이동 방식으로 건설 기계를 바인딩 할 수 설계 되었습니다. BMP2-K3Plk, 불리는이 변형 유전자 codon 확장11에 의해 도입 된 인공 아미노산으로 구성 됩니다. 이 이체의 생물 활성을 유지 하면서 공유 결합 전략을 사용 하 여 건설 기계에 성공적으로 연결 되었습니다.
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Protocol
1. 생산의 BMP2 변형 BMP2-K3Plk
- 복제의 BMP2-K3Plk 사이트 감독 mutagenesis PCR를 사용 하 여 12
- 인간의 성숙 BMP2 증폭 (hmBMP2) p25N hmBMP2 벡터에서 ( 재료의 표참조) 앞으로 뇌관 (5' 3' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC) 및 역방향 뇌관 (5' 3' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT) 황색 정지 codon (소개 태그) BMP2´s 성숙 부분의 첫 번째 신의 위치에. H2O, 10 µ L의 PCR 반응 혼합 33.5 µ L, 10 µ M dNTP 재고 솔루션의 1.5 µ L, 앞으로 뇌관 (10 pmol / µ L), 역방향 뇌관 (10 pmol / µ L), p25N-hmBMP2 (10 ng / µ L)의 1 µ L의 1.5 µ L의 1.5 µ L를 사용 하 여 PCR 반응을 수행합니다 그리고 DNA 중 합 효소의 1 µ L ( 재료의 표참조)에 열 cycler (변성 5 분 동안 95 ° C에서 1 분, 1 분, 1 분에 72 ° C에서 신장 그리고 10 분 동안 72 ° C에서 최종 확장에 대 한 60 ° C에서 어 닐 링 동안 95 ° C에서 변성의 30 주기).
- 제조 업체의 권장 사항에 따라 상용 키트를 사용 하 여 PCR 제품을 정화 ( 재료의 표참조).
- H2O, 3 µ L의 소화 버퍼의 16 µ L, DNA의 10 µ L를 사용 하 여 45 분 동안 37 ° C에서 제한 효소 NdeI PCR 제품을 소화 (20 ng / µ L), 및 1 µ L의 제한 효소. 열-비활성화 65 ° C에서 효소 5 분 다이제스트 1 h H2O, 3 µ L의 소화 버퍼의 16 µ L, DNA의 10 µ L를 사용 하 여 37 ° C에서 제한 효소 BamHI로 PCR 제품을 위한 (20 ng / µ L), 및 1 µ L의 제한 효소. 5 분 동안 80 ° C에서 열 비활성화 효소
- H2O, 3 µ L의 소화 버퍼의 16 µ L, DNA의 10 µ L를 사용 하 여 2 h 45 분 동안 37 ° C에서 NdeI와 pET11a-pyrtRNA 벡터를 소화 (20 ng / µ L), 및 1 µ L의 제한 효소. 열-비활성화 65 ° C에서 5 분 다이제스트 1 h H2O, 3 µ L의 소화 버퍼의 16 µ L, DNA의 10 µ L를 사용 하 여 37 ° C에서 BamHI로 pET11a pyrtRNA 벡터에 대 한 (20 ng / µ L), 및 1 µ L의 제한 효소. 5 분 동안 80 ° C에서 열 비활성화.
- 소화 되지 않은 벡터에서 소화 벡터를 분리 하 고 소화 잔재 여 agarose 젤 전기 이동 법 (0.8 %agarose, 100 V에서 60 분). 2 h 100을 사용 하 여 실 온 (RT)에서 소화 pET11a pyrtRNA 등뼈와 소화 BMP2 K3TAG 삽입을 위하여 pET11a pyrtRNA 백본 및 34.5의 ng ng의 BMP2 K3TAG 삽입 (어 금 니 비율 1:3). 반응 혼합물 DNA 등뼈 및 삽입, 리가 버퍼의 2 µ L, DNA 리가, 그리고 H2O 20 µ L의 총 볼륨의 1 µ L를 포함 한다.
- BL21(DE3) 박테리아에 pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk 및 pSRF-듀엣-pyrtRNAsynth의 공동 변화를 수행:
- 50 추가 30 분 동안 얼음 50 42 ° C에서 열 충격에 혼합물을 배치 하는 각 플라스 미드는 박테리아의 ng s, 5 분 동안 얼음에, 혼합물, Lysogeny 국물 (파운드) 매체의 500 µ L을 추가 하 고 60 분 동안 300 rpm에서 흔들어.
- 미리 데워 진된 대 (50 µ g/mL)에 세균성 혼합물의 100 µ L를 확산 / 암 피 실린 (100 µ g/mL) 접시, 고 37 ° c.에서 밤새 품 어
- 표현과 BMP2 K3Plk의 정화 13 , 14
- 50 µ g/mL 대와 100 µ g/mL 암 피 실린 37 ° c.에 파운드 매체의 50 mL에서 하룻밤 단일 식민지를 전파
- 야간 문화 1시 20분 대의 50 µ g/mL와 100 µ g/mL 암 피 실린, 보완 하는 훌륭한 국물 (TB) 매체의 800 mL로 희석 하 고 0.7의600 세이 때까지 37 ° C에서 성장 한다. 10 m m의 최종 농도를 propargyl-L-리 신을 추가 합니다. 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 유도 전에 문화에서 100 µ L 샘플을 수집 합니다.
- 1 m m의 최종 농도에 IPTG의 추가 의해 유전자 발현을 유도. 180 rpm에서 궤도 통에 16 h 37 ° C에서 문화를 성장. 문화에서 100 µ L의 샘플을 수집 합니다.
- 원심에서 9000 x g 30 분 삭제에 대 한 전체 문화 상쾌한, 그리고 1:1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (갓 추가)와: TBSE 버퍼 (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA))의 30 mL에서 세균 펠 릿 resuspend.
주의: 연기 후드 2-mercaptoethanol을 처리 합니다. 피부와 눈과의 접촉을 피하십시오. 증기 나 미스 트의 흡입을 하지 마십시오. 2-mercaptoethanol 연기 후드를 포함 하는 버퍼와 물의 resuspension의 모든 단계를 수행 합니다. - 무게는 빈 원심 분리기 비 커와 빈 비 커에 resuspended 펠 릿을 전송. 20 분 삭제는 상쾌한 6360 x g에서 centrifuge와 펠 릿으로 비 커를 무게. 펠 릿의 무게를 계산 하려면 빈 비 커의 무게를 뺍니다.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 짧은 기간에-20 ° C에 또는 긴 기간에서-80 ° C에서 펠 릿을 고정 합니다. 프로토콜을 다시 시작 시 실시간에 펠 릿을 녹여 - STE 버퍼 (10 mM Tris pH 8.0; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 375 mM 자당, 1:1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (갓 추가))에 펠 릿을 resuspend. STE 버퍼의 200 mL를 사용 하 여 펠 릿의 모든 10 g에 대 한.
- 얼음 (10 분 40 s 펄스, 20 s 브레이크, 및 30% 진폭)에 정지 sonicate 20 분 삭제는 상쾌한 6360 x g에서 centrifuge와 펠 릿을 무게. 4 번 쥡니다 및 원심 분리 단계를 반복 합니다.
- TBS 버퍼 (10 mM Tris, 150 mM NaCl) 100 mL에 펠 릿을 resuspend. 20 분 삭제는 상쾌한 6360 x g에서 centrifuge와 펠 릿을 무게.
- 갓 추가 80 U/mL nuclease (예, Benzonase)와 nuclease 버퍼 (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 m m MgCl2) 펠 릿 resuspend 펠 릿의 10 mL/g를 사용 하 여. 교 반 접시 (30 rpm)에 실시간에 하룻밤 정지를 품 어.
- 트리톤 버퍼 추가 (60 mM EDTA, 1.5 M NaCl, 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) 페 닐 폴 리 에틸렌 글리콜) 정지에. 트리톤 버퍼 추가 현 탁 액의 0.5 볼륨 부분에 해당 합니다. RT (교 반)에서 10 분 동안 품 어. 20 분 삭제는 상쾌한 6360 x g에서 centrifuge와 펠 릿을 무게.
- 펠 릿 테 버퍼 (100 mM Tris, 20 mM EDTA)에 resuspend 8 mL/g의 펠 릿을 사용 하 여. 20 분 삭제는 상쾌한 6360 x g에서 centrifuge와 펠 릿을 무게.
- 4 mL/g 25 m m NaAc pH 5.0의 1 m m dithiothreitol (DTT) (갓 추가)와 6 M GuCl의의 5 mL/g을 추가 하 여 펠 릿을 resuspend. 교 반 접시 (30 rpm)에 4 ° C에서 하룻밤 정지를 품 어.
- 20 분 동안 75500 x g에서 원심. 상쾌한 펼친된 단위체 BMP2 단백질을 이제 포함 되어 있습니다. 상쾌한 고 집중 하는 집중에 3 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) 멤브레인을 사용 하 여 20 세/mL에 추출이 물이 세포 ( 재료의 표참조)를 수집 합니다.
- (30 rpm)를 교 반 하면서 Renaturation 버퍼 (2 M LiCl, 50 mM Tris, 25mm 균열, 5 mM EDTA, 1mm 티 아 황산 (GSSG) 2 m m 티 (GSH))를 단일 상품에 집중된 단위체 추가 합니다. 어둠 속에서 120 h RT에서 품 어.
참고: 동안이 부 화 기간, refolding occours. 앞으로이 단계에서 솔루션에는 접힌된 dimeric BMP2-K3Plk 포함 되어 있습니다. - 3.0 집중 셀에 10 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) 멤브레인을 사용 하 여 dialyzed 솔루션 집중된 HCl. Dialyze 1 m HCl 집중 m에 대 한 솔루션을 사용 하 여 솔루션의 pH를 조정 합니다.
- 버퍼는 (20 m m NaAc, 30% 소 프로 파 놀)을 추가 하 여 솔루션을 equilibrate. 버퍼 A 해당 하는 솔루션의 30% 볼륨의 볼륨을 추가 합니다. 4700 x g 15 분에서 솔루션 원심
- 이온 교환 버퍼 A. 부하 equilibrated 열에 단백질 해결책의 150 mL와 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템15 에 대 한 열 equilibrate (20 m m NaAc, 30% 소 프로 파 놀, 2 M NaCl) 버퍼 B의 선형 그라디언트를 사용 하 여 분수 elute 버퍼 B. 수집 2 mL 분수의 100 mL를 사용 하 여.
참고: 총 열 량에 따라 열에 로드 하기 전에 단백질을 집중 한다. 최종 단백질 볼륨 이어야 한다 < 총 열 량의 5%. - SDS Polyacrylamide 젤 (12%) 전기 영동 (SDS-PAGE) 16 및 Coomassie 화려한 블루 얼룩17 ( 재료의 표참조)에 의해 각 분수의 20 µ L를 분석 합니다.
참고: SDS 페이지 젤 쇼 분수 이합체 (26 kDa)와 포함 하는 단위체 (13 kDa) 분수를 포함 하는 Coomassie 화려한 블루 스테인드. - 포함 하는 이합체 분수 풀. 1mm HCl (5 리터 볼륨)에 대 한 4 ° C에서 하룻밤 분수를 포함 하는 이합체의 풀 dialyze 10 kDa 원심 필터 단위 집중을 사용 하 여 최종 제품을 집중 ( 재료의 표참조). (12%) SDS Polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지) 및 Coomassie 화려한 블루 얼룩에 의해 최종 제품을 분석.
참고: Coomassie 화려한 블루에 밴드 스테인드 SDS 페이지 젤 26 kDa에 하나의 밴드를 표시 해야 합니다. 이것은 최종 BMP2-K3Plk 제품입니다.
2. 구리 (I)의 최적화-촉매 Alkyne-아 지 드 Cycloaddition (CuAAC) 조건
- 나트륨 하는데 (NaAsc) 및 구리 (II) 황산 염 (CuSO 4 )의 효과 야생 타입 BMP2에 (BMP2-WT)
- 20 µ M를 품 어 BMP2-WT CuSO4NaAsc의 다른 비율. 50 µ L 볼륨에 0.5 m NaAsc m와 0.5 m m CuSO4 (시작 농도)를 사용 합니다. NaAsc의 다음 비율 CuSO4진행: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20: 1), 0.5 m m에 지속적인 CuSO4 농도 유지 하 고 NaAsc의 농도 적절 하 게 조정. 실시간에서 H2O (20 rpm) 회전 믹서에 반응을 밤새 수행 하는 방법
- 5 %2-mercaptoethanol을 포함 하는 로드 버퍼를 추가 하 여 감소 샘플을 준비 하 고 6 분 분석 감소 및 SDS Polyacrylamide 여 비 감소 샘플 (12%) 전기 영동 (SDS-PAGE)와 화려한 Coomassie 파란 얼룩이 지 젤 95 ° C에서 샘플을 품 어. SDS 페이지 젤 스테인드 Coomasie 13 kDa (감소 이용) 26 kDa와 높은 분자량 (비 감소 조건)의 범위에서 밴드를 표시 합니다.
-
효과 Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) CuAAC 반응에 아민 (THPTA)
- 20 µ M를 품 어 BMP2-K3Plk CuSO4THPTA의 다른 비율. 사용 하 여 5 mM NaAsc, 그리고 200 µ M 3-Azido-7-hydroxycoumarin (일정 하 게 유지 NaAsc와 3-Azido-7-hydroxycoumarin). 50 µ M THPTA와 CuSO4 의 0.5 m m를 사용 하 여 농도 시작으로. CuSO4THPTA의 다른 비율을 사용 하 여: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). 회전 믹서 (20 rpm)에 실시간에 24 h에 대 한 반응에서 H2O (50 µ L 총 볼륨)를 수행.
- 커플링, 시 3-Azido-7-hydroxycoumarin 형광 염색 된다. 감소 및 감소 비 조건에서 샘플을 준비 하 고 SDS 페이지 분석. 3-Azido-7-hydroxycoumarin에 대 한 특정 파장 여기 채널에서 젤 시각화 (λabs 404 = nm; λem 477 = nm).
3. 공유 결합 기술 BMP2-아 지 드를 K3Plk의 공업화 Agarose 구슬
- 2 h RT에는 rotati에 대 한 반응 버퍼 (0.1 m M HEPES pH 7.0, 3.9 M 요소, 50 µ M CuSO4, 250 µ M THPTA, 5mm 나트륨 하는데)에 500 µ L의 전체 볼륨에 아 지 드 활성화 agarose 구슬의 20 µ L로 BMP2 K3Plk 또는 BMP2 WT (부정적인 제어 사용) 20 µ M를 품 어 ng 믹서 (20 rpm)입니다. 5 mM EDTA (최종 농도)를 추가 하 여 반응을 중지 합니다.
- RT에 회전 믹서 (20 rpm)에 15 분 동안 품 어. 실시간 수집에 1 분 동안 20000 x g에서 샘플은 supernatants 원심.
- 4 M MgCl2, 1000 µ L와 함께 두 번 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 1000 µ L 세 번의 HBS500 버퍼 (50 mM HEPES, 500 mM NaCl), 1000 µ L와 구슬 포함 된 펠 릿 세 번 씻어. 모든 세척 단계에서 RT에 1 분 동안 20000 x g에서 원심과 supernatants를 수집 합니다. 4 ° c.에 PBS의 1000 µ L에 결합 된 구슬 저장
주의: 제거는 상쾌한 하는 동안 비드 펠 렛을 방해 하지 마십시오.
4. BMP 수용 체를 분류 존재와 고정된 BMP2-K3Plk를 사용 하 여 텍사스 레드의 생물 학적 활동의 유효성 검사 나 Ectodomain BMPR IA ( EC )
- 50을 품 어 텍사스 레드의 1 µ M와 기능성된 BMP2 K3Plk 구슬의 µ L 회전 믹서 (20 rpm)에 1 시간에 대 한 실시간에 HBS500 버퍼 (50 mM HEPES, 500 mM NaCl)의 150 µ L 함께 BMPR IAEC 를 분류.
- 20000 x g 실시간 삭제는 상쾌한에 1 분 동안에 구슬 원심 워시 1000 µ L의 HBS500 버퍼와 구슬. 세척 단계는 추가 3 회 반복 한다. 각 후 RT에 1 분 동안 20000 x g에서 원심 분리기 세척 단계.
- PBS의 500 µ L에 구슬 resuspend 고 유리 커버 슬라이드에 50 µ L 플라스틱. 561 또는 594 nm 사이 현미경 필터를 설정 합니다. 텍사스 레드-BMPR-IAEC검색-BMP2-K3Plk 기능성 형광 현미경 검사 법 및 사진을 사용 하 여 구슬.
5. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 측정 전에 BMP2 K3Plk 생산 고는 결합 후 반응의 생체 외에서 Bioactivity를 증명 하는 식.
-
알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 분석 결과
- Promyoblastic C2C12 세포 (ATCC CRL-172)에서 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 100 U/mL 페니실린 G, 5% CO2습도 분위기에서 37 ° C에서 100 µ g/mL 스와 문화.
- 96-잘 microplate에 3 × 104 셀/잘의 밀도에 씨앗 C2C12 세포. 셀 하룻밤을 연결 하자. 매체를 제거 하 고 품 어 0.5-200의 C2C12 세포에 100 µ L/잘 DMEM (2% FCS 100 U/mL 페니실린 G, 100 µ g/mL 스)의 5% CO2 72 h 습도 분위기에서 37 ° C에서의 BMP2 WT 또는 BMP2 K3Plk nM.
- 매체를 제거 하 고 잘 당 PBS의 100 µ L로 세포 세척. 세포의 용 해 버퍼의 100 µ L/잘 1 h에 대 한 실시간에 세포를 lyse (1 %NP-40, 0.1 m M 글리신, pH 9.6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) 흔들어에 접시 (220 rpm).
- 세포 lysate를 100 µ L/ALP 버퍼 (0.1 m M 글리신, pH 9.6, 1 mM MgCl2, 1mm ZnCl2)의 우물 1 mg/mL p-nitrophenylphosphate (갓 추가) 추가.
- 405에서 흡수 측정 여러 리더 알프 버퍼 및 모든 5 분을 추가 하는 색상의 개발 완료 될 때까지 후에 nm. 복용량 응답 곡선 및 로지스틱 모델을 사용 하 여 EC50 값 생성 y = A2 + (A1-A2) / (1 + (x/0x)p).
-
알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 얼룩
- Promyoblastic C2C12 세포 (ATCC CRL-172)에서 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 100 U/mL 페니실린 G, 5% CO2습도 분위기에서 37 ° C에서 100 µ g/mL 스와 문화.
- 씨앗의 3 × 104 셀/96-잘 microplate에 밀도에 세포를 C2C12. 셀 하룻밤을 연결 하자. 매체를 제거 하 고 20 µ L/잘 BMP2 K3Plk 결합 된 구슬의 추가. BMP2 K3Plk 결합 구슬 1000 µ L의 PBS 정지에 있습니다.
- DMEM에 0.4% 낮은 녹는 점 agarose의 솔루션을 준비 합니다. 그리고 전자 렌지 (600 W 3 분)에서 녹여 사용까지 37 ° C에서 물 욕조에 진정 하자.
- 각 잘 (취재 구슬과 셀)에서 0.4% 낮은 녹는 점 agarose의 20 µ L를 추가 합니다. 20 ° c.에서 5 분 동안 2000 x g에서 원심 분리기 80 µ L DMEM (2% FCS 100 U/mL 페니실린 G, 100 µ g/mL 스)를 추가 하 고 5% CO2 72 h 습도 분위기에서 37 ° C에서 품 어.
- 매체, 응고 0.4 %agarose 분리 하지 않도록 주의 하 고 제거 합니다. 추가 100 µ L/우물 1 단계 NBT/BCIP (니트로 블루 tetrazolium 염화 물, 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-톨루이 소금) 기판 솔루션.
- 알칼리 성 인산 가수분해 효소는 명백 하 게 되는 보라색 얼룩 직후 가벼운 현미경 검사 법을 사용 하 여 얼룩 분석. 밝은 분야 현미경 검사 법을 사용 하 고 사진을 찍고.
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Representative Results
이 문서에서 우리는 covalently 상용 아 지 드 기능성된 agarose 구슬 (그림 1)을 새로운 BMP2 변종, BMP2-K3Plk 하는 방법을 설명 합니다. 생산된 BMP2 K3Plk variant의 bioactivity C2C12 세포에 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 유전자 발현의 유도 의해 확인 되었다. 생체 외에서 시험 야생 타입 BMP2에 의해 유도 된 유사한 ALP 식 레벨 표시 (BMP2-WT) 및 BMP2-K3Plk (그림 2).
구리 (II) 황산 염 (CuSO4)과 나트륨 하는데 (NaAsc) 사이 redox 반응 구조적 무결성에 영향을 하 고 따라서 BMP2 K3Plk의 bioactivity에 영향을 미칠 수 있습니다 반응성 산소 종을 생성 합니다. 단백질의 구조적 무결성을 확인 하기 위해 CuSO4 와 NaAsc, (감소 된 조건 (그림 3A1 SDS 페이지 시각 농도 의존 방식에서 BMP2 WT 저하를 보여주는 야간 보육을 수행 했습니다. ))와 multimers 또는 집계 (조건 비 감소) 약 40 kDa에 표시의 형성 (그림 3A2). 피하기 위해 단백질 저하, 트리 스 (3-hydroxypropyltriazolyl-메 틸) 아민 (THPTA) 보호 요원 (그림 3B)으로 사용 되었다. THPTA 사용 하 여 더 높은 분자량 구조 형성 THPTA의 추가 의해 방해 되지 수 하는 동안 BMP2 조각화를 방지 합니다. 반응의 더 개선 해결 반응 버퍼, 반응 온도 및 반응 시간 (데이터 표시 되지 않음)의 구성. 프로토콜 정보 반응 버퍼 구성, 온도 및 반응 시간에 관한 최종 성과 여기 설명합니다.
확인 하려면 BMP2 K3Plk 결합 후 bioactivity를 유지, 사용 하는 형식의 붙일 레이블된 수용 체 ectodomain 단백질 나 수용 체 (BMPR IAEC) 고정된 단백질은이 수용 체에 바인딩할 수 입증. 구슬은 BMP2 K3Plk CuAAC 화학 형광 염료 표시 BMPR IAEC (그림 4)와 함께 알을 품을 때 굴복을 통해 코팅. 대비, 비 코팅 구슬 또는 BMP2 WT 보였다 아무 형광과 인 큐베이 팅 했다 구슬 배경 위에 신호 레벨 (데이터 표시 되지 않음)14.
확인 후 시험관에고정된 ligand 수용 체 바인딩 기능, 우리는 또한 생물학 응답 세포 기반 분석 결과에서 공업화 구슬에 의해 트리거될 수 있습니다 여부를 테스트. ALP 중재 BMP2-K3Plk-기능성된 비즈 (그림 5)와 직접 접촉에 있던 그 세포에서 서만 발생 한 얼룩. 이 단백질 이며 실제로 covalently 구슬에 연결 된 그냥 흡수, 구슬에 더 큰 거리에 더 확산 밖으로 얼룩 것입니다 그렇지 않으면 관찰 되었습니다 이후 확인 합니다.
그림 1: BMP2의 묘사-K3Plk. (A) 도입된 된 아미노산 대체의 지역화와 BMP2 K3Plk 이체의 묘사. (B) 연결 계획: BMP2 K3Plk CuAAC 반응 아 지 드와 기능성 비즈. Tabisz 외허가 (적응) 표현. (2017): BMP-2 동원 정지 사이트 감독: 혁신적인 Osteoinductive 장비의 생산을 위한 두 가지 방법. Biomacromolecules입니다. 18 (3), 695-708. (저작권 2017 미국 화학 사회) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: BMP2 변종의 Bioactivity. (BMP2-WT) wildtype BMP2 BMP2 K3Plk의 bioactivities (ALP 분석 결과)의 비교. BMP2 K3Plk 분석 결과에 사용 또는 x 축 BMP2 WT의 농도 나타냅니다. EC50 데이터 평균값 및 표준 편차 4 개별 실험 (N = 4)을 나타냅니다. Tabisz 외허가 (적응) 표현. (2017): BMP-2 동원 정지 사이트 감독: 혁신적인 Osteoinductive 장비의 생산을 위한 두 가지 방법. Biomacromolecules입니다. 18 (3), 695-708. (저작권 2017 미국 화학 사회) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3:는 BMP2의 무결성에는 환 원제의 영향. (A) BMP2 WT 나트륨 하는데 (NaAsc) 구리 (CuSO4) 황산 염 (II)의 다른 어 금 니 비율에 노출 되었다. 샘플은 SDS 페이지와 감소 (그림 A1) 및 비 감소 조건 (그림 A2) Coomassie 화려한 블루 얼룩에 의해 분석 되었다. 감소 된 조건 (A1)에서 빨간색 화살표 쪼개진된 BMP2-WT를 나타냅니다. 비 감소 조건 (A2)에서 빨간색 화살표는 multimeric BMP2 WT를 나타냅니다. 쪼개진된 BMP2 종족을 대표 하는 밴드는 파란색 화살표로 표시 됩니다. 전설: NCR -감소 BMP2 WT 치료; NC-BMP2 WT 치료; 1:1 20:1-증가 CuSO4나트륨 하는데 어 금 니 비율 (B) BMP2-K3Plk 3-Azido-7-hydroxycoumarin를 결합 했다 CuAAC 반응 조건 THPTA 보충을 사용 하 여. 결합 시 3-Azido-7-hydroxycoumarin 형광 염색 된다. 전설: NC-BMP2 WT 3-Azido-7-hydroxycoumarin;와 반응 7:1 20:1 CuSO4THPTA의 어 금 니 비율을 증가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 고정된 BMP2-생체 외에서 K3Plk의 Bioactivity. 텍사스 레드 셔 서 BMPR IAEC와 고정된 BMP2-K3Plk의 상호 작용의 대표적인 그림. Tabisz 외허가 (적응) 표현. (2017): BMP-2 동원 정지 사이트 감독: 혁신적인 Osteoinductive 장비의 생산을 위한 두 가지 방법. Biomacromolecules입니다. 18 (3), 695-708. (저작권 2017 미국 화학 사회) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 세포 기반 분석 결과에 고정된 BMP2-K3Plk의 Bioactivity. (A) 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 구슬 치료 시 얼룩의 대표 그림 BMP2-K3Plk 기능성된 비즈를 결합. (B) 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 수용 성 25 치료 시 얼룩 nM BMP2-K3Plk. Reprinted Tabisz 외허가 (적응). (2017): BMP-2 동원 정지 사이트 감독: 혁신적인 Osteoinductive 장비의 생산을 위한 두 가지 방법. Biomacromolecules입니다. 18 (3), 695-708. (저작권 2017 미국 화학 사회) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
유전자 codon 확장 태그 단백질 이체를 생성 주로 기본 단백질 시퀀스의 어떤 위치 든 지에서 다양 한 비 천연 아미노산 아날로그의 도입을 허용 한다. BMP2 같은 Bmp, 경우 공통 태그 6 히스티딘 (그의) 태그 수와 같은 N-말기, 이후 protein´s C 터미널 끝 차 단백질 구조 내에서 매장 된다 고 따라서 액세스할 수 없는 외부에서 도입. 다른 위치에서 소개 태그의 크기는 결과적으로 BMP´s bioactivity를 없애다 구조 변경 가능성이 매우 발생할 수 있습니다. 또한, 돌연변이 소개 BMP2 시퀀스로 refolding 효능에 영향을 미칠 수 있습니다 그리고 또한 수정 된 단백질의 전자 포인트 같은 다른 단백질 매개 변수를 변경할 수 있습니다. 따라서, 설립된 단백질 생산 프로토콜에서 모든 단일 단계 변경된 단백질 variant´s 특성에 따라 적응 해야 합니다. BMP2-K3Plk의 생산은 실제로 야생 타입 BMP2의 표현에 대 한 설립된 방법의 수정이 필요합니다. 다른 문화 시간 또는 propargyl-L-리 신 (Plk) 농도 테스트 (데이터 표시 되지 않음)은 최고의 식 율을 도달 하기 위하여. Refolding, 별거 및 정화 단계 다행히 요구 하지 않았다 추가 적응. 우리는 우리 실험실에서 생산 다른 BMP2 변종, 경우 일부 단백질 특성 변경 된 크게, BMP 생산 방법18의 여러 단계의 수정 필수 보고 이미 있다. 생산된 BMP2 K3Plk 야생 유형 단백질의 비교 생물 학적 활동을 보여주었다. 차이 야생 타입 BMP2의 비교 매체에서 BMP2 K3Plk variant의 낮은 용 해도 때문에 아마 높은 BMP2 농도에서 발생 합니다.
아 지 드-alkyne 구리 촉매 cycloaddition (CuAAC)19의 알려진된 장점에도 불구 하 고 CuAAC 반응 특정 응용 프로그램을 신중 하 게 적응 해야 합니다. 우리는 어떻게 BMP2 조각화 될 수 있습니다 또는 집계 또는 multimers 강한 감소 반응 조건에 따라 만들 것을 보였다. 따라서, 모든 반응 매개 단백질을 영향을 받지 않는 조건을 찾기 위해 자세히 분석 했다.
하 covalently BMP2 변종 아 지 드 기능성된 agarose 구슬을 클릭 화학에 의해 우리의 접근 고효율 기능성된 비즈 osteogenic 차별화에 생체 외에서트리거링 결과로 실현 될 수 있습니다. 야생 타입 BMP2 단백질 대신 구슬에 대 한 반응에서 사용 되었다 때 우리만 약한 ALP 식의 얼룩, 커플링 BMP2 K3Plk의 propargyl-L-lysin 잔류물을 통해 매우 구체적으로 실제로 발생 했음을 나타내는 관찰 수 합니다.
이 위치 결합 특이성 클래식 보 건국/EDC 화학 관련 된 동원 정지 절차에 비해 큰 개선을 반영 합니다. 이러한 경우에, 주로 1 차 아민 그룹 리 진 잔류물에 관련 된 임의의 커플링 발생 합니다. 결합 된 단백질 발판, 향해 세포 수용 체 단백질의 다른 방향으로 이어지는 가능한 연결의 다양성으로 인해 가변 osteogenic 활동이 있다.
사이트 직접 고정된 BMP2 사용 하 여 뼈의 형성을 유발 하는 데 필요한 가용성 BMP2의 높은 복용량에 관련 된 언급 한 단점 극복할 수 있습니다. 또한, 결과 명확 하 게 특정 세포 응답을 표시와 같은 C2C12 셀의 osteogenic 차별화 완전히 움직이지 BMP2 시작 됩니다, 그 신호를 주장 하는 최근 학문에도 불구 하 고 변환 필요 endocytosis의는 ligand/리간드-수용 체 복잡 한20,21. 우리의 발견은 BMP2, covalently 결합 (만 하지 사이트 감독)를 비 endocytosable 표면은 유도 osteoblast 차별화22수를 보여주는 다른 연구와 일치 하 여 이다.
우리 커플링 반응에 대 한 BMP2의 위에 생리 적인 농도 사용한 고려, 고정된 BMP2 양의 여전히 구슬의 osteogenic 속성을 보존 하는 동안 더 감소 될 수 있습니다. 그러나 이러한 최적화 단계 이전, BMP2-K3Plk-기능성된 비 계는 osteogenic 잠재적인 비보를 증명 하기 위해 동물 실험에서 테스트 해야 합니다.
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 pyrrolysyl-tRNA를 인코딩 하는 플라스 미드를 제공 하 고 제공 하는 pRSFduet pyrtRNAsynth 인코딩 해당 aminoacyl-tRNA 합성 박사 M. Rubini (Konstanz, 독일) 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1-Step NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Add solution to cells |
| 3-Azido-7-hydroxycoumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Chemical used for click reaction |
| Agarose low melting point | Biozym | 840101 | Agarose for ALP assay |
| Azide agarose beads | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Beads used for reaction |
| BamHI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriction enzyme |
| BMP receptor IA (BMPR-IAEC) | -- | -- | Produced in our lab |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE |
| Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Chemical used for click reaction |
| DNA Polymerase and reaction buffer | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Cell culture media |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Chemical used to stop click reaction |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bacteria induction (1mM final concentration) |
| NdeI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriction enzyme |
| NHS-activated Texas Red | Life technologies | T6134 | Coupled to receptor |
| P- Nitrophenyl Phosphate | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkaline Phosphatase |
| p25N-hmBMP2 | -- | -- | Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| propargyl-L-lysine (Plk) | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel Purification |
| Qiagen PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR Purification |
| Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Chemical used for click reaction |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligation |
| tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Chemical used for click reaction |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon concentrating cell 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Concentrating unit |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck KGaA | UFC901024 | Concentrating centrifugal unit |
| ÄKTA avant FPLC | ÄKTA | -- | FPLC machine |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge for bacterial culture |
| Bacterial Shaking Incubator | Infors HT | Shaking incubator for bacterial culture | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | -- | Imaging and analysis system for SDS-PAGE |
| Fluorescent miscroscope | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3- (M) | Merck KGaA | 116882 | Ion Exchange Chromatography column material |
| Greiner CELLSTAR® 96 well plates | Sigma | M5811-40EA | 96 well plates for cell culture (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | -- | Centrifuge |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoScientific | 75003624 | Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining |
| Microcentrifuge - 5417R | Eppendorf | -- | Centrifuge |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | -- | software for stastic analysis of ALP assay data |
| Polysine Slides | ThermoScientific | 10143265 | microscope slides |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Tecan infinite M200 multiplate reader | Tecan Deutschland GmbH | -- | Multiplate reader for ALP assay |
| Thermocycler - Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | -- | PCR |
| TxRed - microscope filter | Keyence | Filter for fluorescent microscope | |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
References
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