Summary
Biomateriales dopados con hueso Morphogenetic Protein 2 (BMP2) se han utilizado como una nueva estrategia terapéutica para sanar fracturas sin unión. Para superar los efectos secundarios resultantes de una liberación incontrolable del factor, proponemos una nueva estrategia para sitio-directamente inmovilizar el factor, creando materiales con mayor capacidad osteogénica.
Abstract
Diferentes estrategias terapéuticas para el tratamiento de defectos de hueso largo no han sido investigados intensivamente. Actualmente se utiliza tratamientos presente varias limitaciones que han llevado a la utilización de biomateriales en combinación con factores de crecimiento osteogénicos, como proteínas morfogenéticas óseas (BMPs). Utilizado métodos de absorción o encapsulación requieren supra fisiológicas de BMP2, típicamente resultando en un efecto de liberación de supuesto estallido inicial que provoca efectos secundarios adversos severos varias. Una posible estrategia para resolver estos problemas sería acoplar covalentemente la proteína al andamio. Por otra parte, acoplamiento debe realizarse de manera específica con el fin de garantizar un resultado de producto reproducible. Por lo tanto, hemos creado una variante de BMP2, en el cual un aminoácido artificial (propargyl-L-lisina) fue introducido en la parte madura de la proteína de BMP2 por la expansión del uso de codon (BMP2-K3Plk). Bmp2-K3Plk fue junto a granos funcionalizados mediante cicloadición de azidas catalizada cobre-alquino (CuAAC). La actividad biológica de la juntada K3Plk de BMP2 fue demostrada en vitro y la actividad osteogénica de los granos de BMP2-K3Plk-functionalized fue probada en ensayos de células base. Los granos funcionalizados en contacto con las células C2C12 fueron capaces de inducir la expresión de fosfatasa alcalina (ALP) en proximidad local restringido del grano. Así, mediante esta técnica, se pueden producir andamios funcionalizados que pueden desencadenar la diferenciación celular hacia un linaje osteogénico. Además, dosis más bajas de BMP2 son suficientes debido a la orientación controlada de BMP2 acoplado dirigida. Con este método, BMPs están siempre expuestos a sus receptores en la superficie celular en la orientación apropiada, que no es el caso si los factores se juntan mediante técnicas de acoplamiento no-dirigida. El resultado del producto es altamente controlable y, por lo tanto, resultados en materiales con propiedades homogéneas, mejora su aplicabilidad para la reparación de tamaño crítico hueso defectos.
Introduction
El objetivo final de regeneración del tejido óseo ingeniería y hueso es superar las desventajas y limitaciones que se producen durante tratamientos comunes de fracturas sin unión. Auto o allo trasplantes se utilizan predominante como estrategias actuales de terapia, aunque ambos tienen varios inconvenientes. El injerto óseo ideal debe inducir osteogénesis osteoinduction como osteoconducción, llevando a la osteointegración del injerto en el hueso. Hoy en día, sólo auto-trasplante se considera como el "gold standard" ya que proporciona todas las características de un injerto óseo ideal. Por desgracia, también presenta aspectos negativos importantes, tales como tiempos de cirugía larga y un segundo sitio de trauma que generalmente conlleva más complicaciones (p. ej., dolor crónico, las formaciones de hematoma, infecciones, defectos cosméticos, etc.). Injertos alogénicos, por otro lado tienen características subóptimas para todos aspectos generales1. Tecnologías de injerto de hueso alternativos han mejorado en los últimos años, con el objetivo de producir andamios Osteoinductor, osteoconductive, biocompatible, y bioabsorbibles. Puesto que muchos biomateriales no muestran todas estas características osteogénicos, diferentes factores de crecimiento, principalmente BMP2 y BMP7, se han incorporado para mejorar el potencial osteogénico del andamio especial2.
Como un criterio esencial, tales sistemas de suministro de factor de crecimiento deberá proporcionar una versión de dosis controlada con el tiempo para facilitar las citas imprescindibles como el reclutamiento celular y accesorio, crecimiento celular y angiogénesis. Sin embargo, BMP así como otros factores de crecimiento osteogénicos han sido comúnmente inmovilizados no covalente3. Técnicas de colocación de trampas y adsorción requieren el uso de cantidades supra fisiológicas de proteína debido a un lanzamiento del estallido inicial, que conduce a graves desventajas en vivo, que afecta típicamente a los tejidos circundantes mediante la inducción de crecimiento excesivo de hueso, Osteólisis, la hinchazón y la inflamación4. Por lo tanto, la retención de factores de crecimiento en el sitio de entrega para períodos más largos de tiempo puede lograrse por métodos de inmovilización covalente. Modificar químicamente BMP2 (succinylated5, acetilado6 o biotinilado7), ingeniería de heterodímeros8o BMP2 oligopéptidos derivados9 han sido diseñados y utilizados para superar las limitaciones relacionadas con absorción. Sin embargo, la bio-actividad de estas construcciones no es predecible, ya que el arreglo potencialmente inhibe el atascamiento del ligand inmovilizado a los receptores celulares. Según lo demostrado previamente, es esencial que todas las cuatro cadenas de receptor implicadas en la formación de complejos ligando-receptor activado interactuarán con la BMP2 inmovilizados para activar completamente todo aguas abajo de cascadas de señalización10.
Para superar los problemas de un resultado de producto no homogéneo con limitaciones en términos de bioactividad, la estabilidad y biodisponibilidad del factor inmovilizado, se diseñó una variante BMP capaz de enlace covalente andamios de manera dirigida. Esta variante, denominada BMP2-K3Plk, incluye un aminoácido artificial que fue introducido por codón genético extensión11. Esta variante se ha relacionado con éxito con andamios utilizando una estrategia de acoplamiento covalente mientras que mantiene su actividad biológica.
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Protocol
1. producción de la variante de BMP2 BMP2-K3Plk
- Clonación de BMP2-K3Plk por mutagénesis sitio-dirigida mediante PCR 12
- Amplificar humana BMP2 maduros (hmBMP2) de un vector de p25N-hmBMP2 (véase Tabla de materiales) con un primer avance (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') y la introducción de un primer revés (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') (un codón) parada de ámbar De la etiqueta) en la posición de la lisina primera parte madura BMP2´s. Realizar la reacción de PCR usando 33.5 μl de H2O, 10 μl de la mezcla de reacción de PCR, 1.5 μl de solución stock de 10 μm dNTP, 1,5 μl del primer avance (10 pmol/μL), 1,5 μl de cebador reverso (10 pmol/μL), 1 μl de p25N-hmBMP2 (10 ng/μL) y 1 μl de ADN polimerasa (véase Tabla de materiales) en un termociclador (desnaturalización a 95 ° C por 5 min, 30 ciclos de desnaturalización a 95 ° C por 1 min, recocido a 60 ° C por 1 min., elongación a 72 ° C por 1 min y una extensión final a 72 ° C por 10 min).
- Purificar el producto PCR utilizando un kit comercial siguiendo las recomendaciones del fabricante (véase Tabla de materiales).
- Digerir el producto PCR con la enzima de restricción NdeI a 37 ° C por 45 min con 16 μl de H2O, 3 μl de tampón de digestión, 10 μl de ADN (20 ng/μL) y 1 μl de enzima de la restricción. Calor-inactivar la enzima a 65 ° C por 5 minutos digerir el producto PCR con la enzima de restricción BamHI a 37 ° C por 1 h con 16 μl de H2O, 3 μl de tampón de digestión, 10 μl de ADN (20 ng/μL) y 1 μl de enzima de la restricción. Enzima Inactive por calor a 80 ° C durante 5 minutos.
- Digerir el vector de pET11a-pyrtRNA con NdeI a 37 ° C por 2 h y 45 min con 16 μl de H2O, 3 μl de tampón de digestión, 10 μl de ADN (20 ng / μL) y 1 μl de enzima de la restricción. Inactive por calor a 65 ° C por 5 minutos digerir el vector de pET11a-pyrtRNA con BamHI a 37 ° C por 1 h con 16 μl de H2O, 3 μl de tampón de digestión, 10 μl de ADN (20 ng/μL) y 1 μl de enzima de la restricción. Inactive por calor a 80 ° C durante 5 minutos.
- Separar el vector digerido de vector no digerida y restos de la digestión por agarosa gel electroforesis (agarosa 0.8%, 60 min a 100 V). Ligar el inserto de BMP2 K3TAG digerido con columna vertebral digerido pET11a-pyrtRNA a temperatura ambiente (RT) por 2 h con 100 ng de columna vertebral pET11a pyrtRNA y 34.5 ng de BMP2-K3TAG inserto (relación molar de 1:3). La mezcla de reacción contiene la espina dorsal de la DNA y parte movible, 2 μl de buffer ligasa, 1 μl de ADN ligasa y H2O hasta un volumen total de 20 μl.
- Realizar una transformación conjunta de pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk y pSRF-dueto-pyrtRNAsynth en las bacterias BL21(DE3):
- Añadir 50 ng de cada plásmido a las bacterias, coloque la mezcla en hielo durante 30 minutos, el choque térmico a 42 ° C por 50 s, coloque en hielo por 5 min, agregar 500 μl de medio caldo de lisogenia (LB) en la mezcla y agite a 300 rpm por 60 min.
- Extensión 100 μl de la mezcla bacteriana en con kanamicina (50 μg/mL) / placas de ampicilina (100 μg/mL) e incubar toda la noche a 37 ° C.
- Expresión y purificación de BMP2-K3Plk 13 , 14
- Propagar una colonia solo durante la noche en 50 mL de medio LB con 50 μg/mL de kanamicina y 100 μg/mL de ampicilina a 37 ° C.
- Diluir una noche culturas 1:20 en 800 mL de medio de caldo buenísimo (TB) suplementado con 50 μg/mL de kanamicina y 100 μg/mL de ampicilina y crecen a 37 ° C hasta que se alcance un OD600 de 0,7. Añadir propargyl-L-lisina a una concentración final de 10 mM. Recoger un 100 μl de muestra de la cultura antes de la inducción de Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG).
- Inducen la expresión de genes mediante la adición de IPTG para una concentración final de 1 mM. Crece el cultivo a 37 ° C por 16 h en un agitador orbital a 180 rpm. Recoge una muestra de 100 μl de la cultura.
- Centrifugue la cultura todo a 9000 x g durante 30 minutos, descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado bacteriano en 30 mL de tampón TBSE (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM ácido de etilendiaminotetracético (EDTA)) con 1: 1000 (v/v) 2-Mercaptoetanol (recientemente agregado).
PRECAUCIÓN: Manipule el 2-Mercaptoetanol en la campana. Evite el contacto con la piel y ojos. Evitar la inhalación de vapor o de niebla. Realice todos los pasos de resuspensión con buffers que contienen 2-Mercaptoetanol en la campana. - Pesar un vaso de precipitados vacío centrífuga y transferir el sedimento resuspendido en el vaso vacío. Centrifugue a 6.360 x g durante 20 min, descartar el sobrenadante y pesar el vaso con el precipitado. Reste el peso del vaso vacío para calcular el peso del precipitado.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. Congelar la pelotilla a-20 ° C a corto plazo o a-80 ° C en el largo plazo. Al reasumir el protocolo, descongelar la pelotilla a TA. - Resuspender el precipitado en tampón STE (10 mM de Tris pH 8,0; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, sacarosa 375 mM; 1: 1000 (v/v) 2-Mercaptoetanol (recientemente agregado)). Utilizar 200 mL de tampón de STE por cada 10 g de pellets.
- Someter a ultrasonidos la suspensión en el hielo (10 minutos con 40 pulso s 20 freno s, amplitud y 30%). Centrifugue a 6.360 x g durante 20 min, descartar el sobrenadante y pese el precipitado. Repita los pasos de sonicación y centrifugación 4 veces.
- Resuspender el precipitado en 100 mL de tampón TBS (10 mM Tris, 150 mM NaCl). Centrifugue a 6.360 x g durante 20 min, descartar el sobrenadante y pesar pellets.
- Resuspender el precipitado en tampón de nucleasa (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl2) con el recién agregado nucleasa U/mL 80 (p. ej., Benzonase) utilizando 10 mL/g de pellets. Incubar la suspensión durante la noche a temperatura ambiente en una placa de agitación (30 rpm).
- Agregar buffer Tritón (60 mM EDTA, 1,5 M de NaCl, 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) fenil-polietilenglicol) a la suspensión. El volumen de buffer Tritón añadir corresponde a una parte de volumen 0,5 de la suspensión. Incubar por 10 min a temperatura ambiente (sin revolver). Centrifugue a 6.360 x g durante 20 min, descartar el sobrenadante y pese el precipitado.
- Resuspender el precipitado en tampón TE (100 mM Tris, 20 mM EDTA) utilizando 8 mL/g de pellets. Centrifugue a 6.360 x g durante 20 min, descartar el sobrenadante y pese el precipitado.
- Resuspender el precipitado mediante la adición de 4 mL/g de 25 mM de NaAc de pH 5.0 y 5 mL/g de 6 M GuCl con 1 mM Ditiotreitol (DTT) (recientemente agregado). Incubar la suspensión durante la noche a 4 ° C sobre una placa de agitación (30 rpm).
- Centrifugue a 75.500 x g por 20 min. El sobrenadante contiene ahora la proteína monomérica desplegada de BMP2. Recoger el sobrenadante y concentrado este extracto a OD 20/mL usando una membrana de corte (MWCO) de peso molecular de 3 kDa en una concentración de la célula (véase Tabla de materiales).
- Añadir los monómeros concentrados en gotas solo al buffer de renaturalización (2 M 2 m m LiCl, 50 mM Tris, caps de 25 mM, 5 mM EDTA, disulfuro de glutatión de 1 mM (GSSG), glutatión (GSH)) agitando (30 rpm). Incubar a temperatura ambiente durante 120 h en la oscuridad.
Nota: Durante este período de incubación, refolding occours. La solución de este paso adelante contiene la dimérica doblado BMP2-K3Plk. - Ajustar el pH de la solución a 3.0 mediante concentrado HCl. Dialyze la solución contra 1 mM HCl. concentrado de la solución de dializado con una membrana de corte (MWCO) de peso molecular de 10 kDa en una celda de concentración.
- Equilibre la solución mediante la adición de tampón un (20 mM NaAc, isopropanol al 30%). Añadir un volumen de buffer A correspondiente a un 30% del volumen de la solución. Centrifugue la solución a 4700 x g durante 15 minutos.
- Equilibrar la columna de intercambio iónico en una proteína rápida cromatografía líquida (FPLC) sistema15 con 150 mL de tampón de carga de A. la solución de la proteína en la columna de equilibrado. Eluir fracciones utilizando un gradiente lineal de tampón B (20 mM NaAc, 30% de isopropanol, 2 M de NaCl) con 100 mL de fracciones de tampón B. recolectar 2 mL.
Nota: Concentrar la proteína antes de la carga a la columna según el volumen de la columna total. El volumen final de la proteína debe ser < 5% del volumen total de la columna. - Análisis de 20 μl de cada fracción por gel (12%) de poliacrilamida SDS electroforesis (SDS-PAGE) 16 y la coloración azul brillante de Coomassie17 (véase Tabla de materiales).
Nota: El azul brillante de Coomassie había manchado SDS-PAGE gel muestra fracciones con fracciones que contienen monómeros (13 kDa) y dímeros (26 kDa). - Fracciones que contienen el dímero de la piscina. Dializan la piscina de dímeros que contienen fracciones durante la noche a 4 ° C contra 1 mM HCl (volumen de 5 litros). Concentrar el producto final utilizando un 10 kDa concentración unidad filtro centrífugo (véase Tabla de materiales). Analizar el producto final por electroforesis del gel de poliacrilamida (12%) de SDS (SDS-PAGE) y la coloración azul brillante de Coomassie.
Nota: La banda en el azul brillante de Coomassie manchado SDS-PAGE gel debe mostrar solamente una venda de 26 kDa. Este es el producto final de BMP2-K3Plk.
2. optimización de cobre (I)-catalizado alquino-azida cicloadición (CuAAC) condiciones
- Efecto del ascorbato de sodio (fiesta) y cobre (II) sulfato (CuSO 4 ) en el tipo salvaje BMP2 (BMP2-WT)
- Incubar 20 μm BMP2-WT con diversos cocientes de la fiesta a CuSO4. Utilice fiesta de 0,5 mM y 0,5 mM CuSO4 (a partir de concentración) en un volumen de 50 μl. Continúe con los siguientes cocientes de fiesta con CuSO4: (1:1), (1.7: 1), (10:1), (20: 1), manteniendo constante la concentración de CuSO4 0,5 mM y ajustar en consecuencia la concentración de la fiesta. Realizar la reacción de H2O en un mezclador rotatorio (20 rpm) durante la noche a TA.
- Preparar muestras reducidas mediante la adición de tampón de carga que contiene 5% 2-Mercaptoetanol e incubar muestra a 95 ° C por 6 minutos analizar reducido y no reducidas muestras de poliacrilamida SDS del gel electroforesis (SDS-PAGE) de la (12%) y la coloración azul brillante de Coomassie. El Coomasie tinción de geles de SDS-PAGE muestran bandas en el rango de 13 kDa (condiciones reducidas) y 26 kDa peso molecular más alto (condiciones no-reducido).
-
Efecto de la Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) amina (THPTA) en la reacción de CuAAC
- Incubar 20 μm BMP2-K3Plk con diferentes proporciones de THPTA a CuSO4. Utilice 5 mM fiesta y 200 μm 3-Azido-7-hidroxicumarina (mantener constante fiesta y 3-Azido-7-hidroxicumarina). Utilizar 50 μm THPTA y 0.5m m de CuSO4 como las concentraciones de partida. Utilizar diferentes proporciones de THPTA a CuSO4: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). realizar reacción en H2O (volumen total de 50 μL) durante 24 h a temperatura ambiente en un mezclador rotatorio (20 rpm).
- A acoplamiento, 3-Azido-7-hidroxicumarina se convierte en un colorante fluorescente. Preparar las muestras en condiciones reducidas y no reducidas y analizarlos por SDS-PAGE. Visualizar el gel bajo el canal de excitación con la longitud de onda específica para el 3-Azido-7-hidroxicumarina (λabs = 404 nm; λem = 477 nm).
3. covalente acoplamiento técnica de BMP2-K3Plk a azida funcionalizados perlas de agarosa
- Incubar a 20 μm de BMP2-K3Plk o BMP2-WT (utilizado como control negativo) con 20 μl de agarosa de azida-activado granos en un volumen total de 500 μl de buffer de reacción (0.1 M HEPES pH 7.0, 3,9 M de urea, 50 μm CuSO4, 250 μm THPTA, ascorbato de sodio 5 mM) por 2 h a RT en una rotati mezclador de NG (20 rpm). Detener la reacción agregando 5 mM EDTA (concentración final).
- Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos en un mezclador rotatorio (20 rpm). Centrifugar las muestras a 20.000 x g durante 1 min a recoger a RT. los sobrenadantes.
- Lavar el precipitado que contiene los granos tres veces con 1000 μl de tampón de500 HBS 50 mM HEPES, 500 mM (NaCl), tres veces con 1000 μl de 4 M de MgCl2y dos veces con 1000 μl de tampón fosfato salino (PBS). En todo paso de lavar, centrifugar a 20.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y recoger sobrenadante. Almacenar granos acoplados en 1000 μl de PBS a 4 ° C.
PRECAUCIÓN: No toque la pelotilla del grano mientras se retira el sobrenadante.
4. validación de la presencia y la actividad biológica del rojo de Texas utilizando BMP2 inmovilizados-K3Plk etiquetado Receptor BMP I un ectodominio (BMPR-IA CE )
- Incubar en 50 μl de los granos de BMP2-K3Plk funcionalizados con 1 μm de Texas Red etiquetado BMPR-IACE con 150 μL de tampón de500 HBS (50 mM HEPES, 500 mM NaCl) a temperatura ambiente durante 1 hora en un mezclador rotatorio (20 rpm).
- Centrifugue los granos a 20.000 x g durante 1 min a RT. descartar el sobrenadante. Lavar los granos con 1000 μl de tampón de500 HBS. Repetir el lavado adicionales 3 veces. Centrífuga a 20.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente después de cada lavado el paso.
- Suspender los granos en 500 μl de PBS y pipetee 50 μL en un portaobjeto de cubierta. Establecer el filtro de microscopio entre 561 ó 594 nm. Detectar Texas rojo – BMPR-IACE-BMP2-K3Plk funcionalizados granos utilizando fluorescentes microscopia y tomar fotos.
5. medición de la fosfatasa alcalina (ALP) expresión para demostrar la bioactividad In Vitro de BMP2 K3Plk producidos antes y después de la reacción de acoplamiento.
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Ensayo de la fosfatasa alcalina (ALP)
- La cultura células C2C12 de promyoblastic (ATCC CRL-172) en medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) con 10% Suero Fetal de ternero (FCS), 100 U/mL de penicilina G y estreptomicina 100 μg/mL a 37 ° C en una atmósfera humidificada al 5% CO2.
- Semilla de células C2C12 a una densidad de 3 x 104 células/pozo en una microplaca de 96 pozos. Dejar que las células fije durante la noche. Retire el medio e incubar las células C2C12 en presencia de 0.5-200 nM de BMP2-WT o BMP2-K3Plk de 100 μL/pocillo de DMEM (2% FCS, 100 U/mL de penicilina G y estreptomicina 100 de μg/mL) a 37 ° C en un ambiente humidificado en 5% CO2 para 72 h.
- Medio de quitar y lavar las células con 100 μl de PBS por pozo. Lyse las células a temperatura ambiente durante 1 hora con 100 μL/pocillo del tampón de lisis (1% NP-40, glicina de 0.1 M, pH 9.6, 1 mM MgCl2, vivencias de 1 mM2) en una sacudida de la placa (220 rpm).
- Añadir 100 μL/pocillo del tampón de ALP (glicina de 0.1 M, pH 9.6, 1 mM MgCl2, 1 mM vivencias2) con 1 mg/mL p-nitrophenylphosphate (recientemente agregado) a la celda lisada.
- Medir la absorción a 405 nm en un lector multiplate después de añadir el buffer ALP y cada 5 min hasta que se complete el desarrollo del color. Generar curvas de dosis respuesta y valores de la CE50 utilizando un modelo logístico y = A2 + (A1-A2) / (1 + (x/x0)p).
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Tinción de fosfatasa alcalina (ALP)
- La cultura células C2C12 de promyoblastic (ATCC CRL-172) en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) con 10% Suero Fetal de ternero (FCS), 100 U/mL de penicilina G y estreptomicina 100 μg/mL a 37 ° C en una atmósfera humidificada al 5% CO2.
- Semilla de células C2C12 a una densidad de 3 x 104 células/pozo en una microplaca de 96 pozos. Dejar que las células fije durante la noche. Quite el medio y añadir 20 μL/pocillo de BMP2-K3Plk juntado granos. Bmp2-K3Plk juntada son en 1000 μl de una suspensión de la PBS.
- Preparar una solución de agarosa de bajo punto de fusión de 0.4% en DMEM. Derretir en el microondas (600 W durante 3 minutos) y deje que se enfríe en un baño de agua a 37 ° C hasta su uso.
- Añadir 20 μl de agarosa de bajo punto de fusión de 0.4% en cada pozo (cubierta de los granos y las células). Centrifugar a 2000 x g durante 5 minutos a 20 ° C. Añadir 80 μl de DMEM (2% FCS, 100 U/mL de penicilina G y 100 μg/mL estreptomicina) e incube a 37 ° C en un ambiente humidificado en 5% CO2 para 72 h.
- Retire el medio, teniendo cuidado de no separar la agarosa solidificada de 0,4%. Añadir 100 μL/pocillo de NBT 1 paso/solución de sustrato BCIP (cloruro de tetrazolio Nitro azul, sal de 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidina).
- Análisis de fosfatasa alcalina que manchaba usando microscopia ligera inmediatamente después de la coloración púrpura se convierte en evidente. Uso de microscopía de campo brillante y tomar fotografías.
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Representative Results
En este artículo, se describe un método para acoplar covalentemente una nueva variante de BMP2, BMP2-K3Plk, a azida comercialmente disponible funcionalizada perlas de agarosa (figura 1). Se validó la bioactividad de la variante de BMP2-K3Plk producida por la inducción de la expresión génica de la fosfatasa alcalina (ALP) en células C2C12. El ensayo in vitro muestra niveles similares de expresión de ALP inducidos por el tipo de salvaje BMP2 (BMP2-WT) y BMP2-K3Plk (figura 2).
Las reacciones redox entre el cobre (II) sulfato (CuSO4) y ascorbato de sodio (fiesta) generan especies reactivas de oxígeno que pueden afectar la integridad estructural y así afectar la bioactividad de BMP2-K3Plk. Para comprobar la integridad estructural de la proteína, se realizó una incubación durante la noche y fiesta, mostrando la degradación BMP2-WT en una manera dependiente de la concentración (visualizada por SDS-PAGE bajo condiciones reducidas (Figura 3A1 CuSO4 )) y la formación de Multímeros o agregados visibles en aproximadamente 40 kDa (condiciones no reducidas) (Figura 3A2). Para evitar la degradación de las proteínas, Tris (3-hydroxypropyltriazolyl-metil) amino (THPTA) fue utilizado como un agente protector (figura 3B). El uso de THPTA evita fragmentación BMP2, mientras que la formación de estructuras de peso molecular más alto no podría prevenirse mediante la adición de THPTA. Otras mejoras de la reacción abordaron la composición del buffer de reacción y la temperatura de reacción, tiempo de reacción (datos no mostrados). El protocolo había descrito aquí detalles los logros finales en cuanto a la composición del tampón de reacción, temperatura y tiempo de reacción.
Para confirmar que BMP2-K3Plk conserva bioactividad después de acoplamiento, utilizamos receptores fluorescencia etiquetada ectodominio proteína del tipo receptor (BMPR-IACE) para demostrar que la proteína inmovilizada es todavía capaz de enlazar a este receptor. Los granos recubiertos con BMP2-K3Plk vía química CuAAC rindió fluorescencia cuando se incuban con el marcado tinte BMPR-IACE (figura 4). En contraste, sin revestimiento granos o granos que se incubaron con BMP2-WT no demostrada ninguna fluorescencia señal sobre fondo niveles (datos no mostrados)14.
Después de confirmar la capacidad de enlace del receptor del ligando inmovilizado en vitro, también Probamos si respuestas biológicas pueden ser desencadenadas por los granos funcionalizados en un análisis basado en la célula. ALP mediada por la coloración se produjo sólo en aquellas células que estaban en contacto directo con los granos de BMP2-K3Plk-funcionalizados (figura 5). Esto confirma que la proteína es de hecho covalentemente ligado a las cuentas y no sólo absorbe, puesto que una tinción más spread out en distancias más grandes a las cuentas de lo contrario habría observada.
Figura 1: representación de BMP2-K3Plk. (A) Representación de la variante de BMP2-K3Plk con la localización de la substitución del aminoácido introducido. (B) esquema de acoplamiento: reacción CuAAC BMP2-K3Plk con azida funcionalizados granos. Reimpreso (adaptado) con permiso de Tabisz et al. (2017): inmovilización dirigida de BMP-2: dos enfoques para la producción de andamios innovador Osteoinductor. Biomacromoléculas. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: bioactividad de variantes de BMP2. Comparación de las bioactividades (ensayo de fosfatasa alcalina) de BMP2-K3Plk y wildtype BMP2 (BMP2-WT). El eje x representa la concentración de BMP2-WT o BMP2-K3Plk utilizado en el ensayo. Los datos de EC50 representan valores medios y desviaciones estándar de 4 experimentos individuales (N = 4). Reimpreso (adaptado) con permiso de Tabisz et al. (2017): inmovilización dirigida de BMP-2: dos enfoques para la producción de andamios innovador Osteoinductor. Biomacromoléculas. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: efecto del agente de reducción en la integridad de la BMP2. (A) BMP2-WT fue expuesta a diferentes relaciones molares de ascorbato de sodio (fiesta) a cobre (II) sulfato (CuSO4). Las muestras fueron analizadas por SDS-PAGE y la coloración azul brillante de Coomassie en condiciones no-reducido (Figura A2) y reducida (Figura A1). En las condiciones de reducción (A1), las flechas rojas representan exfoliado BMP2-WT. En las condiciones no-reducido (A2), las flechas rojas indican multimérica BMP2-WT. Las bandas que representan especies de BMP2 exfoliadas se indican con una flecha azul. Leyenda: NCR - reducido BMP2-WT sin tratamiento; NC - BMP2-WT sin tratamiento; relaciones molares 1:1 20:1-aumento de ascorbato de sodio a CuSO4. (B) K3Plk de BMP2 fue juntado a 3-Azido-7-hidroxicumarina CuAAC condiciones de reacción con THPTA. A acoplamiento 3-Azido-7-hidroxicumarina se convierte en un colorante fluorescente. Leyenda: NC - BMP2-WT reaccionó con 3-Azido-7-hidroxicumarina; 7:1 a 20:1 aumento de relaciones molares de THPTA a CuSO4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: bioactividad de BMP2 inmovilizados-K3Plk in vitro. Cuadro representativo de la interacción del inmovilizado K3Plk de BMP2 con marcado con rojo Texas BMPR-IAEC. Reimpreso (adaptado) con permiso de Tabisz et al. (2017): inmovilización dirigida de BMP-2: dos enfoques para la producción de andamios innovador Osteoinductor. Biomacromoléculas. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: bioactividad de BMP2-K3Plk inmovilizada en un análisis basado en la célula. (A) cuadro representativo de la fosfatasa alcalina (ALP) manchas sobre el tratamiento con perlas junto a granos de BMP2-K3Plk funcionalizados. (B) fosfatasa alcalina (ALP) manchas sobre el tratamiento con soluble 25 nM BMP2-K3Plk. reimpreso (adaptado) con permiso de Tabisz et al. (2017): inmovilización dirigida de BMP-2: dos enfoques para la producción de andamios innovador Osteoinductor. Biomacromoléculas. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Generar variantes de la proteína etiquetado por expansión del codón genético permite la introducción de varios análogos de aminoácidos no naturales principalmente en cualquier posición de la secuencia primaria. En el caso de BMPs como BMP2, común clave como una etiqueta 6-histidina (su) sólo puede ser introducida N-terminal, puesto que el final de protein´s C-terminal se entierra dentro de la estructura terciaria de la proteína y por lo tanto no es accesible desde el exterior. En otras posiciones, el tamaño de la etiqueta introducida muy probablemente puede causar alteraciones estructurales que, en consecuencia, destruye la bioactividad de BMP´s. Además, introducir una mutación en la secuencia de BMP2 puede afectar la eficacia de repliegue y también puede cambiar otros parámetros de proteína tales como punto isoeléctrico de la proteína modificada. Así, cada paso en un protocolo de producción de proteína establecido deba ser adaptado según las características de variant´s de la proteína alterada. La producción de BMP2-K3Plk hecho necesaria una modificación del método establecido para la expresión de tipo salvaje BMP2. Cultura diferentes tiempos o concentraciones de propargyl-L-lisina (Plk) fueron probados (datos no mostrados) para alcanzar el rendimiento más alto de expresión. Refolding, pasos de separación y purificación afortunadamente no requería de más adaptaciones. Ya hemos informado que en el caso de otras variantes de BMP2 producidos en nuestro laboratorio, algunas características de la proteína fueron alterados significativamente, que requirió la modificación de varios pasos de la producción de BMP método18. La producción de BMP2-K3Plk demostró actividad biológica comparable a la de la proteína de tipo salvaje. Una diferencia se produce en altas concentraciones de BMP2, probablemente como consecuencia de una menor solubilidad de la variante K3Plk de BMP2 en medio comparada con la de tipo salvaje BMP2.
A pesar de las ventajas conocidas de cobre-catalizada de azida-alquino cicloadición (CuAAC)19, CuAAC reacciones deben ser cuidadosamente adaptadas a aplicaciones específicas. Mostramos cómo BMP2 puede ser fragmentado o crear agregados o Multímeros debido a las fuertes condiciones de reacción reductora. Así, todos los parámetros de reacción tuvieron que ser analizados en detalle para encontrar las condiciones que la proteína afectada.
Nuestro enfoque para acoplar covalentemente la variante BMP2 a perlas de agarosa azida funcionalizados por química del tecleo podría realizarse con eficiencia, dando como resultado granos funcionalizados de activación Diferenciación osteogénica en vitro. Cuando la proteína de tipo salvaje BMP2 fue utilizada en la reacción con los granos en su lugar, pudimos observar sólo débil tinción de la expresión de fosfatasa alcalina, lo que indica que acoplamiento hecho ocurrió muy específicamente por el residuo de propargyl-L-lysin de BMP2-K3Plk.
Esta especificidad posicional acoplamiento refleja una gran mejora en comparación con los procedimientos inmovilización química clásica de NHS/EDC. En tales casos, se produce acoplamiento al azar, principalmente con los grupos de amina primaria presentes en residuos de lisina. La proteína de acoplamiento tiene una variable actividad osteogénica, debido a la multiplicidad de conexiones posibles para el andamio, a orientaciones diferentes de la proteína hacia receptores de las células.
La utilización de BMP2 inmovilizados sitio directa podría superar los inconvenientes mencionados, relacionadas con las elevadas dosis de BMP2 solubles, que son necesarias para inducir la formación de hueso. Además, los resultados muestran claramente que ciertas respuestas celulares, tales como la diferenciación osteogénica de células C2C12, totalmente iniciada por BMP2 inmovilizados, a pesar de recientes estudios que esa señal transducción requiere endocitosis de la complejo ligando-receptor/ligando20,21. Nuestros resultados concuerdan con otros estudios que demuestran que las BMP2, que está unida covalentemente (pero no dirigida) a las superficies no endocytosable, es todavía capaz de inducir la diferenciación de osteoblastos22.
Teniendo en cuenta que hemos utilizado concentraciones supra fisiológicas de BMP2 para la reacción de acoplamiento, la cantidad de BMP2 inmovilizados se podría reducirse más todavía conservando las propiedades osteogénicos de los granos. Antes de las medidas de optimización, sin embargo, el andamio BMP2-K3Plk-functionalized necesita probarse en experimentos con animales para probar su potencial osteogénico en vivo.
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Disclosures
Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Dr. M. Rubini (Konstanz, Alemania) para proporcionar el plásmido codificación pyrrolysyl-tRNA y para proporcionar pRSFduet-pyrtRNAsynth codificación el correspondiente aminoacil-tRNA sintetasa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1-Step NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Add solution to cells |
| 3-Azido-7-hydroxycoumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Chemical used for click reaction |
| Agarose low melting point | Biozym | 840101 | Agarose for ALP assay |
| Azide agarose beads | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Beads used for reaction |
| BamHI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriction enzyme |
| BMP receptor IA (BMPR-IAEC) | -- | -- | Produced in our lab |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE |
| Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Chemical used for click reaction |
| DNA Polymerase and reaction buffer | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Cell culture media |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Chemical used to stop click reaction |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bacteria induction (1mM final concentration) |
| NdeI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriction enzyme |
| NHS-activated Texas Red | Life technologies | T6134 | Coupled to receptor |
| P- Nitrophenyl Phosphate | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkaline Phosphatase |
| p25N-hmBMP2 | -- | -- | Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| propargyl-L-lysine (Plk) | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel Purification |
| Qiagen PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR Purification |
| Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Chemical used for click reaction |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligation |
| tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Chemical used for click reaction |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon concentrating cell 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Concentrating unit |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck KGaA | UFC901024 | Concentrating centrifugal unit |
| ÄKTA avant FPLC | ÄKTA | -- | FPLC machine |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge for bacterial culture |
| Bacterial Shaking Incubator | Infors HT | Shaking incubator for bacterial culture | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | -- | Imaging and analysis system for SDS-PAGE |
| Fluorescent miscroscope | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3- (M) | Merck KGaA | 116882 | Ion Exchange Chromatography column material |
| Greiner CELLSTAR® 96 well plates | Sigma | M5811-40EA | 96 well plates for cell culture (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | -- | Centrifuge |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoScientific | 75003624 | Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining |
| Microcentrifuge - 5417R | Eppendorf | -- | Centrifuge |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | -- | software for stastic analysis of ALP assay data |
| Polysine Slides | ThermoScientific | 10143265 | microscope slides |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Tecan infinite M200 multiplate reader | Tecan Deutschland GmbH | -- | Multiplate reader for ALP assay |
| Thermocycler - Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | -- | PCR |
| TxRed - microscope filter | Keyence | Filter for fluorescent microscope | |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
References
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