Summary
Biomaterial dopade med Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) har använts som en ny terapeutisk strategi för att läka oläkta frakturer. För att övervinna biverkningar som följd av en okontrollerbar release av faktorn, föreslår vi en ny strategi för att webbplats-direkt immobilisera den faktorn, vilket skapar material med förbättrad osteogent kapacitet.
Abstract
Olika terapeutiska strategier för behandling av icke-läkande rörben defekter har undersökts intensivt. För närvarande används behandlingar finns flera begränsningar som har lett till användning av biomaterial i kombination med osteogent tillväxt faktorer, såsom ben morphogenetic proteiner (bmp). Vanligen används absorption eller inkapsling metoder kräver suprafysiologiska mängder BMP2, vanligtvis resulterar i en effekt av så kallade inledande burst-release som provocerar flera allvarliga negativa biverkningar. En möjlig strategi för att övervinna dessa problem vore att kovalent proteinet till schavotten. Dessutom bör koppling utföras på platsspecifika sätt för att garantera en reproducerbar produkt resultatet. Därför skapade vi en BMP2 variant, där en konstgjord aminosyra (propargyl-L-lysin) infördes i den äldre delen av proteinet BMP2 av kodon användning expansion (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk kopplades till functionalized pärlor via koppar katalyseras natriumazid-alkynen cykloadditionen (CuAAC). Den biologiska aktiviteten av de kopplade BMP2-K3Plk bevisades in vitro- och osteogent aktiviteten av BMP2-K3Plk-functionalized pärlor bevisades i cellbaserade analyser. Functionalized pärlorna i kontakt med C2C12 celler skulle kunna framkalla alkaliskt fosfatas (ALP) uttryck i lokalt begränsad närhet av kornet. Således av denna teknik, functionalized ställningar kan produceras som kan utlösa celldifferentiering mot ett osteogent härstamning. Dessutom är lägre BMP2 doser tillräcklig på grund av webbplats-regisserad kopplat BMP2 kontrollerade orientering. Med den här metoden utsätts BMPs alltid deras receptorer på cellytan i lämplig orientering, vilket inte är fallet om faktorerna som är kopplade via icke-plats-riktade koppling tekniker. Produkt resultatet är mycket kontrollerbar och, således, resultat i material med homogena egenskaper, förbättra deras tillämplighet för reparation av kritisk storlek ben defekter.
Introduction
Det yttersta målet för ben vävnadsregeneration engineering och ben är att övervinna de nackdelar och begränsningar som inträffar under vanliga behandlingar av oläkta frakturer. Auto - eller allo-transplantationer används huvudsakligen som nuvarande terapi strategier, även om de båda har flera nackdelar. Den idealiska bentransplantation bör föranleda osteogenesis av såväl osteoinduction som osteoconduction, leder till osteointegration av transplantat i benet. Numera är bara auto-transplantation ansett som ”gold standard” eftersom det ger alla kännetecken för en idealisk bentransplantat. Tyvärr, det ger också viktiga negativa aspekter, såsom långa kirurgi gånger, och en andra trauma webbplats som vanligtvis innebär fler komplikationer (t.ex., kronisk smärta, hematom formationer, infektioner, kosmetiska defekter, etc.). Prövningar ympkvistar, har å andra sidan suboptimala egenskaper för alla allmänna aspekter1. Alternativa ben graft teknik har förbättrats under de senaste åren, i syfte att producera ställningar som är osteoinduktiv, osteokonduktivt, biokompatibla, och bioresorbable. Eftersom många biomaterial inte visar alla dessa osteogent egenskaper, har olika tillväxtfaktorer, främst BMP2 och BMP7, upptagits för att förbättra osteogent potentialen i den särskilda ställning2.
Som ett viktigt kriterium, bör sådana tillväxtfaktor leveranssystem ge en kontrollerad dos frisättning över tiden för att underlätta de väsentliga händelserna såsom cell rekrytering och fastsättning, cell inväxt och angiogenes. Dock orörlig BMPs, liksom andra osteogent tillväxtfaktorer har varit allmänt icke-kovalent3. Adsorption och klämskador tekniker kräver användning av suprafysiologiska mängder protein på grund av en inledande burst release, vilket leder till allvarliga nackdelar in vivo som vanligtvis påverkar omgivande vävnader genom att inducera ben överväxt, osteolys, svullnad och inflammation4. Således, lagring av tillväxtfaktorer på webbplatsen leverans under längre tidsperioder kan uppnås genom kovalent immobilisering metoder. Kemiskt modifierade BMP2 (succinylated5, acetylerade6 eller biotinylerade7), konstruerad heterodimerer8eller BMP2 härledda oligopeptider9 har utformats och används för att övervinna begränsningarna som avser absorptionen. Bio-aktiviteten i dessa konstruktioner är dock inte förutsägbar eftersom arrangemanget potentiellt hämmar bindningen av immobiliserade liganden till cellulära receptorer. Som tidigare visad är det viktigt att alla fyra receptor kedjor inblandade i bildandet av aktiverade ligand-receptor komplex samverkar med den immobiliserade BMP2 för att fullt ut aktivera alla nedströms signalering cascades10.
För att övervinna problemen med en inhomogena produkt resultatet med begränsningar när det gäller bioaktivitet, stabilitet och biotillgängligheten av immobiliserade faktorn, utformade vi en BMP variant kan kovalent bindning ställningar på ett sätt som webbplats-regi. Denna variant, som kallas BMP2-K3Plk, består av en konstgjord aminosyra som infördes genom genetiska kodon expansion11. Denna variant har varit framgångsrikt kopplade till ställningar med en kovalent kopplingen strategi samtidigt som dess biologiska aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. produktion av den BMP2 Variant BMP2-K3Plk
- Kloning av-BMP2-K3Plk av webbplats riktad mutagenes med PCR 12
- Förstärka människors mogen BMP2 (hmBMP2) från en p25N-hmBMP2 vector (se Tabell för material) med en forward primer (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') och en omvänd primer (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') införa en bärnstensfärgad stop kodon ( TAGGA) på positionen för den första lysin BMP2´s mogen del. Utför PCR-reaktionen med 33,5 µL av H2O, 10 µL av PCR-reaktionsblandning, 1,5 µL 10 µM dNTP stamlösning, 1,5 µL av forward primer (10 pmol/µL), 1,5 µL av reverse primer (10 pmol/µL), 1 µL av p25N-hmBMP2 (10 ng/µL) , och 1 µL av DNA-polymeras (se Tabell för material) i en termocykel (denaturering vid 95 ° C i 5 min, 30 cykler av denaturering vid 95 ° C i 1 min, glödgning vid 60 ° C i 1 min, töjning vid 72 ° C i 1 min och en sista förlängning vid 72 ° C i ca 10 min).
- Rena PCR-produkten med hjälp av en kommersiellt tillgänglig kit efter tillverkarens rekommendationer (se Tabell för material).
- Smälta PCR-produkten med enzymet begränsning NdeI vid 37 ° C i 45 min med 16 µL av H2O, 3 µL av matsmältningen buffert, 10 µL av DNA (20 ng/µL), och 1 µL restriktionsenzym. Värme-inaktivera enzymet vid 65 ° C för 5 min. smälta PCR-produkten med enzymet begränsning BamHI vid 37 ° C för 1 h med 16 µL av H2O, 3 µL av matsmältningen buffert, 10 µL av DNA (20 ng/µL), och 1 µL restriktionsenzym. Värme-inaktivera enzym vid 80 ° C i 5 min.
- Smälta pET11a-pyrtRNA vektorn med NdeI vid 37 ° C i 2 h och 45 min med 16 µL av H2O, 3 µL av matsmältningen buffert, 10 µL av DNA (20 ng / µL), och 1 µL restriktionsenzym. Värme-inaktivera vid 65 ° C för 5 min. smälta pET11a-pyrtRNA vektorn med BamHI vid 37 ° C för 1 h med 16 µL av H2O, 3 µL av matsmältningen buffert, 10 µL av DNA (20 ng/µL), och 1 µL restriktionsenzym. Värme-inaktivera vid 80 ° C i 5 min.
- Separata smält vektorn från osmält vector och matsmältningen resterna av agaros gel elektrofores (0,8% agaros, 60 min vid 100 V). Ligera smält BMP2-K3TAG skäret med smält pET11a-pyrtRNA ryggrad vid rumstemperatur (RT) för 2 h med 100 ng pET11a-pyrtRNA ryggrad och 34,5 ng av BMP2-K3TAG Infoga (1:3 molar förhållandet). Reaktionsblandningen innehåller DNA ryggraden och infoga, 2 µL av ligase buffert, 1 µL av DNA-ligase och H2O till en total volym på 20 µL.
- Utföra en samtidig omvandling av pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk och pSRF-duett-pyrtRNAsynth i BL21(DE3) bakterier:
- Tillsätt 50 ng av varje plasmid till bakterier, placera blandningen på is för 30 min, värme chock vid 42 ° C för 50 s, placera på is för 5 min, tillsätt 500 µL av Lysogeny buljong (LB) medium i blandningen och skaka vid 300 rpm för 60 min.
- Sprida 100 µL av bakteriell blandningen på förhand värmde kanamycin (50 µg/mL) / ampicillin (100 µg/mL) plattor, och inkubera över natten vid 37 ° C.
- Uttryck och rening av BMP2-K3Plk 13 , 14
- Sprida en enda koloni övernattning i 50 mL LB medium med 50 µg/mL kanamycin och 100 µg/mL ampicillin vid 37 ° C.
- Späd övernattning kulturer 1:20 till 800 mL Terrific buljong (TB) medium kompletteras med 50 µg/mL kanamycin och 100 µg/mL ampicillin och växa vid 37 ° C tills en OD600 av 0,7 nås. Lägg till propargyl-L-lysin till en slutlig koncentration på 10 mM. Samla 100 µL prov från kulturen innan isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induktion.
- Inducera genuttryck genom tillsats av IPTG till en slutlig koncentration på 1 mM. Växer kulturen vid 37 ° C i 16 h i orbitalskak vid 180 rpm. Samla 100 µL prov från kulturen.
- Centrifugera hela kulturen vid 9000 x g i 30 min. Kassera supernatanten och återsuspendera bakteriell pelleten i 30 mL TBSE buffert (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA)) med 1: 1000 (v/v) 2-merkaptoetanol (nyligen tillagd).
Försiktighet: Handtag 2-merkaptoetanol under spiskåpa. Undvik kontakt med hud och ögon. Undvik inandning av ånga eller dimma. Utför alla resuspension steg med buffertar som innehåller 2-merkaptoetanol under spiskåpa. - Väger en tom centrifug bägare och överför den återsuspenderade pelleten till den tomma bägaren. Centrifugera vid 6.360 x g i 20 min. Kassera supernatanten och väger bägaren med pelleten. Subtrahera vikten av tomma bägaren att beräkna vikten av pelleten.
Obs: Protokollet kan pausas här. Frysa pelleten vid-20 ° C på kort sikt eller vid-80 ° C på lång sikt. Vid återuppta protokollet, Tina pelleten på RT. - Återsuspendera pelleten i STE buffert (10 mM Tris pH 8,0; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA, 375 mM sackaros; 1: 1000 (v/v) 2-merkaptoetanol (nyligen tillagd)). Använd 200 mL av STE buffert för varje 10 g pellet.
- Sonikera fjädringen på isen (10 min med 40 s puls, 20 s broms och 30% amplitud). Centrifugera vid 6.360 x g i 20 min. Kassera supernatanten och väga pelleten. Upprepa steg för ultraljudsbehandling och centrifugering 4 gånger.
- Återsuspendera pelleten i 100 mL TBS buffert (10 mM Tris, 150 mM NaCl). Centrifugera vid 6.360 x g i 20 min. Kassera supernatanten och väga pellet.
- Återsuspendera pelleten i nuclease buffert (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl2) med nyligen tillagda 80 U/mL nuclease (t.ex., bensonas) med 10 mL/g pellet. Inkubera suspensionen övernattning på RT på en omrörningsanordning tallrik (30 rpm).
- Lägg till Triton buffert (60 mM EDTA, 1,5 M NaCl, 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) fenyl-polyetylenglykol) till upphängningen. Volymen av Triton buffert att lägga till motsvarar en 0.5 volym del av suspensionen. Inkubera i 10 min vid RT (ingen omrörning). Centrifugera vid 6.360 x g i 20 min. Kassera supernatanten och väga pelleten.
- Återsuspendera pelleten i TE buffert (100 mM Tris, 20 mM EDTA) med 8 mL/g pellet. Centrifugera vid 6.360 x g i 20 min. Kassera supernatanten och väga pelleten.
- Återsuspendera pelleten genom att lägga till 4 mL/g 25 mM NaAc pH 5,0 och 5 mL/g för 6 M GuCl med 1 mM Ditiotreitol (DTT) (nyligen tillagd). Inkubera suspensionen övernattning på 4 ° C på en omrörningsanordning tallrik (30 rpm).
- Centrifugera vid 75.500 x g i 20 min. Supernatanten innehåller nu Övik monomer BMP2 proteinet. Samla in supernatanten och koncentrat detta extrakt till 20 OD/mL med hjälp av en 3 kDa molekylvikt cut-off (MWCO) membran en koncentrationssvårigheter cell (se Tabell för material).
- Lägga till koncentrerad monomerer i enstaka droppar utvinningsarbete bufferten (2 M LiCl, 50 mM Tris, 25 mM käkar, 5 mM EDTA, 1 mM glutation disulfid (GSSG), 2 mM glutation (GSH)) under omrörning (30 rpm). Inkubera vid RT för 120 h i mörkret.
Obs: under denna inkubationstid, vika occours. Det innehåller den vikta dimeriskt BMP2-K3Plk lösningen från detta steg framåt. - Justera pH-värdet i lösningen till 3.0 med koncentrerad HCl. Dialyze lösningen mot 1 mM HCl. koncentrat dialyzed lösningen med ett 10 kDa molekylvikt cut-off (MWCO) membran i en koncentrera cell.
- Temperera lösningen genom att lägga till buffert en (20 mM NaAc, 30% isopropanol). Lägga till en volym av buffert A motsvarar en 30% volym av lösningen. Centrifugera lösningen vid 4700 x g i 15 min.
- Jämvikta kolonnen för jonbyte på en snabb protein vätskekromatografi (FPLC) system15 med 150 mL buffert A. belastning protein lösningen på kolumnen skakad. Eluera fraktioner med hjälp av en linjär gradient av buffert B (20 mM NaAc, 30% isopropanol, 2 M NaCl) med 100 mL buffert B. samla 2 mL fraktioner.
Obs: Koncentrera proteinet före lastning till kolumnen enligt summakolumn volymen. Slutliga protein volymen bör vara < 5% av den totala kolumn volymen. - Analysera 20 µL av varje del av SDS polyakrylamid gel (12%) elektrofores (SDS-PAGE) 16 och Coomassie Brilliant Blue färgning17 (se Tabell för material).
Obs: Den Coomassie Brilliant Blue färgade SDS-PAGE gel visar fraktioner som innehåller dimerer (26 kDa) och fraktioner som innehåller monomerer (13 kDa). - Pool dimer-innehållande fraktioner. Dialyze poolen av dimer som innehåller bråk över natten vid 4 ° C mot 1 mM HCl (5 liters volym). Koncentrera sig den slutliga produkten genom att använda en 10 kDa koncentrera centrifugal filterenheten (se Tabell för material). Analysera den slutliga produkten av SDS polyakrylamid (12%) gelelektrofores (SDS-PAGE) och Coomassie Brilliant Blue färgning.
Obs: Bandet på den Coomassie Brilliant Blue målat SDS-PAGE gel bör Visa bara ett band på 26 kDa. Detta är den slutliga BMP2-K3Plk-produkten.
2. optimering av koppar (I)-katalyseras alkynen-natriumazid cykloadditionen (CuAAC) villkor
- Effekten av natriumaskorbat (NaAsc) och koppar (II) sulfat (CuSO 4 ) på vildtyp BMP2 (BMP2-WT)
- Inkubera 20 µM BMP2-WT med olika nyckeltal för NaAsc till CuSO4. Använd 0,5 mM NaAsc och 0,5 mM CuSO4 (start koncentration) i en 50 µL volym. Fortsätt med de följande nyckeltal av NaAsc till CuSO4: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20: 1), hålla CuSO4 koncentrationen konstant på 0,5 mM och justering av koncentrationen av NaAsc med detta. Utföra reaktionen i H2O på en roterande mixer (20 rpm) över natten på RT.
- Förbereda reducerade prover genom att lägga till lastning buffert som innehåller 5% 2-merkaptoetanol och inkubera provet vid 95 ° C för 6 min. analysera minskas och icke-reducerade prover av SDS polyakrylamid gel (12%) elektrofores (SDS-PAGE) och Coomassie Brilliant Blue färgning. Den Coomasie målat SDS-PAGE geler visar band i intervallet 13 kDa (nedsatt villkor) 26 kDa och högre molekylvikt (icke-reducerad villkorar).
-
Effekten av Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) Amin (THPTA) på CuAAC reaktionen
- Inkubera 20 µM BMP2-K3Plk med olika nyckeltal för THPTA till CuSO4. Använd 5 mM NaAsc och 200 µM 3-azid-7-hydroxycoumarin (hålla NaAsc och 3-azid-7-hydroxycoumarin konstant). Använd 50 µM THPTA och 0,5 mM CuSO4 som utgångsmaterial koncentrationer. Använda olika proportioner av THPTA till CuSO4: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). utföra reaktion i H2O (50 µL totala volym) för 24 h vid RT på en roterande mixer (20 rpm).
- Vid kopplingen blir 3-azid-7-hydroxycoumarin ett fluorescerande färgämne. Förbereda prover i reducerad och icke-reducerad förhållanden och analysera dem med SDS-PAGE. Visualisera gelerna under magnetisering kanalen med specifika våglängden för den 3-azid-7-hydroxycoumarin (λabs = 404 nm; λem = 477 nm).
3. kovalent koppling teknik av BMP2-K3Plk till natriumazid Functionalized agaros pärlor
- Inkubera 2 h på RT på en rotati 20 µM BMP2-K3Plk eller BMP2-WT (används som negativ kontroll) med 20 µL av natriumazid-aktiverat agaros pärlor i en total volym av 500 µL i reaktion buffert (0,1 M HEPES pH 7.0, 3,9 M urea, 50 µM CuSO4, 250 µM THPTA, 5 mM natriumaskorbat) ng mixer (20 rpm). Stoppa reaktionen genom att lägga till 5 mM EDTA (slutlig koncentration).
- Inkubera vid RT i 15 min på en roterande mixer (20 rpm). Centrifugera proverna vid 20 000 x g för 1 min vid RT. samla supernatanterna.
- Tvätta pelleten som innehåller pärlorna tre gånger med 1000 µL av HBS500 buffert (50 mM HEPES, 500 mM NaCl), tre gånger med 1000 µL av 4 M MgCl2, och två gånger med 1000 µL av fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Vid varje tvätt steg, Centrifugera 20 000 x g för 1 min på RT och samla supernatanterna. Lagra kopplat pärlor i 1000 µL av PBS vid 4 ° C.
Försiktighet: Stör inte pärla pelleten samtidigt avlägsna supernatanten.
4. validering av närvaro och biologiska aktiviteten av immobiliserade BMP2-K3Plk med Texas röd märkt BMP Receptor jag en Ectodomain (BMPR-IA EG )
- Inkubera 50 µL av BMP2-K3Plk functionalized pärlor med 1 µM Texas röd märkt BMPR-IAEG med 150 µL av HBS500 buffert (50 mM HEPES, 500 mM NaCl) på RT för 1 h på en roterande mixer (20 rpm).
- Centrifugera pärlorna på 20 000 x g för 1 min på RT. Kassera supernatanten. Tvätta pärlorna med 1000 µL av HBS500 buffert. Upprepa tvätt ytterligare 3 gånger. Centrifugera vid 20 000 x g för 1 min på RT efter varje tvätt steg.
- Återsuspendera pärlorna i 500 µL av PBS och överför med pipett 50 μl på en glasskiva täcka. Ange Mikroskop filtret mellan 561 eller 594 nm. Upptäcka Texas Red – BMPR-IAEG– BMP2-K3Plk functionalized pärlor med fluorescerande mikroskopi och ta bilder.
5. mätning av alkaliskt fosfatas (ALP) uttryck för att bevisa den In Vitro bioaktiviteten av producerade BMP2-K3Plk före och efter the koppling reaktion.
-
Alkaliskt fosfatas (ALP) analys
- Kultur promyoblastic C2C12 celler (ATCC CRL-172) i Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) med 10% fostrets kalv Serum (FCS), 100 U/mL penicillin G och 100 µg/mL streptomycin vid 37 ° C i en fuktad atmosfär på 5% CO2.
- Frö C2C12 celler på en densitet på 3 × 104 celler per brunn i en 96 brunnar mikroplattan. Låt celler bifoga övernattning. Ta bort medium och inkubera C2C12 celler i närvaro av 0,5-200 nM BMP2-WT eller BMP2-K3Plk i 100 µL per brunn av DMEM (2% FCS, 100 U/mL penicillin G och 100 µg/mL streptomycin) vid 37 ° C i en fuktad atmosfär på 5% CO2 72 h.
- Ta bort medium och tvätta cellerna med 100 µL av PBS per brunn. Lysera celler på RT för 1 h med 100 µL per brunn lyseringsbuffert (1% NP-40, 0.1 M glycin, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) på en skaka plåt (220 rpm).
- Tillsätt 100 µL per brunn av ALP buffert (0,1 M glycin, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) med 1 mg/mL p-nitrophenylphosphate (nyligen tillagd) till cell lysate.
- Mäta absorption vid 405 nm i en multiplate läsare efter ALP bufferten, och varje 5 min tills utvecklingen av färgen är klar. Generera dos-responskurvor och EC50-värden med hjälp av en logistisk modell, y = A2 + (A1-A2) / (1 + (x/x0)p).
-
Alkaliskt fosfatas (ALP) färgning
- Kultur promyoblastic C2C12 celler (ATCC CRL-172) i Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) med 10% fostrets kalv Serum (FCS), 100 U/mL penicillin G och 100 µg/mL streptomycin vid 37 ° C i en fuktad atmosfär på 5% CO2.
- Frö C2C12 celler på en densitet på 3 × 104 celler per brunn i en 96 brunnar mikroplattan. Låt celler bifoga övernattning. Ta bort medium och tillsätt 20 µL per brunn av BMP2-K3Plk tillsammans pärlor. BMP2-K3Plk tillsammans pärlor är 1000 µL av en PBS suspension.
- Bered en lösning av 0,4% låg--smältpunkt agaros i DMEM. Smält i mikron (600 W för 3 min) och låt den svalna i vattenbad vid 37 ° C fram till användning.
- Tillsätt 20 µL av 0,4% låg--smältpunkt agaros i varje brunn (täcker pärlor och celler). Centrifugera vid 2000 x g i 5 min vid 20 ° C. Tillsätt 80 µL DMEM (2% FCS, 100 U/mL penicillin G och 100 µg/mL streptomycin) och inkubera vid 37 ° C i en fuktad atmosfär på 5% CO2 72 h.
- Ta bort medium, var noga med att inte ta loss den stelnad 0,4% agarosen. Tillsätt 100 µL per brunn av 1-steg NBT/Beneluxkonventionen (Nitro-blå-tetrazoliumklorid, 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidin salt) substratlösningen.
- Analysera alkaliskt fosfatas färgning med ljusmikroskopi omedelbart efter lila färgningen blir uppenbart. Använd ljusa fält mikroskopi och ta bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den här artikeln beskriver vi en metod för att kovalent par en ny BMP2 variant, BMP2-K3Plk, att kommersiellt tillgängliga natriumazid functionalized agaros pärlor (figur 1). Bioaktiviteten av den producerade BMP2-K3Plk varianten har validerats genom induktion av alkaliskt fosfatas (ALP) genuttryck i C2C12 celler. In vitro- testet visar liknande ALP uttrycksnivåerna induceras av vildtyp BMP2 (BMP2-WT) och BMP2-K3Plk (figur 2).
Redoxreaktioner mellan koppar (II) sulfat (CuSO4) och natriumaskorbat (NaAsc) generera reaktiva syreradikaler som kan påverka den strukturella integriteten och därmed påverka bioaktiviteten av BMP2-K3Plk. För att verifiera den strukturella integriteten av proteinet, utförde vi ett över natten inkubation med CuSO4 och NaAsc, visar BMP2-WT nedbrytning i en koncentrationsberoende sätt (visualiseras av SDS-PAGE nedsatt villkor (figur 3A1 )) och bildandet av multimers eller aggregat synlig vid cirka 40 kDa (under icke-reducerad förutsättningar) (figur 3A2). Att undvika proteinnedbrytning, Tris (3-hydroxypropyltriazolyl-metyl) Amin (THPTA) användes som en skyddande agent (figur 3B). THPTA förebygger BMP2 fragmentering, medan bildandet av högre molekylvikt strukturer inte kunde förhindras genom tillsats av THPTA. Ytterligare förbättringar av reaktionen upp sammansättningen av reaktion bufferten, reaktion temperatur och reaktionstid (inga data anges). Protokollet beskrivs här Detaljer slutliga resultaten avseende reaktion buffert sammansättning, temperatur och reaktionstid.
För att bekräfta att BMP2-K3Plk behåller bioaktivitet efter kopplingen, vi använde fluorescently märkt receptorproteinet ectodomain av typen jag receptor (BMPR-IAEG) Visa att proteinet immobiliserade är fortfarande kan binda till denna receptor. Pärlor belagd med BMP2-K3Plk via CuAAC kemi gav fluorescens när inkuberas med dye-märkt BMPR-IAEG (figur 4). I kontrast, icke-belagda pärlor eller pärlor som inkuberades med BMP2-WT visade ingen fluorescens nivåer signal över bakgrunden (inga data anges)14.
Efter att ha bekräftat receptor bindande kapacitet i immobiliserade liganden i vitro, testade vi också om biologiska svar kan utlösas av functionalized pärlor i en cell-baserad analys. ALP medierad färgning förekom endast i de celler som var i direkt kontakt med BMP2-K3Plk-functionalized pärlor (figur 5). Detta bekräftar att proteinet är verkligen kovalent länkade till pärlorna och inte bara absorberas, eftersom en mer utspridda färgning på större avstånd att pärlorna skulle annars har observerats.
Figur 1: skildring av BMP2-K3Plk. (A) Skildring av BMP2-K3Plk variant med localizationen av introducerade aminosyra substitution. (B) koppling system: BMP2-K3Plk CuAAC reaktion med natriumazid functionalized pärlor. Omtryckt (anpassad) med tillstånd från Tabisz et al. (2017): webbplats-regisserad immobilisering av BMP-2: två metoder för produktion av innovativa osteoinduktiv ställningar. Biomakromolekyler. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: bioaktivitet av BMP2-varianter. Jämförelse av bioactivities (ALP assay) BMP2-K3Plk och vildtyp BMP2 (BMP2-WT). X-axeln representerar koncentrationen av BMP2-WT eller BMP2-K3Plk används i analysen. EC50 data representerar medelvärden och standardavvikelser av 4 individuella experiment (N = 4). Omtryckt (anpassad) med tillstånd från Tabisz et al. (2017): webbplats-regisserad immobilisering av BMP-2: två metoder för produktion av innovativa osteoinduktiv ställningar. Biomakromolekyler. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: effekt av reducerande agent på BMP2 integritet. (A) BMP2-WT utsattes för olika molar förhållandet mellan natriumaskorbat (NaAsc) till koppar (II) sulfat (CuSO4). Proverna analyserades av SDS-PAGE och Coomassie Brilliant Blue färgning minskat (Figur A1) och icke-reducerad villkor (Diagram A2). I minskad villkoren (A1) representerar de röda pilarna klyvs BMP2-WT. I icke-reducerad villkoren (A2) visar de röda pilarna multimeric BMP2-WT. De band som representerar klyvs BMP2 arter markeras med en blå pil. Legend: NCR - minskad BMP2-WT obehandlad; NC - BMP2-WT obehandlad; 1:1 till 20:1 - ökande molara förhållanden för natriumaskorbat CuSO4. (B) BMP2-K3Plk kopplades ihop till 3-azid-7-hydroxycoumarin med CuAAC reaktion villkor kompletteras med THPTA. Vid koppling blir 3-azid-7-hydroxycoumarin ett fluorescerande färgämne. Legend: NC - BMP2-WT reagerade med 3-azid-7-hydroxycoumarin; 7:1 till 20:1 öka molar förhållandet av THPTA till CuSO4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: bioaktivitet av immobiliserade BMP2-K3Plk in vitro-. Representativ bild av samspelet mellan immobiliserade BMP2-K3Plk med Texas-Red-märkta BMPR-IAEG. Omtryckt (anpassad) med tillstånd från Tabisz et al. (2017): webbplats-regisserad immobilisering av BMP-2: två metoder för produktion av innovativa osteoinduktiv ställningar. Biomakromolekyler. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: bioaktivitet av immobiliserade BMP2-K3Plk i en cell-baserad analys. (A) representativ bild av alkaliskt fosfatas (ALP) färgning vid behandling med pärlor kopplat till BMP2-K3Plk functionalized pärlor. (B) alkaliskt fosfatas (ALP) färgning vid behandling med lösliga 25 nM BMP2-K3Plk. Reprinted (anpassad) med tillstånd från Tabisz et al. (2017): webbplats-regisserad immobilisering av BMP-2: två metoder för produktion av innovativa osteoinduktiv ställningar. Biomakromolekyler. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genererar märkta proteinet varianter av genetiska kodon expansion tillåter införandet av olika icke-naturlig aminosyra analoger huvudsakligen vid någon av de primära proteinsekvens. Vid BMPs som BMP2, gemensamma taggar såsom en 6-histidin (hans)-tagg kan endast vara infört N-terminalt, eftersom protein´s C-terminal slutet är begravda i den tertiary proteinstrukturen, och kan således inte nås från utsidan. På andra positioner, kan storleken på taggen introducerade mycket sannolikt orsaka strukturella förändringar som följaktligen utplåna den BMP´s bioaktiviteten. Ytterligare, att införa en mutation i sekvensen BMP2 kan påverka refolding effekt, och kan också ändra andra protein parametrar såsom den isoelektriska punkten av modifierat protein. Således kan varje steg i en etablerad protein produktion protokoll behöva anpassas efter de förändrade protein variant´s egenskaperna. Produktionen av den BMP2-K3Plk krävs faktiskt en modifiering av den etablerade metoden för uttrycket av vildtyp BMP2. Annan kultur gånger eller propargyl-L-lysin (Plk) koncentrationer var testade (inga data anges) för att nå högsta möjliga uttryck avkastning. Vika, kräver separation och rening lyckligtvis inte ytterligare anpassningar. Vi har redan rapporterat att vid andra BMP2 varianter produceras i vårt labb, vissa protein egenskaper har ändrats betydligt, som krävs för ändring av flera steg av BMP produktion metod18. Den producerade BMP2-K3Plk visade biologisk aktivitet jämförbar med proteinet vildtyp. Skillnad uppstår vid höga BMP2 koncentrationer, förmodligen till följd av en lägre löslighet av BMP2-K3Plk variant i medium jämförelse med vildtyp BMP2.
Trots de kända fördelarna med koppar-katalyseras natriumazid-alkynen cykloadditionen (CuAAC)19, bör CuAAC reaktioner anpassas noggrant till särskilda applikationer. Vi visade hur BMP2 kan fragmenteras eller skapa aggregat eller multimers på grund av de starkt reducerande reaktion villkor. Således hade alla reaktion parametrar som ska analyseras i detalj för att hitta villkor som lämnar proteinet opåverkad.
Vår strategi att kovalent BMP2 varianten till natriumazid-functionalized agaros pärlor av Klicka kemi kunde realiseras med hög effektivitet leder till functionalized pärlor utlöser osteogent differentiering i vitro. När vildtyp BMP2 protein användes i reaktionen med pärlor istället, kunde vi konstatera bara svag färgning av ALP uttryck, som anger att kopplingen verkligen inträffat mycket specifikt via propargyl-L-lysin återstoden av BMP2-K3Plk.
Detta positionella koppling specificitet återspeglar en stor förbättring jämfört med immobilisering förfaranden som involverar klassiskt NHS/EDC kemi. I sådana fall inträffar slumpmässiga kopplingshandsken, som främst berör de primära amine grupperna närvarande i lysin rester. Kopplat proteinet har en variabel osteogent aktivitet, på grund av mångfalden av möjliga anslutningar till schavotten, leder till olika inriktningar av proteinet mot cellreceptorer.
Användning av webbplats-direkt immobiliserade BMP2 kan övervinna nämnda nackdelarna relaterade till de höga doser av lösliga BMP2, som behövs för att framkalla benbildning. Resultaten visar tydligt att vissa cellulära svar, såsom osteogent differentieringen av C2C12 celler, initieras helt av immobiliserade BMP2, trots senaste studier hävdar att signal transduktion kräver dessutom endocytos av den ligand/ligand-receptor komplex20,21. Våra resultat är överens med andra studier som visar att BMP2, som tillsammans kovalent (men inte webbplats-regi) till icke-endocytosable ytor, är fortfarande kunna inducera osteoblast differentiering22.
Med tanke på att vi har använt suprafysiologiska koncentrationer av BMP2 för koppling reaktionen, kan mängden den immobiliserade BMP2 minskas ytterligare medan fortfarande bevara osteogent egenskaperna av pärlor. Före sådan optimering steg måste BMP2-K3Plk-functionalized ställningen dock testas i djurförsök att bevisa dess osteogent potentiella i vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr M. Rubini (Konstanz, Tyskland) för att tillhandahålla plasmiden pyrrolysyl-tRNA-kodning och som tillhandahåller pRSFduet-pyrtRNAsynth kodning den motsvarande aminoacyl-tRNA-syntetas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1-Step NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Add solution to cells |
| 3-Azido-7-hydroxycoumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Chemical used for click reaction |
| Agarose low melting point | Biozym | 840101 | Agarose for ALP assay |
| Azide agarose beads | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Beads used for reaction |
| BamHI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriction enzyme |
| BMP receptor IA (BMPR-IAEC) | -- | -- | Produced in our lab |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE |
| Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Chemical used for click reaction |
| DNA Polymerase and reaction buffer | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Cell culture media |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Chemical used to stop click reaction |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bacteria induction (1mM final concentration) |
| NdeI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriction enzyme |
| NHS-activated Texas Red | Life technologies | T6134 | Coupled to receptor |
| P- Nitrophenyl Phosphate | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkaline Phosphatase |
| p25N-hmBMP2 | -- | -- | Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| propargyl-L-lysine (Plk) | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel Purification |
| Qiagen PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR Purification |
| Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Chemical used for click reaction |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligation |
| tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Chemical used for click reaction |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon concentrating cell 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Concentrating unit |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck KGaA | UFC901024 | Concentrating centrifugal unit |
| ÄKTA avant FPLC | ÄKTA | -- | FPLC machine |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge for bacterial culture |
| Bacterial Shaking Incubator | Infors HT | Shaking incubator for bacterial culture | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | -- | Imaging and analysis system for SDS-PAGE |
| Fluorescent miscroscope | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3- (M) | Merck KGaA | 116882 | Ion Exchange Chromatography column material |
| Greiner CELLSTAR® 96 well plates | Sigma | M5811-40EA | 96 well plates for cell culture (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | -- | Centrifuge |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoScientific | 75003624 | Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining |
| Microcentrifuge - 5417R | Eppendorf | -- | Centrifuge |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | -- | software for stastic analysis of ALP assay data |
| Polysine Slides | ThermoScientific | 10143265 | microscope slides |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Tecan infinite M200 multiplate reader | Tecan Deutschland GmbH | -- | Multiplate reader for ALP assay |
| Thermocycler - Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | -- | PCR |
| TxRed - microscope filter | Keyence | Filter for fluorescent microscope | |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
References
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: An update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27 (2005).
- Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations. Biofactors. 40 (5), 459-481 (2014).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., Merkle, H. P., Gander, B. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur J Pharm Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Haidar, Z. S., Hamdy, R. C., Tabrizian, M. Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part A: Current challenges in BMP delivery. Biotechnol Lett. 31 (12), 1817-1824 (2009).
- Hollinger, J. O., Uludag, H., Winn, S. R. Sustained release emphasizing recombinant human bone morphogenetic protein-2. Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 303-318 (1998).
- Uludag, H., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: A correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J Biomed Mater Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Uludag, H., Golden, J., Palmer, R., Wozney, J. M. Biotinated bone morphogenetic protein-2: In vivo and in vitro activity. Biotechnol Bioeng. 65 (6), 668-672 (1999).
- Aono, A., et al. Potent ectopic bone-inducing activity of bone morphogenetic protein-4/7 heterodimer. Biochem Biophys Res Commun. 210 (3), 670-677 (1995).
- Suzuki, Y., et al. Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo. J Biomed Mater Res. 50 (3), 405-409 (2000).
- Knaus, P., Sebald, W. Cooperativity of binding epitopes and receptor chains in the BMP/TGFbeta superfamily. Biol Chem. 382 (8), 1189-1195 (2001).
- Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 225-249 (2006).
- Costa, G. L., Weiner, M. P. Rapid PCR site-directed mutagenesis. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2. FEBS Lett. 468 (2-3), 215-219 (2000).
- Tabisz, B., et al. Site-directed immobilization of BMP-2: Two approaches for the production of innovative osteoinductive scaffolds. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708 (2017).
- Duong-Ly, K. C., Gabelli, S. B. Using ion exchange chromatography to purify a recombinantly expressed protein. Methods Enzymol. 541, 95-103 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II. EMBO J. 19 (13), 3314-3324 (2000).
- Hein, J. E., Fokin, V. V. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides. Chem Soc Rev. 39 (4), 1302-1315 (2010).
- Alborzinia, H., et al. Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists. J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).
- Paarmann, P., et al. Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling. Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).
- Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
