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Bioengineering

Site-Directed immobilizzazione della proteina morfogenetica ossea 2 a superfici solide di Click Chemistry

Published: March 29, 2018 doi: 10.3791/56616

Summary

Biomateriali drogati con Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) sono stati utilizzati come una nuova strategia terapeutica per guarire fratture ossee non sindacale. Per superare gli effetti collaterali derivanti da un'incontrollabile rilascio del fattore, vi proponiamo una nuova strategia per sito-direttamente immobilizzare il fattore, creando così materiali con migliorate capacità osteogeniche.

Abstract

Diverse strategie terapeutiche per il trattamento di non-guarigione dell'osso lungo i difetti sono state studiate intensivamente. Attualmente utilizzati trattamenti presenti numerose limitazioni che hanno portato all'uso di biomateriali in combinazione con fattori di crescita osteogeniche, quali proteine morfogenetiche dell'osso (BMP). Metodi comunemente usati di assorbimento o incapsulamento richiedono quantità sovra-fisiologiche di BMP2, in genere causando un effetto di rilascio cosiddetto scoppio iniziale che provoca diversi effetti collaterali negativi gravi. Una possibile strategia per superare questi problemi sarebbe coppia covalentemente alla proteina al patibolo. Inoltre, accoppiamento deve essere eseguita in modo specifico del sito al fine di garantire un risultato riproducibile prodotto. Pertanto, abbiamo creato una variante BMP2, in cui un amminoacido artificiale (propargil-L-lisina) è stata introdotta nella parte matura della proteina BMP2 di espansione l'utilizzo di codone (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk è stata accoppiata al funzionalizzati perline attraverso catalizzata rame azide-alchino cicloaddizione (CuAAC). L'attività biologica dell'accoppiata BMP2-K3Plk è stata dimostrata in vitro e l'attività osteogenica delle perle BMP2-K3Plk-funzionalizzati è stata dimostrata nelle analisi delle cellule basata. Le perline funzionalizzate a contatto con cellule C2C12 erano in grado di indurre l'espressione di fosfatasi alcalina (ALP) nella prossimità localmente limitato del tallone. Così, da questa tecnica, possono essere prodotto funzionalizzate impalcature che può innescare la differenziazione delle cellule verso una linea osteogenica. Inoltre, le dosi più basse BMP2 sono sufficienti a causa dell'orientamento controllato del sito diretta accoppiato BMP2. Con questo metodo, BMPs sono sempre esposti ai loro ricevitori sulla superficie delle cellule con l'orientamento appropriato, che non è il caso se i fattori sono accoppiati tramite tecniche di accoppiamento non-luogo-diretta. Il risultato prodotto è altamente controllabile e, quindi, risultati in materiali con proprietà omogenea, migliorando la loro applicabilità per la riparazione di dimensione critica dell'osso difetti.

Introduction

L'obiettivo finale di rigenerazione ossea del tessuto dell'osso e ingegneria è quello di superare gli svantaggi e limitazioni che si verificano durante i trattamenti comuni delle fratture non-Unione. Auto o allo trapianti sono usati principalmente come attuali strategie di terapia, anche se entrambi hanno diversi inconvenienti. L'innesto osseo ideale dovrebbe indurre osteogenesi di osteoinduzione così come osteoconduzione, conduce per l'osteointegrazione dell'innesto dell'osso. Al giorno d'oggi, solo auto-trapianto è considerato come il "gold standard", poiché esso fornisce tutte le caratteristiche di un innesto di osso ideale. Purtroppo, esso presenta anche importanti aspetti negativi, quali tempi chirurgici lungo e un secondo sito di trauma che solitamente comporta ulteriori complicazioni (ad es., dolore cronico, formazioni di ematoma, infezioni, difetti estetici, ecc.). Trapianto allogenico, d'altra parte hanno caratteristiche non ottimali per tutti gli aspetti generali1. Tecnologie di innesto osseo alternativi sono stati migliorati negli ultimi pochi anni, con l'obiettivo di produrre impalcature che sono osteoinduttivo, osteoconduttivo, biocompatibile e bioriassorbibile. Poiché molti biomateriali non mostrare tutte queste caratteristiche osteogeniche, fattori di crescita differenti, principalmente BMP2 e BMP7, sono state integrate al fine di migliorare il potenziale osteogenico dell' impalcatura particolare2.

Come criterio essenziale, tali sistemi di consegna di fattore di crescita dovrebbe fornire un rilascio di dose controllata nel tempo al fine di facilitare gli eventi essenziali come reclutamento di cellule e attaccamento, ricrescita delle cellule e l'angiogenesi. Tuttavia, BMPs così come altri fattori di crescita osteogeniche sono stati comunemente immobilizzato non covalentemente3. Tecniche di intrappolamento e adsorbimento richiedono l'uso di sovra-fisiologiche quantità di proteine a causa un rilascio di scoppio iniziale, che porta a gravi svantaggi in vivo, che interessa tipicamente i tessuti circostanti inducendo la crescita eccessiva dell'osso, osteolisi, gonfiore e infiammazione4. Così, la conservazione dei fattori di crescita nel sito di consegna per lunghi periodi di tempo può essere ottenuta metodi di immobilizzazione covalente. Modificati chimicamente BMP2 (succinylated5, acetilata6 o biotinilati7), ingegnerizzato eterodimeri8, o BMP2 oligopeptidi derivata9 sono stati progettati e utilizzati per superare le limitazioni relative al assorbimento. Tuttavia, la bio-attività di questi costrutti non è prevedibile, poiché la disposizione potenzialmente inibisce il legame del ligando immobilizzato ai ricevitori cellulari. Come illustrato in precedenza, è essenziale che tutte le quattro catene di recettori coinvolte nella formazione di complessi ligando-recettore attivato interagiscano con la BMP2 immobilizzato per attivare completamente tutto a valle segnalazione cascades10.

Per superare i problemi di un risultato prodotto non omogeneo con limitazioni in termini di bioattività, stabilità e biodisponibilità del fattore immobilizzato, abbiamo progettato una variante BMP in grado di legare covalentemente impalcature in maniera diretta al sito. Questa variante, definita BMP2-K3Plk, comprende un amminoacido artificiale introdotta dal codone genetica espansione11. Questa variante è stata collegata con successo a ponteggi utilizzando una strategia di accoppiamento covalente pur mantenendo la sua attività biologica.

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Protocol

1. produzione della variante BMP2 BMP2-K3Plk

  1. Clonazione di BMP2-K3Plk di mutagenesi sito-diretta mediante PCR 12
    1. Amplificare BMP2 maturo umano (hmBMP2) da un vettore di p25N-hmBMP2 (Vedi Tabella materiali) con un primer forward (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') e un primer inverso (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') l'introduzione di un codone di stop ambra ( TAG) nella posizione della lisina prima di BMP2´s parte matura. Eseguire la reazione di PCR utilizzando 33,5 µ l di H2O, 10 µ l di miscela di reazione PCR, 1,5 µ l di soluzione stock di 10 µM dNTP, 1,5 µ l di primer forward (10 pmol / µ l), 1,5 µ l di primer reverse (10 pmol / µ l), 1 µ l di p25N-hmBMP2 (10 ng / µ l) e 1 µ l di DNA polimerasi (Vedi Tabella materiali) in un termociclatore (denaturazione a 95 ° C per 5 min, 30 cicli di denaturazione a 95 ° C per 1 min, ricottura a 60 ° C per 1 min, l'allungamento a 72 ° C per 1 min e un'estensione finale a 72 ° C per 10 min).
    2. Purificare il prodotto PCR utilizzando un kit disponibile in commercio seguendo le raccomandazioni del produttore (Vedi Tabella materiali).
    3. Digerire il prodotto di PCR con l'enzima di restrizione NdeI a 37 ° C per 45 min utilizzando 16 µ l di H2O, 3 µ l di tampone di digestione, 10 µ l di DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l di enzima di restrizione. Calore-inattivare l'enzima a 65 ° C per 5 min. digerire il prodotto di PCR con l'enzima di restrizione BamHI a 37 ° C per 1 h utilizzando 16 µ l di H2O, 3 µ l di tampone di digestione, 10 µ l di DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l di enzima di restrizione. Calore-inattivare l'enzima a 80 ° C per 5 min.
    4. Digerire il vettore di pET11a-pyrtRNA con NdeI a 37 ° C per 2 h e 45 min utilizzando 16 µ l di H2O, 3 µ l di tampone di digestione, 10 µ l di DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l di enzima di restrizione. Calore-inattivare a 65 ° C per 5 min. digerire il vettore di pET11a-pyrtRNA con BamHI a 37 ° C per 1 h utilizzando 16 µ l di H2O, 3 µ l di tampone di digestione, 10 µ l di DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l di enzima di restrizione. Inattivare a caldo a 80 ° C per 5 min.
    5. Separare il vettore digerito dal vettore non digerito e i resti di digestione di agarosio gel elettroforesi (agarosio 0.8%, 60 min a 100 V). Legare l'inserto BMP2-K3TAG digerito con spina dorsale digerito pET11a-pyrtRNA a temperatura ambiente (TA) per 2 h usando 100 ng di pET11a-pyrtRNA spina dorsale e 34,5 ng di inserto BMP2-K3TAG (rapporto molare 1:3). La miscela di reazione contiene la spina dorsale del DNA e inserto, 2 µ l di tampone di ligasi, 1 µ l di DNA ligasi e H2O a un volume totale di 20 µ l.
    6. Eseguire una co-trasformazione di pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk e pSRF-duetto-pyrtRNAsynth nei batteri BL21 (DE3):
      1. Aggiungere 50 ng di ogni plasmide ai batteri, mettere il composto sul ghiaccio per 30 min, shock termico a 42 ° C per 50 s, mettere sul ghiaccio per 5 min, aggiungere 500 µ l di terreno di Lisogenesi brodo (LB) nella miscela e agitare a 300 giri/min per 60 min.
      2. Sviluppa 100 µ l della miscela batterica sul pre-riscaldata kanamicina (50 µ g/mL) / lastre di ampicillina (100 µ g/mL) e incubare per una notte a 37 ° C.
  2. Espressione e purificazione di BMP2-K3Plk 13 , 14
    1. Propagare una singola Colonia pernottamento in 50 mL di LB medium con 50 µ g/mL di kanamicina e 100 µ g/mL di ampicillina a 37 ° C.
    2. Diluire una notte Culture 01:20 in 800 mL di medium di formidabile brodo (TB) completate con 50 µ g/mL di kanamicina e 100 µ g/mL di ampicillina e crescere a 37 ° C fino a quando viene raggiunto un OD600 di 0,7. Aggiungere propargil-L-lisina a una concentrazione finale di 10 mM. Raccogliere un campione di 100 µ l dalla cultura prima di induzione di isopropile β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).
    3. Indurre l'espressione genica mediante l'aggiunta di IPTG ad una concentrazione finale di 1 mM. Far crescere la cultura a 37 ° C per 16 h in un agitatore orbitale a 180 giri/min. Raccogliere un campione di 100 µ l dalla cultura.
    4. Centrifugare a tutta la cultura a 9000 x g per 30 min. scartare il supernatante e risospendere il pellet batterico in 30 mL di tampone TBSE (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)) con 1: 1000 (v/v) 2-mercaptoetanolo (appena aggiunto).
      Attenzione: Maneggiare 2-mercaptoetanolo sotto la cappa. Evitare il contatto con pelle e occhi. Evitare l'inalazione di vapore o nebbia. Eseguire tutti i passaggi di risospensione con buffer contenente 2-mercaptoetanolo sotto la cappa.
    5. Pesare un beaker vuoto centrifuga e trasferire il sedimento risospeso nel becher vuoto. Centrifugare a 6.360 x g per 20 min. scartare il sopranatante e pesare il becher con la pallina. Sottrarre il peso del bicchiere vuoto per calcolare il peso del pellet.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Congelare il pellet a-20 ° C a breve termine o a-80 ° C a lungo termine. Al momento della ripresa del protocollo, scongelare il pellet a TA.
    6. Risospendere il pellet in STE tampone (Tris 10 mM pH 8.0; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, saccarosio 375 mM; 1: 1000 (v/v) 2-mercaptoetanolo (appena aggiunto)). Utilizzare 200 mL di buffer di STE per ogni 10 g di pellet.
    7. Sonicare la sospensione su ghiaccio (10 min con 40 s pulse, freno s 20 e 30% ampiezza). Centrifugare a 6.360 x g per 20 min. scartare il sopranatante e pesare il pellet. Ripetere i passaggi di sonicazione e centrifugazione 4 volte.
    8. Risospendere il pellet in 100 mL di tampone TBS (10 mM Tris, 150 mM NaCl). Centrifugare a 6.360 x g per 20 min. scartare il sopranatante e pesare pellet.
    9. Risospendere il pellet in buffer di nucleasi (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl2) con appena aggiunto 80 nucleasi U/mL (ad es., benzonasi) utilizzando 10 mL/g di pellet. Incubare la sospensione durante la notte a RT su una piastra di agitazione (30 giri).
    10. Aggiungere tampone di Triton (60 mM EDTA, 1.5 M NaCl, 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietilenglicole) alla sospensione. Il volume di tampone di Triton per aggiungere corrisponde ad una parte di 0,5 volume della sospensione. Incubare per 10 min a RT (nessuna agitazione). Centrifugare a 6.360 x g per 20 min. scartare il sopranatante e pesare il pellet.
    11. Risospendere il pellet in buffer di TE (100 mM Tris, 20 mM EDTA) utilizzando 8 mL/g di pellet. Centrifugare a 6.360 x g per 20 min. scartare il sopranatante e pesare il pellet.
    12. Risospendere il pellet con l'aggiunta di 4 mL/g 25 mM a Pierantonio pH 5.0 e 5 mL/g di 6 M GuCl con 1 mM dithiothreitol (DTT) (appena aggiunto). Incubare la sospensione durante la notte a 4 ° C su una piastra di agitazione (30 giri).
    13. Centrifugare a 75.500 x g per 20 min. Il surnatante ora contiene la proteina unfolded monomerica BMP2. Raccogliere il surnatante e concentrato questo estratto a 20 OD/mL utilizzando una membrana di cut-off (MWCO) di peso molecolare 3 kDa in una concentrazione delle cellule (Vedi Tabella materiali).
    14. Aggiungere i monomeri concentrati in singole gocce nel buffer di rinaturazione (2m LiCl, 50 mM Tris, CHAPS 25 mM, 5 mM EDTA, bisolfuro di 1 mM del glutatione (GSSG), 2 mM del glutatione (GSH)) agitando (30 giri). Incubare a RT per 120 ore al buio.
      Nota: durante questo periodo di incubazione, ripiegamento occours. La soluzione da questo punto in poi contiene il piegato dimerica BMP2-K3Plk.
    15. Regolare il pH della soluzione a 3.0 utilizzando concentrato HCl. Dialyze la soluzione contro 1 mM HCl. concentrato la soluzione dializzata utilizzando una membrana di cut-off (MWCO) peso molecolare 10 kDa in una cella di concentrazione.
    16. Equilibrare la soluzione aggiungendo buffer (20mm Pierantonio, 30% isopropanolo). Aggiungere un volume di tampone A corrispondente ad un volume di 30% della soluzione. Centrifugare la soluzione a 4700 x g per 15 min.
    17. Equilibrare la colonna di scambio ionico su un di sistema di cromatografia in fase liquida (FPLC)15 proteine veloci con 150 mL di tampone carico r. la soluzione della proteina sulla colonna equilibrata. Eluire frazioni utilizzando una sfumatura lineare del buffer B (20mm Pierantonio, 30% isopropanolo, 2 M NaCl) con 100 mL di frazioni di mL di tampone di B. raccogliere 2.
      Nota: Concentrare la proteina prima di caricare la colonna in base al volume totale colonna. Il volume finale di proteine dovrebbe essere < 5% del volume totale colonna.
    18. Analizzare 20 µ l di ciascuna frazione di SDS poliacrilammide gel (12%) elettroforesi (SDS-PAGE) 16 e colorante Coomassie Brilliant Blue17 (Vedi Tabella materiali).
      Nota: Il Coomassie Brilliant Blue macchiato SDS-PAGE gel spettacoli frazioni contenenti dimeri (26 kDa) e frazioni contenenti monomeri (13 kDa).
    19. Frazioni contenenti dimero di piscina. Dializzare la piscina del dimero contenente frazioni durante la notte a 4 ° C contro 1 mM HCl (volume di 5 litri). Concentrare il prodotto finale utilizzando un 10 kDa concentrando unità filtro centrifugo (Vedi Tabella materiali). Analizzare il prodotto finale mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS (12%) (SDS-PAGE) e la macchiatura Coomassie Brilliant Blue.
      Nota: La band il Coomassie Brilliant Blue macchiato SDS-PAGE gel dovrebbe mostrare soltanto una fascia al kDa 26. Questo è il prodotto finale BMP2-K3Plk.

2. ottimizzazione di rame (I)-catalizzata alchino-Azide cicloaddizione (CuAAC) condizioni

  1. Effetto di ascorbato di sodio (NaAsc) e solfato di rame (II) (CuSO 4 ) il tipo selvaggio BMP2 (BMP2-WT)
    1. Incubare 20 µM BMP2-WT con differenti rapporti di NaAsc a CuSO4. Utilizzare 0,5 mM NaAsc e 0,5 mM CuSO4 (a partire di concentrazione) in un volume di 50 µ l. Procedere con i seguenti rapporti di NaAsc di CuSO4: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20: 1), mantenendo costante la concentrazione di CuSO4 a 0,5 mM e regolando di conseguenza la concentrazione di NaAsc. Eseguire la reazione in H2O su un miscelatore rotante (20 giri) durante la notte a TA.
    2. Preparare campioni ridotti con l'aggiunta di tampone di caricamento contenente 5% 2-mercaptoetanolo e incubare il campione a 95 ° C per 6 min. Analyze ridotto e non ridotta campioni di SDS poliacrilammide gel (12%) elettroforesi (SDS-PAGE) e macchiatura Coomassie Brilliant Blue. Il Coomasie macchiato gel di SDS-PAGE mostrano bande nella gamma di 13 kDa (ridotta conditons)-26 kDa e più alto peso molecolare (non ridotte condizioni).
  2. Effetto di Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) amine (THPTA) sulla reazione di CuAAC
    1. Incubare 20 µM BMP2-K3Plk con differenti rapporti di THPTA a CuSO4. Utilizzare 5 mM NaAsc e 200 µM 3-Azido-7-hydroxycoumarin (NaAsc e 3-Azido-7-hydroxycoumarin mantenere costante). Utilizzare 50 µM THPTA e 0,5 mM di CuSO4 come le concentrazioni di partenza. Utilizzare differenti rapporti di THPTA a CuSO4: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). eseguire la reazione in H2O (volume totale di 50 µ l) per 24 h a RT su un miscelatore rotante (20 giri).
    2. Al momento dell'accoppiamento, 3-Azido-7-hydroxycoumarin diventa una tintura fluorescente. Preparazione di campioni in condizioni di ridotte e non ridotta e analizzarli da SDS-PAGE. Visualizzare il gel sotto il canale di eccitazione con la lunghezza d'onda specifica per il 3-Azido-7-hydroxycoumarin (λabs = 404 nm; λem = 477 nm).

3. tecnica di accoppiamento covalente di BMP2-K3Plk di Azide funzionalizzati agarosio perline

  1. Incubare 2 ore a RT su un rotati 20 µM di BMP2-K3Plk o BMP2-WT (usato come controllo negativo) con 20 µ l di azide-attivato dell'agarosi branelli in un volume totale di 500 µ l di tampone di reazione (0,1 M HEPES pH 7.0, urea 3,9 M, 50 µM CuSO4, 250 µM THPTA, ascorbato di sodio di 5 mM) Miscelatore di ng (20 giri). Fermare la reazione aggiungendo 5 mM EDTA (concentrazione finale).
  2. Incubare a RT per 15 min in un miscelatore rotante (20 giri). Centrifugare i campioni a 20.000 x g per 1 min a RT. Collect i sovranatante.
  3. Lavare il pellet contenente microsfere tre volte con 1.000 µ l di tampone HBS500 (50 mM HEPES, 500 mM NaCl), tre volte con 1.000 µ l di 4 M MgCl2e due volte con 1.000 µ l di tampone fosfato salino (PBS). In ogni fase di lavaggio, centrifugare a 20.000 x g per 1 min a RT e raccogliere i surnatanti. Negozio perline accoppiati a 1.000 µ l di PBS a 4 ° C.
    Attenzione: Non disturbare il pellet perlina durante la rimozione del surnatante.

4. convalida la presenza e l'attività biologica di immobilizzato BMP2-K3Plk utilizzando Texas rosso etichettato recettore BMP ho un Ectodomain (BMPR-IA CE )

  1. Incubare 50 µ l di perline BMP2-K3Plk funzionalizzati con 1 µM di Texas Red etichettato BMPR-IACE con 150 µ l di tampone HBS500 (50 mM HEPES, 500 mM NaCl) a TA per 1h su un miscelatore rotante (20 giri).
  2. Centrifugare le perline a 20.000 x g per 1 min a RT. scartare il surnatante. Lavare le perle con 1000 µ l di tampone di500 HBS. Ripetere la fase di lavaggio di un ulteriore 3 volte. Centrifugare a 20.000 x g per 1 min RT dopo ogni fase di lavaggio.
  3. Risospendere le sfere in 500 µ l di PBS e pipettare 50 µ l su un vetrino di copertura. Impostare il filtro di microscopio tra 561 o 594 nm. Rilevare il Texas Red – BMPR-IACE– BMP2-K3Plk funzionalizzati perline usando le immagini di microscopia e prendere fluorescente.

5. misurazione della fosfatasi alcalina (ALP) espressione per dimostrare la bioattività In Vitro del prodotto BMP2-K3Plk prima e dopo la reazione di accoppiamento.

  1. Analisi della fosfatasi alcalina (ALP)
    1. Cultura promyoblastic cellule C2C12 (ATCC CRL-172) in di per volta Eagle di Dulbecco Medium (DMEM) con 10% siero fetale di vitello (FCS), 100 U/mL di penicillina G e 100 µ g/mL di streptomicina a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO2.
    2. Semi di cellule C2C12 ad una densità di 3 × 104 cellule/pozzetto in una micropiastra a 96 pozzetti. Ha lasciato le cellule allegare durante la notte. Rimuovere il mezzo e incubare le cellule C2C12 in presenza di 0.5-200 nM di BMP2-WT o BMP2-K3Plk in 100 µ l/pozzetto di DMEM (2% FCS, 100 U/mL di penicillina G e 100 µ g/mL di streptomicina) a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO2 per 72 h.
    3. Rimuovere il mezzo e lavare le cellule con 100 µ l di PBS. Lisare cellule a temperatura ambiente per 1 h con 100 µ l/pozzetto di tampone di lisi (1% NP-40, glicina 0,1 M, pH 9.6, 1 mM MgCl2, 1mm ZnCl2) su un'agitazione piastra (220 giri/min).
    4. Aggiungere 100 µ l/pozzetto di buffer di ALP (glicina di 0,1 M, pH 9.6, 1 mM MgCl2, 1mm ZnCl2) con 1 mg/mL p-nitrophenylphosphate (appena aggiunto) il lysate delle cellule.
    5. Misurare l'assorbimento a 405 nm in un lettore multidisco dopo aver aggiunto il buffer ALP e ogni 5 min fino a completo lo sviluppo del colore. Generazione di curve dose-risposta e valori di EC50 utilizzando un modello logistico, y = A2 + (A1-A2) / (1 + (x/x0)p).
  2. Macchiatura di fosfatasi alcalina (ALP)
    1. Cultura promyoblastic cellule C2C12 (ATCC CRL-172) in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) con 10% siero fetale di vitello (FCS), 100 U/mL di penicillina G e 100 µ g/mL di streptomicina a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO2.
    2. Semi di cellule C2C12 ad una densità di 3 × 104 cellule/pozzetto in una micropiastra a 96 pozzetti. Ha lasciato le cellule allegare durante la notte. Rimuovere il mezzo e aggiungere 20 µ l/pozzetto di perline BMP2-K3Plk accoppiato. BMP2-K3Plk accoppiato perle sono a 1000 µ l di una sospensione di PBS.
    3. Preparare una soluzione di agarosio di punto di fusione basso di 0,4% in DMEM. Sciogliere nel microonde (600 W per 3 min) e lasciatelo raffreddare in un bagno di acqua a 37 ° C fino all'utilizzo.
    4. Aggiungere 20 µ l di 0,4% punto di fusione basso agarosio in ciascun pozzetto (copertura perline e cellule). Centrifugare a 2000 x g per 5 min a 20 ° C. Aggiungere 80 µ l DMEM (2% FCS, 100 U/mL di penicillina G e 100 µ g/mL di streptomicina) e incubare a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO2 per 72 h.
    5. Rimuovere il mezzo, facendo attenzione a non staccare l'agarosio solidificato di 0,4%. Aggiungere 100 µ l/pozzetto di NBT 1-Step/soluzione substrato BCIP (cloruro di Nitro blu di tetrazolio, 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidina sale).
    6. Analizzare la fosfatasi alcalina che macchia usando la microscopia chiara immediatamente dopo la colorazione viola diventa apparente. Utilizzare la microscopia luminosa del campo e scattare foto.

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Representative Results

In questo articolo, descriviamo un metodo per coppie covalentemente una nuova variante di BMP2, BMP2-K3Plk, ai branelli di agarosio commercialmente disponibili azide funzionalizzati (Figura 1). La bioattività del prodotto variant BMP2-K3Plk è stata convalidata tramite l'induzione dell'espressione genica della fosfatasi alcalina (ALP) in cellule C2C12. Il test in vitro Mostra simili livelli di espressione di ALP indotti dal tipo selvaggio BMP2 (BMP2-WT) e BMP2-K3Plk (Figura 2).

Le reazioni redox tra solfato di rame (II) (CuSO4) e l'ascorbato di sodio (NaAsc) generano specie reattive dell'ossigeno che potrebbero compromettere l'integrità strutturale e quindi influenzare la bioattività di BMP2-K3Plk. Per verificare l'integrità strutturale della proteina, abbiamo effettuato un'incubazione overnight con CuSO4 e NaAsc, mostrando degrado BMP2-WT in modo concentrazione-dipendente (visualizzato da SDS-PAGE in condizioni di ridotte (Figura 3A1 )) e la formazione dei multimeri o aggregati visibili a circa 40 kDa (in condizioni di non ridotte) (Figura 3A2). Per evitare la degradazione della proteina, Tris (3-hydroxypropyltriazolyl-metil) ammina (THPTA) è stato usato come agente protettivo (Figura 3B). L'uso di THPTA impedisce la frammentazione BMP2, mentre la formazione di più alto peso molecolare strutture non potrebbe essere evitata con l'aggiunta di THPTA. Ulteriori miglioramenti della reazione indirizzata la composizione del buffer di reazione, la temperatura di reazione e tempo di reazione (dati non mostrati). Il protocollo descritto qui dettagli i risultati finali per quanto riguarda la composizione del tampone di reazione, la temperatura e tempo di reazione.

Per confermare che BMP2-K3Plk mantiene la bioattività dopo accoppiamento, abbiamo usato fluorescente contrassegnati ectodomain di recettore di tipo I recettori (BMPR-IACE) per dimostrare che la proteina immobilizzata è ancora in grado di associare a questo recettore. Perline rivestite con BMP2-K3Plk via CuAAC chimica ha reso fluorescenza quando incubati con il tingere-contrassegnati BMPR-IACE (Figura 4). In contrasto, non rivestiti di perline o che sono state incubate con BMP2-WT ha mostrato alcuna fluorescenza livelli del segnale sopra priorità bassa (dati non mostrati)14.

Dopo aver confermato la funzionalità di associazione del recettore del ligando immobilizzato in vitro, abbiamo provato anche se risposte biologiche possono essere innescate dalle perle funzionalizzate in un'analisi basata sulle celle. ALP mediata colorazione si è verificato solo in quelle cellule che erano in contatto diretto con le perline BMP2-K3Plk-funzionalizzati (Figura 5). Questo conferma che la proteina è infatti covalentemente ai talloni e non appena assorbito, poiché una colorazione più sparso alle più grandi distanze per le perline sarebbe altrimenti sono stata osservata.

Figure 1
Figura 1: raffigurazione di BMP2-K3Plk. (A) Raffigurazione della variante BMP2-K3Plk con la localizzazione della sostituzione dell'amminoacido introdotto. (B) schema di accoppiamento: reazione BMP2-K3Plk CuAAC azide funzionalizzati perline. Ristampato (adattato) con il permesso dal tasso et al. (2017): site-Directed immobilizzazione di BMP-2: due approcci per la produzione di Scaffolds innovativi osteoinduttivo. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: bioattività di varianti di BMP2. Confronto tra le bioattività (analisi di ALP) di BMP2-K3Plk e wildtype BMP2 (BMP2-WT). L'asse x rappresenta la concentrazione di BMP2-WT o BMP2-K3Plk usato per il test. I dati di EC50 rappresentano valori medi e deviazioni standard di 4 singoli esperimenti (N = 4). Ristampato (adattato) con il permesso dal tasso et al. (2017): site-Directed immobilizzazione di BMP-2: due approcci per la produzione di Scaffolds innovativi osteoinduttivo. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: effetto del riducente sull'integrità della BMP2. (A) BMP2-WT è stato esposto a diversi rapporti molari di ascorbato di sodio (NaAsc) al rame (II) solfato (CuSO4). I campioni sono stati analizzati da SDS-PAGE e macchiatura Coomassie Brilliant Blue ridotta (Figura A1) e non ridotta condizioni (Figura A2). Nelle condizioni di ridotte (A1), le frecce rosse rappresentano spaccati BMP2-WT. Nelle condizioni non ridotte (A2), le frecce rosse indicano multimerici BMP2-WT. Le bande che rappresentano spaccati BMP2 specie sono indicate da una freccia blu. Legenda: NCR - ridotto BMP2-WT non trattato; NC - BMP2-WT non trattato; 1:1 a 20:1 - crescenti rapporti molari di ascorbato di sodio a CuSO4. (B) BMP2-K3Plk è stato accoppiato a 3-Azido-7-hydroxycoumarin utilizzando condizioni di reazione di CuAAC completate con THPTA. Al momento dell'accoppiamento 3-Azido-7-hydroxycoumarin diventa una tintura fluorescente. Legenda: NC - BMP2-WT ha reagito con 3-Azido-7-hydroxycoumarin; 7:1 a 20:1 aumento rapporti molari di THPTA a CuSO4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: bioattività di immobilizzato BMP2-K3Plk in vitro. Immagine rappresentativa dell'interazione di immobilizzato BMP2-K3Plk con Texas-rosso-labelled BMPR-IACE. Ristampato (adattato) con il permesso dal tasso et al. (2017): site-Directed immobilizzazione di BMP-2: due approcci per la produzione di Scaffolds innovativi osteoinduttivo. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: bioattività di immobilizzato BMP2-K3Plk in un'analisi basata sulle celle. (A) immagine rappresentativa della fosfatasi alcalina (ALP) colorazione sul trattamento con perline accoppiato a perline BMP2-K3Plk funzionalizzati. (B) di fosfatasi alcalina (ALP) colorazione sul trattamento con solubile 25 nM BMP2-K3Plk. ristampato (adattato) con permesso dal tasso et al. (2017): site-Directed immobilizzazione di BMP-2: due approcci per la produzione di Scaffolds innovativi osteoinduttivo. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Generazione di varianti della proteina contrassegnati dall'espansione di codone genetica permette l'introduzione di vari aminoacidi non naturali analoghi principalmente in qualsiasi posizione della sequenza primaria della proteina. In caso di BMPs come BMP2, comune tag come un tag 6-istidina (sua) può solo essere presentare N-terminalmente, poiché alla fine di protein´s C-terminale è sepolto all'interno della struttura terziaria della proteina e quindi non è accessibile dall'esterno. In altre posizioni, la dimensione del tag introdotto molto probabilmente può causare alterazioni strutturali che di conseguenza eliminare la bioattività di BMP´s. Ulteriormente, l'introduzione di una mutazione nella sequenza BMP2 può influenzare l'efficacia di refolding e può anche modificare altri parametri di proteine come il punto isoelettrico della proteina modificata. Così, ogni singolo passo in un protocollo di produzione stabilito proteina potrebbe essere necessario essere adattato secondo le caratteristiche di variant´s proteina alterata. La produzione di BMP2-K3Plk infatti necessaria una modifica del metodo stabilito per l'espressione di tipo selvaggio BMP2. Tempi di cultura diversa o concentrazioni propargil-L-lisina (Plk) sono stati testati (dati non mostrati) al fine di raggiungere il più alto rendimento di espressione. Ripiegamento, separazione e purificazione passaggi fortunatamente non hanno richiesto ulteriori adattamenti. Abbiamo già segnalato che in caso di altre varianti BMP2 prodotte nel nostro laboratorio, alcune caratteristiche della proteina sono state alterate significativamente, che ha richiesto la modifica di diversi passaggi del BMP produzione metodo18. Il prodotto BMP2-K3Plk ha mostrato attività biologica paragonabile a quella della proteina wild-type. Una differenza si verifica alle alte concentrazioni di BMP2, probabilmente in conseguenza di una bassa solubilità della variante BMP2-K3Plk nel mezzo rispetto a quella di tipo selvaggio BMP2.

Nonostante i noti vantaggi di rame-catalizzata azide-alchino cicloaddizione (CuAAC)19, CuAAC reazioni devono essere attentamente adattate per applicazioni particolari. Abbiamo mostrato come BMP2 può essere frammentato o creare aggregazioni o multimeri a causa delle condizioni di reazione riducente forte. Così, tutti i parametri di reazione ha dovuto essere analizzato in dettaglio al fine di trovare condizioni che lasciano inalterati la proteina.

Il nostro approccio al legame covalente delle coppie la variante BMP2 ai branelli di agarosio azide-funzionalizzate dal clic chimica potrebbe essere realizzato con alta efficienza con conseguente funzionalizzati perline innescando la differenziazione osteogenica in vitro. Quando la proteina wild type BMP2 è stata invece utilizzata nella reazione con le perline, abbiamo potuto osservare soli debole colorazione dell'espressione di ALP, indicando che accoppiamento infatti si è verificato in modo altamente specifico tramite il residuo propargil-L-lisina di BMP2-K3Plk.

Questa specificità di accoppiamento posizionale riflette un grande miglioramento rispetto alle procedure di immobilizzazione che coinvolge chimica classica NHS/EDC. In tali casi, si verifica accoppiamento casuale, pricipalmente che coinvolge i gruppi di ammina primaria presenti nei residui di lisina. La proteina accoppiata ha una variabile attività osteogenica, dovuto la molteplicità di possibili connessioni al patibolo, che conduce a diversi orientamenti della proteina verso i recettori cellulari.

L'uso del sito-diretta immobilizzato BMP2 potrebbe superare gli inconvenienti menzionati relazionati con le dosi elevate di BMP2 solubili, che sono necessari per indurre la formazione dell'osso. Inoltre, i risultati mostrano chiaramente che alcune risposte cellulari, come il differenziamento osteogenico delle cellule C2C12, interamente vengono avviate da immobilizzato BMP2, nonostante recenti studi che affermano che il segnale trasduzione richiede endocitosi della ligando/ligando-recettore complesso20,21. I nostri risultati sono in accordo con altri studi che dimostrano che BMP2, che è accoppiato in modo covalente (ma non sito-diretta) alle superfici non-endocytosable, è ancora in grado di indurre la differenziazione di osteoblasti22.

Considerando che abbiamo usato sovra-fisiologiche concentrazioni di BMP2 per la reazione di accoppiamento, la quantità della BMP2 immobilizzato potrebbe essere ulteriormente ridotto pur conservando le proprietà osteogeniche dei branelli. Prima di tali fasi di ottimizzazione, tuttavia, l'impalcatura BMP2-K3Plk-funzionalizzati deve essere testato negli esperimenti sugli animali per dimostrare il suo potenziale osteogenico in vivo.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano il Dr. M. Rubini (Costanza, Germania) per fornire il plasmide codifica pyrrolysyl-tRNA e per la fornitura di pRSFduet-pyrtRNAsynth codifica il corrispondente aminoacyl-tRNA-sintetasi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
1-Step NBT/BCIP Thermo Fisher 34042 Add solution to cells
3-Azido-7-hydroxycoumarin BaseClick BCFA-047-1 Chemical used for click reaction
Agarose low melting point Biozym 840101 Agarose for ALP assay 
Azide agarose beads Jena Bioscience CLK-1038-2 Beads used for reaction
BamHI (Fast Digest enzyme) Thermo Fisher Scientific FD0054 Restriction enzyme
BMP receptor IA (BMPR-IAEC) -- -- Produced in our lab
Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye Thermo Fisher Scientific 20279 Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE
Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) Alfa Aesar A13986 Chemical used for click reaction
DNA Polymerase and reaction buffer  Kapabiosystems KK2102 KAPA HiFi PCR Kit
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX Gibco 61965-026 Cell culture media
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich GmbH E5134-1kg Chemical used to stop click reaction
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Carl Roth GmbH 2316.5 Bacteria induction (1mM final concentration) 
NdeI (Fast Digest enzyme) Thermo Fisher Scientific ER0581 Restriction enzyme
NHS-activated Texas Red Life technologies T6134 Coupled to receptor
P- Nitrophenyl Phosphate Sigma Aldrich GmbH N4645-1G Alkaline Phosphatase
p25N-hmBMP2  -- -- Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel
pET11a-pyrtRNA -- -- Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg
propargyl-L-lysine (Plk) -- -- Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg
pSRFduet-pyrtRNAsynth -- -- Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg
Qiagen Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Gel Purification
Qiagen PCR purification Kit Qiagen 28104 PCR Purification 
Sodium L-ascorbate Sigma Aldrich GmbH A7631-100G Chemical used for click reaction
T4 DNA Ligase ThermoScientific EL0011 Ligation 
tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) BaseClick BCMI-006-100 Chemical used for click reaction
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol Sigma Aldrich GmbH X100-1L Triton X 100 
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Amicon concentrating cell 400 ml  Merck KGaA UFSC40001 Concentrating unit
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merck KGaA UFC901024 Concentrating centrifugal unit
ÄKTA avant FPLC ÄKTA -- FPLC machine
Avanti J-26XP Beckman Coulter  393124 Centrifuge for bacterial culture
Bacterial Shaking Incubator Infors HT Shaking incubator for bacterial culture
FluorChem Q system proteinsimple -- Imaging and analysis system for SDS-PAGE
Fluorescent miscroscope Keyence BZ-9000 (BIOREVO)
Fractogel® EMD SO3- (M) Merck KGaA 116882 Ion Exchange Chromatography column material
Greiner CELLSTAR® 96 well plates Sigma M5811-40EA 96 well plates for cell culture (ALP Assay)
Heraeus Multifuge X1R ThermoScientific -- Centrifuge
M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor ThermoScientific 75003624 Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining
Microcentrifuge - 5417R Eppendorf -- Centrifuge
OriginPro 9.1 G  OriginLab -- software for stastic analysis of ALP assay data
Polysine Slides ThermoScientific 10143265 microscope slides
Rotor JA-10 Beckman Coulter  -- rotor for Avanti J-26XP centrifuge
Rotor JLA 8.1 Beckman Coulter  -- rotor for Avanti J-26XP centrifuge
Rotor JA 25.50 Beckman Coulter  -- rotor for Avanti J-26XP centrifuge
Tecan infinite M200 multiplate reader Tecan Deutschland GmbH -- Multiplate reader for ALP assay
Thermocycler - Labcycler Gradient SensoQuest GmbH -- PCR
TxRed - microscope filter Keyence Filter for fluorescent microscope 
Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa Merck KGaA PLBC04310 used with amicon concentrating cell 400ml
Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa Merck KGaA PLGC04310 used with amicon concentrating cell 400ml

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References

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Bioingegneria problema 133 rigenerazione ossea ossea morfogenetica (BMP) fattore di crescita differenziamento osteogenico Site-Directed immobilizzazione Click-chimica.
Site-Directed immobilizzazione della proteina morfogenetica ossea 2 a superfici solide di Click Chemistry
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Siverino, C., Tabisz, B., Lühmann, T., Meinel, L., Müller, T., Walles, H., Nickel, J. Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry. J. Vis. Exp. (133), e56616, doi:10.3791/56616 (2018).

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