Summary
Biologisk materiale dopet med bein Morfogenetiske proteinet 2 (BMP2) har blitt brukt som en ny terapeutiske strategi for å helbrede ikke-unionen benbrudd. For å overvinne bivirkninger som følge av en ukontrollert utgivelse av faktor, foreslår vi en ny strategi området-direkte nakkens faktoren, dermed skape materialer med forbedret osteogenic evner.
Abstract
Forskjellige strategier for behandling av ikke-healing lange ben mangler har vært intenst undersøkt. For øyeblikket brukes behandlinger finnes flere begrensninger som har ført til bruk av biologisk materiale i kombinasjon med osteogenic vekst faktorer, som bein Morfogenetiske proteiner (BMP). Brukte absorpsjon eller innkapsling metodene krever supra fysiologiske mengder BMP2, vanligvis resulterer i en såkalt første burst utgivelse effekt som provoserer flere alvorlige uønskede bivirkninger. En mulig strategi for å overvinne disse problemene vil være å covalently par protein til stillaset. Videre skal kopling utføres på en områdespesifikk måte for å garantere en reproduserbar produktet utfall. Derfor opprettet vi en BMP2 variant, der en kunstige aminosyre (propargyl-L-lysine) ble introdusert i den eldre delen av BMP2 protein ved codon behandling ekspansjon (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk ble koblet til functionalized perler gjennom kobber catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). Kombinert BMP2-K3Plk biologiske aktivitet ble påvist i vitro og osteogenic aktiviteten av BMP2-K3Plk-functionalized perler ble påvist i cellen basert analyser. Functionalized perler i kontakt med C2C12 celler klarte å indusere alkalisk fosfatase (ALP) uttrykket i lokalt begrenset nærhet perlen. Derfor, av denne teknikken, functionalized stillaser kan produseres som kan utløse celledifferensiering mot en osteogenic avstamning. I tillegg er lavere BMP2 doser nok på grunn av kontrollert orienteringen av området-rettet kombinert BMP2. Med denne metoden utsatt BMPs alltid for deres reseptorer på cellens overflate i riktig retning, hvilke ikke er saken hvis faktorene er koplet via nettstedet-Uadresserte kopling teknikker. Produktet Resultatet er svært kontrollerbare og dermed resulterer i materialer med homogen egenskaper, forbedre deres anvendelighet for reparasjon av kritisk størrelse bein mangler.
Introduction
Det endelige målet med bein vev engineering og bein gjenfødelse er å overvinne ulemper og begrensninger oppstår under vanlige behandlinger av ikke-unionen frakturer. Auto - eller allo-transplantasjoner brukes hovedsakelig som gjeldende terapi strategier, selv om de begge har flere ulemper. Ideell benet pode skal indusere osteogenesis av osteoinduction samt osteoconduction, fører til osteointegration av graftet i benet. I dag, er bare auto-transplantasjon regnet som "gullstandarden" siden det gir alle karakteristikkene av en ideell bein pode. Dessverre også presenterer viktige negative aspekter som lang kirurgi ganger, og en andre traumer nettsted som vanligvis innebærer mer komplikasjoner (f.eks, kroniske smerter, hematoma formasjoner, infeksjoner, kosmetiske feil, etc.). Allogenic grafts, har derimot suboptimal egenskaper for alle generelle aspektene1. Alternative bein pode teknologi forbedret de siste årene, med sikte på å produsere stillaser som er osteoinductive, osteoconductive, biokompatible, og bioresorbable. Siden mange biologisk materiale ikke viser alle disse osteogenic egenskaper, er ulike vekstfaktorer, hovedsakelig BMP2 og BMP7, innarbeidet for å forbedre osteogenic potensialet av bestemt stillaset2.
Som en viktig kriterium, bør slik vekstfaktor leveringssystemer gi en kontrollert dose utgivelse over tid for å lette viktige hendelser som celle rekruttering og vedlegg, cellen ingrowth og angiogenese. Imidlertid immobilisert BMPs samt andre osteogenic vekst faktorer er vanligvis ikke-covalently3. Entrapment og adsorpsjon teknikker krever bruk av supra fysiologiske mengder protein på grunn av en første burst utgivelse, som fører til alvorlige ulemper i vivo, vanligvis påvirker omkringliggende vev ved å fremkalle bein overvekst, osteolysis, hevelse og betennelse4. Oppbevaring av vekstfaktorer på leveringssted for lengre perioder kan dermed oppnås ved kovalente immobilisering metoder. Kjemisk endret BMP2 (succinylated5, acetylated6 eller biotinylated7), utviklet heterodimerer8eller BMP2 avledede oligopeptides9 er utviklet og brukt til å overvinne begrensningene knyttet til absorpsjon. Bio-aktiviteten til disse konstruerer er imidlertid ikke forutsigbar siden ordningen potensielt hemmer binding av ligand immobilisert på mobilnettet reseptorene. Som tidligere vist er det viktig at alle fire reseptor kjeder involvert i dannelsen av aktivert ligand-reseptor komplekser samhandle med immobilisert BMP2 vil fullt aktivere alle nedstrøms signalnettverk cascades10.
For å overvinne problemene med ikke-homogen produktet resultat med begrensninger i bioactivity, stabilitet og biotilgjengelighet av immobilisert faktor, utviklet vi en BMP variant kan covalently bindende stillaser i en område-rettet måte. Denne varianten, kalt BMP2-K3Plk, omfatter en kunstig aminosyre som ble introdusert av genetisk codon ekspansjon11. Denne varianten er koblet til stillaser bruker en kovalente kopling strategi samtidig opprettholde sin biologiske aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. produksjon av BMP2 Variant BMP2-K3Plk
- Kloning av BMP2-K3Plk av området-rettet mutagenese bruker PCR 12
- Forsterke human moden BMP2 (hmBMP2) fra en p25N-hmBMP2-vektor (se Tabell for materiale) med en frem primer (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3) og en omvendt primer (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3) introdusere en oransje stopp codon ( TAG) på plasseringen av den første lysin av BMP2´s kjønnsmodne del. Utføre PCR reaksjonen bruker 33,5 µL av H2O, 10 µL av PCR reaksjonen blanding, 1,5 µL av 10 µM dNTP lager løsning, 1,5 µL av fremover primer (10 pmol/µL), 1,5 µL av omvendt primer (10 pmol/µL), 1 µL av p25N-hmBMP2 (10 ng/µL) , og 1 µL av DNA polymerase (se Tabell for materiale) i en termisk cycler (rødsprit ved 95 ° C i 5 minutter, 30 sykluser av rødsprit 95 ° c for 1 min, annealing ved 60 ° C i 1 min forlengelse ved 72 ° C i 1 min og en endelig utvidelse ved 72 ° C i 10 min).
- Rense PCR produktet ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig utstyr etter produsent anbefalinger (se Tabell for materiale).
- Fordøye PCR produktet med begrensning enzymet NdeI ved 37 ° C i 45 min med 16 µL av H2O, 3 µL fordøyelsen bufferen, 10 µL av DNA (20 ng/µL), og 1 µL av begrensning enzym. Varme-Deaktiver enzymet på 65 ° C for 5 min. fordøye PCR produktet med begrensning enzymet BamHI ved 37 ° C i 1 time med 16 µL av H2O, 3 µL fordøyelsen bufferen, 10 µL av DNA (20 ng/µL), og 1 µL av begrensning enzym. Varme-Deaktiver enzym ved 80 ° C i 5 minutter.
- Fordøye den pET11a-pyrtRNA vektoren med NdeI på 37 ° C i 2 h og 45 minutter med 16 µL av H2O, 3 µL fordøyelsen bufferen, 10 µL av DNA (20 ng / µL), og 1 µL av begrensning enzym. Varme-Deaktiver på 65 ° C for 5 min. fordøye angrepsvektorene i pET11a-pyrtRNA med BamHI ved 37 ° C i 1 time med 16 µL av H2O, 3 µL fordøyelsen bufferen, 10 µL av DNA (20 ng/µL), og 1 µL av begrensning enzym. Varme-Deaktiver ved 80 ° C i 5 minutter.
- Separate fordøyd vektoren ufordøyd angrepsvektorene og fordøyelsen restene av agarose gel geleelektroforese (0,8% agarose, 60 min 100 V). Ligate fordøyd BMP2-K3TAG innsatsen med fordøyd pET11a-pyrtRNA ryggraden ved romtemperatur (RT) for 2t bruk 100 ng pET11a-pyrtRNA ryggraden og 34,5 ng av BMP2-K3TAG sette (1:3 molar ratio). Reaksjonsblandingen inneholder DNA ryggraden og sett inn, 2 µL ligase bufferen, 1 µL av DNA ligase og H2O til et totalvolum på 20 µL.
- Utføre en co transformasjonen av pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk og pSRF-duett-pyrtRNAsynth i BL21(DE3) bakterier:
- Legge 50 ng av hver plasmider til bakterier, plasser blandingen på is 30 min, varme støt ved 42 ° C i 50 s, plassere på is 5 min, legge til 500 µL Lysogeny kjøttkraft (LB) medium i blandingen og riste på 300 rpm for 60 min.
- Spre 100 µL av bakteriell blandingen på forvarmes kanamycin (50 µg/mL) / ampicillin (100 µg/mL) plater, og ruge over natten på 37 ° C.
- Uttrykk og rensing av BMP2-K3Plk 13 , 14
- Overføre en enkelt koloni overnatter i 50 mL av LB medium med 50 µg/mL av kanamycin og 100 µg/mL ampicillin på 37 ° C.
- Fortynne overnatting kulturer 1:20 til 800 mL kjempefint kjøttkraft (TB) medium med 50 µg/mL av kanamycin og 100 µg/mL ampicillin, og vokser på 37 ° C til en OD600 av 0,7 er nådd. Legge til propargyl-L-lysine en siste konsentrasjon av 10 mM. Samle et 100 µL utvalg fra kulturen før isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induksjon.
- Indusere genuttrykk ved tillegg av IPTG til en siste konsentrasjon av 1 mM. Vokse kulturen på 37 ° C 16 h i en orbital shaker på 180 rpm. Samle et 100 µL utvalg fra kulturen.
- Sentrifuge hele kulturen 9000 x g for 30 min. Forkast nedbryting, og resuspend den bakterielle pellet i 30 mL av TBSE buffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA)) med 1:1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (nylig lagt).
Forsiktig: Håndtere 2-mercaptoethanol under avtrekksvifte. Unngå kontakt med hud og øyne. Unngå innånding av damp eller tåke. Utføre alle rørets trinnene med buffere som inneholder 2-mercaptoethanol under avtrekksvifte. - Veie en tom sentrifuge kanne og Overfør urinprøven til tom begeret. Sentrifuge 6,360 x g i 20 min. Forkast nedbryting og veie kanne med pellet. Trekk vekten av Tom begeret til å beregne vekten av pellet.
Merk: Protokollen kan pauses her. Fryse pellet ved 20 ° C på kort sikt eller-80 ° C på lang sikt. På gjenoppta protokollen, tine pellet på RT. - Resuspend pellet STE buffer (10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 375 mM sukrose, 1:1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (nylig lagt)). Bruk 200 mL STE buffer for hver 10 g av pellets.
- Sonicate suspensjon på is (10 min 40 s puls, 20 s brems og 30% amplituden). Sentrifuge 6,360 x g i 20 min. Forkast nedbryting og veie pellet. Gjenta sonication og sentrifugering trinnene 4 ganger.
- Resuspend pellet i 100 mL TBS buffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl). Sentrifuge 6,360 x g i 20 min. Forkast nedbryting og veie pellets.
- Resuspend pellets nuclease buffer (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl2) med nykvernet lagt 80 U/mL nuclease (f.eksBenzonase) med 10 mL/g av pellets. Inkuber suspensjon overnatting på RT på en gripende plate (30 rpm).
- Legge til Triton buffer (60 mM EDTA, 1,5 M NaCl, 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) fenyl-polyetylenglykol) til suspensjon. Volumet av Triton buffer til tilsvarer en 0,5 volum del av suspensjon. Inkuber i 10 min på RT (ingen omrøring). Sentrifuge 6,360 x g i 20 min. Forkast nedbryting og veie pellet.
- Resuspend pellet TE buffer (100 mM Tris, 20 mM EDTA) bruker 8 mL/g av pellets. Sentrifuge 6,360 x g i 20 min. Forkast nedbryting og veie pellet.
- Resuspend pellet ved å legge 4 mL/g av 25 mM NaAc pH 5.0 og 5 mL/g av 6 M GuCl med 1 mM dithiothreitol (DTT) (nylig lagt). Inkuber suspensjon overnatting på 4 ° C på en gripende plate (30 rpm).
- Sentrifuge 75.500 x g for 20 min. Nedbryting inneholder nå ufalsede monomerisk BMP2 protein. Samle nedbryting og konsentrere dette ekstrakt til 20 OD/mL bruker en 3 kDa molekylvekt cut-off (MWCO) membran i en konsentrasjon celle (se Tabell for materiale).
- Legge til konsentrert monomerer i enkelt dråper til Renaturation bufferen (2 M LiCl, 50 mM Tris, 25 mM CHAPS, 5 mM EDTA, 1 mM glutation disulfide (GSSG), 2 mM glutathione (GSH)) mens røring (30 rpm). Ruge på RT 120 h i mørket.
Merk: Under denne inkubasjonstiden, refolding occours. Løsningen fra dette trinnet videre inneholder de kastet dimeric BMP2-K3Plk. - Justere pH av løsningen 3.0 bruker konsentrert HCl. Dialyze løsningen mot 1 mM HCl. konsentrat dialyzed løsningen bruker en 10 kDa molekylvekt cut-off (MWCO) membran i en konsentrere celle.
- Equilibrate løsningen ved å legge til buffer en (20 mM NaAc, 30% isopropanol). Legge til et volum på bufferen A tilsvarer et 30% volum av løsningen. Sentrifuge løsningen 4700 x g i 15 min.
- Equilibrate kolonnen for ion utveksling på en rask protein flytende kromatografi (FPLC) system15 med 150 mL buffer A. Load protein løsningen på kolonnen equilibrated. Elute fraksjoner ved hjelp av en lineær forløpning bufferen B (20 mM NaAc, 30% isopropanol, 2 M NaCl) med 100 mL buffer B. samle 2 mL fraksjoner.
Merk: Konsentrere protein før lasting kolonnen etter totalt kolonnen volumet. Siste protein volumet skal < 5% av totale kolonnen. - Analysere 20 µL av hver fraksjon av SDS polyakrylamid gel (12%) geleelektroforese (SDS-side) 16 og Coomassie briljant blå flekker17 (se Tabell for materiale).
Merk: Coomassie briljant blå farget SDS side gel viser brøker som inneholder dimers (26 kDa) og brøker som inneholder monomerer (13 kDa). - Basseng dimer inneholder brøker. Dialyze pool av dimer som inneholder brøker overnatting på 4 ° C mot 1 mM HCl (5 liters volum). Konsentrere det endelige produktet ved hjelp av en 10 kDa konsentrere sentrifugal filter enhet (se Tabell for materiale). Analysere det endelige produktet av SDS polyakrylamid (12%) gel gelelektroforese (SDS-side) og Coomassie briljant blå flekker.
Merk: Bandet på Coomassie briljant blå farget SDS side gel skal vise bare ett band på 26 kDa. Dette er BMP2-K3Plk sluttproduktet.
2. optimalisering av kobber (I)-katalysert Alkyne-Azide Cycloaddition (CuAAC) forhold
- Effekten av natrium ascorbate (NaAsc) og kobber (II) sulfate (CuSO 4 ) på wild type BMP2 (BMP2-WT)
- Inkuber 20 µM BMP2-WT med ulike forhold av NaAsc til CuSO4. Bruk 0,5 mM NaAsc og 0,5 mM CuSO4 (starter konsentrasjon) i et 50 µL volum. Fortsette med følgende prosenter av NaAsc til CuSO4: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20: 1), holde CuSO4 konsentrasjonen konstant på 0,5 mM og justere konsentrasjonen av NaAsc tilsvarende. Utføre reaksjonen i H2O på en roterende mikser (20 rpm) natten RT.
- Forberede redusert eksemplene ved å legge til lasting bufferen som inneholder 5% 2-mercaptoethanol og ruge eksempel på 95 ° C for 6 min. analyser redusert og ikke-redusert eksemplene av SDS polyakrylamid gel (12%) gelelektroforese (SDS-side) og Coomassie briljant blå flekker. Coomasie farget SDS side gels viser band mellom 13 kDa (redusert conditons) til 26 kDa og høyere molekylvekt (ikke-reduserte betingelser).
-
Effekten av Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) Amin (THPTA) på CuAAC reaksjonen
- Inkuber 20 µM BMP2-K3Plk med ulike forhold av THPTA til CuSO4. Bruke 5 mM NaAsc og 200 µM 3-Azido-7-hydroxycoumarin (holde NaAsc og 3-Azido-7-hydroxycoumarin konstant). Bruke 50 µM THPTA og 0,5 mM CuSO4 som starter konsentrasjoner. Bruke ulike forhold av THPTA til CuSO4: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). utføre reaksjon i H2O (50 µL totalt volum) for 24 h på RT på en roterende mikser (20 rpm).
- Ved kobling blir 3-Azido-7-hydroxycoumarin et lysstoffrør fargestoff. Forberede prøver redusert og ikke-redusert og analysere dem SDS-side. Visualisere geléer under eksitasjon kanalen med bestemt bølgelengde for 3-Azido-7-hydroxycoumarin (λabs = 404 nm; λem = 477 nm).
3. kovalente kopling teknikken av BMP2-K3Plk til Azide Functionalized Agarose perler
- Inkuber 20 µM BMP2-K3Plk eller BMP2-WT (brukt som negativ kontroll) med 20 µL av azide-aktivert agarose perler i et totalt volum på 500 µL reaksjon buffer (0.1 M HEPES pH 7.0, 3,9 M urea, 50 µM CuSO4, 250 µM THPTA, 5 mM natrium ascorbate) 2 h på RT på en rotati ng blandebatteri (20 rpm). Stoppe reaksjonen ved å legge til 5 mM EDTA (siste konsentrasjon).
- Ruge på RT i 15 min på en roterende mikser (20 rpm). Sentrifuge eksempler på 20.000 x g for 1 min på RT. samle supernatants.
- Vask pellet inneholder perlene tre ganger med 1000 µL HBS500 bufferen (50 mM HEPES, 500 mM NaCl), tre ganger 1000 µL av 4 M MgCl2, og to ganger med 1000 µL fosfat bufret saltoppløsning (PBS). Alle vask trinn, sentrifuge 20.000 x g for 1 min på RT og samle supernatants. Lagre kombinert perler i 1000 µL av PBS på 4 ° C.
Forsiktig: Ikke forstyrr perle pellets under fjerning nedbryting.
4. validering tilstedeværelse og biologiske aktivitet immobilisert BMP2-K3Plk ved hjelp av Texas røde merket BMP reseptor jeg en Ectodomain (BMPR-IA EC )
- Inkuber 50 µL av BMP2-K3Plk functionalized perler med 1 µM Texas rød merket BMPR-IAEC med 150 µL HBS500 bufferen (50 mM HEPES, 500 mM NaCl) på RT 1t på en roterende mikser (20 rpm).
- Sentrifuge perler på 20.000 x g for 1 min på RT. Forkast nedbryting. Vask perler med 1000 µL HBS500 bufferen. Gjenta vask trinnet ytterligere 3 ganger. Sentrifuger 20.000 x g for 1 min på RT etter hver vask trinn.
- Resuspend perler i 500 µL av PBS og Pipetter 50 µL på et glass cover lysbilde. Satt mikroskop filteret mellom 561 eller 594 nm. Oppdage Texas rød-BMPR-IAEF-BMP2-K3Plk functionalized perler med fluorescerende mikroskopi og ta bilder.
5. måle alkalisk fosfatase (ALP) uttrykk for å vise seg På Vitro Bioactivity produsert BMP2-K3Plk før og etter koblingen reaksjon.
-
Alkalisk fosfatase (ALP) analysen
- Kultur promyoblastic C2C12 celler (ATCC CRL-172) i Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM) med 10% fosterets kalv Serum (FCS), 100 U/mL penicillin G og 100 µg/mL streptomycin på 37 ° C i en fuktet atmosfære på 5% CO2.
- Frø C2C12 cellene på en tetthet av 3 × 104 celler/godt inn i en 96-brønnen microplate. La celler knytte overnatting. Fjerne medium og Inkuber C2C12 celler i nærvær av 0,5-200 nM BMP2-WT eller BMP2-K3Plk i 100 µL/godt av DMEM (2% FCS, 100 U/mL penicillin G og 100 µg/mL streptomycin) på 37 ° C i en fuktet atmosfære på 5% CO2 72 h.
- Fjerne medium og vask celler med 100 µL av PBS per brønn. Lyse cellene på RT 1t med 100 µL/godt av lyseringsbuffer (1% NP-40, 0.1 M glysin, pH 9.6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) på risting plate (220 rpm).
- Legg 100 µL/vel ALP bufferen (0.1 M glysin, pH 9.6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) med 1 mg/mL p-nitrophenylphosphate (nylig lagt) til lysate-cellen.
- Måle absorpsjon ved 405 nm i en multiplate leser etter tilføyer ALP bufferen, og hver 5 min til utviklingen av fargen er fullført. Generere dose svar kurver og EC50 verdier ved hjelp av en logistikk modell, y = A2 + (A1-A2) / (1 + (x/x0)p).
-
Alkalisk fosfatase (ALP) flekker
- Kultur promyoblastic C2C12 celler (ATCC CRL-172) i Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) med 10% fosterets kalv Serum (FCS), 100 U/mL penicillin G og 100 µg/mL streptomycin på 37 ° C i en fuktet atmosfære på 5% CO2.
- Frø C2C12 cellene på en tetthet av 3 × 104 celler/godt i en 96-brønnen microplate. La celler knytte overnatting. Fjern medium og tilsett 20 µL/vel av BMP2-K3Plk kombinert perler. BMP2-K3Plk kombinert perler er i 1000 µL av en PBS suspensjon.
- Forberede en løsning av 0,4% lav-smelte-punkt agarose i DMEM. Smelte i mikrobølgeovn (600 M til 3 min) og la den avkjøles i et vannbad på 37 ° C før bruk.
- Legge til 20 µL av 0,4% lav-smelte-punkt agarose i hver brønn (dekker perler og celler). Sentrifuger 2000 x g i 5 min på 20 ° C. Legg til 80 µL DMEM (2% FCS, 100 U/mL penicillin G og 100 µg/mL streptomycin) og ruge på 37 ° C i en fuktet atmosfære på 5% CO2 72 h.
- Fjerne medium, være forsiktig med å løsne den befestet 0,4% agarose. Legge til 100 µL/godt av 1-trinns NBT/BCIP (Nitro-blå tetrazolium chloride, 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidine salt) substratløsningen.
- Analysere alkalisk fosfatase flekker bruker * lys straks den lilla flekker blir tydelig. Bruk lyse feltet mikroskopi og ta bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne artikkelen beskriver vi en metode for å covalently par en ny BMP2 variant, BMP2-K3Plk, til kommersielt tilgjengelig azide functionalized agarose perler (figur 1). Bioactivity for den produserte BMP2-K3Plk-varianten ble godkjent av induksjon av alkalisk fosfatase (ALP) genuttrykk i C2C12 celler. I vitro testen viser lignende ALP uttrykk nivåer av vill-type BMP2 (BMP2-WT) og BMP2-K3Plk (figur 2).
Redoksreaksjoner mellom kobber (II) sulfate (CuSO4) og natrium ascorbate (NaAsc) genererer reaktive oksygen arter som kan påvirke den strukturelle integriteten og dermed påvirke bioactivity av BMP2-K3Plk. For å bekrefte den strukturelle integriteten av protein, utført vi en overnatting inkubasjon med CuSO4 og NaAsc, viser BMP2-WT fornedrelse i en konsentrasjon-avhengige måte (visualisert SDS-side under redusert forhold (figur 3A1 )) og dannelsen av multimers eller aggregater synlig på ca 40 kDa (under ikke-reduserte betingelser) (figur 3A2). Unngå protein fornedrelse, Tris (3-hydroxypropyltriazolyl-metyl) Amin (THPTA) ble brukt som beskyttende agent (figur 3B). Bruk av THPTA forhindrer BMP2 fragmentering, mens dannelsen av høyere molekylvekt strukturer ikke kan forebygges ved tillegg av THPTA. Ytterligere forbedringer av reaksjonen adressert sammensetningen av reaksjon bufferen, reaksjon temperatur og reaksjonstid (data ikke vist). Protokollen beskrevet her detaljer siste prestasjoner om reaksjon buffer sammensetning, temperatur og reaksjonstid.
For å bekrefte at BMP2-K3Plk beholder bioactivity etter kopling, vi brukte fluorescently merket reseptoren ectodomain protein av typen jeg reseptor (BMPR-IAEC) å vise at immobilisert protein er fortsatt i stand til å binde til denne reseptoren. Perler belagt med BMP2-K3Plk via CuAAC kjemi gitt fluorescens når inkubert med fargestoff-merket BMPR-IAEC (Figur 4). I kontrast, ikke-belagt perler eller perler som ble inkubert med BMP2-WT viste ingen fluorescens nivåer signalet over bakgrunnen (data ikke vist)14.
Etter å ha bekreftet reseptor bindende evner for immobilisert ligand vitro, testet vi også om biologiske responser kan utløses av functionalized perler i en cellebasert analysen. ALP mediert farging skjedde bare i disse cellene som var i direkte kontakt med BMP2-K3Plk-functionalized perler (figur 5). Dette bekrefter at protein er faktisk covalently knyttet til perler og ikke bare absorbert, siden en mer spre ut flekker på større avstander til perlene ville ellers er observert.
Figur 1: skildring av BMP2-K3Plk. (A) Fremstilling av BMP2-K3Plk variant med lokalisering av introduserte aminosyre substitusjon. (B) kopling ordningen: BMP2-K3Plk CuAAC reaksjon med azide functionalized perler. Gjengitt (tilpasset) med tillatelse fra Tabisz et al. (2017): nettsted rettet immobilisering av BMP-2: to tilnærminger for produksjon av nyskapende Osteoinductive stillaser. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Opphavsrett 2017 American Chemical Society) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Bioactivity BMP2-varianter. Sammenligning av bioactivities (ALP analysen) BMP2-K3Plk og wildtype BMP2 (BMP2-WT). X-aksen representerer konsentrasjonen av BMP2-WT eller BMP2-K3Plk brukt i analysen. EC50 data representerer betyr verdier og standardavvik av 4 individuelle eksperimenter (N = 4). Gjengitt (tilpasset) med tillatelse fra Tabisz et al. (2017): nettsted rettet immobilisering av BMP-2: to tilnærminger for produksjon av nyskapende Osteoinductive stillaser. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Opphavsrett 2017 American Chemical Society) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: effekten av redusert agent på integriteten til BMP2. (A) BMP2-WT ble utsatt for ulike molar forhold av natrium ascorbate (NaAsc) til kobber (II) sulfate (CuSO4). Prøvene ble analysert av SDS side og Coomassie briljant blå flekker under redusert (Figur A1) og ikke-reduserte forhold (Figur A2). I redusert forhold (A1) representerer den røde piler kløyvde BMP2-WT. I de ikke-reduserte forholdene (A2) indikerer de røde pilene multimeric BMP2-WT. Feltene representerer kløyvde BMP2 arter er angitt med en blå pil. Forklaring: NCR - redusert BMP2-WT ubehandlet; NC - BMP2-WT ubehandlet; 11:20:1-økende molar prosenter av natrium askorbat til CuSO4. (B) BMP2-K3Plk ble koblet til 3-Azido-7-hydroxycoumarin CuAAC reaksjon betingelser med THPTA. Ved kobling blir 3-Azido-7-hydroxycoumarin et lysstoffrør fargestoff. Forklaring: NC - BMP2-WT reagert med 3-Azido-7-hydroxycoumarin; 7:1 til 20:1 øke molar prosenter av THPTA til CuSO4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Bioactivity av immobilisert BMP2-K3Plk i vitro. Representativt bilde av samspillet av immobilisert BMP2-K3Plk med Texas-rød-merket BMPR-IAEF. Gjengitt (tilpasset) med tillatelse fra Tabisz et al. (2017): nettsted rettet immobilisering av BMP-2: to tilnærminger for produksjon av nyskapende Osteoinductive stillaser. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Opphavsrett 2017 American Chemical Society) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Bioactivity av immobilisert BMP2-K3Plk i en cellebasert analysen. (A) representativt bilde av alkalisk fosfatase (ALP) flekker på behandling med perler koblet til BMP2-K3Plk functionalized perler. (B) alkalisk fosfatase (ALP) flekker på behandling med løselig 25 nM BMP2-K3Plk. Reprinted (tilpasset) med tillatelse fra Tabisz et al. (2017): nettsted rettet immobilisering av BMP-2: to tilnærminger for produksjon av nyskapende Osteoinductive stillaser. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Opphavsrett 2017 American Chemical Society) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generere merket protein varianter av genetisk codon utvidelsen lar innføring av ulike ikke-naturlige aminosyre analogs hovedsakelig på enhver posisjon av primære protein sekvensen. Hvis BMP som BMP2, felles koder som en 6-histidin (hans) kode kan bare være introdusert N-Terminal, siden protein´s C-terminalen slutten er gravlagt i tertiær protein strukturen, og er derfor ikke tilgjengelig fra utsiden. På andre stillinger, kan størrelsen på introdusert koden svært sannsynlig forårsake strukturelle endringer som følgelig utslette BMP´s bioactivity. Videre introduserer en mutasjon i BMP2-sekvensen kan påvirke refolding effekten, og kan også endre andre protein parametere som isoelectric poenget med endrede protein. Dermed må hvert enkelt trinn i en etablert protein produksjon protokollen tilpasses i henhold til endrede protein variant´s egenskapene. Produksjon av BMP2-K3Plk faktisk kreves en endring av etablerte metoden for uttrykket av vill-type BMP2. Annen kultur ganger eller propargyl-L-lysine (Plk) konsentrasjoner ble testet (data ikke vist) for å nå høyeste uttrykk avkastningen. Refolding, krever atskillelse og renselse heldigvis ikke ytterligere tilpasninger. Vi har allerede rapportert at ved andre BMP2 varianter produsert i vår lab, noen protein egenskaper ble endret betydelig, som krevde endring av flere trinn BMP produksjon metoden18. Den produserte BMP2-K3Plk viste biologiske aktivitet sammenlignes med wild type protein. Det er forskjell på høy BMP2 konsentrasjoner, sannsynligvis som følge av en lavere Løseligheten av den BMP2-K3Plk-varianten i medium sammenlignet med wild type BMP2.
Til tross for kjent fordelene med kobber-katalysert azide-alkyne cycloaddition (CuAAC)19, skal CuAAC reaksjoner være nøye tilpasset bestemte programmer. Vi viste hvordan BMP2 kan være fragmentert eller opprette tilslag eller multimers på grunn av sterk reduksjon reaksjon forhold. Dermed måtte alle reaksjon parametere bli analysert i detalj for å finne tilstander som forlater protein upåvirket.
Vår tilnærming til covalently par BMP2 varianten til azide-functionalized agarose perler av Klikk kjemi kan realiseres med høy effektivitet som resulterer i functionalized perler utløser osteogenic differensiering i vitro. Da wild type BMP2 protein ble brukt i reaksjon med perler i stedet, kunne vi observere bare svake flekker ALP uttrykk, som angir at koblingen faktisk skjedde svært spesielt via propargyl-L-lysin rester av BMP2-K3Plk.
Denne posisjonelle kopling spesifisitet gjenspeiler en stor forbedring i forhold til immobilisering prosedyrene som involverer klassisk NHS/EDC kjemi. I slike tilfeller skjer tilfeldig koplingen, hovedsakelig med de primære Amin gruppene i lysin rester. Kombinert protein har en variabel osteogenic aktivitet, på grunn av mangfoldet av mulige tilkoblinger til skafottet, fører til ulike retninger av proteinet mot celle reseptorer.
Bruk av området-direkte immobilisert BMP2 kan overvinne nevnte ulempene knyttet til de høye doser av løselig BMP2, som er nødvendig for å skape bein. I tillegg resultatene tydelig viser at enkelte mobilnettet svar, som osteogenic differensiering av C2C12 celler, er helt initiert av immobilisert BMP2, til tross for studier hevder at signal signaltransduksjon krever endocytose av den ligand/ligand-reseptor komplekse20,21. Våre funn er med andre studier viser at BMP2, som er kombinert covalently (men ikke område-regisserte) til ikke-endocytosable overflater, er fremdeles å indusere osteoblast differensiering22.
Mengden immobilisert BMP2 vurderer at vi har brukt supra fysiologiske konsentrasjoner av BMP2 for kopling reaksjonen, og kan videre bli redusert mens fortsatt spare osteogenic egenskaper av perler. Før slike optimering skritt, men må BMP2-K3Plk-functionalized stillaset testes i dyreforsøk å bevise sin osteogenic potensielle i vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. M. Rubini (Konstanz, Tyskland) for å gi plasmider koding pyrrolysyl-tRNA og for pRSFduet-pyrtRNAsynth koding tilsvarende aminoacyl-tRNA synthetase.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1-Step NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Add solution to cells |
| 3-Azido-7-hydroxycoumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Chemical used for click reaction |
| Agarose low melting point | Biozym | 840101 | Agarose for ALP assay |
| Azide agarose beads | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Beads used for reaction |
| BamHI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriction enzyme |
| BMP receptor IA (BMPR-IAEC) | -- | -- | Produced in our lab |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE |
| Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Chemical used for click reaction |
| DNA Polymerase and reaction buffer | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Cell culture media |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Chemical used to stop click reaction |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bacteria induction (1mM final concentration) |
| NdeI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriction enzyme |
| NHS-activated Texas Red | Life technologies | T6134 | Coupled to receptor |
| P- Nitrophenyl Phosphate | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkaline Phosphatase |
| p25N-hmBMP2 | -- | -- | Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| propargyl-L-lysine (Plk) | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel Purification |
| Qiagen PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR Purification |
| Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Chemical used for click reaction |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligation |
| tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Chemical used for click reaction |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon concentrating cell 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Concentrating unit |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck KGaA | UFC901024 | Concentrating centrifugal unit |
| ÄKTA avant FPLC | ÄKTA | -- | FPLC machine |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge for bacterial culture |
| Bacterial Shaking Incubator | Infors HT | Shaking incubator for bacterial culture | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | -- | Imaging and analysis system for SDS-PAGE |
| Fluorescent miscroscope | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3- (M) | Merck KGaA | 116882 | Ion Exchange Chromatography column material |
| Greiner CELLSTAR® 96 well plates | Sigma | M5811-40EA | 96 well plates for cell culture (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | -- | Centrifuge |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoScientific | 75003624 | Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining |
| Microcentrifuge - 5417R | Eppendorf | -- | Centrifuge |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | -- | software for stastic analysis of ALP assay data |
| Polysine Slides | ThermoScientific | 10143265 | microscope slides |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Tecan infinite M200 multiplate reader | Tecan Deutschland GmbH | -- | Multiplate reader for ALP assay |
| Thermocycler - Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | -- | PCR |
| TxRed - microscope filter | Keyence | Filter for fluorescent microscope | |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
References
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: An update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27 (2005).
- Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations. Biofactors. 40 (5), 459-481 (2014).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., Merkle, H. P., Gander, B. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur J Pharm Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Haidar, Z. S., Hamdy, R. C., Tabrizian, M. Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part A: Current challenges in BMP delivery. Biotechnol Lett. 31 (12), 1817-1824 (2009).
- Hollinger, J. O., Uludag, H., Winn, S. R. Sustained release emphasizing recombinant human bone morphogenetic protein-2. Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 303-318 (1998).
- Uludag, H., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: A correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J Biomed Mater Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Uludag, H., Golden, J., Palmer, R., Wozney, J. M. Biotinated bone morphogenetic protein-2: In vivo and in vitro activity. Biotechnol Bioeng. 65 (6), 668-672 (1999).
- Aono, A., et al. Potent ectopic bone-inducing activity of bone morphogenetic protein-4/7 heterodimer. Biochem Biophys Res Commun. 210 (3), 670-677 (1995).
- Suzuki, Y., et al. Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo. J Biomed Mater Res. 50 (3), 405-409 (2000).
- Knaus, P., Sebald, W. Cooperativity of binding epitopes and receptor chains in the BMP/TGFbeta superfamily. Biol Chem. 382 (8), 1189-1195 (2001).
- Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 225-249 (2006).
- Costa, G. L., Weiner, M. P. Rapid PCR site-directed mutagenesis. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2. FEBS Lett. 468 (2-3), 215-219 (2000).
- Tabisz, B., et al. Site-directed immobilization of BMP-2: Two approaches for the production of innovative osteoinductive scaffolds. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708 (2017).
- Duong-Ly, K. C., Gabelli, S. B. Using ion exchange chromatography to purify a recombinantly expressed protein. Methods Enzymol. 541, 95-103 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II. EMBO J. 19 (13), 3314-3324 (2000).
- Hein, J. E., Fokin, V. V. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides. Chem Soc Rev. 39 (4), 1302-1315 (2010).
- Alborzinia, H., et al. Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists. J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).
- Paarmann, P., et al. Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling. Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).
- Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
