Summary
Biomateriais dopados com 2 de Proteína morfogenética óssea (BMP2) utilizaram-se como uma nova estratégia terapêutica para curar fraturas não-união óssea. Para superar os efeitos secundários resultantes de uma incontrolável liberação do fator, propomos uma nova estratégia para o site-imobilizar diretamente o fator, criando assim materiais com capacidade osteogênica melhorada.
Abstract
Diferentes estratégias terapêuticas para o tratamento de não-cura ossos longos defeitos foram intensamente investigadas. Atualmente usado tratamentos presentes várias limitações que conduziram ao uso de biomateriais em combinação com fatores de crescimento osteogênicos, tais como proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs). Métodos comumente usados de absorção ou encapsulamento requerem quantidades supra fisiológicos de BMP2, geralmente resultando em um efeito de lançamento do chamado surto inicial que provoca vários graves efeitos colaterais. Uma estratégia possível para superar esses problemas seria casal covalentemente a proteína para o cadafalso. Além disso, acoplamento deve ser realizado de forma específica a fim de garantir um resultado de produto reprodutível. Por isso, criámos uma variante BMP2, em que um aminoácido artificial (propargil-L-lisina) foi introduzido a parte madura da proteína BMP2 pela expansão de uso de códon (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk foi acoplado ao funcionalizados grânulos através de cobre catalisada azida-alquino cicloadição (CuAAC). A atividade biológica da BMP2-K3Plk acoplado foi comprovada em vitro e a atividade osteogênica dos grânulos BMP2-K3Plk-acrescida foi comprovada em ensaios de célula com base. Os grânulos funcionalizados em contacto com células de C2C12 foram capazes de induzir a expressão de fosfatase alcalina (FAL ou ALP) na proximidade localmente restrita do cordão de. Assim, por esta técnica, funcionalizados andaimes podem ser produzidos que podem desencadear a diferenciação celular, no sentido de uma linhagem osteogênica. Além disso, doses mais baixas de BMP2 são suficientes devido à orientação controlada do local-dirigido BMP2 acoplado. Com este método, BMPs são sempre expostos aos seus receptores na superfície das células na orientação adequada, que não é o caso, se os factores são acoplados através de técnicas de acoplamento non-local-dirigido. O resultado do produto é altamente controlável e, portanto, resulta em materiais com propriedades homogêneas, melhorando sua aplicabilidade para a reparação do tamanho crítico óssea defeitos.
Introduction
O objetivo final da regeneração óssea tecido engenharia e osso é superar as desvantagens e limitações ocorrem durante tratamentos comuns de fraturas não-sindicalizados. Auto - ou allo-transplantes são utilizados predominantemente como estratégias de terapia atual, mesmo que ambos têm várias desvantagens. O enxerto ósseo ideal deve induzir osteogênese, osteoindução, bem como osteocondução, levando-à osteointegração do enxerto no osso. Hoje em dia, apenas autotransplante é considerado como o "padrão ouro" uma vez que fornece todas as características de um enxerto ideal. Infelizmente, ele também apresenta importantes aspectos negativos, tais como tempos de cirurgias longas e um segundo local de trauma que normalmente implica mais complicações (por exemplo, dor crônica, formações de hematoma, infecções, defeitos cosméticos, etc.). Enxerto alogênico, por outro lado tem características ideais para todos os aspectos gerais1. Tecnologias de enxerto de osso alternativos foram melhoradas nos últimos anos, com o objectivo de produzir andaimes osteoindutora, osteocondutora, biocompatível, e biorreabsorvível. Desde que muitos biomateriais não mostram todas estas características osteogênicas, diferentes fatores de crescimento, principalmente BMP2 e BMP7, foram incorporadas a fim de melhorar o potencial osteogênico do andaime particular2.
Como um critério essencial, tais sistemas de entrega de fator de crescimento deve fornecer uma liberação de dose controlada ao longo do tempo a fim de facilitar os eventos essenciais como recrutamento celular e acessório, crescimento celular e angiogênese. No entanto, BMPs, bem como outros fatores de crescimento osteogênicos têm sido comumente imobilizada não ligado covalentemente3. Uma armadilha e adsorção técnicas requerem o uso de montantes suprafisiológica da proteína devido a uma liberação de surto inicial, que leva a graves desvantagens em vivo, normalmente afetar os tecidos circunvizinhos através da indução de supercrescimento ósseo, osteólise, inchaço e inflamação4. Assim, a retenção de fatores de crescimento no local da entrega por longos períodos de tempo pode ser alcançada por métodos de imobilização covalente. Quimicamente modificados BMP2 (succinylated5, acetilado6 ou biotinilado7), engenharia de heterodímeros8ou BMP2 derivada oligopeptídeos9 foram concebidos e usados para superar as limitações relacionadas com a absorção. No entanto, a bio-atividade dessas construções não é previsível, desde que o arranjo potencialmente inibe a ligação do ligante imobilizado aos receptores celulares. Como mostrada anteriormente, é essencial que todos os quatro cadeias receptores envolvidas na formação de complexos receptor-ligante ativado interagirem com o imobilizado BMP2 para ativar completamente toda a jusante de cascatas de sinalização10.
Para superar os problemas de um resultado de produto não-homogênea, com limitações em termos de bioatividade, estabilidade e biodisponibilidade do factor de imobilizado, nós projetamos uma variante BMP capaz de ligar covalentemente andaimes de forma local-dirigido. Esta variante, denominado BMP2-K3Plk, é composto por um aminoácido artificial que foi introduzido pelo códon genético expansão11. Esta variante tem sido associada com êxito a andaimes usando uma estratégia de acoplamento covalente, mantendo sua atividade biológica.
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Protocol
1. produção da variante BMP2 BMP2-K3Plk
- Clonagem de BMP2-K3Plk por mutagenesis local-dirigido usando PCR 12
- Amplificar o humano BMP2 maduro (hmBMP2) de um vetor de p25N-hmBMP2 (ver Tabela de materiais) com um primer para a frente (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') e um primer reverso (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') introduzindo um âmbar stop códon ( TAG) na posição da primeira lisina de BMP2´s parte madura. Realizar a reação de PCR usando 33,5 µ l de H2O, 10 µ l da mistura de reação de PCR, 1,5 µ l de 10 µM dNTP solução, 1,5 µ l de primer para a frente (10 pmol / µ l), 1,5 µ l de primer reverso (10 pmol / µ l), 1 µ l de p25N-hmBMP2 (10 ng / µ l) e 1 µ l de DNA polimerase (ver Tabela de materiais) em um termociclador (desnaturação a 95 ° C por 5 min, 30 ciclos de desnaturação a 95 ° C por 1 min, recozimento a 60 ° C por 1 min, alongamento a 72 ° C por 1 min e uma extensão final a 72 ° C por 10 min).
- Purificar o produto do PCR usando um kit disponível comercialmente, seguindo as recomendações do fabricante (ver Tabela de materiais).
- Digerir o produto PCR com a enzima de restrição NdeI a 37 ° C por 45 min usando 16 µ l de H2O, 3 µ l de tampão de digestão, 10 µ l de DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l da enzima de restrição. Calor-inativar a enzima a 65 ° C por 5 min. digerir o produto PCR com a enzima de restrição BamHI a 37 ° C, durante 1 h, usando 16 µ l de H2O, 3 µ l de tampão de digestão, 10 µ l de DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l da enzima de restrição. Calor-inativar enzimas a 80 ° C por 5 min.
- Digerir o vetor de pET11a-pyrtRNA com NdeI a 37 ° C por 2 horas e 45 minutos usando 16 µ l de H2O, 3 µ l de tampão de digestão, 10 µ l de DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l da enzima de restrição. Calor-inativar a 65 ° C por 5 min. digerir o vetor de pET11a-pyrtRNA com BamHI a 37 ° C, durante 1 h, usando 16 µ l de H2O, 3 µ l de tampão de digestão, 10 µ l de DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l da enzima de restrição. Calor-inativar a 80 ° C por 5 min.
- Separar o vetor digerido do vetor não digerido e restos de digestão por agarose gel eletroforese (agarose 0,8%, 60 min a 100 V). Ligate a inserção BMP2-K3TAG digerida com backbone digerido pET11a-pyrtRNA à temperatura ambiente (RT) para 2 h, usando 100 ng de pET11a-pyrtRNA espinha dorsal e 34,5 ng da inserção BMP2-K3TAG (razão molar de 1:3). A mistura de reação contém a espinha dorsal de DNA e inserção, 2 µ l de tampão de ligase, 1 µ l de DNA ligase e H2O para um volume total de 20 µ l.
- Execute uma transformação co de pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk e pyrtRNAsynth-pSRF-dueto em bactérias BL21(DE3):
- Adicionar 50 ng do cada do plasmídeo para as bactérias, coloque a mistura no gelo por 30 min, choque térmico a 42 ° C para 50 s, colocar no gelo por 5 min, adicione 500 µ l de caldo de lisogenia (LB) médio na mistura e agitar a 300 rpm para 60 min.
- Espalhar a 100 µ l da mistura bacteriana em pré-aquecido canamicina (50 µ g/mL) / placas de ampicilina (100 µ g/mL) e incubar durante uma noite a 37 ° C.
- Expressão e purificação de BMP2-K3Plk 13 , 14
- Propagar uma única colônia durante a noite em 50 mL de meio LB com 50 µ g/mL de canamicina e 100 µ g/mL de ampicilina a 37 ° C.
- Diluir uma noite culturas 01:20 em 800 mL de meio de caldo fantástico (TB), suplementado com 50 µ g/mL de canamicina e 100 µ g/mL de ampicilina e cresce a 37 ° C, até que seja alcançada uma OD600 de 0,7. Adicione propargil-L-lisina para uma concentração final de 10 mM. Recolha uma amostra de 100 µ l da cultura antes da indução (IPTG) de β-D-1-thiogalactopyranoside isopropílico.
- Induzi a expressão do gene através da adição de IPTG para uma concentração final de 1 mM. Cresce a cultura a 37 ° C durante 16 h em um agitador orbital a 180 rpm. Recolha uma amostra de 100 µ l da cultura.
- Centrifugar a cultura toda a 9000 x g durante 30 min. descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado bacteriano em 30 mL de tampão TBSE (10 mM Tris, 150 mM NaCl, ácido de 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)) com 1: 1000 (v/v) 2-mercaptoetanol (recém adicionado).
Atenção: Lidar com 2-Mercaptoetanol sob a coifa. Evite contato com pele e olhos. Evite a inalação do vapor ou névoa. Execute todas as etapas de ressuspensão com buffers contendo 2-Mercaptoetanol sob a coifa. - Pesar um copo vazio centrifugar e transferir ressuspenso para o copo vazio. Centrifugar a 6.360 x g por 20 min. descartar o sobrenadante e pesar o béquer com a pelota. Subtrai o peso do copo vazio para calcular o peso do sedimento.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Congele a pelota a-20 º C a curto prazo ou a-80 ° C, a longo prazo. Após retomar o protocolo, descongelar a pelota no RT - Resuspenda o pellet em buffer STE (1 mM EDTA, sacarose 375 mM, pH de 10 mM Tris 8.0; 150 mM NaCl; 1: 1000 (v/v) 2-mercaptoetanol (recém adicionado)). 200 mL de tampão STE de uso para cada 10g de pelota.
- Proceda à sonicação a suspensão no gelo (10 min com 40 pulso s, freio de s 20 e 30% de amplitude). Centrifugar a 6.360 x g por 20 min. descartar o sobrenadante e pesar a pelota. Repita as etapas sonication e centrifugação 4 vezes.
- Resuspenda o pellet em 100 mL de tampão TBS (10 mM Tris, 150 mM NaCl). Centrifugar a 6.360 x g por 20 min. descartar o sobrenadante e pesar da pelota.
- Resuspenda o pellet em buffer nuclease (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl2) com recém adicionado nuclease 80 U/mL (por exemplo, Benzonase) usando 10 mL/g de pelota. Incube durante a noite a suspensão de RT em uma placa de agita (30 rpm).
- Adicionar o buffer de Triton (60 mM EDTA, 1,5 M NaCl, 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietileno glicol) para a suspensão. O volume de reserva de Triton para adicionar corresponde a uma parte de volume de 0,5 da suspensão. Incube durante 10 minutos a RT (sem agitação). Centrifugar a 6.360 x g por 20 min. descartar o sobrenadante e pesar a pelota.
- Resuspenda o pellet em tampão TE (100 mM Tris, 20 mM de EDTA) usando 8 mL/g de pelota. Centrifugar a 6.360 x g por 20 min. descartar o sobrenadante e pesar a pelota.
- Resuspenda o pellet adicionando 4 mL/g de pH de NaAc 25mm 5.0 e 5 mL/g de 6 M GuCl com 1 mM ditiotreitol (DTT) (recém adicionado). Incube a suspensão durante a noite a 4 ° C, em uma placa de agita (30 rpm).
- Centrifugar a 75.500 x g por 20 min. O sobrenadante agora contém a proteína monomérica desdobrada do BMP2. Recolha o sobrenadante e concentrar-neste extrato para OD/20ml usando uma membrana de corte (MWCO) de peso molecular de 3 kDa em uma concentração de células (veja a Tabela de materiais).
- Adicione os monómeros concentrados em única gotas para o buffer de renaturalização (2m LiCl, 50 mM Tris, caps de 25 mM, 5 mM EDTA, dissulfeto de glutationa 1mm (GSSG), 2mm glutationa (GSH)) agitando (30 rpm). Incube a RT por 120 h no escuro.
Nota: Durante este período de incubação, reenovelamento occours. A solução desta etapa em diante contém o dobrado dimérica BMP2-K3Plk. - Ajuste o pH da solução a 3.0 usando concentrado HCl. Dialyze a solução contra 1mm. HCl concentrado a solução dializada usando uma membrana de corte (MWCO) de peso molecular de 10 kDa em uma célula de concentração.
- Equilibrar a solução adicionando reserva um (20mm NaAc, 30% de isopropanol). Adicione um volume de tampão A corresponde a um volume de 30% da solução. Centrifugue a solução a 4700 x g, durante 15 min.
- Equilibrar a coluna de troca iônica em um sistema cromatografia líquida (FPLC) proteína rápida15 com 150 mL de tampão r. Load solução da proteína para a coluna equilibrada. Eluir frações usando um gradiente linear de buffer B (20mm NaAc, 30% de isopropanol, 2 M NaCl) com 100 mL de frações de mL de tampão B. coletar 2.
Nota: Concentre a proteína antes do embarque para a coluna de acordo com o volume total da coluna. O volume final da proteína deve ser < 5% do volume total da coluna. - Analise 20 µ l de cada fração por SDS poliacrilamida (12%) gel de eletroforese (SDS-PAGE) 16 e de coloração azul brilhante de Coomassie17 (ver Tabela de materiais).
Nota: O azul Coomassie brilhante manchado fracções de espectáculos de gel de SDS-PAGE contendo dímeros (26 kDa) e frações contendo monômeros (13 kDa). - Fracções de dímero-contendo piscina. Dialize da piscina do dímero contendo frações durante a noite a 4 ° C, contra 1 mM HCl (volume de 5 litros). Concentre-se no produto final usando um kDa 10 unidade de filtro centrífugo de concentração (ver Tabela de materiais). Analise o produto final por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS (12%) (SDS-PAGE) e coloração azul de Coomassie brilhante.
Nota: A banda sobre o azul Coomassie brilhante manchado de SDS-PAGE gel deve mostrar apenas uma banda em 26 kDa. Este é o produto final da BMP2-K3Plk.
2. otimização de cobre (I)-catalisada Alkyne-azida condições de cicloadição (CuAAC)
- Efeito de ascorbato de sódio (NaAsc) e sulfato de cobre (II) (CuSO 4 ) no tipo selvagem BMP2 (BMP2-WT)
- Incubar a 20 µM BMP2-WT com diferentes proporções de NaAsc de CuSO4. Usar NaAsc de 0.5 mM e 0,5 mM CuSO4 (concentração de partida) em um volume de 50 µ l. Prossiga com as seguintes proporções de NaAsc de CuSO4: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20: 1), mantendo a CuSO4 concentração constante de 0,5 mM e ajustando a concentração de NaAsc adequadamente. Realizar a reação em H2O em um misturador rotativo (20 rpm) durante a noite no RT
- Preparar amostras reduzidas pela adição de tampão de carregamento contendo 5% 2-Mercaptoetanol e incubar a amostra a 95 ° C por 6 min. Analyze reduzido e amostras não-reduzida por SDS poliacrilamida gel (12%) eletroforese (SDS-PAGE) e coloração azul de Coomassie brilhante. O Coomasie manchado geles de SDS-PAGE mostrar bandas na faixa de 13 kDa (condições reduzidas) para 26 kDa e maior peso molecular (condições não-reduzida).
-
Efeito de Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) amina (THPTA) sobre a reação de CuAAC
- Incubar a 20 µM BMP2-K3Plk com diferentes proporções de THPTA de CuSO4. Use 5 mM NaAsc e 200 µM 3-Azido-7-Hidroxicumarina (manter NaAsc e 3-Azido-7-Hidroxicumarina constante). Use 50 µM THPTA e 0,5 mM de CuSO4 como concentrações de partida. Usar diferentes rácios de THPTA de CuSO4: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). realizar reação em H2O (volume total de 50 µ l) por 24 h no RT em um misturador rotativo (20 rpm).
- Em cima de acoplamento, 3-Azido-7-Hidroxicumarina torna-se um corante fluorescente. Preparar amostras em condições reduzidas e não reduzida e analisá-los por SDS-PAGE. Visualizar os géis sob o canal da excitação com o comprimento de onda específico para o 3-Azido-7-Hidroxicumarina (λabs = 404 nm; λem = 477 nm).
3. ligações covalentes acoplamento técnica da BMP2-K3Plk de azida acrescida de Agarose Beads
- Incube 20 µM de BMP2-K3Plk ou BMP2-WT (usado como controlo negativo) com 20 µ l de grânulos de agarose azida-ativado em um volume total de 500 µ l no amortecedor da reação (0,1 M HEPES pH 7.0, ureia de 3,9 M, 50 µM CuSO4, 250 µM THPTA, ascorbato de sódio de 5 mM) por 2 h em RT em um rotati misturador de ng (20 rpm). Pare a reação adicionando 5 mM EDTA (concentração final).
- Incube a RT por 15 min em um misturador rotativo (20 rpm). Centrifugar as amostras a 20.000 x g por 1 min a RT. recolher os sobrenadantes.
- Lave o sedimento contendo os grânulos três vezes com 1.000 µ l de tampão de500 HBS (50 mM HEPES, 500 mM de NaCl), três vezes com 1.000 µ l de 4m MgCl2e duas vezes com 1.000 µ l de soro de tampão fosfato (PBS). Em cada etapa de lavagem, centrifugar a 20.000 x g por 1 min em RT e coletar sobrenadantes. Grânulos de armazenamento acoplado em 1.000 µ l de PBS a 4 ° C.
Cuidado: Não perturbe a pelota do grânulo ao remover o sobrenadante.
4. validando a presença e a atividade biológica do imobilizado BMP2-K3Plk usando vermelho Texas rotulado BMP Receptor eu um ectodomínio (BMPR-IA CE )
- Incubar a 50 µ l dos grânulos BMP2-K3Plk acrescida com 1 µM de Texas Red rotulada BMPR-IACE com 150 µ l de tampão de500 HBS (50 mM HEPES, 500 mM NaCl) no RT para 1 h em um misturador rotativo (20 rpm).
- Centrifugue os grânulos a 20.000 x g por 1 min em RT. descartar o sobrenadante. Lave os grânulos com 1000 µ l de tampão de500 HBS. Repita a etapa de lavagem adicional 3 vezes. Centrifugar 20.000 x g por 1 min em RT após cada etapa de lavagem.
- Resuspenda os grânulos em 500 µ l de PBS e Pipetar 50 µ l em um slide de tampa de vidro. Defina o filtro de microscópio entre 561 ou 594 nm. Detectar o Texas Red – BMPR-IACE-BMP2-K3Plk acrescida grânulos usando fluorescente microscopia e tirar fotos.
5. medição da fosfatase alcalina (FAL ou ALP) expressão para provar a bioatividade In Vitro da BMP2-K3Plk produzido antes e após a reação de acoplamento.
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Ensaio de fosfatase alcalina (FAL ou ALP)
- Cultura de células de C2C12 de promyoblastic (ATCC CRL-172) no meio modificado águia de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro Fetal de bezerro (FCS), 100 U/mL penicilina G e estreptomicina 100 µ g/mL a 37 ° C numa atmosfera umidificada no 5% CO2.
- Sementes C2C12 de células em uma densidade de 3 × 104 células/poço em uma microplaca de 96 poços. Deixe células anexar durante a noite. Remover médio e incubar as células C2C12 na presença de 0.5-200 nM de BMP2-WT ou BMP2-K3Plk em 100 µ l/poço de DMEM (FCS 2%, penicilina de U/mL 100 G e 100 µ g/mL Estreptomicina) a 37 ° C numa atmosfera umidificada em 5% de CO2 por 72 h.
- Remover médio e lavam-se células com 100 µ l de PBS por bem. Lyse pilhas no RT por 1h com 100 µ l/poço de lise (1% NP-40, glicina 0,1 M, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1mm ZnCl2) em um tremendo da placa (220 rpm).
- Adicione 100 µ l/poço de buffer de ALP (glicina 0,1 M, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1mm ZnCl2) com 1 mg/mL p-nitrofenilfosfato (recém adicionado) para o lisado celular.
- Medir a absorção no 405 nm em um leitor multiplate depois de adicionar o buffer ALP e cada 5 min até que o desenvolvimento da cor é completo. Gerar curvas dose-resposta e valores CE50 usando um modelo logístico, y = A2 + (A1-A2) / (1 + (x/x0)p).
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Coloração da fosfatase alcalina (FAL ou ALP)
- Cultura de células de C2C12 de promyoblastic (ATCC CRL-172) em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) com 10% de soro Fetal de bezerro (FCS), 100 U/mL penicilina G e estreptomicina 100 µ g/mL a 37 ° C numa atmosfera umidificada no 5% CO2.
- Sementes C2C12 de células em uma densidade de 3 × 104 células/poço em uma microplaca de 96 poços. Deixe células anexar durante a noite. Médio de remover e adicionar 20 µ l/poço de grânulos BMP2-K3Plk acoplado. BMP2-K3Plk acoplado grânulos estão em 1000 µ l de uma suspensão de PBS.
- Prepare uma solução de agarose de baixo ponto de fusão de 0,4% em DMEM. Derreter no microondas (600 W por 3 min) e deixe arrefecer no banho-maria a 37 ° C até o uso.
- Adicione 20 µ l de agarose de baixo ponto de fusão de 0,4% em cada poço (coberta de grânulos e células). Centrifugação a 2000 x g por 5 min a 20 ° C. Adicione 80 µ l DMEM (FCS 2%, 100 U/mL penicilina G e 100 estreptomicina µ g/mL) e incubar a 37 ° C numa atmosfera umidificada em 5% de CO2 por 72 h.
- Remova médio, tomando cuidado para não destacar o agarose solidificado de 0,4%. Adicionar 100 µ l/poço de 1 passo NBT/solução de substrato BCIP (cloreto de tetrazólio Nitro-azul, sal 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidina).
- Analise a fosfatase alcalina coloração usando microscopia de luz, imediatamente após a coloração roxa torna-se aparente. Usar microscopia de campo claro e tirar fotos.
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Representative Results
Neste artigo, descrevemos um método para covalentemente acoplar uma nova variante BMP2, BMP2-K3Plk, grânulos de agarose acrescida de azida comercialmente disponíveis (Figura 1). A bioatividade da variante BMP2-K3Plk produzido foi validada pela indução da expressão do gene da fosfatase alcalina (FAL ou ALP) nas células C2C12. O teste in vitro mostra níveis semelhantes de ALP expressão induzidos pelo tipo selvagem BMP2 (BMP2-WT) e BMP2-K3Plk (Figura 2).
As reações de redox entre sulfato de cobre (II) (CuSO4) e ascorbato de sódio (NaAsc) geram espécies reativas de oxigênio que podem afetar a integridade estrutural e, portanto, afetar a bioatividade de BMP2-K3Plk. Para verificar a integridade estrutural da proteína, realizamos uma incubação overnight com CuSO4 e NaAsc, apresentando degradação BMP2-WT de forma concentração-dependente (visualizada por SDS-PAGE em condições reduzidas (Figura 3A1 )) e a formação do mediastino ou agregados visíveis em aproximadamente 40 kDa (em condições não-reduzida) (Figura 3A2). Para evitar a degradação de proteínas, Tris (3-hydroxypropyltriazolyl-metilo) amina (THPTA) foi usada como um agente protetor (Figura 3B). O uso de THPTA impede a fragmentação BMP2, enquanto a formação de estruturas de peso molecular superiores não poderia ser evitada através da adição de THPTA. Melhorias da reação dirigida a composição do buffer de reação, a temperatura de reação e tempo de reação (dados não mostrados). O protocolo descrito aqui detalhes das conquistas finais sobre a composição do tampão de reação, temperatura e tempo de reação.
Para confirmar que BMP2-K3Plk mantém a bioatividade após o acoplamento, usamos proteína de ectodomínio fluorescente etiquetadas do receptor do tipo eu receptor (BMPR-IACE) para demonstrar que a proteína imobilizada é ainda capaz de ligar a este receptor. Grânulos revestidos com BMP2-K3Plk através de CuAAC química rendida fluorescência quando incubadas com a tingir-etiquetados BMPR-IACE (Figura 4). Em contraste, contas de não-revestidos ou contas que foram incubadas com BMP2-WT não mostrou nenhuma fluorescência sinal acima fundo níveis (dados não mostrados)14.
Após a confirmação de recursos de ligação do receptor do ligante imobilizado em vitro, testamos também se respostas biológicas podem ser desencadeadas pelos grânulos funcionalizados em um ensaio de baseada em célula. ALP mediada coloração ocorreu somente nas células que estavam em contato direto com os grânulos BMP2-K3Plk-acrescida (Figura 5). Isto confirma que a proteína é realmente covalentemente ligados aos talões e não só absorvido, desde uma coloração mais espalhadas out em distâncias maiores para os grânulos seria caso contrário têm sido observada.
Figura 1: representação da BMP2-K3Plk. (A) Representação da variante BMP2-K3Plk com a localização da substituição do aminoácido introduzido. (B) esquema de acoplamento: BMP2-K3Plk CuAAC reação com azida acrescida de grânulos. Reproduzido (adaptado) com permissão da Tabisz et al. (2017): imobilização local-dirigido da BMP-2: duas abordagens para a produção de andaimes osteoindutora inovadoras. Macromoléculas. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: bioatividade de variantes-BMP2. Comparação entre os bioactivities (ensaio ALP) de BMP2-K3Plk e sua BMP2 (BMP2-WT). O eixo x representa a concentração de BMP2-WT ou BMP2-K3Plk usado no ensaio. Os dados de EC50 representam valores médios e desvios-padrão de 4 experimentos individuais (N = 4). Reproduzido (adaptado) com permissão da Tabisz et al. (2017): imobilização local-dirigido da BMP-2: duas abordagens para a produção de andaimes osteoindutora inovadoras. Macromoléculas. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: efeito do agente redutor na integridade do BMP2. (A) BMP2-WT foi exposto a diferentes proporções molares de ascorbato de sódio (NaAsc) de cobre (II) sulfato (CuSO4). As amostras foram analisadas por SDS-PAGE e coloração azul de Coomassie brilhante em condições não-reduzida (Figura A2) e reduzida (Figura A1). Em condições de reduzida (A1), as setas vermelhas representam clivada BMP2-WT. Nas não-reduzidas condições (A2), as setas vermelhas indicam multiméricas BMP2-WT. As bandas representando clivada BMP2 espécies são indicadas por uma seta azul. Legenda: NCR - reduzida BMP2-WT não tratada; NC - BMP2-WT não tratada; rácios molares 1:1 a 20:1 - aumento de ascorbato de sódio para CuSO4. (B) BMP2-K3Plk foi acoplado ao 3-Azido-7-Hidroxicumarina usando condições de reação CuAAC suplementadas com THPTA. Em cima de acoplamento 3-Azido-7-Hidroxicumarina torna-se um corante fluorescente. Legenda: NC - BMP2-WT reagiu com 3-Azido-7-Hidroxicumarina; 7:1 a 20:1 aumentando rácios molares de THPTA de CuSO4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: bioatividade de imobilizado BMP2-K3Plk in vitro. Imagem representativa da interação do imobilizado BMP2-K3Plk com Texas-vermelho-rotulados BMPR-IACE. Reproduzido (adaptado) com permissão da Tabisz et al. (2017): imobilização local-dirigido da BMP-2: duas abordagens para a produção de andaimes osteoindutora inovadoras. Macromoléculas. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: bioatividade de imobilizado BMP2-K3Plk em um ensaio de baseada em célula. (A) imagem representativa de fosfatase alcalina (FAL ou ALP) após tratamento com grânulos de coloração acoplado a grânulos BMP2-K3Plk acrescida. (B) fosfatase alcalina (FAL ou ALP) coloração após tratamento com solúvel 25 nM BMP2-K3Plk. reproduzido (adaptado) com a permissão de Tabisz et al. (2017): imobilização local-dirigido da BMP-2: duas abordagens para a produção de andaimes osteoindutora inovadoras. Macromoléculas. 18 (3), 695-708. (Copyright 2017 American Chemical Society) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Gerar variantes da proteína marcados pela expansão de códon genético permite a introdução de vários análogos de aminoácidos não naturais principalmente em qualquer posição da sequência primária da proteína. Em caso de BMPs como BMP2, comum tags como uma marca de 6-histidina (dele) só pode ser introduzido N-terminal, desde o fim de protein´s C-terminal é enterrado dentro da estrutura terciária da proteína e, portanto, não é acessível a partir do exterior. Em outras posições, o tamanho da marca introduziu muito provavelmente pode causar alterações estruturais que consequentemente obliterar a bioatividade de BMP´s. Além disso, apresentando uma mutação na sequência BMP2 pode afetar a eficácia redobramento e também pode mudar outros parâmetros de proteína como o ponto isoelétrico da proteína modificada. Assim, cada passo em um protocolo de produção de proteína estabelecida talvez precise ser adaptado de acordo com as características de variant´s de proteínas alteradas. A produção do BMP2-K3Plk de fato requerido uma modificação do método estabelecido para a expressão de tipo selvagem BMP2. Tempos de cultura diferente ou concentrações propargil-L-lisina (Plk) foram testados (dados não mostrados) para alcançar o maior rendimento de expressão. Dobrar, etapas de separação e purificação Felizmente não exigem novas adaptações. Já informamos que em caso de outras variantes BMP2 produzidos em nosso laboratório, algumas características da proteína foram alteradas significativamente, que exigia a modificação de várias etapas do método produção BMP18. O K3Plk-BMP2 produzido mostrou atividade biológica comparável da proteína do tipo selvagem. A diferença ocorre em concentrações elevadas de BMP2, provavelmente em consequência de uma baixa solubilidade da variante BMP2-K3Plk médio, comparada com a do tipo selvagem BMP2.
Apesar das conhecidas vantagens do cobre-catalisada azida-alquino cicloadição (CuAAC)19, reações de CuAAC devem ser cuidadosamente adaptadas para aplicações específicas. Nós mostramos como BMP2 podem ser fragmentados ou criar agregações ou oriundas devido às condições de reação forte redução. Assim, todos os parâmetros de reação tinham de ser analisado detalhadamente, a fim de encontrar condições que deixam a proteína afetada.
Nossa abordagem para acoplar covalentemente a variante BMP2 talões de agarose azida-acrescida pela química clique poderia ser realizada com eficiência elevada, resultando em grânulos funcionalizados provocando diferenciação osteogênica em vitro. Quando o tipo selvagem BMP2 proteína foi usada na reação com os grânulos em vez disso, pudemos observar apenas fraca coloração de expressão de ALP, indicando que o acoplamento ocorreu de fato altamente especificamente através do resíduo propargil-L-lysin de BMP2-K3Plk.
Essa especificidade de acoplamento posicional reflete uma grande melhoria em comparação com os procedimentos de imobilização envolvendo química clássica do NHS/EDC. Em tais casos, acoplamento aleatório ocorre, principalmente envolvendo os grupos amina primária presentes em resíduos de lisina. A proteína acoplada tem uma atividade osteogênica variável, devido à multiplicidade de conexões possíveis para o cadafalso, levando a diferentes orientações da proteína para receptores celulares.
O uso do site-direct BMP2 imobilizado pode superar os inconvenientes mencionados, relacionados com as altas doses de BMP2 solúvel, que são necessários para induzir a formação óssea. Além disso, os resultados mostram claramente que certas respostas celulares, tais como a diferenciação osteogênica das células de C2C12, são inteiramente iniciadas por BMP2 imobilizado, apesar de estudos recentes, alegando que o sinal transdução requer a endocitose do ligante/ligante-receptor complexo20,21. Nossos resultados estão de acordo com outros estudos mostrando que a BMP2, que é ligado covalentemente (mas não local-dirigido) para superfícies não-endocytosable, é ainda capaz de induzir a diferenciação de osteoblastos22.
Considerando que nós usamos supra fisiológicos concentrações de BMP2 para a reação de acoplamento, a quantidade da BMP2 imobilizado pode ser reduzida ainda mais, ainda preservando as propriedades osteogênicas dos grânulos. Antes de tais etapas de otimização, no entanto, o andaime BMP2-K3Plk-acrescida precisa ser testados em experiências com animais para provar seu potencial osteogênico em vivo.
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Disclosures
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Acknowledgments
Os autores agradecer Dr. M. Rubini (Constança) fornecendo o plasmídeo codificação pyrrolysyl-tRNA e fornecer o correspondente aminoacil-tRNA sintetase de codificação pRSFduet-pyrtRNAsynth.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1-Step NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Add solution to cells |
| 3-Azido-7-hydroxycoumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Chemical used for click reaction |
| Agarose low melting point | Biozym | 840101 | Agarose for ALP assay |
| Azide agarose beads | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Beads used for reaction |
| BamHI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriction enzyme |
| BMP receptor IA (BMPR-IAEC) | -- | -- | Produced in our lab |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE |
| Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Chemical used for click reaction |
| DNA Polymerase and reaction buffer | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Cell culture media |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Chemical used to stop click reaction |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bacteria induction (1mM final concentration) |
| NdeI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriction enzyme |
| NHS-activated Texas Red | Life technologies | T6134 | Coupled to receptor |
| P- Nitrophenyl Phosphate | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkaline Phosphatase |
| p25N-hmBMP2 | -- | -- | Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| propargyl-L-lysine (Plk) | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel Purification |
| Qiagen PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR Purification |
| Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Chemical used for click reaction |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligation |
| tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Chemical used for click reaction |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon concentrating cell 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Concentrating unit |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck KGaA | UFC901024 | Concentrating centrifugal unit |
| ÄKTA avant FPLC | ÄKTA | -- | FPLC machine |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge for bacterial culture |
| Bacterial Shaking Incubator | Infors HT | Shaking incubator for bacterial culture | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | -- | Imaging and analysis system for SDS-PAGE |
| Fluorescent miscroscope | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3- (M) | Merck KGaA | 116882 | Ion Exchange Chromatography column material |
| Greiner CELLSTAR® 96 well plates | Sigma | M5811-40EA | 96 well plates for cell culture (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | -- | Centrifuge |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoScientific | 75003624 | Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining |
| Microcentrifuge - 5417R | Eppendorf | -- | Centrifuge |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | -- | software for stastic analysis of ALP assay data |
| Polysine Slides | ThermoScientific | 10143265 | microscope slides |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Tecan infinite M200 multiplate reader | Tecan Deutschland GmbH | -- | Multiplate reader for ALP assay |
| Thermocycler - Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | -- | PCR |
| TxRed - microscope filter | Keyence | Filter for fluorescent microscope | |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
References
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