Summary
Kemik morfogenetik Protein 2 (BMP2) katkılı Biyomalzeme yeni bir tedavi stratejisi sendikasız Kemik kırıkları iyileşmek için kullanılmaktadır. Yan etkileri faktörü kontrol edilemez bir sürümden kaynaklanan üstesinden gelmek için biz site için yeni bir strateji teklif-doğrudan böylece malzemeleri ile geliştirilmiş Osteojenik yetenekleri oluşturma faktörü, hareketsiz.
Abstract
Uzun kemik defektleri sigara şifa tedavisi için farklı tedavi stratejileri yoğun bir şekilde araştırdık. Tedaviler mevcut Biyomalzeme kemik morfogenetik proteinler (BMP) gibi Osteojenik büyüme faktörleri ile birlikte kullanımı yol açmıştır bazı sınırlamaları kullanılmakta. Yaygın olarak kullanılan emme veya saklama yöntemleri BMP2, genellikle birkaç ciddi olumsuz yan etkileri kışkırtır bir sözde ilk patlama yayın etkisi sonucu supra fizyolojik miktarda gerektirir. Bu sorunların üstesinden gelmek için strateji kovalent protein için iskele çift olacaktır. Ayrıca, bağlantı site belirli bir şekilde bir tekrarlanabilir ürün sonuç sağlamak için yapılmalıdır. Bu nedenle, biz bir yapay amino asit (propargyl-L-lizin) kodon kullanımı genişletme (BMP2-K3Plk) tarafından BMP2 protein olgun parçası tanıtıldı bir BMP2 değişken oluşturdu. BMP2-K3Plk functionalized boncuk bakır katalize azid ALKİN cycloaddition (CuAAC) ile birleştiğinde. Eşleşmiş BMP2 K3Plk biyolojik aktivitesini vitro kanıtlanmış oldu ve BMP2-K3Plk-functionalized boncuk Osteojenik etkinlik tabanlı hücre deneyleri kanıtlanmış oldu. C2C12 hücreleri ile temas functionalized boncuk boncuk yerel olarak kısıtlı bir mesafede alkalen fosfataz (ALP) ifade ikna edebildik. Böylece, bu tekniği ile functionalized iskele üretilebilir hücre farklılaşması Osteojenik bir soy doğru tetikleyebilir. Ayrıca, alt BMP2 dozlarda eşleşmiş BMP2 site yönettiği kontrollü yönelimi nedeniyle yeterlidir. Bu yöntemle, BMP her zaman onların reseptörleri hücre yüzeyi uygun yönde hangi faktörler site yönettiği kaplin teknikleri ile birleştiğinde Eğer durum böyle değil maruz kalır. Ürün sonucu çok kontrol edilebilir ve böylece, malzeme homojen özellikleri, onların uygulanabilirliği kritik boyutu tamiri için iyileştirilmesi ile sonuçlarında kusurları kemik.
Introduction
Kemik doku Mühendisliği ve kemik rejenerasyonu nihai hedefi dezavantajları ve sendikasız kırıklar ortak tedaviler sırasında ortaya çıkan sınırlamalar üstesinden gelmektir. Her ikisi de birkaç dezavantajları olsa bile otomatik veya allo nakillerine ağırlıklı olarak geçerli tedavi stratejileri kullanılır. İdeal kemik grefti osteogenesis osteoindiksiyon yanı sıra osteoconduction, kemik greft osteointegrasyon için lider tarafından ikna etmek. Günümüzde, bir ideal kemik grefti tüm özelliklerinin sağladığı yalnızca otomatik nakli "altın standart" kabul edilir. Ne yazık ki, uzun cerrahi kez ve genellikle daha fazla komplikasyonlar (örneğin, kronik ağrı, Hematom oluşumları, enfeksiyonlar, kozmetik kusurları, vb) gerektirdiği ikinci bir travma site gibi önemli olumsuz yönleri de sunar. Allojenik Greftler, öte yandan tüm genel özellikleri1için suboptimal özelliklere sahip. Alternatif kemik greft teknolojileri osteoindüktif, osteoconductive, Biyouyumlu, ve bioresorbable iskele üretmek amacı ile son birkaç yıl içinde geliştirilmiştir. Birçok Biyomalzeme değil göstermek tüm Osteojenik bu özelliklere göre farklı büyüme faktörleri, özellikle BMP2 ve BMP7, belirli iskele2Osteojenik potansiyelini artırmak için dahil edilmiş.
Önemli bir ölçüt olarak hücre işe alım ve eki, hücre ingrowth ve anjiogenezi gibi önemli olaylar kolaylaştırmak amacıyla bir kontrollü doz yayın zamanla böyle büyüme faktörü vasıtalarının sağlamalıdır. Ancak, bmp gibi diğer Osteojenik büyüme faktörleri de sık kovalent olmayan3immobilize. Tuzak ve adsorpsiyon teknikleri genellikle kemik büyüme inducing tarafından çevre dokular etkileyen şiddetli dezavantajları içinde vivo yol açar bir ilk patlama açıklaması nedeniyle protein supra fizyolojik miktarda kullanımını gerektiren, Osteoliz, şişme ve iltihap4. Böylece, büyüme faktörleri daha uzun süreler için teslim yerinde tutma kovalent immobilizasyon yöntemleri tarafından elde edilebilir. Kimyasal olarak değiştirilmiş BMP2 (succinylated5, acetylated6 veya biotinylated7), mühendislik heterodimers8veya türetilmiş oligopeptides9 tasarlanmış ve sınırlamaları aşmak için kullanılan BMP2 ile ilgili emme. Ancak, düzenleme potansiyel olarak immobilize ligand bağlanması için hücresel reseptörleri inhibe. beri biyo-etkinlik bu yapıları, tahmin edilebilir değildir. Olarak daha önce gösterilen, bu tüm dört reseptör zincirleri aktif ligand-reseptör kompleksleri oluşumunda yer alan tüm aşağı akım sinyal cascades10tam olarak etkinleştirmek için immobilize BMP2 ile etkileşim esastır.
Bir inhomogeneous ürün sonucu sorunları açısından bioactivity, istikrar ve bioavailability immobilize faktörünün kısıtlamaları aşmak için kovalent iskele site yönettiği bir şekilde bağlama yetenekli bir BMP değişken tasarlanmıştır. BMP2-K3Plk, olarak adlandırdığı bu varyant genetik kodon genişleme11' de kullanılmaya başlanan yapay bir amino asit oluşur. Bu varyant için iskele süre paraca desteklemek onun biyolojik aktivitesi kovalent kaplin strateji kullanarak başarıyla bağlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. BMP2 değişken BMP2 K3Plk imalatı
- Klonlama, BMP2-K3Plk tarafından site yönettiği mutagenesis PCR kullanarak 12
- İnsan olgun BMP2 yükseltmek (hmBMP2) p25N-hmBMP2 vektöründen ( Tablo malzemelerigörmek) ile ileri bir astar (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') ve ters bir astar (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') tanıtan bir kehribar stop kodonu ( «««TAG) BMP2´s olgun bölümünün ilk lizin konumunda. Kullanarak 33,5 µL H2O, 10 µL PCR reaksiyon mix, 1,5 µL 10 µM dNTP hisse senedi çözüm, ileri astar (10 pmol/µL), ters astar (10 pmol/µL), p25N-hmBMP2 (10 ng/µL) 1 µL 1,5 µL 1,5 µL PCR reaksiyonu gerçekleştirmek ve DNA polimeraz 1 µL ( Tablo malzemelerigörmek) termal cycler (95 ° c 5 min için denatürasyon denatürasyon 95 ° C'de 30 döngüleri için 1 dk 1 dk, 1 dk 72 ° C uzama ve son bir uzantısı için 10 dk 72 ° C'de 60 ° C'de tavlama) içinde.
- Aşağıdaki üretici önerileri piyasada bulunan bir seti kullanarak PCR ürünü arındırmak ( Tablo malzemelerigörmek).
- 45 dk 16 µL H2O, 3 µL sindirim arabelleği, DNA'ın 10 µL kullanarak için 37 ° C'de restriksiyon enzimi NdeI PCR ürünü sindirmek (20 ng/µL) ve restriksiyon enzimi 1 µL. Isı-65 ° c enzim 5 dk. sindirmek için 1 h H2O, 3 µL sindirim arabelleği 16 µL, DNA'ın 10 µL kullanarak için 37 ° C'de restriksiyon enzimi BamHI PCR ürünü devre dışı bırakabilirsiniz (20 ng/µL) ve restriksiyon enzimi 1 µL. Enzim 5 min için 80 ° C'de ısı devre dışı bırakabilirsiniz.
- NdeI ile pET11a-pyrtRNA vektör 16 µL H2O, 3 µL sindirim arabelleği, DNA'ın 10 µL kullanarak 2 saat 45 dk için 37 ° C'de sindirmek (20 ng / µL) ve restriksiyon enzimi 1 µL. Isı-devre dışı bırakabilirsiniz 65 ° C'de 5 dk. sindirmek için BamHI ile pET11a-pyrtRNA vektör 1 h H2O, 3 µL sindirim arabelleği 16 µL, DNA'ın 10 µL kullanarak için 37 ° C'de (20 ng/µL) ve restriksiyon enzimi 1 µL. 5 min için 80 ° C'de ısı devre dışı bırakabilirsiniz.
- Sindirilmemiş vektör sindirilir vektör ayrı ve sindirim artıkları tarafından özel Jel Elektroforez (% 0,8 özel, 100 V 60 dk.). Sindirilir BMP2-K3TAG ekleme için 2 h 100 kullanarak (RT) oda sıcaklığında sindirilmiş pET11a-pyrtRNA omurga ile ligate pET11a-pyrtRNA omurga ve 34.5 ng ng BMP2-K3TAG ucun (molar oranı 1:3). Reaksiyon karışımı içeren DNA omurga ve INSERT, 2 µL ligaz arabelleği, DNA ligaz ve H2O 20 µL toplam hacmiyle 1 µL.
- PET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk ve pSRF-düet-pyrtRNAsynth ortak bir dönüşüm BL21(DE3) bakteri gerçekleştirin:
- 50 ekleyin her plazmid bakteri için ng buz 30 dk için 50 42 ° C'de ısı şok karışımı koyun s, on Ice 5 min için yer, Lysogeny suyu (LB) orta 500 µL karışımı ekleyin ve 60 dk için 300 RPM sallamak.
- Önceden ısıtılmış sefaloridin (50 µg/mL) üzerine bakteriyel karışımı 100 µL yaymak / Ampisilin (100 µg/mL) levha ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
- İfade ve BMP2-K3Plk arıtma 13 , 14
- Bir koloni LB orta 50 mL 50 µg/mL sefaloridin ve Ampisilin 37 ° C'de 100 µg/mL ile geceleme yaymak
- 800 mL 50 µg/mL sefaloridin ve 100 µg/mL Ampisilin ile müthiş suyu (TB) orta içine gecede kültür 1:20 oranında seyreltin ve 37 ° C'de 0.7 OD600 ulaşılana kadar büyür. Propargyl-L-lizin 10 mM son bir konsantrasyon için ekleyin. İzopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) indüksiyon önce kültüründen 100 µL örnek toplamak.
- Gen ifadesinin IPTG ek olarak 1 mM son bir konsantrasyon tarafından ikna etmek. Kültür için bir orbital shaker 180 RPM 16 h 37 ° C'de büyümek. 100 µL örnek kültüründen toplamak.
- 9000 x g 30 dk at için de bütün kültür süpernatant santrifüj kapasitesi ve bakteriyel Pelet TBSE arabellek (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA)) 30 ml 1: 1000 (v/v) 2-(taze eklendi) mercaptoethanol ile resuspend.
Dikkat: 2-mercaptoethanol duman başlık altında ele. Deriyle ve gözle temastan kaçının. Buharı veya duman zehirlenmesinden kaçının. 2-mercaptoethanol duman başlık altında içeren arabellekleri ile tüm resuspension adımları gerçekleştirin. - Bir boş santrifüj kabı tartmak ve resuspended Pelet boş kabı aktarın. 6,360 x g 20 dk. atma süpernatant de santrifüj kapasitesi ve kabı ile Pelet tartın. Pelet ağırlığını hesaplamak için boş kabı ağırlığı çıkarma.
Not: Protokol burada duraklatılmış. Pelet-20 ° c kısa vadeli veya uzun vadede-80 ° C'de dondurmak. Protokol sürdürme üzerine, RT, pelet tezcan - Pelet STE arabellekte (10 mM Tris pH 8.0; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA, 375 mM Sükroz; 1: 1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (taze ekledi)) resuspend. 200 mL STE arabelleği her 10 g Pelet için kullanın.
- Buz (40 s darbe, 20 s fren ve % 30 genlik ile 10 dakika) uzaklaştırılmış solüsyon içeren temizleyicide. 6,360 x g 20 dk. atma süpernatant de santrifüj kapasitesi ve Pelet tartın. Sonication ve Santrifüjü adımları 4 kere tekrar edin.
- Pelet TBS arabellek (10 mM Tris, 150 mM NaCl) 100 mL resuspend. 6,360 x g 20 dk. atma süpernatant de santrifüj kapasitesi ve Pelet tartın.
- Pelet nükleaz arabelleği (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl2) taze ekledi 80 U/mL nükleaz ile (örneğin, Benzonase) resuspend 10 mL/g Pelet kullanarak. Süspansiyon gecede, RT karıştırma plaka (30 rpm) üzerinde kuluçkaya.
- Triton arabellek ekleyin (60 mM EDTA, 1.5 M NaCl, % 6 (v/v) 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) fenil-polietilen glikol) süspansiyon için. Eklemek için Triton arabellek hacmi süspansiyon 0.5 birim bölümüne karşılık gelir. RT (karıştırma), 10 min için kuluçkaya. 6,360 x g 20 dk. atma süpernatant de santrifüj kapasitesi ve Pelet tartın.
- Pelet TE arabellek (100 mM Tris, 20 mM EDTA) resuspend 8 mL/g Pelet kullanarak. 6,360 x g 20 dk. atma süpernatant de santrifüj kapasitesi ve Pelet tartın.
- Pelet 4 mL/g 25 mM NaAc pH 5.0 ve 5 mL/g (taze eklendi) 1 mM dithiothreitol (DTT) ile 6 M GuCl ekleyerek resuspend. Süspansiyon gecede 4 ° C'de karıştırma plaka (30 rpm) üzerinde kuluçkaya.
- 75,500 x g 20 dk için de santrifüj kapasitesi. Süpernatant şimdi gelişeceğini monomeric BMP2 protein içerir. Toplamak süpernatant ve bu özü 20 OD/ml bir konsantre olarak 3 kDa molekül ağırlığı kesme (MWCO) membran kullanarak hücre ( Tablo malzemelerigörmek) konsantre.
- Konsantre monomerleri tek damla Renaturation arabellek (2 M LiCl, 50 mM Tris, 25 mM arkadaşlar, 5 mM EDTA, 1 mM glutatyon disülfür (GSSG), 2 mM glutatyon (GSH)) (30 rpm) karıştırarak ekleyin. RT karanlıkta 120 h için kuluçkaya.
Not: Bu kuluçka döneminde occours refolding. Bu adım ileriye doğru çözüm katlanmış dimerik BMP2 K3Plk içerir. - Konsantre HCl. Dialyze 1 mM konsantre HCl. karşı çözüm konsantre hücrede 10 kDa molekül ağırlığı kesme (MWCO) membran kullanarak diyaliz solüsyonu kullanarak 3.0 çözüm pH ayarlayın.
- Çözüm arabellek (20 mM NaAc, % 30 isopropanol) ekleyerek equilibrate. Arabellek A bir çözüm % 30 birime karşılık gelen bir birim eklemek. Belgili tanımlık eriyik vasıl 4700 x g 15 dakika santrifüj kapasitesi.
- İyon değiştirme arabelleği A. yükü dengelenmiş sütuna protein çözüm 150 mL ile bir hızlı protein sıvı Kromatografi (FPLC) sistem15 için sütun equilibrate. Doğrusal gradyan (20 mM NaAc, % 30 isopropanol, 2 M NaCl) arabelleği B kullanarak kesirler elute arabellek B. toplamak 2 mL kesirler 100 mL kullanarak.
Not: Toplam sütun hacmine göre sütun için yüklemeden önce protein konsantre. Son protein birim olmalıdır < %5 Toplam sütun biriminin. - Her kesir 20 µL SDS Polyacrylamide (% 12) Jel Elektroforez (SDS-sayfa) 16 ve Coomassie parlak mavi boyama17 tarafından ( Tablo malzemelerigörmek) analiz.
Not: SDS-sayfa jel gösterir kesirler dimer (26 kDa) ve kesirler monomer (13 kDa) içeren içeren Coomassie parlak mavi lekeli. - Dimer içeren kesirleri havuz. Kesirler gecede 4 ° C'de 1 mM HCl (5 litre hacim) karşı içeren dimer havuzu diyaliz. Santrifüj filtre ünitesi konsantre bir 10 kDa kullanarak nihai ürün konsantre ( Tablo malzemelerigörmek). SDS Polyacrylamide (% 12) Jel Elektroforez (SDS-sayfa) ve Coomassie parlak mavi boyama tarafından nihai ürün analiz.
Not: Coomassie parlak mavi bant SDS-sayfa lekeli jel 26 kDa tek bir grup göstermek. Bu son BMP2-K3Plk ürünüdür.
2. bakır (I) getirilmesi-ALKİN-azid Cycloaddition (CuAAC) koşulları katalize
- Sodyum askorbat (NaAsc) ve bakır (II) sülfat (CuSO 4 ) etkisi BMP2 vahşi türüne (BMP2-WT)
- 20 µM kuluçkaya BMP2-WT NaAsc farklı oranlara CuSO4' e sahip. 0,5 mM NaAsc ve 0,5 mM CuSO4 (başlangıç konsantrasyonu) 50 µL hacmindeki kullanın. NaAsc aşağıdaki oranları ile CuSO4' e devam: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20: 1), CuSO4 konsantrasyonu 0.5 mM sabit tutmak ve NaAsc konsantrasyonu buna göre ayarlayarak. H2O dönen Mikser (20 devir/dakika) üzerinde tepki gecede RT. gerçekleştirmek
- Azaltılmış örnekleri %5 2-mercaptoethanol içeren yükleme arabelleği ekleyerek hazırlamak ve örnek 95 ° c 6 dk. analiz azalır ve SDS Polyacrylamide tarafından sigara azaltılmış örnekleri (% 12) Elektroforez (SDS-sayfa) ve Coomassie parlak mavi boyama jel için kuluçkaya. SDS-sayfa jelleri lekeli Coomasie 13 kDa (sınırlı koşullar) 26 kDa ve daha yüksek molekül ağırlıklı (sigara azaltılmış koşullar) aralığında bantları göster.
-
Etkisi Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) Amin (THPTA) üzerinde CuAAC tepki
- 20 µM kuluçkaya BMP2-K3Plk THPTA farklı oranlara CuSO4' e sahip. 5 mM NaAsc ve 200 µM 3-Azido-7-Hidroksikumarin (NaAsc ve 3-Azido-7-Hidroksikumarin sabit tutmak) kullanın. 50 µM THPTA ve 0,5 mM CuSO4 konsantrasyonları başlangıç olarak kullanın. THPTA farklı oranlara CuSO4kullanın: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). RT 24 h üzerinde dönen Mikser (20 devir/dakika) reaksiyon H2O (50 µL Toplam hacim) gerçekleştirir.
- Kaplin üzerine bir floresan boya 3-Azido-7-Hidroksikumarin olur. Örnekleri azaltılmış ve sigara azaltılmış koşullarda hazırlamak ve bunları SDS-PAGE tarafından analiz. 3-Azido-7-Hidroksikumarin için belirli dalga boyu ile uyarma kanalın altında jelleri görselleştirmek (λabs 404 = nm; λem = 477 nm).
3. BMP2-K3Plk azid için kovalent kaplin tekniği özel boncuk Functionalized
- BMP2-K3Plk veya BMP2-WT (negatif kontrol kullanılan) 20 µM azid aktif özel boncuk tepki arabelleği (0.1 M HEPES pH 7,0, 3,9 M üre, 50 µM CuSO4, 250 µM THPTA, 5 mM sodyum askorbat) 500 µL toplam hacmi içinde 20 µL ile bir rotati RT, 2 h için kuluçkaya NG Mikser (20 devir/dakika). Reaksiyon 5 mM EDTA (son konsantrasyonu) ekleyerek durdurmak.
- RT dönen Mikser (20 devir/dakika) üzerinde 15 dakika kuluçkaya. 20.000 x g 1 dk az RT. toplamak için de örnekler santrifüj kapasitesi supernatants.
- Üç kez ile 1.000 µL HBS500 arabelleği (50 mM HEPES, 500 mM NaCl), boncuk içeren Pelet üç kez 4 M MgCl21000 µL ile iki kez 1.000 µL fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın. Her yıkama adımında, RT, 1 dk. için 20.000 x g, santrifüj kapasitesi ve supernatants toplamak. Eşleşmiş boncuk PBS 1.000 µL 4 ° C'de depolayın
Dikkat: süpernatant kaldırılırken boncuk Pelet rahatsız etmeyin.
4. doğrulama varlığı ve biyolojik aktivitesi immobilize BMP2-K3Plk kullanarak Texas kırmızı etiketli BMP reseptör ben bir Ectodomain (BMPR-IA EC )
- 50 kuluçkaya Texas kırmızı 1 µM ile BMP2-K3Plk functionalized boncuk µL dönen Mikser (20 devir/dakika) 1 h için RT 150 µL HBS500 arabelleği (50 mM HEPES, 500 mM NaCl) ile BMPR-IAEC etiketli.
- Boncuk için 1 dk RT. atma süpernatant az 20.000 x g, santrifüj kapasitesi. Boncuk 1000 µL HBS500 arabelleği ile yıkayın. Ek bir çamaşır adım 3 kez tekrarlayın. Her sonra RT, 1 dk. için 20.000 x g, santrifüj adım yıkama.
- Boncuk PBS 500 µL içinde resuspend ve cam kapak Slayt üzerindeki 50 µL pipet. 561 veya 594 nm arasında mikroskop filtre ayarlayın. Texas kırmızı-BMPR-IAECalgılamak-BMP2-K3Plk functionalized kullanılması floresan mikroskopi ve take Fotoğraflar boncuk.
5. ölçme alkalen fosfataz (ALP) In Vitro Bioactivity BMP2-K3Plk önce üretilen ve kaplin reaksiyon sonra kanıtlamak için ifade.
-
Alkalen fosfataz (ALP) tahlil
- Promyoblastic C2C12 hücreleri (ATCC CRL-172) %10 Fetal buzağı Serum (FCS), 100 U/mL penisilin G ve 100 µg/mL streptomisin %5 CO2oksijen bir atmosferde 37 ° C'de Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) içinde kültür.
- C2C12 hücreleri, 3 × 104 hücreleri/iyi bir yoğunluk bir 96-şey Mikroplaka içine tohum. Hücreleri bir gecede eklemek izin. Orta kaldırmak ve C2C12 hücreleri 0,5-200 huzurunda kuluçkaya 100 µL/iyi DMEM (% 2 FCS, 100 U/mL penisilin G ve 100 µg/mL streptomisin), % 5 CO2 72 h için oksijen bir atmosferde 37 ° C'de BMP2-WT veya BMP2-K3Plk nM.
- Orta kaldırmak ve hücreleri PBS 100 µL iyi ücret ile yıkayın. RT 100 µL/iyi lizis arabelleği ile 1 h için hücreleri Parçalayıcı (%1 NP-40, 0.1 M glisin, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) bir sallayarak plaka (220 devir/dakika).
- 100 µL/iyi ALP arabelleği (0.1 M glisin, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) 1 mg/mL p-(taze eklendi) nitrophenylphosphate ile lysate hücreye ekleyin.
- Ölçmek emme 405 nm içinde renk gelişimi tamamlanana kadar ALP tampon ve her 5 dk ekledikten sonra multiplate bir okuyucu. Doz yanıt eğrileri ve EC50 değerleri logistic bir modeli kullanarak oluşturmak y = A2 + (A1-A2) / (1 + (0x)p).
-
Alkalen fosfataz (ALP) Boyama
- Promyoblastic C2C12 hücreleri (ATCC CRL-172) içinde Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) %10 Fetal buzağı Serum (FCS), 100 U/mL penisilin G ve % 5 CO2oksijen bir atmosferde 37 ° C'de 100 µg/mL streptomisin kültür.
- C2C12 hücreleri, 3 × 104 hücreleri/kuyuda bir 96-şey Mikroplaka yoğunluğu tohum. Hücreleri bir gecede eklemek izin. Orta kaldırın ve 20 µL/iyi BMP2-K3Plk birleştiğinde boncuk ekleyin. BMP2-K3Plk birleştiğinde boncuk bir PBS süspansiyon 1000 µL içinde vardır.
- %0,4 düşük erime noktası özel DMEM içinde bir çözüm hazırlamak. (600 W 3 dk) mikrodalgada eritin ve 37 ° C'de bir su banyosunda soğumasını kadar kullanmak sağlar.
- 20 µL % 0,4 düşük erime noktası özel her şey (kaplama boncuk ve hücreleri) ekleyin. 20 ° C'de 5 min için 2000 x g, santrifüj 80 µL DMEM (% 2 FCS, 100 U/mL penisilin G ve 100 µg/mL streptomisin) ekleyin ve %5 CO2 72 h için oksijen bir atmosferde 37 ° C'de kuluçkaya.
- Orta katılaşmış % 0,4 özel ayırmaz için dikkatli olmak, kaldırın. 1-adım NBT 100 µL/kuyu eklemek/BCIP (Nitro-mavi tetrazolium klorür, 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidin tuz) substrat çözeltisi.
- Alkalen fosfataz hemen mor boyama belli olduktan sonra ışık mikroskobu kullanarak boyama analiz. Parlak alan mikroskobu kullanın ve fotoğraf çekmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makalede, kovalent bir yeni BMP2 değişken, BMP2-K3Plk, piyasada bulunan azid functionalized özel boncuk (şekil 1) çift için bir yöntem açıklanmaktadır. Üretilen BMP2-K3Plk değişken bioactivity alkalen fosfataz (ALP) gen ekspresyonu C2C12 hücrelerdeki indüksiyon tarafından doğrulandı. Vitro test benzer ALP ifade düzeyleri vahşi türü BMP2 tarafından indüklenen gösterir (BMP2-WT) ve BMP2-K3Plk (Şekil 2).
Bakır (II) sülfat (CuSO4) ve sodyum askorbat (NaAsc) arasında Redoks reaksiyonları yapısal bütünlük etkiler ve böylece BMP2-K3Plk bioactivity etkiler Reaktif oksijen türleri oluşturmak. Protein yapısal bütünlüğünü doğrulamak için biz bir gecede kuluçka CuSO4 ve NaAsc, BMP2-WT bozulması (sınırlı koşullarda (şekil 3A1 SDS-PAGE tarafından görüntülenmiştir bir konsantrasyon bağımlı şekilde gösterilen ile gerçekleştirilen )) ve multimers veya toplamları (koşullarda sigara azaltılmış) yaklaşık 40 kDa görünür oluşumu (şekil 3A2). Protein yıkımı, Tris önlemek için (3-hydroxypropyltriazolyl-metil) Amin (THPTA) bir koruyucu ajan (şekil 3B) olarak kullanılmıştır. Buna ek olarak THPTA tarafından yüksek molekül ağırlıklı yapıların oluşumu önlenebileceğini değil iken BMP2 parçalanma, THPTA kullanımını engeller. Daha fazla iyileştirmeler reaksiyon reaksiyon arabellek, reaksiyon sıcaklık ve reaksiyon süresi (veri gösterilmez) ele. Protokol burada Ayrıntılar tepki arabellek oluşturma, sıcaklık ve reaksiyon süresi ile ilgili son başarıları anlatılan.
BMP2-K3Plk bioactivity sonra kaplin korur onaylamak için biz fluorescently etiketli reseptör ectodomain protein türü kullanılan ben immobilize protein bu reseptör bağlamak hala mümkün olduğunu göstermek için reseptör (BMPR-IAEC). Boncuk boya etiketli BMPR-IAEC ile (şekil 4) inkübe zaman Floresans vermiştir CuAAC kimya ile BMP2-K3Plk ile kaplı. Kontrast, Sigara kaplı boncuk veya BMP2-WT yok Floresans gösterdi inkübe boncuk (veri gösterilmez)14arka plan üzerinde sinyal seviyeleri.
Reseptör bağlama yeteneklerine immobilize ligand vitroonayladıktan sonra biz de biyolojik yanıt hücre tabanlı tahlil functionalized boncuk tarafından tetiklenen olup olmadığını test. ALP BMP2-K3Plk-functionalized boncuk (şekil 5) ile doğrudan temas halinde olan hücrelerde meydana gelen boyama aracılık. Bu boncuklar için daha büyük mesafelerde bir daha yayılmış-out boyama aksi takdirde gözlenmiştir bu yana protein boncuk gerçekten kovalent bağlı ve sadece bencil değil, onaylar.
Şekil 1: BMP2 tasviri-K3Plk. (A) BMP2-K3Plk değişken bir tasviri ile tanıtılan amino asit ikame lokalizasyonu. (B) düzeni kaplin: BMP2-K3Plk CuAAC tepki azid ile functionalized boncuk. İzniyle Tabisz ve ark(uyarlama) yayımlanmaktadır. (2017): site yönettiği immobilizasyon BMP-2: yenilikçi osteoindüktif iskele imalatı için iki yaklaşım. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Telif hakkı 2017 Amerikan Kimya Derneği) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Bioactivity BMP2-versiyonlarının. Karşılaştırma BMP2-K3Plk ve wildtype BMP2 (ALP tahlil) bioactivities (BMP2-WT). BMP2-K3Plk assay olarak kullanılan ya da BMP2-WT konsantrasyonu x ekseni gösterir. EC50 veri ortalama değerleri ve standart sapmalar 4 bireysel deneyler (N = 4) temsil eder. İzniyle Tabisz ve ark(uyarlama) yayımlanmaktadır. (2017): site yönettiği immobilizasyon BMP-2: yenilikçi osteoindüktif iskele imalatı için iki yaklaşım. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Telif hakkı 2017 Amerikan Kimya Derneği) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: BMP2 bütünlüğünü indirgeyici etkisi. (A) BMP2-WT sodyum askorbat (NaAsc) (II) sülfat (CuSO4) bakır için farklı molar oranı maruz oldu. Örnekleri SDS-sayfa ve Coomassie parlak mavi azaltılmış (Şekil A1) ve sigara azaltılmış koşullarda (Şekil A2) Boyama tarafından analiz edildi. Sınırlı koşullarda (A1), Kırmızı oklar i ciddi BMP2-WT temsil eder. Sigara azaltılmış koşullarında (A2), Kırmızı oklar, multimeric BMP2-WT gösterir. İ ciddi BMP2 tür temsil eden grup mavi bir okla belirtilir. Gösterge: NCR - BMP2-WT tedavi edilmezse azalır; NC - BMP2-WT tedavi edilmezse; 1:1 20:1-artan sodyum askorbat CuSO4azıdişi oranları. (B) BMP2-K3Plk 3-Azido-7-Hidroksikumarin için birleştiğinde THPTA ile takviye CuAAC reaksiyon koşul kullanma. Kaplin üzerine bir floresan boya 3-Azido-7-Hidroksikumarin olur. Gösterge: NC - 3-Azido-7-Hidroksikumarin ile BMP2-WT tepki gösterdi; 7: 1'e 20:1 THPTA molar oranları CuSO4artan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: immobilize BMP2 K3Plk tüp bebek Bioactivity. Temsili resim immobilize BMP2-K3Plk BMPR-IAECTexas kırmızı etiketli ile etkileşim. İzniyle Tabisz ve ark(uyarlama) yayımlanmaktadır. (2017): site yönettiği immobilizasyon BMP-2: yenilikçi osteoindüktif iskele imalatı için iki yaklaşım. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Telif hakkı 2017 Amerikan Kimya Derneği) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: bir hücre tabanlı tahlil immobilize BMP2-K3Plk Bioactivity. (A) temsili resmi alkalen fosfataz (ALP) Boncuk ile tedavi üzerine boyama birleştiğinde BMP2-K3Plk functionalized boncuk için. (B) çözünür 25 ile tedavi üzerine boyama alkalen fosfataz (ALP) nM BMP2-(Tabisz ve arkizniyle uyarlanmıştır) K3Plk. Reprinted. (2017): site yönettiği immobilizasyon BMP-2: yenilikçi osteoindüktif iskele imalatı için iki yaklaşım. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708. (Telif hakkı 2017 Amerikan Kimya Derneği) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tagged protein değişik genetik kodon genişleme getirici birincil protein dizi herhangi bir konumundaki başta olmak üzere çeşitli doğal olmayan amino asit analogları giriş izin verir. 6-histidin (onun) etiketi yalnızca olabilir gibi BMP2 gibi BMP durumunda ortak Etiketler beri protein´s C-terminal sonuna Tersiyer protein yapısı içinde gömülü ve böylece dışarıdan erişilebilir değil N ölümcül, tanıttı. Diğer konumlarda tanıtılan etiket boyutunu çok büyük olasılıkla sonuç olarak BMP´s bioactivity tıkamak yapısal değişikliklere neden olabilir. Ayrıca, bir mutasyon tanıtımı BMP2 sıra içine refolding etkinliğini etkileyebilir ve ayrıca değiştirilmiş protein isoelectric noktası gibi diğer protein parametreleri değiştirebilirsiniz. Böylece, her adım bir kurulan protein üretim protokolündeki değişmiş protein variant´s özelliklerine göre adapte gerekir. BMP2-K3Plk üretim gerçekten vahşi türü BMP2 ifade için kurulan yöntemi bir değişiklik gerekli. Farklı kültür kez veya propargyl-L-lizin (Plk) konsantrasyonları edildi (test verileri gösterilmez) en yüksek ifade verim ulaşmak için. Refolding, ayırma ve saflaştırma adımları Neyse ki başka adaptasyonlar gerek yoktu. Biz zaten bizim laboratuvarda üretilen diğer BMP2 türevleri durumunda bazı protein özellikleri önemli ölçüde, BMP üretim yöntemi18birkaç adım değişiklik gerekli değiştirilmiş olduğunu bildirdi. Üretilen BMP2 K3Plk biyolojik aktivitesi vahşi türü protein karşılaştırılabilir gösterdi. Muhtemelen bir sonucu olarak daha düşük bir çözünürlük vahşi türü BMP2 kıyasla orta BMP2 K3Plk varyantın yüksek BMP2 konsantrasyonlarda bir fark oluşur.
Bakır katalize azid-ALKİN cycloaddition (CuAAC)19bilinen avantajları rağmen CuAAC reaksiyonlar dikkatlice belirli uygulamalara adapte olmalıdır. Biz nasıl BMP2 parçalanmış veya toplamları veya multimers güçlü azalan bakiyeli reaksiyon koşulları nedeniyle oluşturmak gösterdi. Böylece, tüm reaksiyon parametreleri ayrıntılı olarak protein etkilenmemelerini koşulları bulmak için analiz edilecek vardı.
Bizim yaklaşım kovalent BMP2 değişken azid functionalized özel boncuk için tıklayın kimya tarafından çift functionalized boncuk Osteojenik farklılaşma vitrotetikleme kaynaklanan yüksek verimlilik ile fark. Vahşi türü BMP2 protein boncuklar ile tepki yerine kullanıldığında, ALP ifade boyama, kaplin gerçekten son derece özel olarak BMP2-K3Plk propargyl-L-lysin kalıntı oluştuğunu gösteren tek zayıf gözlemlemek.
Bu konuma göre kaplin özgüllük klasik NHS/EDC kimya içeren immobilizasyon prosedürlere göre büyük bir gelişme yansıtır. Bu gibi durumlarda, rasgele kancası oluşur, esas olarak lizin kalıntılarında mevcut birincil Amin grupları içeren. Eşleşmiş protein bir değişken Osteojenik etkinliği, farklı yönelimleri proteinin hücre reseptörleri doğru yol iskele için olası bağlantı çokluğu nedeniyle vardır.
Site doğrudan immobilize BMP2 kullanımı kemik oluşumunu ikna etmek için gerekli olan yüksek dozda çözünür BMP2 için ilgili belirtilen sakıncaları üstesinden. Tarafından immobilize BMP2 C2C12 hücrelerinin Osteojenik farklılaşma tamamen başlatılan gibi ek olarak, sonuçları açıkça belli bazı hücresel yanıt-e doğru göstermek son çalışmalar bu sinyal iddia rağmen iletim, endositoz gerektirir ligand/ligand-reseptör karmaşık20,21. Cihazla ilgili izlenimlerimizi kovalent birleştiğinde (ama değil site yönetmen) endocytosable olmayan yüzeylere, BMP2, hala osteoblast farklılaşma22ikna etmek mümkün olduğunu gösteren diğer çalışmalar ile anlaşma vardır.
Kaplin tepki için BMP2 supra fizyolojik konsantrasyonları kullanmış göz önüne alındığında, immobilize BMP2 miktarı daha da hala boncuk Osteojenik özelliklerini muhafaza süre azalabilir. Gibi en iyi duruma getirme adımlar önce ancak, BMP2-K3Plk-functionalized iskele Osteojenik potansiyel içinde vivokanıtlamak için hayvan deneylerinde test edilmesi gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.
Acknowledgments
Yazarlar Dr. M. Rubini (Konstanz, Almanya) pyrrolysyl-tRNA kodlama plazmid sağlamak için ve pRSFduet-pyrtRNAsynth karşılık gelen aminoasil tRNA sentetaz kodlama sağlamak için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1-Step NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Add solution to cells |
| 3-Azido-7-hydroxycoumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Chemical used for click reaction |
| Agarose low melting point | Biozym | 840101 | Agarose for ALP assay |
| Azide agarose beads | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Beads used for reaction |
| BamHI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriction enzyme |
| BMP receptor IA (BMPR-IAEC) | -- | -- | Produced in our lab |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE |
| Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Chemical used for click reaction |
| DNA Polymerase and reaction buffer | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Cell culture media |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Chemical used to stop click reaction |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bacteria induction (1mM final concentration) |
| NdeI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriction enzyme |
| NHS-activated Texas Red | Life technologies | T6134 | Coupled to receptor |
| P- Nitrophenyl Phosphate | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkaline Phosphatase |
| p25N-hmBMP2 | -- | -- | Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| propargyl-L-lysine (Plk) | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | -- | -- | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel Purification |
| Qiagen PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR Purification |
| Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Chemical used for click reaction |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligation |
| tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Chemical used for click reaction |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon concentrating cell 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Concentrating unit |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck KGaA | UFC901024 | Concentrating centrifugal unit |
| ÄKTA avant FPLC | ÄKTA | -- | FPLC machine |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge for bacterial culture |
| Bacterial Shaking Incubator | Infors HT | Shaking incubator for bacterial culture | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | -- | Imaging and analysis system for SDS-PAGE |
| Fluorescent miscroscope | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3- (M) | Merck KGaA | 116882 | Ion Exchange Chromatography column material |
| Greiner CELLSTAR® 96 well plates | Sigma | M5811-40EA | 96 well plates for cell culture (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | -- | Centrifuge |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoScientific | 75003624 | Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining |
| Microcentrifuge - 5417R | Eppendorf | -- | Centrifuge |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | -- | software for stastic analysis of ALP assay data |
| Polysine Slides | ThermoScientific | 10143265 | microscope slides |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | -- | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Tecan infinite M200 multiplate reader | Tecan Deutschland GmbH | -- | Multiplate reader for ALP assay |
| Thermocycler - Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | -- | PCR |
| TxRed - microscope filter | Keyence | Filter for fluorescent microscope | |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
References
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: An update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27 (2005).
- Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations. Biofactors. 40 (5), 459-481 (2014).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., Merkle, H. P., Gander, B. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur J Pharm Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Haidar, Z. S., Hamdy, R. C., Tabrizian, M. Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part A: Current challenges in BMP delivery. Biotechnol Lett. 31 (12), 1817-1824 (2009).
- Hollinger, J. O., Uludag, H., Winn, S. R. Sustained release emphasizing recombinant human bone morphogenetic protein-2. Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 303-318 (1998).
- Uludag, H., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: A correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J Biomed Mater Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Uludag, H., Golden, J., Palmer, R., Wozney, J. M. Biotinated bone morphogenetic protein-2: In vivo and in vitro activity. Biotechnol Bioeng. 65 (6), 668-672 (1999).
- Aono, A., et al. Potent ectopic bone-inducing activity of bone morphogenetic protein-4/7 heterodimer. Biochem Biophys Res Commun. 210 (3), 670-677 (1995).
- Suzuki, Y., et al. Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo. J Biomed Mater Res. 50 (3), 405-409 (2000).
- Knaus, P., Sebald, W. Cooperativity of binding epitopes and receptor chains in the BMP/TGFbeta superfamily. Biol Chem. 382 (8), 1189-1195 (2001).
- Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 225-249 (2006).
- Costa, G. L., Weiner, M. P. Rapid PCR site-directed mutagenesis. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2. FEBS Lett. 468 (2-3), 215-219 (2000).
- Tabisz, B., et al. Site-directed immobilization of BMP-2: Two approaches for the production of innovative osteoinductive scaffolds. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708 (2017).
- Duong-Ly, K. C., Gabelli, S. B. Using ion exchange chromatography to purify a recombinantly expressed protein. Methods Enzymol. 541, 95-103 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II. EMBO J. 19 (13), 3314-3324 (2000).
- Hein, J. E., Fokin, V. V. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides. Chem Soc Rev. 39 (4), 1302-1315 (2010).
- Alborzinia, H., et al. Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists. J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).
- Paarmann, P., et al. Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling. Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).
- Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
