Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 für die Analyse der Bildung und Reparatur der DNA Double-Strand Breaks

Published: November 3, 2017 doi: 10.3791/56617

Summary

Diese Handschrift enthält ein Protokoll für die Analyse von DNA-Doppel-Strangbrüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1.

Abstract

DNA-Doppel-Strangbrüchen (DSB) sind schwere DNA-Läsionen. Analyse der Bildung und Reparatur des DSB ist in einem breiten Spektrum von Forschungsgebieten einschließlich Genom Integrität, Genotoxizität, Strahlenbiologie, Altern, Krebs und Arzneimittelentwicklung. In Erwiderung auf DSB ist die Histon H2AX Serin 139 in einer Region mit mehreren Megabase Paare bilden diskrete nuklearen Herde nachweisbar durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie phosphoryliert. Darüber hinaus 53BP1 (p53 bindendes Protein 1) ist ein weiteres wichtiges DSB-responsive Protein Förderung der Reparatur des DSB bei nonhomologous Ende-homologe Rekombination zu verhindern. Entsprechend den spezifischen Funktionen der γH2AX und 53BP1 möglicherweise die kombinierte Analyse von γH2AX und 53BP1 durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ein vernünftiger Ansatz für eine detaillierte Analyse des DSB. Diese Handschrift enthält eine Schritt für Schritt Protokoll ergänzt durch methodische Hinweise für die Durchführung der Technik. Insbesondere zeigt sich der Einfluss des Zellzyklus auf γH2AX Brennpunkte Muster in normalen Fibroblasten der Zelllinie NHDF. Darüber hinaus ist der Wert der γH2AX Brennpunkte als Biomarker in Röntgenstrahlung bestrahlt Lymphozyten eines gesunden Menschen dargestellt. Zu guter Letzt wird die genetischer Instabilität in CD34 + Zellen eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 untersucht.

Introduction

DNA wird kontinuierlich durch endogene beschädigt (z.B., Replikation Stress, reaktive Sauerstoffspezies, innere Instabilität von DNA) und exogene(z. B.chemische radikale, Bestrahlung) Quellen (Abbildung 1)1,2 ,3,4. Unter DNA-Schäden DNA-Doppel-Strangbrüchen (DSB) sind besonders schwere Läsionen und Zelltod oder Karzinogenese induzieren können. Etwa 50 DSB ergeben sich pro Zelle und Zellzyklus5. In Säugetierzellen entwickelte homologe Rekombination (HR) und nonhomologous Ende verbinden (NHEJ) als wichtigen Wege für die Reparatur des DSB (Abbildung 2). HR in späten S/G2-Phase tritt und nutzt eine intakte Schwester Chromatids als Vorlage für potenziell fehlerfreie Reparatur. Im Vergleich dazu ist NHEJ während des Zellzyklus aktiv und potenziell mutagene wie Basenpaare hinzugefügt oder vor der Ligatur der gebrochenen enden reseziert werden. Darüber hinaus kann Alternativen Ende-Verbindung als eine langsame mutagene Back-up Repair-Mechanismus bei NHEJ Mangel6,7betraut sein.

DSB induzieren die Phosphorylierung des Histon H2AX Serin 139 in einer Region von mehreren Megabase Paaren um jede DSB. Bildenden nuklearen Brennpunkte werden benannt γH2AX Brennpunkte und nachweisbar durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie-8. ΓH2AX fördert die Einstellung von weiteren DSB-responsive Proteine und Chromatin umgestalten, DNA-Reparatur und Signal Transduction9beteiligt ist. Da jeder γH2AX Schwerpunkt gilt, einen einzigen DSB zu vertreten, ist die Quantifizierung der DSB durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie möglich, die nachweislich in Krebszelllinien und Patientenproben10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 bindendes Protein 1) ist eine weitere wichtige Protein bei der Vermittlung von DSB-Reparatur. Es ist bei der Rekrutierung von DSB-responsive Proteine, Checkpoint Signalisierung und der Synapsis DSB endet15beteiligt. Darüber hinaus spielt die 53BP1 eine entscheidende Rolle bei der DSB Reparatur Weg Wahl. Es löst die Reparatur des DSB in Richtung NHEJ, während HR verhindert16ist. In Betracht der echte Funktionen γH2AX und 53BP1 in der DSB-Reparatur möglicherweise die simultane Analyse von γH2AX und 53BP1 durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie eine nützliche Methode für die genaue Analyse der Bildung und Reparatur des DSB.

Diese Handschrift enthält eine Schritt für Schritt Protokoll für Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 in Zellkernen durchführen. Insbesondere ist die Technik in normalen Fibroblasten der Zelllinie NHDF, in x-ray bestrahlt Lymphozyten eines gesunden Menschen und CD34 + Zellen eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie angewendet. Die Einzelheiten des Verfahrens sind im Zusammenhang mit den vorgestellten Ergebnissen hingewiesen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

alle hier beschriebene Methoden wurden von der Ethik Komitee II in die medizinische Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg zugelassen. Schriftliche Einwilligung von allen Personen eingeholt wurde.

1. Vorbereitung der Materialien

  1. Antikoagulans-Stammlösung: bereiten ein Antikoagulans Stammlösung 200 IE Heparin pro mL in 0,9 % Natriumchlorid. Füllen Sie jeweils die Röhrchen (zeichnen Sie Volume 9 mL) mit 2 mL der gerinnungshemmenden Vorratslösung vor Entnahme der Proben Blut oder Knochenmark.
  2. Lyse-Lösung für die Erythrozyten: bereiten die 10 x Lyse-Lösung für die Erythrozyten mit 82,91 g Ammoniumchlorid, 7,91 g Ammonium Bicarbonat und 2 mL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic sauren Lösung einen pH-Wert von 8,0 durch Auflösen der Wirkstoffe in bidestilliertem Wasser für ein Gesamtvolumen von 1 L.
  3. Fixierung Lösung: hinzufügen 8.3 µL einer 1 M Kalilauge zu 360 mg Paraformaldehyd (PFA) in einem Mikrotiter-Rohr. Füllen Sie das Rohr mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bis 1 mL-Markierung des Rohres und Wärme der Röhre in einem Heizblock bei 95 ° C, 1 mL einer 36 % PFA Lösung zu bekommen. Ein Rohr mit einer Kapazität von 15 mL übermitteln Sie 1 mL 36 % PFA Lösung. Die Lösung 1 mL 36 % PFA, 9 mL einer 4 % PFA Vorratslösung zu fügen Sie 8 mL PBS hinzu. Aliquoten 4 % PFA-Stammlösung und Speicher bei-18 ° C bis zur Fixierung der Zellen nutzen.
    Achtung: (1) Kalilauge ist ätzend. Beachten Sie Augen-und Haut. (2) PFA ist krebserregend. Vermeiden Sie Hautkontakt und Inhalation. Bereiten Sie die Fixierung-Lösung unter einer Haube.
  4. Permeabilisierung Lösung: hinzufügen 50 µL Octoxinol 9 bis 50 mL PBS zu einer Lösung von ca. 0,1 % Octoxinol 9.
  5. Blockiert Lösung: bereiten Sie 5 % und 2 % blockieren von Lösungen durch Mischen der Protein Blockierungsmittel mit PBS und Store bei 6 – 8 ° C.

2. Vorbereitung der Proben

  1. Fibroblasten in der Zellkultur: pflegen menschliche Fibroblasten der Zelllinie NHDF in einer befeuchteten 5 % CO 2 Atmosphäre bei 37 ° C in RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10 % fetalen Kälberserum, 4 mM Glutamin, und 1 % Penicillin/Streptomycin.
    1. Vorbereitung der einen Objektträger mit Anhänger Fibroblasten
      1. Entfernen Sie das Medium aus der Flasche (75 cm 2 Wachstumsbereich) mit exponentiell wachsenden NHDF Fibroblasten. Fügen Sie 10 mL PBS in den Kolben. Vorsichtig waschen anhaftenden Fibroblasten durch manuell Schütteln der Flasche für 1 min.
      2. Die PBS zu entfernen und fügen Sie 1 mL Trypsin in den Kolben. Schütteln Sie die Flasche vorsichtig, um sicherzustellen, dass alle adhärente Zellen von Trypsin abgedeckt werden. Die Trypsin aus der Flasche zu entfernen. Legen Sie die Flasche in den Brutkasten für 5 min bei 37 ° c
      3. Nehmen die Flasche aus dem Inkubator und 10 mL RPMI 1640 Medium in den Kolben. Pipette das Medium nach oben und unten mehrmals die Fibroblasten zu zerstreuen.
      4. Der dispergierten Fibroblasten auf jeweils zwei Felder der Objektträger 0,3 mL pipette und setzen Sie die Folie in den Brutkasten für 24 h, so dass die Fibroblasten zur Folie haften. Für Immunostaining von γH2AX und 53BP1 in Kernen von Fibroblasten, fahren Sie mit Schritt 3.1.
  2. Patientenproben
    1. Blutproben: verwenden Sie die Röhrchen, die angefüllt waren mit 2 mL der gerinnungshemmenden Vorratslösung und fügen 7 mL Blut in die Rohre. Speichern Sie die Proben über Nacht bei Raumtemperatur (d.h., 18-20 ° C). Am nächsten Tag isolieren die G0/G1-Phase ruhen Mononukleäre Zellen durch Dichte Gradienten Zentrifugieren (Schritt 2.2.3).
    2. Knochenmarkproben: verwenden Sie die Röhrchen, die angefüllt waren mit 2 mL der gerinnungshemmenden Vorratslösung (Schritt 1.1) und fügen Sie 7 mL Knochenmark in den Rohren. Speichern Sie die Proben über Nacht bei Raumtemperatur (d.h., 18-20 ° C). Am nächsten Tag isolieren der G0/G1-Phase ruhen Mononukleäre Zellen durch Dichte Gradienten Zentrifugieren (Schritt 2.2.3). Verwenden Sie CD34 Microbeads und Zell-Trennsäulen für die Isolierung von CD34 + Zellen.
    3. Isolierung von mononukleären Zellen durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung
      Hinweis: Mononukleäre Zellen sind von Blut und Knochenmarkproben durch Dichte Gradienten Zentrifugation 17 , 18 , 19 isoliert.
      1. Verdünnt den heparinisierten Blutprobe in einem Verhältnis von 1:1 mit PBS und der heparinisierten Knochenmarkprobe in einem Verhältnis von 1:3 mit PBS. Aussetzen der Zellen sanft durch Zeichnen sie in die und aus der Pipette zweimal.
      2. Volumen Dichte Gradienten Medium zu einem neuen Schlauch. Sanft Schicht verdünnten Blut oder Knochenmark auf das Dichte-Gradienten-Medium. Achten Sie darauf, nicht die beiden Schichten mischen.
      3. Zentrifugieren der Röhre für 30 min bei Raumtemperatur und 400 X g. Abziehen der oberen Plasmaschicht mit der Pipette. Dann ernten Sie sorgfältig die mononukleären Zellen in der Schicht über das Dichte-Gradienten-Medium. Übertragen der mononukleären Zellen in ein frisches Gefäß.
      4. Mindestens drei Bände von PBS hinzufügen der mononukleären Zellen in der Röhre. Aussetzen Sie die Zellen sanft durch Zeichnen sie in die und aus der Pipette zwei Mal. Zentrifugieren Sie das Rohr für 10 min bei Raumtemperatur und 400 X g.
      5. Nach dem Spin den Überstand zu entfernen und 10 mL 4 ° C, 1 x Lyse-Lösung für die Erythrozyten. Aufschwemmen der Zellen sanft durch Zeichnen sie in die und aus der Pipette zwei Mal, und das Rohr für 5 min auf Eis legen. Dann fügen Sie 30 mL PBS bei 4 ° C und Zentrifugieren Sie das Rohr für 10 min bei Raumtemperatur und 400 X g.
    4. Vorbereitung der Cytospins
      1. bereiten Sie zwei Cytospins mit mononukleären Zellen von Patientenproben (d. h., ein Cytospin für γH2AX Immunfluoreszenz Färbung und eine Cytospin für γH2AX und 53BP1 kombiniert Immunfluoreszenz-Färbung) durch Zentrifugieren (300 X g, 10 min) von 1,0 x 10 5 Zellen für jede Zubereitung ( Abbildung 3 und 4).

3. γH2AX und 53BP1 Immunfluoreszenz Färbung

  1. Fixierung und Permeabilisierung: befestigen Sie die Zellen mit 200 µL 4 % PFA 10 min. lang. Waschen Sie nach der Fixierung die Zellen vorsichtig dreimal mit 30 mL PBS für 5 min auf einem Labor-Shaker. Dann permeabilize die Zellen mit 200 µL von 0,1 % Octoxinol 9 für 10 min. die Zellen sanft dreimal waschen mit 30 mL 5 % blockieren Lösung für 5 min auf einem Labor-Shaker. Blockieren Sie die Zellen in 30 mL frische 5 % blockiert Lösung für 1 h
  2. Inkubation mit Antikörpern
    1. inkubieren, eine Vorbereitung der Zellen mit einer Maus monoklonalen Anti-γH2AX Antikörper (1: 500) und die weitere Vorbereitung der Zellen mit einer Maus monoklonalen Anti-γH2AX Antikörper (1: 500) und eine polyklonale Kaninchen Anti-53BP1 Antikörper (1: 500) über Nacht bei 4 ° c
    2. Nach Inkubation der Zellen vorsichtig waschen 3 Mal mit 30 mL 2 % blockieren Lösung für jede 5 min auf einem Labor-Shaker.
    3. Entfernen Sie die blockierende Lösung und inkubieren Sie die erste Vorbereitung der Zellen mit einer Ziege Alexa488-konjugierten Anti-Maus Sekundärantikörper (1: 500) und die zweite Vorbereitung der Zellen mit einer Ziege Alexa488 konjugierten Anti-Maus Sekundärantikörper ( 1: 500) und ein Esel Alexa555-konjugierten Anti-Kaninchen Sekundärantikörper (1: 500) für 1 h bei Raumtemperatur.
  3. Eindeckmittel: setzen Sie die Folie mit den Zellen in eine Schüssel geben und die Zellen vorsichtig dreimal für jeweils 5 min auf einem Labor-Shaker mit 30 mL PBS waschen. Entfernen Sie die PBS und montieren Sie die Zellen mit Eindeckmittel mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole. Vorsichtig ein Deckglas auf das Eindeckmittel gelegt, so dass keine Luftblasen sind eingebettet. Warten Sie mindestens 3 h zum Härten des Mediums Montage vor der Analyse der Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie.

4. Analyse von γH2AX und 53BP1 Schwerpunkte

  1. Fluoreszenz-Mikroskopie: γH2AX und 53BP1 Brennpunkte in den Zellkernen mit einem Fluoreszenzmikroskop, ausgestattet mit Filter für DAPI, Alexa 488 und Cy3 während der Bildgebung auf ein 100 X Objektiv zu analysieren Vergrößerung. Bilder mit einer Kamera aufnehmen und verarbeiten der Bilder mit entsprechenden Imagingsoftware.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analyse der γH2AX Herde in den Zellen ist in der G0/G1-Phase und G2-Phase als γH2AX Herde als verschiedene fluoreszierende Punkte (Abbildung 5A) erscheinen am genauesten. Im Gegensatz dazu wird durch verteilte Pan-nuklearen γH2AX Flecken verursacht durch den Replikationsprozess (Abb. 5 b) Analyse der γH2AX Brennpunkte in Zellen in der S-Phase erschwert.

Fixierung der Zellen erfolgte mit 4 % PFA (10 min) und Permeabilisierung mit 0,1 % Octoxinol 9 (10 min). Methanol kann auch für die Fixierung und Permeabilisierung, benutzt werden; jedoch Methanol kann die Zellkerne ganz schwer aufzubrechen und schmieren, γH2AX Brennpunkte γH2AX Brennpunkte nicht deutlich im Vergleich zu der γH2AX Herde durch die Behandlung mit 4 % PFA und 0,1 % angezeigt Octoxinol-9.

Die Wahl des effizienten Antikörper ist entscheidend für die effektive Immunfluoreszenz-Mikroskopie. Experimente wurden durchgeführt, mit einem primären Maus monoklonalen Anti-γH2AX-Antikörper und eine primäre Kaninchen polyklonale Anti-53BP1 Antikörper für die Immunfluoreszenz-Färbung des γH2AX und 53BP1, beziehungsweise.

Wie jeder γH2AX Schwerpunkt betrachtet wird, ein einzelnes DSB vertreten, kann die Immunfluoreszenz-Färbung des γH2AX für die Quantifizierung des DSB im bestrahlten Gewebe verwendet werden. ΓH2AX Brennpunkte in bestrahlter Lymphozyten (Abbildung 6) sind proportional zur Bestrahlung Dosis20,21. ΓH2AX Herde können maximal bereits 5 Minuten Bestrahlung20,22erreichen. Der Zerfall des γH2AX Brennpunkte zu späteren Zeitpunkten kann überwacht werden und spiegelt die Reparatur von DSB20,21,22.

Genetischer Instabilität kann durch kombinierte Immunfluoreszenz-Färbung des γH2AX und 53BP1 in Zell-Linien und Tumor Proben10,11,12,13,14analysiert werden. Eine exemplarische Analyse erfolgte in den CD34 + Zellen eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (Abbildung 7). Co Lokalisierung von γH2AX und 53BP1 angezeigt, Förderung der 53BP1-vermittelten NHEJ Reparaturmechanismen an Standorten der DSB während HR verhindert werden konnte. Allerdings war der Anteil an Co lokalisierenden γH2AX und 53BP1 Schwerpunkte in Blasten der akuten myeloischen Leukämie Variable. Die γH2AX Herde ohne eine zusätzliche 53BP1-Signal könnte HR für die Reparatur des DSB in S/G2 Spätphase engagiert haben. Die Rolle des singulären 53BP1 Herde blieb schwer.

Figure 1
Abbildung 1: Quellen und folgen der endogene und exogene DNA schädigen1,2,3,4. DSB, DNA-Doppel-Strangbrüchen; NHEJ nonhomologous Ende-Beitritt.

Figure 2
Abbildung 2 : Schematische Darstellung der wichtigsten DNA-Doppel-Strang Pause (DSB) Reparaturmechanismen in Säugetierzellen. Homologe Rekombination verwendet eine intakte Schwester Chromatids in späten S/G2-Phase für potenziell fehlerfreie Reparatur des DSB. Nonhomologous Ende verbinden (NHEJ) ist aktiv in den Zellzyklus und potenziell fehleranfälliger paar Basenpaare können hinzugefügt oder vor der Ligatur der DSB enden reseziert. Alternatives Ende-Beitritt ist eine langsame mutagene Backup-Repair-Mechanismus die bei NHEJ-Mangel tätig werden könnte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Gerät für die Zubereitung des Cytospins. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Vorbereitung der Cytospins. Zwei Cytospins jeder Probe werden durch Zentrifugation von 1,0 x 105 Zellen bei 300 X g für 10 min zubereitet. Ein Cytospin dient γH2AX Immunfluoreszenz Färbung und ein weiteres Cytospin ist für kombinierte γH2AX und 53BP1 Immunfluoreszenz Färbung genutzt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Zellzyklus abhängige Muster der γH2AX Brennpunkte in normalen Fibroblasten der Zelllinie NHDF. (A) γH2AX Herde (grün, Alexa 488) in Kernen (blau, DAPI) der NHDF Fibroblasten erscheinen als verschiedene Punkte in der G0/G1 oder G2-Phase. (B) γH2AX Herde in Kernen von Fibroblasten in S-Phase als verteilte Pan-nuklearen Flecken erscheinen (Maßstabsleiste = 5 µm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : ΓH2AX Herde im Röntgenbild bestrahlt Lymphozyten eines gesunden Menschen. Die Bilder der γH2AX Herde (grün, Alexa 488) in Kernen (blau, DAPI) der Lymphozyten werden bei 5 min nach der Bestrahlung mit 100 mGy aufgezeichnet (Maßstabsleiste = 5 µm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 : Co Lokalisierung von γH2AX und 53BP1 Schwerpunkte in CD34 + Zellen eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie. Co-Lokalisierung der γH2AX Herde (grün, Alexa 488) und 53BP1 Herde (rot, Cy3) gibt an Förderung der 53BP1-vermittelten nonhomologous Ende-Beitritt Reparaturmechanismen an Standorten von DNA-Doppel-Strangbrüchen (Maßstabsleiste = 5 µm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 ist eine nützliche Methode für die Analyse der Bildung und Reparatur des DSB in einem breiten Spektrum von Forschungsgebieten. Wichtige Parameter, die Einfluss auf das Ergebnis der Experimente sind die Phase des Zellzyklus, die Agenten für die Fixierung und Permeabilisierung der Zellen, die die Antikörper und die Hardware und Software von dem Fluoreszenzmikroskop verwendet.

Die Beeinflussung des Zellzyklus γH2AX Brennpunkte Muster zeigte sich von normalen Fibroblasten der Zelllinie NHDF wächst exponentiell. Die γH2AX-Herde erschien als verschiedene fluoreszierende Punkte in der G0/G1 und G2-Phasen im Vergleich zu verteilten Pan-nuklearen γH2AX Flecken im S-Phase (Abbildung 5). Die unterschiedlichen γH2AX-Herde in der G0/G1 phase und in G2 phase angegebenen Transienten und/oder konstitutive DNA-Schäden, die bei sich wiederholenden Zellzyklus Passagen erworben worden sein könnte; umgekehrt die verstreuten Flecken in S-Phase nur vorübergehend aufgetreten und wurden vermutlich von den Replikationsprozess zugeordnet. Als Pan-nuklearen γH2AX, die Flecken stören können empfiehlt sich die Analyse der echten γH2AX Herde, der Ausschluss von S Phase Zellen aus Analyse leicht erledigt die S Phase spezifische γH2AX Muster. Alternativ können die Zellen in der S-Phase durch Messung der Intensität des Signals DAPI oder Anwendung S Phase spezifischer Marker (z.B.Cyclin A) ausgeschlossen werden. Darüber hinaus kann die Induktion von Wachstum Verhaftung mit Synchronisation von Zellen in der G0/G1-Phase hilfreich sein, vor der Herstellung der Cytospins durch Lagerung der Proben bei Raumtemperatur (d.h. 18-20 ° C) über Nacht.

Die Verfahren der Fixierung und Permeabilisierung sind wichtige Schritte in Immunostaining von γH2AX und 53BP1. Die Fixierung ist notwendig zur Erhaltung der Morphologie und Antigenität der Zellen23. Permeabilisierung ermöglicht den Zugriff auf die intrazelluläre und nukleare Antigene24. PFA ist ein relativ schonende Mittel zur Fixierung und Zellen unter Beibehaltung der Proteinstrukturen durch Reaktion mit basischen Aminosäuren in Form Methylen Querverbindungen stabilisiert. Nach der Fixierung mit PFA können Cytospins für Tage und Wochen bis Weiterverarbeitung gespeichert werden. Für die Erkennung von γH2AX und 53BP1 müssen die Zellen permeabilized werden. Octoxinol 9 diente als ein nicht-ionische Waschmittel mit ungeladenen hydrophilen Kopfgruppen bestehend aus Polyoxyethylen Moieties. Octoxinol 9 bricht die Zellkerne sanft und bewahrt γH2AX Herde ganz deutlich. Alternativ kann auch Methanol für die Fixierung und Permeabilisierung der Zellen verwendet werden. Methanol Ausscheidungen Proteine und Lipide aus der Zellmembran, so dass sie durchlässig für Antikörper löst. Aber Behandlung mit Methanol ist vermutlich aggressiver und γH2AX Schwerpunkte erscheinen nicht als deutlich im Vergleich zu der γH2AX Herde durch die Behandlung mit 4 % PFA und 0,1 % Octoxinol-9. Ungeachtet spielen effiziente Antikörper eine Schlüsselrolle für die Immunostaining von γH2AX und 53BP1. Daher empfiehlt sich die Verwendung der nachgewiesenen Antikörper (siehe Tabelle der Materialien/Geräte). Eine serielle Verdünnung der Antikörper möglicherweise nützlich für die Bestimmung der optimalen Antikörper-Konzentrationen.

ΓH2AX Schwerpunkte dienen als Marker in Strahlung Biodosimetry bei niedrigen Dosen > 1 mGy25. ΓH2AX Schwerpunkte wurden in Lymphozyten bei 5 min nach Röntgenbestrahlung mit einer Dosis von 100 mGy in Vitro (Abbildung 6) analysiert. Wie H2AX rasch nach der Bestrahlung an den Standorten des DSB phosphoryliert wird, kann die Anzahl der γH2AX Herde bereits ein Maximum bei 5 min nach Bestrahlung20,22erreichen. Jedoch die Reparatur-Prozess beginnt sofort nach der Bestrahlung und γH2AX Schwerpunkte sind auf eine ausgeprägte Zerfallsrate entfernt. Daher für die Überwachung der Anzahl der γH2AX Schwerpunkte in einer chronologischen Reihenfolge, ist es ratsam, den Reparatur-Prozess zu unterbrechen, indem Sie die Probe auf Eis am angegebenen Punkt in der Zeit nach der Bestrahlung.

Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 ist eine nützliche Methode für die Analyse der genetischen Instabilität in Krebszellen. CD34 + Zellen wurden aus dem Knochenmark von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie mit CD34 Microbeads bereichert. Bilder von γH2AX Schwerpunkten und 53BP1 Schwerpunkte wurden spezifische Fluoreszenz-Filter verwenden. Eine helle Ausleuchtung der Cytospin ist wichtig, ausreichend Fluoreszenz der γH2AX und 53BP1 Brennpunkte zu induzieren. Nach der Aufnahme des Bilds, ist die Anpassung der Intensität der Brennpunkte und das Hintergrundsignal notwendig über die imaging-Software. Für die Analyse der Co Lokalisierung von γH2AX und 53BP1 Schwerpunkte, die Bilder werden zusammengeführt (Abbildung 7). Eine grundlegende Epifluoreszenz-Mikroskop mit Filtern für DAPI, Alexa 488 und Cy3 in Kombination mit einem Kamerasystem ausgestattet und imaging-Software ist ausreichend für die Analyse von γH2AX und 53BP1 Schwerpunkte in DAPI gefärbt Zellkerne. Jedoch erfordern bestimmte Anwendungen (z.B. Analyse von DNA-Schäden an einzelnen Partikels Gleisen) höhere Auflösung und Reduzierung der Hintergrundfluoreszenz (wie z. B. durch konfokale Laser-scanning-Mikroskopie). Mikroskop-Technologie ist ein sich rasant entwickelnden Gebiet und eine Auflösung unter 200 nm ist machbar mit State-of-the-Art-Mikroskopen.

Zusammenfassend lässt sich sagen diese Handschrift stellt kritische Fragen des DSB Bildung und Reparatur und enthält eine Schritt für Schritt Protokoll für eine detaillierte Analyse der DSB durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1. Die Forschung über DSB profitieren deutlich von den vergangenen und zukünftigen Entwicklungen in der Mikroskop-Technologie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Das Projekt wurde von der deutschen José Carreras Leukämie Stiftung (DJCLS 14 R/2017) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI medium Sigma-Aldrich R0883 Medium for cell culture
Heparin sodium ratiopharm PZN 3029843  Heparin 5,000 I.U. / mL
Sodium chloride solution 0.9% B. Braun PZN 1957154 Component of the anticoagulant stock solution
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 Medium for isolation of mononuclear cells
Trypsin solution 10X Sigma-Aldrich 59427C Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture
CD34 MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-046-702 Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells
Diagnostic microscope slides Thermo Scientific ER-203B-CE24 Microscope slides
Megafuge 1.0 R Heraeus 75003060  Tabletop centrifuge 
Cytospin device
Lid Heraeus 76003422 Lid for working without micro-tubes
Cyto container Heraeus 75003416 Cyto container with 2 conical bores
Clip carrier Heraeus 75003414 Carrier for holding a cyto container and a slide
Support insert Heraeus 75003417 Support insert for holding a clip carrier
Triton X-100 (Octoxinol 9) Thermo Scientific 85112 Detergent for permeabilization of cell membranes
Potassium hydroxide solution 1M Merck Millipore 109107 Necessary for preparing the paraformaldehyde solution
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Fixation agent
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 Balanced salt solution
Chemiblocker Merck Millipore 2170 Blocking agent
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) Merck Millipore 05-636 Primary antibody for detection of γH2AX
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) Novus Biologicals NB100-304 Primary antibody for detection of 53BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody Invitrogen A-11001 Secondary antibody
Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody Invitrogen A-31572 Secondary antibody
Vectashield mounting medium Vector Laboratories H-1200 Contains DAPI for staining of DNA
Axio Scope.A1 Zeiss 490035 Fluorescence microscope
Cool Cube 1 CCD camera Metasystems H-0310-010-MS Camera system for digital recording
Isis software Metasystems Not applicable Microscope software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
  2. Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
  3. Zeman, M. K., Cimprich, K. A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).
  4. IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf (1994).
  5. Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).
  6. Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).
  7. Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70. Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).
  8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  9. Scully, R., Xie, A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).
  10. Walters, D. K., et al. Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX. Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).
  11. Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).
  12. Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence. Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).
  13. Chen, E., et al. JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).
  14. Popp, H. D., et al. Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Leuk Res. 57, 112-118 (2017).
  15. Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).
  16. Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
  17. Boyum, A. Separation of White Blood Cells. Nature. 204, 793-794 (1964).
  18. Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
  19. Bain, B., Pshyk, K. Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).
  20. Popp, H. D., et al. Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology. Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).
  21. Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
  22. Lobrich, M., et al. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).
  24. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
  25. Rothkamm, K., Lobrich, M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).

Tags

Zellbiologie Ausgabe 129 Immunfluoreszenz-Mikroskopie γH2AX 53BP1 Röntgen genetische Instabilität DNA-Doppel-Strangbrüchen DNA-Reparatur
Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 für die Analyse der Bildung und Reparatur der DNA Double-Strand Breaks
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann,More

Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J. Vis. Exp. (129), e56617, doi:10.3791/56617 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter