Summary
כתב יד זה מספק פרוטוקול לניתוח של מעברי כפול-גדיל ה-DNA על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.
Abstract
מעברי כפול-גדיל ה-DNA (DSB) הם נגעים DNA רציני. ניתוח היווצרות ותיקון של DSB רלוונטי, בקשת רחבה של תחומי מחקר כולל גנום שלמות, genotoxicity, קרינה ביולוגיה, הזדקנות, סרטן של פיתוח תרופות. בתגובה DSB, היסטון H2AX הוא phosphorylated-סרין 139 באזור של כמה זוגות megabase ויוצרים foci גרעיני דיסקרטית לזיהוי על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. בנוסף, 53BP1 (איגוד p53 חלבון 1) הוא עוד חלבון מגיב DSB חשוב בקידום תיקון של DSB ומצטרף nonhomologous סוף-תוך מניעת רקומבינציה הומולוגית. על פי הפונקציות ספציפית של γH2AX, 53BP1, ניתוח משולב של γH2AX ו- 53BP1 על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence עשוי להיות גישה סבירה עבור ניתוח מפורט של DSB. כתב יד זה מספק פרוטוקול מפורטות בתוספת הערות שיטתי על ביצוע הטכניקה. באופן ספציפי, ההשפעה של מחזור התא על דפוסי מוקדים γH2AX הוא הפגינו fibroblasts נורמלי של הקו תא NHDF. יתר על כן, הערך של מוקדים γH2AX כמו סמן מתואר רנטגן מוקרן לימפוציטים של אדם בריא. לבסוף, אי-יציבות גנטית ייחקר בתאים CD34 + של מטופל עם לוקמיה מיאלואידית חריפה על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.
Introduction
הדנ א פגום באופן רציף על ידי אנדוגני (למשל, השכפול מתחים, מינים חמצן תגובתי, חוסר יציבות פנימי של ה-DNA), אקסוגני (למשל, רדיקלים כימי, הקרנה) מקורות (איור 1)1,2 3, ,4. בין נזק לדנ א, מעברי כפול-גדיל ה-DNA (DSB) נגעים רציני במיוחד, עשוי לגרום מוות של תאים או carcinogenesis. כ-50 DSB שעלולים להתעורר לכל מחזור התא ותא.5. בתרבית של תאים, רקומבינציה הומולוגית (HR) והצטרפות nonhomologous סוף-(NHEJ) פיתח כמו מסלולים עיקריים עבור התיקון של DSB (איור 2). HR מתרחשת בשלב מאוחר S/G2 ומשתמש אחות שלם כרומטידה כתבנית לתיקון פוטנציאלי ללא שגיאות. לשם השוואה, NHEJ הוא פעיל במהלך מחזור התא, פוטנציאל מוטגניות כפי בסיסי זוגות ניתן להוסיף או resected לפני מצדו של הקצוות השבורים. בנוסף, סוף-הצטרפות אלטרנטיבית עשויים להיות עסוקים כמנגנון איטי מוטגניות גיבוי תיקון במקרה של NHEJ מחסור6,7.
DSB לגרום זירחון של היסטון H2AX-סרין 139 באזור של כמה זוגות megabase סביב כל DSB. מוקדים הגרעין ויוצרים נקראים γH2AX מוקדים, ניתן לזהות על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence8. ΓH2AX מקדמת את גיוס נוסף DSB מגיב חלבונים, ומעורב כרומטין שיפוץ, תיקון ה-DNA, ואת האות התמרה חושית9. כמו כל פוקוס γH2AX נחשב לייצוג של DSB יחיד, כימות של DSB על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence הוא אפשרי, אשר הוכח שורות תאים סרטן, דגימות מטופלים10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (איגוד p53 חלבון 1) הוא חלבון מפתח אחר במתווכים DSB תיקון. . מעורב בלשכת הגיוס של DSB מגיב חלבונים, מחסום איתות את synapsis של DSB קצוות15. בנוסף, 53BP1 ממלאת תפקיד קריטי בבחירת מסלול תיקון DSB. זה מפעיל התיקון של DSB לכיוון NHEJ אמנם HR מנעו16. בהתחשב בפונקציות מקורית של γH2AX ו- 53BP1 תיקון DSB, ניתוח בו זמנית של γH2AX ו- 53BP1 על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence עשוי להיות שיטה שימושית עבור ניתוח מדויק של היווצרות והתיקון של DSB.
כתב יד זה מספק פרוטוקול צעד אחר צעד לביצוע immunofluorescence מיקרוסקופיה של γH2AX ושל 53BP1 בתוך גרעין התא. באופן ספציפי, השיטה מיושמת fibroblasts נורמלי של קו תא NHDF, רנטגן מוקרן לימפוציטים של אדם בריא, תאי CD34 + של חולה עם לוקמיה מיאלואידית חריפה. הפרטים של השיטה הם הצביע בהקשר של התוצאות שהוצגו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ה השני ועדת האתיקה של מנהיים בפקולטה לרפואה של אוניברסיטת היידלברג. נכתב מדעת הושג מאנשים כל.
1. הכנה של חומרים
- פתרון מניות קרישה: להכין פתרון מניות קרישה של הפארין I.U. 200 לכל מ ב- 0.9% נתרן כלורי. למלא כל אחד הצינורות אוסף (לצייר כרך 9 מ ל) 2 מ של הפתרון מניות קרישה לפני נסיגה של דגימות דם או מח עצם.
- פתרון פירוק כדוריות אדומות: הכן 10 x פתרון פירוק כדוריות אדומות עם 82.91 g אמוניום כלוריד, 7.91 ג'י אמוניום ביקרבונט, 2 מ ל תמיסה חומצית ethylenediaminetetraacetic 0.5 M ל pH של 8.0 על ידי המסת הסוכנים ב מזוקק פעמיים מים עבור הנפח הכולל של 1 ל'
- קיבוע פתרון: 8.3 להוסיף µL של 1 מ' אשלגן הידרוקסידי פתרון 360 מ"ג paraformaldehyde (PFA) צינור microtiter. ממלאים את הצינור buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) לסימון 1 מ"ל של הרכבת התחתית, חום הצינורית בתוך גוש חימום ב 95 ° C כדי לקבל 1 מ"ל של פתרון PFA 36%. להעביר את הפתרון מחברים של 36% 1 מ"ל צינור עם קיבולת של 15 מ"ל. הוסף 8 מ"ל PBS הפתרון PFA 36% 1 מ"ל, להשיג 9 מ של פתרון מניות של כדורגלן 4%. 4% PFA פתרון מלאי החנות ב-18 ° C עד ולהשתמש עבור קיבעון של תאי aliquot.
התראה: 1) אשלגן הידרוקסידי פתרון הוא מאכל. להיות מודע העין והגנה על העור. 2) כדורגלן הוא מסרטנים. להימנע במגע עם העור אינהלציה. להכין את הפתרון קיבוע ברדס. - Permeabilization פתרון: להוסיף 50 µL Octoxinol 9-50 מ"ל PBS כדי לקבל פתרון כ- 0.1% Octoxinol 9-
- חוסם פתרון: להכין 5% 2% חסימת פתרונות על ידי ערבוב הסוכן חסימת חלבון עם PBS, חנות-6 – 8 ° C.
2. הכנת הדגימות
- Fibroblasts בתרבות תא: מטפחים fibroblasts האנושי של הקו תא NHDF ב 5% humidified האווירה 2 CO ב 37 מעלות צלזיוס בינוני RPMI 1640 בתוספת 10% עגל עוברית סרום, 4 מ מ גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
- הכנת שקופית מיקרוסקופ עם חסיד fibroblasts
- הסר המדיום הבקבוק (אזור הצמיחה של 2 75 ס מ) עם שמתקדמות NHDF fibroblasts. להוסיף 10 מ"ל PBS הבקבוקון. לשטוף את fibroblasts חסיד בעדינות ע י ניעור באופן ידני את הבקבוקון עבור מינימלית 1
- להסיר את PBS ולהוסיף טריפסין 1 מ"ל לתוך הבקבוק. לנער את הבקבוק בעדינות כדי לוודא כי כל תאים חסיד מכוסים על ידי טריפסין. הסר את טריפסין הבקבוקון. לשים את הבקבוק לתוך החממה במשך 5 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- לקחת את הבקבוק מתוך החממה ולהוסיף 10 מ"ל RPMI 1640 בינוני לתוך הבקבוק. Pipette של המדיום לאורך מספר פעמים כדי לפזר את fibroblasts.
- פיפטה 0.3 מיליליטר fibroblasts מפוזרת על גבי כל אחד מהשדות שני של השקופית מיקרוסקופ ולשים את השקופית לתוך החממה במשך 24 שעות ביממה כך fibroblasts לדבוק השקופית. עבור immunostaining של γH2AX ו 53BP1 ב הגרעינים של fibroblasts, נעבור לשלב 3.1.
- הכנת שקופית מיקרוסקופ עם חסיד fibroblasts
- דגימות החולה
- ודגימות הדם: להשתמש הצינורות אוסף מילוי עם 2 מ"ל של הפתרון מניות קרישה ולהוסיף 7 מ ל דם לתוך הצינורות. אחסן את הדגימות ללילה בטמפרטורת החדר (קרי, 18-20 ° C). למחרת, לבודד את שלב G0/G1 קייזרכרכט תאי תאי צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה (שלב 2.2.3).
- דגימות מח עצם: להשתמש הצינורות אוסף מילוי עם 2 מ"ל של הפתרון מניות קרישה (שלב 1.1) ולהוסיף מח עצם 7 mL לתוך הצינורות. אחסן את הדגימות ללילה בטמפרטורת החדר (קרי, 18-20 ° C). למחרת, לבודד את שלב G0/G1 קייזרכרכט תאי תאי צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה (שלב 2.2.3). השתמש CD34 גרגרי וסלולרי ההפרדה עמודות עבור הבידוד של תאי CD34 +.
- בידוד תאי תאי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות
הערה: תאי תאים מבודדים דגימות מח עצם ודם על ידי צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות 17 , 18 , 19.- Dilute את דגימת הדם heparinized על יחס של 1:1 עם PBS ולדגום את מח העצם heparinized על יחס של 1:3 עם PBS. להשעות את התאים בעדינות על ידי ציור אותם פנימה והחוצה פיפטה פעמיים.
- להוסיף נפח של צפיפות בינונית הדרגתיות צינור טריים. בעדינות שכבת דם מדולל או מח עצם על המדיום הדרגתיות צפיפות. הקפידו לא לערבב שתי שכבות.
- Centrifuge הצינור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, 400 x ג להרחיק את השכבה העליונה פלזמה עם פיפטה. ואז בזהירות לקצור תאי תאי השכבה שמעל המדיום הדרגתיות צפיפות. העברת תאי תאי לתוך צינור טריים.
- להוסיף לפחות שלושה כרכים של PBS תאי תאי בצינור. להשעות את התאים בעדינות על ידי ציור אותם פנימה והחוצה פיפטה פעמיים. Centrifuge את הצינור 10 דקות-בטמפרטורת החדר ו- g x 400
- לאחר הספין להסיר את תגובת שיקוע והוסף 10 מ"ל של 4 ° C, 1 x פתרון פירוק כדוריות אדומות. Resuspend התאים בעדינות על ידי ציור אותם פנימה והחוצה פיפטה פעמיים, ולמקם את הצינורית על קרח למשך 5 דקות. ואז להוסיף 30 מ ל PBS ב 4 ° C, centrifuge את הצינור 10 דקות-בטמפרטורת החדר ו- g x 400
- הכנת cytospins
- להכין שני cytospins עם תאי תאי של הדגימות החולה (קרי, cytospin אחד עבור צביעת immunofluorescence γH2AX, cytospin אחד עבור γH2AX ו- 53BP1 משולב immunofluorescence מכתים) על ידי צנטריפוגה (x 300 גרם, 10 דקות) של 1.0 x 10 5 תאים עבור כל הכנה ( איור 3 ו-4)-
3. γH2AX, צביעת Immunofluorescence 53BP1
- קיבעון, permeabilization: לתקן את התאים עם 200 µL של 4% PFA למשך 10 דקות. לאחר קיבוע, לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מ של PBS למשך 5 דקות כל על המעבדה מטרף. ואז permeabilize את התאים עם 200 µL של 0.1% Octoxinol 9 עבור 10 דקות לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מ של 5% פתרון חסימה למשך 5 דקות כל על המעבדה מטרף. לחסום את התאים 30 מ של טרי 5% חסימת פתרון עבור ה 1
- הדגירה עם נוגדנים
- דגירה בתכשיר אחד של התאים עם נוגדן monoclonal anti-γH2AX העכבר (שבערך) והכנות אחרות של התאים עם נוגדן monoclonal anti-γH2AX העכבר (שבערך) ו- a נוגדן anti-53BP1 ארנב polyclonal (שבערך) בן לילה ב-4 מעלות צלזיוס
- לאחר דגירה לשטוף את התאים בעדינות 3 פעמים עם 30 מ של 2% חסימה פתרון עבור כל 5 דקות על מטרף המעבדה.
- להסיר הפתרון חסימה, דגירה ההכנה הראשונים של התאים עם עז Alexa488 מצומדת אנטי-העכבר המשני נוגדן (שבערך) והכנת השני את התאים עם (נוגדן אנטי עכבר משני עז מצומדת-Alexa488 שבערך) ואת החמור Alexa555 מצומדת ארנב אנטי משני נוגדן (שבערך) לשעה בטמפרטורת החדר.
- הרכבה בינונית: לשים את השקופית הכוללת התאים בקערה ולשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מ של PBS עבור כל 5 דקות על המעבדה מטרף. הסר את PBS והר התאים הרכבה בינונית המכיל 4, 6-diamidino-2-phenylindole. בזהירות לשים את coverslip על המדיום הרכבה כך אין בועות אוויר משובץ. לחכות לפחות 3 h עבור התקשות של המדיום הרכבה לפני ניתוח בתאים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.
4. ניתוח של γH2AX ושל 53BP1 מוקדים
- קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה: לנתח את מוקדים γH2AX ו 53BP1 ב גרעינים תא עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד מסננים דאפי, 488 אלקסה של Cy3 במהלך דימות-מטרה X 100 ההגדלה. שיא תמונות עם מצלמה ולעבד את התמונות עם תוכנת הדמיה המתאימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתוח של מוקדים γH2AX בתאים הוא המדויק ביותר בין שלב G0/G1 לשלב G2 כאשר מוקדים γH2AX מופיעים כנקודות פלורסנט ברורים (איור 5A). לעומת זאת, ניתוח של מוקדים γH2AX בתאים במהלך שלב S הינו מסובך γH2AX פאן-גרעיני התפזרו ספאקלס הנגרמת על ידי תהליך השכפול (איור 5B).
קיבוע התאים בוצעה עם 4% מחברים (10 דקות), permeabilization עם 0.1% Octoxinol 9 (10 דקות). מתנול ניתן להשתמש עבור קיבוע ו- permeabilization, מדי; עם זאת, מתנול עשוי לפרק את גרעין התא די קשות, ימרחו החוצה מוקדים γH2AX אז מוקדים γH2AX עשויים שלא להופיע ברורים בהשוואה מוקדים γH2AX מתקבל על ידי טיפול עם 4% כדורגלן ו 0.1% Octoxinol 9.
הבחירה של נוגדנים יעיל הוא קריטי עבור immunofluorescence יעיל מיקרוסקופ. הניסויים בוצעו עם נוגדן monoclonal anti-γH2AX של העכבר הראשי, של נוגדנים נגד polyclonal-53BP1 הארנב העיקרי עבור immunofluorescence מכתים של γH2AX ו- 53BP1, בהתאמה.
כמו כל פוקוס γH2AX נחשב לייצוג של DSB יחיד, immunofluorescence מכתים של γH2AX יכול לשמש עבור כימות של DSB ברקמות לקרינה. רמות של γH2AX מוקדים לקרינה לימפוציטים (איור 6) הם יחסיים הקרנה במינון20,21. מוקדים γH2AX עשוי להשיג מקסימום כבר 5 דקות של הקרנה20,22. הדעיכה של מוקדים γH2AX בשלבים מאוחרים יותר בזמן ניתן לנטר ומשקף את התיקון של DSB20,21,22.
חוסר היציבות הגנטית ניתן לנתח על ידי צביעת immunofluorescence משולב של γH2AX ו 53BP1 בין שורות תאים סרטניים דגימות10,11,12,13,14. ניתוח למופת בוצעה בתאים CD34 + של מטופל עם לוקמיה מיאלואידית חריפה (איור 7). לוקליזציה משותף של γH2AX ו- 53BP1 ציינו כי הקידום של מנגנוני תיקון NHEJ בתיווך 53BP1 באתרים של DSB בזמן HR נמנעה. עם זאת, אחוז לאיתור שותף γH2AX ו- 53BP1 מוקדים בתקיעות של לוקמיה מיאלואידית חריפה היה משתנה. מוקדים γH2AX ללא אות 53BP1 נוספים שאולי הפרובינציאלית HR עבור התיקון של DSB בשלב S/G2 מאוחר. התפקיד של מוקדים 53BP1 יחידי נשאר חמקמק.
איור 1: מקורות והשלכות של ה-DNA אנדוגני, אקסוגני נזק1,2,3,4. DSB, מעברי כפול-גדיל DNA; NHEJ, nonhomologous סוף-מצטרפת.
איור 2 : הצג סכימתי של מעבר כפול-גדיל DNA הגדולות (DSB) תיקון מנגנונים בתאי יונקים. רקומבינציה הומולוגית משתמשת אחות שלם כרומטידה בשלב מאוחר S/G2 לתיקון פוטנציאל משגיאות של DSB. Nonhomologous סוף-הצטרפות (NHEJ) הוא פעיל במהלך מחזור התא, פוטנציאל לשגיאות כמו כמה בסיסים ניתן להוסיף או resected לפני מצדו של DSB הקצוות. סיום-הצטרפות חלופי הוא מנגנון תיקון גיבוי מוטגניות איטי אשר עשוי להיות מעורב במקרה של מחסור NHEJ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : התקן עבור הכנת את cytospins. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : הכנת cytospins. Cytospins שני של כל מדגם מוכנות על ידי צנטריפוגה של 1.0 x 10 תאים5 -300 גרם x 10 דקות. Cytospin אחד משמש γH2AX immunofluorescence מכתים, cytospin אחר הוא מנוצל עבור משולב γH2AX ו 53BP1 immunofluorescence מכתים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : מחזור התא תלויה דפוסי γH2AX מוקדים ב fibroblasts נורמלי של הקו תא NHDF. (א) γH2AX מוקדים (ירוק, אלקסה 488) בתוך הגרעינים (כחול, דאפי) של NHDF fibroblasts להופיע כנקודות ברורים בשלב G0/G1 או G2. (B) מוקדים γH2AX בתוך הגרעינים של fibroblasts בשלב זה מופיעים התפזרו ספאקלס פאן-גרעיני (סולם בר = 5 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : ΓH2AX מוקדים ב x-ray מוקרן לימפוציטים של אדם בריא. התמונות של γH2AX מוקדים (ירוק, אלקסה 488), גרעינים (כחול, דאפי) של לימפוציטים נרשמים ב 5 דקות לאחר הקרנה עם 100 mGy (סולם בר = 5 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 : לוקליזציה שיתוף של מוקדים γH2AX ו- 53BP1 בתאים CD34 + של מטופל עם לוקמיה מיאלואידית חריפה. שיתוף לוקליזציה של מוקדים γH2AX (ירוק, אלקסה 488), מוקדים 53BP1 (אדום, Cy3) מציין לקידום בתיווך 53BP1 nonhomologous הצטרפות-סוף תיקון מנגנונים באתרים של מעברי כפול-גדיל ה-DNA (סולם בר = 5 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX, 53BP1 היא שיטה שימושית לניתוח היווצרות ותיקון של DSB, בקשת רחבה של תחומי מחקר. פרמטרים קריטיים המשפיעים על התוצאה של הניסויים הם השלב של מחזור התא, הסוכנים המשמש את הקיבעון ואת permeabilization של התאים, הבחירה של הנוגדנים, ורכיבי חומרה ותוכנה של המיקרוסקופ זריחה.
ההשפעה של מחזור התא על דפוסי מוקדים γH2AX הודגם על ידי שמתקדמות נורמלי fibroblasts של הקו תא NHDF. מוקדים γH2AX הופיע כנקודות פלורסנט נפרדות בתוך ה-G0/G1 G2 שלבים לעומת ספאקלס התפזרו γH2AX פאן-גרעיני בשלב S (איור 5). מוקדים ברורים γH2AX ב ה-G0/G1 שלב והשלב ב- G2 המצוין ארעי ו/או מכוננת נזק לדנ א אולי השגויות שרכש במהלך מחזור התא חוזרות מעברים; לעומת זאת, ספאקלס התפזרו בשלב S אירעה רק transiently, היו ככל הנראה משויכת לתהליך שכפול. כמו γH2AX פאן-גרעיני ספאקלס עלול להפריע מומלץ הניתוח של מוקדים γH2AX מקורית, הכללת תאים שלב S מניתוח, אשר מתבצע בקלות על-ידי התבנית γH2AX ספציפיות שלב S. לחלופין, תאים בשלב S יכול ייכללו על ידי מדידה של עוצמת האות דאפי או על-ידי יישום של S שלב מסוים סמנים (למשל, Cyclin A). יתר על כן, אינדוקציה של צמיחה מעצר עם סינכרון של תאים בשלב G0/G1 עשוי להיות שימושי לפני הכנת את cytospins על-ידי אחסון הדגימות בטמפרטורת החדר (קרי, 18-20 מעלות צלזיוס) למשך הלילה.
ההליכים של קיבוע ו- permeabilization הם קריטיים בשלבים immunostaining של γH2AX ושל 53BP1. קיבוע יש צורך לשמר את המורפולוגיה antigenicity של תאים23. Permeabilization מאפשר גישה אל תאיים וגרעיני אנטיגנים24. כדורגלן הוא סוכן עדין יחסית עבור קיבעון ומייצב תאי תוך שמירה על מבנה החלבונים על ידי מגיב עם חומצות אמינו בסיסיות כדי טופס מתילן crosslinks. לאחר קיבוע עם כדורגלן, cytospins ניתן לאחסן במשך ימים ושבועות עד עיבוד נוסף. גילוי של γH2AX ו- 53BP1, התאים צריך להיות permeabilized. Octoxinol 9 שימש חומר ניקוי ללא יונית המכיל קבוצות הידרופיליות ראש לא טעונים המורכב polyoxyethylene moieties. Octoxinol 9 שובר את האטומים תא בעדינות ושומר γH2AX מוקדים שמחשבותיי. לחלופין, מתנול יכול לשמש כדי להפוך את קיבוע permeabilization של התאים, מדי. מתנול ארגונייט שוקע חלבונים, ממיס שומנים מן קרום התא, הפיכתם חדיר כדי נוגדנים. עם זאת, הטיפול עם מתנול הוא ככל הנראה אגרסיבי יותר, מוקדים γH2AX עשויים שלא להופיע כמו מובהק בהשוואה מוקדים γH2AX מתקבל על ידי טיפול עם 4% כדורגלן ו 0.1% Octoxinol 9. על אף האמור, נוגדנים יעילים לשחק תפקיד מפתח עבור immunostaining של γH2AX ושל 53BP1. לכן, מומלץ השימוש של נוגדנים מוכחת (ראה טבלה של חומרים/ציוד). לדילול טורי של הנוגדנים עשוי להיות שימושי לקביעת ריכוז נוגדן אופטימלית.
מוקדים γH2AX משמשים כסמן של קרינה biodosimetry במינון נמוך > 1 mGy25. מוקדים γH2AX נותחו לימפוציטים ב 5 דקות לאחר הקרנה רנטגן עם מנה של 100 mGy במבחנה (איור 6). כפי H2AX phosphorylated במהירות באתרים של DSB לאחר הקרנה, עשויות מספר מוקדים γH2AX כבר להגיע למקסימום ב 5 דקות לאחר הקרנה20,22. עם זאת, תהליך התיקון מתחיל באופן מיידי לאחר הקרנה, מוקדים γH2AX מוסרים בקצב דעיכה ברורה. לפיכך, עבור ניטור מספר מוקדים γH2AX ברצף כרונולוגי, מומלץ כדי להפסיק את תהליך תיקון על ידי לשים את הדגימה על הקרח בנקודה שצוינה בזמן לאחר הקרנה.
מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX, 53BP1 היא שיטה שימושית לניתוח אי-יציבות גנטית בתאי סרטן. תאי CD34 + היו מועשר ממח העצם של החולה עם לוקמיה מיאלואידית חריפה באמצעות גרגרי CD34. תמונות של מוקדים γH2AX 53BP1 מוקדים התקבלו שימוש במסנני קרינה פלואורסצנטית ספציפיים. תאורה בהירים של cytospin חשוב לזירוז פלורסצנטיות נאותה של מוקדים γH2AX ו- 53BP1. לאחר הקלטת התמונה, לאגדת האינטנסיביות של מוקדים ואת האות הרקע נחוץ שימוש בתוכנת הדמיה. לניתוח לוקליזציה שיתוף של מוקדים γH2AX ו- 53BP1, מיזוג התמונות (איור 7). מיקרוסקופ epifluorescence הבסיסי מצויד מסננים דאפי, 488 אלקסה של Cy3 בשילוב עם מערכת המצלמה והדמיה תוכנה מספיקה לניתוח של γH2AX והמוכתמות 53BP1 מוקדים ב דאפי גרעין התא. עם זאת, יישומים מסוימים (למשל, ניתוח של נזק לדנ א לאורך רצועות חלקיק יחיד) עשוי לדרוש הפחתת קרינה פלואורסצנטית הרקע של רזולוציה גבוהה יותר (כפי שנמסרו, למשל על ידי לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ). יתר על כן, מיקרוסקופ הטכנולוגיה היא שדה המתפתחת ופתרון מתחת ל-200 ננומטר הוא ריאלי עם המדינה-of-the-art מיקרוסקופים.
לסיכום, כתב יד זה מדגיש בעיות קריטיות של DSB היווצרות ותיקון ומספק פרוטוקול צעד אחר צעד עבור ניתוח מפורט של DSB על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1. המחקר על DSB יהנה בבירור ההתפתחויות האחרונות ועתיד בטכנולוגיית מיקרוסקופ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
הפרויקט נתמך על ידי קרן לוקמיה קאררס חוסה (DJCLS 14 R/2017) הגרמני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
| Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
| Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
| Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
| Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
| Cytospin device | |||
| Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
| Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
| Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
| Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
| Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
| Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
| Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-31572 | Secondary antibody |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
| Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
| Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |
References
- Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Zeman, M. K., Cimprich, K. A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).
- IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf (1994).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).
- Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70. Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Scully, R., Xie, A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).
- Walters, D. K., et al. Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX. Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).
- Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).
- Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence. Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).
- Chen, E., et al. JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).
- Popp, H. D., et al. Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Leuk Res. 57, 112-118 (2017).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).
- Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Boyum, A. Separation of White Blood Cells. Nature. 204, 793-794 (1964).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
- Bain, B., Pshyk, K. Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).
- Popp, H. D., et al. Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology. Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).
- Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
- Lobrich, M., et al. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
- Rothkamm, K., Lobrich, M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).
