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Cancer Research

डीएनए डबल-किनारा टूट के गठन और मरंमत के विश्लेषण के लिए γH2AX और 53BP1 की इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी

Published: November 3, 2017 doi: 10.3791/56617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Hematology and Oncology, Medical Faculty Mannheim of the Heidelberg University

Summary

इस पांडुलिपि γH2AX और 53BP1 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा डीएनए डबल किनारा टूटता के विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है ।

Abstract

डीएनए डबल-किनारा टूटता (DSB) गंभीर डीएनए घावों हैं । गठन और DSB की मरंमत का विश्लेषण जीनोम अखंडता, genotoxicity, विकिरण जीवविज्ञान, उंर बढ़ने, कैंसर, और नशीली दवाओं के विकास सहित अनुसंधान क्षेत्रों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम में प्रासंगिक है । DSB के जवाब में, citrullinated H2AX Serine माइक्रोस्कोपी द्वारा detectable परमाणु घावों का गठन कई megabase जोड़े के एक क्षेत्र में इम्यूनोफ्लोरेसेंस १३९ पर phosphorylated है । इसके अलावा, 53BP1 (p53 बाइंडिंग प्रोटीन 1) एक और महत्वपूर्ण DSB-प्रतिक्रियाशील प्रोटीन nonhomologous के अंत में शामिल होने से DSB की मरंमत को बढ़ावा देने है, जबकि मुताबिक़ पुनर्संयोजन को रोकने । γH2AX और 53BP1 के विशिष्ट कार्यों के अनुसार, इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा γH2AX और 53BP1 के संयुक्त विश्लेषण DSB का एक विस्तृत विश्लेषण के लिए एक उचित दृष्टिकोण हो सकता है । इस पांडुलिपि तकनीक प्रदर्शन के लिए व्यवस्थित नोटों के साथ पूरक एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करता है. विशेष रूप से, γH2AX घावों पैटर्न पर कोशिका चक्र के प्रभाव को सेल लाइन NHDF के सामान्य fibroblasts में प्रदर्शित किया जाता है । इसके अलावा, एक γH2AX के रूप में घावों के मूल्य एक स्वस्थ व्यक्ति के एक्स-रे विकिरणित लिम्फोसाइटों में दर्शाया गया है । अंत में, आनुवंशिक अस्थिरता γH2AX और 53BP1 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा गंभीर माइलॉयड ल्यूकेमिया के साथ एक रोगी के CD34 + कोशिकाओं में जांच की है ।

Introduction

डीएनए लगातार अंतर्जात (जैसे, प्रतिकृति तनाव, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, डीएनए की आंतरिक अस्थिरता) और exogenous (जैसे, रासायनिक कण, विकिरण) स्रोतों (चित्रा 1)1,2 से क्षतिग्रस्त है ,3,4. डीएनए में क्षति के अलावा, डीएनए डबल-किनारा टूटता (DSB) विशेष रूप से गंभीर घावों हैं और कोशिका मृत्यु या कैंसरजनन को प्रेरित कर सकते हैं । प्रति सेल और सेल चक्र5के बारे में ५० DSB पैदा हो सकता है । स्तनधारी कोशिकाओं में, मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) और nonhomologous अंत में शामिल होने (NHEJ) DSB (चित्रा 2) की मरंमत के लिए प्रमुख रास्ते के रूप में विकसित की है । HR देर S/G2 चरण में होता है और संभावित रूप से त्रुटि मुक्त मरंमत के लिए एक टेम्पलेट के रूप में एक बरकरार बहन chromatid का उपयोग करता है । इसकी तुलना में, NHEJ सेल चक्र भर में सक्रिय है और संभावित mutagenic के रूप में आधार जोड़े जोड़ा जा सकता है या टूट समाप्त होता है की बंधाव से पहले प्रतिप्रदाय । इसके अलावा, वैकल्पिक अंत में शामिल होने के NHEJ कमी6,7के मामले में एक धीमी mutagenic बैक-अप मरंमत तंत्र के रूप में लगे हो सकता है ।

DSB एक Serine के आसपास कई megabase जोड़े के एक क्षेत्र में DSB १३९ पर citrullinated H2AX के फास्फारिलीकरण प्रेरित । गठन परमाणु घावों γH2AX घावों का नाम है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी8द्वारा detectable हैं । γH2AX आगे DSB-उत्तरदायी प्रोटीन की भर्ती को बढ़ावा देता है और क्रोमेटिन remodeling में शामिल है, डीएनए की मरंमत, और संकेत transduction9। प्रत्येक γH2AX ध्यान के रूप में एक एकल DSB का प्रतिनिधित्व करने के लिए माना जाता है, इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा DSB के ठहराव संभव है, जो कैंसर सेल लाइनों और रोगी नमूनों में प्रदर्शन किया गया है10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 बाइंडिंग प्रोटीन 1) DSB मरंमत मध्यस्थता में एक और महत्वपूर्ण प्रोटीन है । यह DSB-उत्तरदायी प्रोटीन, चेकपॉइंट सिग्नलिंग की भर्ती में शामिल है, और DSB के synapsis15समाप्त होता है । इसके अलावा, 53BP1 DSB मरंमत मार्ग विकल्प में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । यह NHEJ की ओर DSB की मरंमत ट्रिगर जबकि एचआर16रोका है । DSB मरम्मत में γH2AX और 53BP1 के वास्तविक कार्यों को ध्यान में रखते हुए, 53BP1 माइक्रोस्कोपी द्वारा γH2AX और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के एक साथ विश्लेषण के गठन और DSB की मरंमत के सटीक विश्लेषण के लिए एक उपयोगी तरीका हो सकता है ।

इस पांडुलिपि सेल नाभिक में γH2AX और 53BP1 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करता है । विशेष रूप से, तकनीक सेल लाइन NHDF के सामान्य fibroblasts में लागू किया जाता है, एक स्वस्थ व्यक्ति के एक्स-रे विकिरणित लिम्फोसाइटों में और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया के साथ एक रोगी की CD34 + कोशिकाओं में । विधि के विवरण प्रस्तुत परिणामों के संदर्भ में बताया जाता है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > यहाँ वर्णित सभी विधियों को हीडलबर्ग विश्वविद्यालय के चिकित्सा संकाय मैनहेम की एथिक्स कमेटी द्वितीय द्वारा अनुमोदित किया गया है । लिखित सूचित सहमति सभी व्यक्तियों से प्राप्त की गई थी.

< p class = "jove_title" > 1. सामग्री की तैयारी

  1. थक्कारोधी स्टॉक समाधान: ०.९% सोडियम क्लोराइड में २०० थक्कारोधी I.U. प्रति मिलीलीटर के एक हेपरिन शेयर समाधान तैयार करते हैं । संग्रह ट्यूबों के प्रत्येक भरें (मात्रा 9 मिलीलीटर ड्रा) रक्त या अस्थि मज्जा के नमूनों की वापसी से पहले थक्कारोधी स्टॉक समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ ।
  2. Lysis लाल कोशिकाओं के लिए समाधान: तैयार 10x & #160; ८२.९१ ग्राम अमोनियम क्लोराइड, ७.९१ ग्राम अमोनियम Lysis के साथ लाल कोशिकाओं के लिए बिकारबोनिट समाधान, और ०.५ मीटर ethylenediaminetetraacetic एसिड समाधान के एक पीएच के लिए 2 मिलीलीटर में एजेंटों भंग द्वारा 1 एल
    3. की कुल मात्रा के लिए डबल आसुत जल
  3. निर्धारण समाधान: Add ८.३ & #181; ए 1 एम पोटेशियम हीड्राकसीड सॉल्यूशन के लिए ३६० mg paraformaldehyde (पीएफए) का microtiter ट्यूब में । ट्यूब के 1 मिलीलीटर मार्क करने के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ ट्यूब भरें और ९५ & #176 पर एक हीटिंग ब्लॉक में ट्यूब गर्मी में एक ३६% पीएफए समाधान के 1 मिलीलीटर पाने के लिए सी । 1 मिलीलीटर ३६% पीएफए समाधान एक ट्यूब के लिए 15 मिलीलीटर की क्षमता के साथ स्थानांतरण । 1 मिलीलीटर ३६% पीएफए समाधान के लिए 8 मिलीलीटर पंजाबियों जोड़ें, एक 4% पीएफए शेयर समाधान के 9 मिलीलीटर पाने के लिए । Aliquot 4% पीएफए स्टॉक समाधान और स्टोर पर-18 & #176; C कक्षों के निर्धारण के लिए उपयोग तक.
    सावधानी: 1) पोटेशियम हीड्राकसीड समाधान राक है । आंख और त्वचा की सुरक्षा के प्रति सजग रहें । 2) पीएफए यलो है । त्वचा से संपर्क करें और साँस लेना । एक डाकू के तहत निर्धारण समाधान तैयार करें ।
  4. Permeabilization हल: Add ५० & #181; L Octoxinol 9 से ५० मिलीलीटर पंजाबियों का हल पाने के लिए लगभग ०.१% Octoxinol 9.
  5. ब्लॉकिंग समाधान: 5% और 2% के साथ प्रोटीन ब्लॉकिंग एजेंट को मिलाकर हल तैयार करें पंजाबियों और स्टोर पर 6 & #8211; & #160; 8 & #176; ग.
< p class = "jove_title" > 2. नमूनों की तैयारी

  1. Fibroblasts सेल कल्चर: में सेल लाइन Fibroblasts की खेती ह्यूमन NHDF एक humidified 5% कं 2 माहौल में ३७ & #176; सी में RPMI १६४० मध्यम 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 4 मिमी के साथ पूरक glutamine, और 1% पेनिसिलिन/streptomycin.
    1. अनुयाई के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड की तैयारी fibroblasts
      1. तेजी से बढ़ती के साथ कुप्पी (७५ सेमी NHDF 2 fibroblasts वृद्धि क्षेत्र) से मध्यम निकालें । कुप्पी में 10 मिलीलीटर पंजाबियों को जोड़ें । अनुयाई fibroblasts धीरे से मैंयुअल रूप से 1 min.
        2. के लिए कुप्पी मिलाते हुए धो
      2. पंजाबियों को हटाने और कुप्पी में 1 मिलीलीटर trypsin जोड़ें । कुप्पी धीरे हिला यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी अनुयाई कोशिकाओं trypsin द्वारा कवर कर रहे हैं । trypsin को कुप्पी से निकाल दें । ३७ & #176 पर 5 मिनट के लिए मशीन में कुप्पी रखो; C.
      3. मशीन के बाहर कुप्पी ले और कुप्पी में 10 मिलीलीटर RPMI १६४० मध्यम जोड़ें । पिपेट को fibroblasts फैलाने के लिए कई बार ऊपर से ऊपर और नीचे की
      4. पिपेट ०.३ की एक खुर्दबीन स्लाइड के दो क्षेत्रों पर फैलाया fibroblasts के एमएल और 24 के लिए मशीन में स्लाइड डाल एच इतना है कि fibroblasts स्लाइड का पालन करें । के लिए immunostaining & #947; H2AX और 53BP1 के नाभिक fibroblasts, चरण ३.१ पर ले जाएं ।
  2. रोगी के नमूने
    1. रक्त के नमूने: संग्रह ट्यूबों है कि थक्कारोधी स्टॉक समाधान के 2 मिलीलीटर से भर रहे थे और ट्यूबों में 7 मिलीलीटर रक्त जोड़ने का उपयोग करें । नमूनों को कमरे के तापमान पर रातोंरात स्टोर करें ( यानी , 18-20 & #176; C). अगले दिन, G0/G1 चरण आराम mononuclear कोशिकाओं घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा (कदम 2.2.3) ।
    2. अस्थि मज्जा के नमूने: संग्रह ट्यूबों है कि थक्कारोधी स्टॉक समाधान (१.१ कदम) के 2 मिलीलीटर से भर रहे थे और ट्यूबों में 7 मिलीलीटर अस्थि मज्जा जोड़ने का उपयोग करें । नमूनों को कमरे के तापमान पर रातोंरात स्टोर करें ( यानी , 18-20 & #176; C). अगले दिन, G0/G1 चरण आराम mononuclear कोशिकाओं घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा (कदम 2.2.3) अलग । CD34 + कक्षों के अलगाव के लिए CD34 microbeads और कक्ष पृथक्करण स्तंभों का उपयोग करें.
      3. घनत्व ढाल केंद्रापसारक
      द्वारा mononuclear कोशिकाओं के
    3. अलगाव नोट: Mononuclear कोशिकाओं घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा रक्त और अस्थि मज्जा के नमूनों से अलग कर रहे है < सुप क्लास = "xref" > 17 , < सुप क्लास = "xref" > 18 , < सुप क्लास = "xref" > १९ .
      1. पंजाबियों के साथ 1:1 के अनुपात में heparinized रक्त के नमूने को कमजोर और पंजाब के साथ 1:3 के अनुपात में heparinized अस्थि मज्जा नमूना । कोशिकाओं को धीरे से उंहें में और पिपेट के बाहर दो बार ड्राइंग द्वारा निलंबित ।
      2. एक ताजा ट्यूब के लिए घनत्व ढाल माध्यम की एक मात्रा में जोड़ें । धीरे घनत्व ढाल माध्यम के शीर्ष पर पतला रक्त या अस्थि मज्जा परत । ख्याल रखना दो परतों मिश्रण नहीं है ।
      3. कमरे के तापमान और ४०० एक्स जी पर 30 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक पिपेट के साथ बंद ऊपरी प्लाज्मा परत ड्रा । फिर ध्यान से घनत्व ढाल माध्यम से ऊपर परत में mononuclear कोशिकाओं फसल । mononuclear कोशिकाओं को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित.
      4. ट्यूब में mononuclear कोशिकाओं के लिए पंजाब के कम से तीन खंड जोड़ें । कोशिकाओं को धीरे से उंहें में और पिपेट के बाहर दो बार ड्राइंग द्वारा निलंबित । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक और ४०० x g.
      5. के बाद supernatant को हटाने और 4 & #176 के 10 मिलीलीटर जोड़ने के लिए; C, 1x & #160; lysis लाल कोशिकाओं के लिए समाधान । कोशिकाओं को धीरे से reसस्पैंड में और पिपेट से बाहर दो बार उंहें ड्राइंग, और 5 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब जगह है । फिर 4 & #176 पर 30 मिलीलीटर पंजाबियों जोड़ें; सी और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक और ४०० x g.
    4. तैयार करने की cytospins
      1. रोगी के नमूनों की cytospins कोशिकाओं के साथ दो mononuclear तैयार करना ( यानी , एक cytospin & #947; H2AX इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलान और एक cytospin के लिए & #947; H2AX और 53BP1 संयुक्त इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला) द्वारा केंद्रापसारक (३०० x g, 10 min) १.० x 10 5 कोशिकाओं के प्रत्येक तैयारी के लिए (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा ३ र ४ ).
< p class = "jove_title" > 3. & #947; H2AX और 53BP1 इम्यूनोफ्लोरेसेंस सना

  1. निर्धारण और permeabilization: २०० & #181 के साथ कोशिकाओं को ठीक करें L 10 मिनट के लिए 4% पीएफए का एल. निर्धारण के बाद, कोशिकाओं को धीरे से धो तीन बार पंजाब के 30 मिलीलीटर के साथ 5 मिनट के लिए प्रत्येक एक प्रयोगशाला शेखर पर । इसके बाद permeabilize के साथ कोशिकाओं को २०० & #181; L का ०.१% Octoxinol 9 के लिए 10 min. कोशिकाओं को धो 5% के 30 मिलीलीटर के साथ धीरे तीन बार 5 मिनट के लिए प्रत्येक एक प्रयोगशाला शेखर पर समाधान अवरुद्ध । 1 h.
    2. के लिए ताजा 5% अवरुद्ध समाधान के 30 मिलीलीटर में कोशिकाओं ब्लॉक एंटीबॉडी
    1. के साथ
    2. की मशीन एक माउस के साथ कोशिकाओं की तैयारी मोनोक्लोनल विरोधी & #947; H2AX एंटीबॉडी (1:500) और माउस के साथ कोशिकाओं की अन्य तैयारी मोनोक्लोनल विरोधी & #947; H2AX एंटीबॉडी (1:500) और एक polyclonal खरगोश विरोधी 53BP1 एंटीबॉडी (1:500) रात भर 4 & #176; ग.
    3. के बाद गर्मी की कोशिकाओं को धो 2% की 30 मिलीलीटर के साथ धीरे 3 बार एक प्रयोगशाला शेखर पर प्रत्येक 5 मिनट के लिए समाधान अवरुद्ध ।
    4. अवरुद्ध समाधान निकालें और एक Alexa488-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500) और एक Alexa488-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस के साथ कोशिकाओं की दूसरी तैयारी के साथ कोशिकाओं की पहली तैयारी गर्मी एंटीबॉडी ( 1:500) और एक Alexa555-संयुग्मित गधा विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500) 1 के लिए कमरे के तापमान पर ज ।
  2. बढ़ते माध्यम: एक कटोरी में कोशिकाओं के साथ स्लाइड रखो और कोशिकाओं धीरे एक प्रयोगशाला शेखर पर प्रत्येक 5 मिनट के लिए पंजाब के 30 मिलीलीटर के साथ तीन बार धोने । पंजाबियों को हटाने और 4, 6-diamidino-2-phenylindole युक्त मध्यम बढ़ते साथ कोशिकाओं माउंट । सावधानी से बढ़ते माध्यम के शीर्ष पर एक coverslip इतना है कि कोई हवा में बुलबुले डाल रहे है एंबेडेड. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण करने से पहले बढ़ते माध्यम के सख्त करने के लिए कम से कम 3 एच रुको.
< p class = "jove_title" > 4. & #947 का विश्लेषण; H2AX और 53BP1 घावों

  1. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी: विश्लेषण & #947; H2AX और 53BP1 घावों नाभिक, Alexa ४८८ के लिए फ़िल्टर से सुसज्जित एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ सेल DAPI में, और इमेजिंग के दौरान Cy3 एक 100X & #160; उद्देश्य आवर्धन. एक कैमरा के साथ छवियों को रिकॉर्ड और उचित इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ छवियों को संसाधित.

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Representative Results

कोशिकाओं में γH2AX घावों का विश्लेषण G0/G1 चरण और G2 चरण में सबसे सटीक है जब γH2AX घावों के रूप में अलग फ्लोरोसेंट डॉट्स (चित्र 5 ए) दिखाई देते हैं । इसके विपरीत, एस चरण के दौरान कोशिकाओं में γH2AX घावों के विश्लेषण से फैला हुआ पान-नाभिकीय γH2AX speckles के कारण प्रतिकृति प्रक्रिया (चित्रा 5B) जटिल है.

कोशिकाओं के निर्धारण 4% पीएफए (10 मिनट) और ०.१% Octoxinol 9 (10 मिनट) के साथ permeabilization के साथ किया गया था । मेथनॉल निर्धारण और permeabilization के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, मेथनॉल कोशिका नाभिक काफी गंभीर रूप से टूट सकता है और γH2AX घावों बाहर धब्बा तो γH2AX घावों अलग प्रकट नहीं हो सकता है जब γH2AX घावों की तुलना में 4% पीएफए और ०.१% Octoxinol 9 के साथ उपचार द्वारा प्राप्त किया ।

कुशल एंटीबॉडी का चुनाव प्रभावी इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए महत्वपूर्ण है । प्रयोगों के एक प्राथमिक माउस मोनोक्लोनल विरोधी γH2AX एंटीबॉडी और एक प्राथमिक खरगोश polyclonal विरोधी 53BP1 एंटीबॉडी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के γH2AX धुंधला के लिए 53BP1, क्रमशः के साथ प्रदर्शन किया गया ।

के रूप में प्रत्येक γH2AX ध्यान केंद्रित एक एकल DSB का प्रतिनिधित्व करने के लिए माना जाता है, γH2AX के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला ठहराव ऊतकों में DSB के विकिरणित के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विकिरणित लिम्फोसाइटों में γH2AX घावों के स्तर (चित्रा 6) विकिरण खुराक के लिए आनुपातिक हैं20,21. γH2AX घावों विकिरण20,22की एक अधिकतम पहले से ही 5 मिनट प्राप्त कर सकते हैं । समय में बाद के बिंदुओं पर γH2AX घावों के क्षय पर नजर रखी जा सकती है और DSB20,21,22की मरंमत को दर्शाता है ।

आनुवंशिक अस्थिरता सेल लाइनों और ट्यूमर नमूनों में γH2AX और 53BP1 के संयुक्त इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है10,11,12,13,14। एक अनुकरणीय विश्लेषण तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (चित्रा 7) के साथ एक रोगी के CD34 + कोशिकाओं में प्रदर्शन किया गया था । γH2AX और 53BP1 के सह स्थानीयकरण DSB की साइटों पर 53BP1 मध्यस्थता NHEJ मरंमत तंत्र की पदोंनति का संकेत दिया जबकि मानव संसाधन रोका गया था । हालांकि, तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया के धमाकों में सह स्थानीयकरण γH2AX और 53BP1 घावों का प्रतिशत चर रहा था । एक अतिरिक्त 53BP1 संकेत के बिना γH2AX घावों देर S में DSB की मरंमत के लिए मानव संसाधन लगे हो सकता/ एकवचन 53BP1 घावों की भूमिका मायावी बनी रही.

Figure 1
चित्र 1: सूत्रों और अंतर्जात और exogenous डीएनए क्षति के परिणाम1,2,3,4। DSB, डीएनए डबल किनारा टूटता है; NHEJ, nonhomologous अंत-कार्यग्रहण.

Figure 2
चित्र 2 : प्रमुख डीएनए के योजनाबद्ध दृश्य डबल-किनारा तोड़ (DSB) स्तनधारी कोशिकाओं में मरंमत तंत्र । मुताबिक़ पुनर्संयोजन देर S/G2 चरण में एक बरकरार बहन chromatid का उपयोग करता है DSB के संभावित त्रुटि मुक्त मरंमत के लिए । Nonhomologous अंत में शामिल होने (NHEJ) सेल चक्र में सक्रिय है और संभावित रूप से त्रुटि प्रवण कुछ आधार जोड़े के रूप में जोड़ा जा सकता है या बंधाव से पहले DSB समाप्त होता है । वैकल्पिक अंत में शामिल होने के एक धीमी mutagenic बैक-अप की मरंमत की व्यवस्था है जो NHEJ की कमी के मामले में लगे हो सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : cytospins तैयार करने के लिए डिवाइस । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : cytospins की तैयारी । प्रत्येक नमूने के दो cytospins 10 मिनट के लिए ३०० x g पर १.० x 105 कोशिकाओं के केंद्रापसारक द्वारा तैयार कर रहे हैं । एक cytospin γH2AX इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए प्रयोग किया जाता है और एक और cytospin संयुक्त γH2AX और 53BP1 इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए उपयोग है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : कोशिका चक्र γH2AX के निर्भर पैटर्न सेल लाइन NHDF के सामान्य fibroblasts में घावों. (क) γH2AX घावों (हरे, Alexa ४८८) में नाभिक (नीले, DAPI) NHDF fibroblasts के G0/G1 या G2 चरण में अलग डॉट्स के रूप में दिखाई देते हैं । (ख) S चरण में fibroblasts के नाभिक में γH2AX घावों के रूप में बिखरे हुए पैन-नाभिकीय speckles (स्केल बार = 5 µm) दिखाई देते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : γH2AX एक स्वस्थ व्यक्ति के एक्स-रे विकिरणित लिम्फोसाइटों में घावों । γH2AX घावों की छवियों (हरे, Alexa ४८८) नाभिक में (नीला, DAPI) लिम्फोसाइटों के १०० mGy (स्केल बार = 5 µm) के साथ विकिरण के बाद 5 मिनट में दर्ज कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया के साथ एक रोगी के CD34 + कोशिकाओं में γH2AX और 53BP1 घावों के सह स्थानीयकरण । γH2AX घावों के सह स्थानीयकरण (हरे, Alexa ४८८) और 53BP1 घावों (लाल, Cy3) डीएनए डबल-कतरा टूटता की साइटों पर 53BP1 मध्यस्थता nonhomologous अंत में शामिल होने की मरंमत तंत्र की पदोंनति इंगित करता है (स्केल बार = 5 µm) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

γH2AX और 53BP1 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी अनुसंधान क्षेत्रों के एक व्यापक स्पेक्ट्रम में गठन और DSB की मरंमत के विश्लेषण के लिए एक उपयोगी तरीका है । महत्वपूर्ण मापदंडों है कि प्रयोगों के परिणाम को प्रभावित सेल चक्र के चरण हैं, एजेंटों के निर्धारण और कोशिकाओं के permeabilization के लिए इस्तेमाल किया, एंटीबॉडी के विकल्प, और हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की.

कोशिका चक्र के प्रभाव γH2AX घावों पैटर्न पर तेजी से बढ़ती सेल लाइन NHDF के सामांय fibroblasts द्वारा प्रदर्शन किया गया । γH2AX घावों G0/G1 और G2 चरणों में अलग फ्लोरोसेंट डॉट्स के रूप में बिखरे हुए पैन-परमाणु γH2AX एस चरण में speckles ( चित्रा 5) की तुलना में दिखाई दिया । G0/G1 चरण में और G2 चरण में विशिष्ट γH2AX घावों परिवर्तनीय और/या गठित डीएनए क्षति है कि दोहराए सेल चक्र मार्ग के दौरान प्राप्त किया गया है हो सकता है संकेत दिया; इसके विपरीत, एस चरण में फैलाया speckles केवल क्षणिक हुई और संभवतः प्रतिकृति प्रक्रिया के साथ जुड़े थे. के रूप में पैन परमाणु γH2AX speckles वास्तविक γH2AX घावों के विश्लेषण को परेशान कर सकते हैं, विश्लेषण से एस चरण कोशिकाओं के बहिष्कार की सिफारिश की है, जो आसानी से एस चरण विशिष्ट γH2AX पैटर्न द्वारा किया जाता है । वैकल्पिक रूप से, एस चरण में कोशिकाओं DAPI संकेत की तीव्रता की माप द्वारा या एस चरण विशिष्ट मार्करों के आवेदन द्वारा बाहर रखा जा सकता है (उदा., Cyclin A) । इसके अलावा, G0/G1 चरण में कक्षों के सिंक्रनाइज़ेशन के साथ विकास की गिरफ्तारी की प्रेरण कमरे के तापमान (जैसे, 18-20 डिग्री सेल्सियस) पर रात भर नमूनों को संग्रहित करके cytospins तैयार करने से पहले उपयोगी हो सकती है ।

निर्धारण और permeabilization की प्रक्रियाएँ γH2AX और 53BP1 के immunostaining में महत्वपूर्ण कदम हैं. निर्धारण23कोशिकाओं की आकृति विज्ञान और antigenicity को संरक्षित करने के लिए आवश्यक है । Permeabilization intracellular और नाभिकीय एंटीजन24तक पहुंच को सक्षम करता है । पीएफए निर्धारण और स्थिर कोशिकाओं के लिए एक अपेक्षाकृत कोमल एजेंट है, जबकि methylene crosslinks फार्म करने के लिए बुनियादी अमीनो एसिड के साथ प्रतिक्रिया द्वारा प्रोटीन संरचनाओं के संरक्षण । पीएफए के साथ निर्धारण के बाद, cytospins दिन और हफ्तों के लिए आगे की प्रक्रिया तक संग्रहित किया जा सकता है । γH2AX और 53BP1 का पता लगाने के लिए, कोशिकाओं को permeabilized किया जाना है । 9 Octoxinol एक गैर ईओण का आरोप लगाया हाइड्रोफिलिक प्रमुख polyoxyethylene moieties से मिलकर समूहों युक्त डिटर्जेंट के रूप में इस्तेमाल किया गया था । Octoxinol 9 कोशिका नाभिक धीरे टूट जाता है और γH2AX घावों को बरकरार रखता है काफी अलग । वैकल्पिक रूप से, मेथनॉल के निर्धारण और permeabilization कोशिकाओं के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है । मेथनॉल हाला प्रोटीन और कोशिका झिल्ली से लिपिड घुल, उंहें एंटीबॉडी को पारगंय कर । हालांकि, मेथनॉल के साथ उपचार संभवतः अधिक आक्रामक है और γH2AX घावों के रूप में स्पष्ट रूप से प्रकट नहीं हो सकता है जब γH2AX 4% पीएफए और ०.१% Octoxinol 9 के साथ उपचार द्वारा प्राप्त घावों की तुलना में । के बावजूद, कुशल एंटीबॉडी γH2AX और 53BP1 के immunostaining के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इसलिए, सिद्ध एंटीबॉडी के उपयोग की सिफारिश की है (देखें सामग्री की तालिका/ एंटीबॉडी के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने इष्टतम एंटीबॉडी सांद्रता के निर्धारण के लिए उपयोगी हो सकता है ।

γH2AX घावों का प्रयोग कम मात्रा में विकिरण biodosimetry में मार्कर के रूप में किया जाता है & #62; 1 mGy25। γH2AX घावों 5 मिनट में लिम्फोसाइटों में एक्स-रे विकिरण के बाद १०० mGy की एक खुराक के साथ विश्लेषण किया गया इन विट्रो (चित्रा 6) । के रूप में H2AX विकिरण के बाद DSB की साइटों पर तेजी से phosphorylated है, γH2AX घावों की संख्या पहले से ही एक अधिकतम 5 मिनट में विकिरण20,22के बाद तक पहुंच सकता है । हालांकि, मरंमत की प्रक्रिया के बाद तुरंत शुरू विकिरण और γH2AX घावों एक अलग क्षय दर पर हटा रहे हैं । इसलिए, एक कालानुक्रमिक अनुक्रम में γH2AX घावों की संख्या की निगरानी के लिए, यह उचित है कि विकिरण के बाद समय में निर्दिष्ट बिंदु पर बर्फ पर नमूना डाल द्वारा मरंमत की प्रक्रिया में बाधा ।

γH2AX और 53BP1 की इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी कैंसर कोशिकाओं में आनुवंशिक अस्थिरता का विश्लेषण करने के लिए एक उपयोगी तरीका है । CD34 + कोशिकाओं CD34 microbeads का उपयोग कर गंभीर माइलॉयड ल्यूकेमिया के साथ एक रोगी की अस्थि मज्जा से समृद्ध थे । विशिष्ट प्रतिदीप्ति फ़िल्टर्स का उपयोग करके γH2AX घावों और 53BP1 घावों की छवियाँ प्राप्त की गईं. cytospin की एक उज्ज्वल रोशनी γH2AX और 53BP1 घावों के पर्याप्त प्रतिदीप्ति प्रेरित करने के लिए महत्वपूर्ण है । छवि रिकॉर्डिंग के बाद, घावों की तीव्रता के अनुकूलन और पृष्ठभूमि संकेत इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । γH2AX और 53BP1 घावों के सह स्थानीयकरण का विश्लेषण करने के लिए, छवियों को विलय कर रहे हैं (चित्र 7) । एक बुनियादी epifluorescence माइक्रोस्कोप DAPI, Alexa ४८८, और एक कैमरा प्रणाली और इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन में Cy3 के लिए फिल्टर के साथ सुसज्जित 53BP1 सना हुआ सेल DAPI में γH2AX और नाभिक घावों के विश्लेषण के लिए पर्याप्त है । हालांकि, कुछ अनुप्रयोगों (उदाहरणके लिए, एक कण पटरियों के साथ डीएनए क्षति का विश्लेषण) उच्च संकल्प और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की कमी की आवश्यकता हो सकती है (के रूप में प्रदान की, जैसे फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा) । इसके अलावा, माइक्रोस्कोप प्रौद्योगिकी एक तेजी से विकसित क्षेत्र है और २०० एनएम नीचे एक संकल्प राज्य के अत्याधुनिक सूक्ष्मदर्शी के साथ संभव है ।

संक्षेप में, इस पांडुलिपि DSB गठन और मरंमत के महत्वपूर्ण मुद्दों पर प्रकाश डाला गया और γH2AX और 53BP1 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप द्वारा DSB का एक विस्तृत विश्लेषण के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करता है । DSB पर अनुसंधान स्पष्ट रूप से माइक्रोस्कोप प्रौद्योगिकी में हाल ही में और भविष्य के घटनाक्रम से लाभ होगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना को जर्मन जोस Carreras ल्यूकेमिया फाउंडेशन (DJCLS 14 आर/2017) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI medium Sigma-Aldrich R0883 Medium for cell culture
Heparin sodium ratiopharm PZN 3029843  Heparin 5,000 I.U. / mL
Sodium chloride solution 0.9% B. Braun PZN 1957154 Component of the anticoagulant stock solution
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 Medium for isolation of mononuclear cells
Trypsin solution 10X Sigma-Aldrich 59427C Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture
CD34 MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-046-702 Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells
Diagnostic microscope slides Thermo Scientific ER-203B-CE24 Microscope slides
Megafuge 1.0 R Heraeus 75003060  Tabletop centrifuge 
Cytospin device
Lid Heraeus 76003422 Lid for working without micro-tubes
Cyto container Heraeus 75003416 Cyto container with 2 conical bores
Clip carrier Heraeus 75003414 Carrier for holding a cyto container and a slide
Support insert Heraeus 75003417 Support insert for holding a clip carrier
Triton X-100 (Octoxinol 9) Thermo Scientific 85112 Detergent for permeabilization of cell membranes
Potassium hydroxide solution 1M Merck Millipore 109107 Necessary for preparing the paraformaldehyde solution
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Fixation agent
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 Balanced salt solution
Chemiblocker Merck Millipore 2170 Blocking agent
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) Merck Millipore 05-636 Primary antibody for detection of γH2AX
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) Novus Biologicals NB100-304 Primary antibody for detection of 53BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody Invitrogen A-11001 Secondary antibody
Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody Invitrogen A-31572 Secondary antibody
Vectashield mounting medium Vector Laboratories H-1200 Contains DAPI for staining of DNA
Axio Scope.A1 Zeiss 490035 Fluorescence microscope
Cool Cube 1 CCD camera Metasystems H-0310-010-MS Camera system for digital recording
Isis software Metasystems Not applicable Microscope software

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक १२९ इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी γH2AX 53BP1 एक्स-रे आनुवंशिक अस्थिरता डीएनए डबल किनारा टूटता है डीएनए की मरंमत
डीएनए डबल-किनारा टूट के गठन और मरंमत के विश्लेषण के लिए γH2AX और 53BP1 की इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी
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Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J. Vis. Exp. (129), e56617, doi:10.3791/56617 (2017).

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