Summary
Questo manoscritto fornisce un protocollo per l'analisi delle rotture del doppio filamento di DNA da microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1.
Abstract
Rotture del DNA a doppio filamento (DSB) sono gravi lesioni al DNA. Analisi della formazione e della riparazione del DSB sono rilevante in un ampio spettro di settori di ricerca tra cui integrità del genoma, genotossicità, radiobiologia, invecchiamento, cancro e lo sviluppo di farmaci. In risposta a DSB, istone H2AX è fosforilata a serina 139 in una regione di diverse coppie di megabase formando fuochi nucleari discreti rilevabili da microscopia di immunofluorescenza. In aggiunta, 53BP1 (proteina p53 1) è un'altra importante proteina DSB-sensible a reagire promuovendo la riparazione del DSB unendo nonhomologous fine-evitando la ricombinazione omologa. Secondo le specifiche funzioni di γH2AX e 53BP1, l'analisi combinata di γH2AX e 53BP1 da microscopia di immunofluorescenza può essere un approccio ragionevole per un'analisi dettagliata del DSB. Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato completato con metodiche note per l'esecuzione della tecnica. In particolare, l'influenza del ciclo cellulare sui modelli di fuochi γH2AX è dimostrata in fibroblasti normali della linea cellulare NHDF. Inoltre, il valore dei fuochi γH2AX come biomarcatore è raffigurato nei linfociti irradiati raggi x di un individuo sano. Infine, l'instabilità genetica è studiata in cellule CD34 + di un paziente con la leucemia mieloide acuta da microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1.
Introduction
DNA è continuamente danneggiato da endogeno (ad es., stress replica, specie reattive dell'ossigeno, intrinseca instabilità del DNA) ed esogene (ad esempio, radicali chimici, irradiazione) fonti (Figura 1)1,2 ,3,4. Tra il danno del DNA, rotture del DNA a doppio filamento (DSB) sono lesioni particolarmente gravi e possono indurre la morte delle cellule o carcinogenesi. Circa 50 DSB possono sorgere al cellulare e ciclo cellulare5. In cellule di mammifero, ricombinazione omologa (HR) e fine-unirsi nonhomologous (NHEJ) sviluppato come vie principali per la riparazione di DSB (Figura 2). HR si verifica nella fase tarda S/G2 e utilizza un'intatta sorella cromatidio come modello per la riparazione potenzialmente privo di errori. In confronto, NHEJ è attivo durante tutto il ciclo cellulare e potenzialmente mutageni come coppie di basi può essere aggiunto o resecate prima legatura dell'estremità rotte. Inoltre, fine-entrare in alternativa possono essere assunti come un meccanismo di lento mutagene backup ripristino in caso di carenza NHEJ6,7.
DSB inducono la fosforilazione dell'istone H2AX a serina 139 in una regione di diverse coppie di megabase intorno ogni DSB. I fuochi che formanti nucleari sono denominati γH2AX i fuochi e rilevabili da microscopia di immunofluorescenza8. ΓH2AX promuove l'assunzione di ulteriori proteine DSB-sensible a reagire ed è coinvolto nel rimodellamento della cromatina, riparazione del DNA e di trasduzione di segnale9. Come ogni focus γH2AX è considerato per rappresentare un singolo DSB, la quantificazione del DSB da microscopia di immunofluorescenza è possibile, che è stata dimostrata in linee cellulari del cancro e i campioni dei pazienti10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (proteina p53 1) è un'altra proteina chiave nel mediare la riparazione DSB. È coinvolto nel reclutamento di DSB-sensible a reagire proteine, segnalazione di checkpoint e le sinapsi di DSB estremità15. Inoltre, 53BP1 svolge un ruolo critico nella scelta di percorso di riparazione DSB. Si innesca la riparazione del DSB verso NHEJ mentre HR è impedito16. Considerando le funzioni originali di γH2AX e 53BP1 in riparazione DSB, l'analisi simultanea di γH2AX e 53BP1 da microscopia di immunofluorescenza può essere un metodo utile per l'analisi precisa della formazione e della riparazione del DSB.
Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per l'esecuzione di microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 nei nuclei delle cellule. In particolare, la tecnica è applicata in fibroblasti normali della linea cellulare NHDF, nei linfociti irradiati raggi x di un individuo sano e in cellule CD34 + di un paziente con la leucemia mieloide acuta. I dettagli del metodo sono indicati nel contesto dei risultati presentati.
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Protocol
tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal Comitato etica II della Mannheim facoltà medica dell'Università di Heidelberg. Scritto il consenso informato è stato ottenuto da tutti gli individui.
1. preparazione dei materiali
- di soluzione anticoagulante: preparare una soluzione di riserva dell'anticoagulante dell'eparina a 200 UI / mL in sodio cloruro 0,9%. Riempire ciascuna delle provette di raccolta (disegnare il volume 9 mL) con 2 mL di soluzione di riserva dell'anticoagulante prima del prelievo dei campioni di sangue o midollo osseo.
- Soluzione di lisi di cellule rosse: preparare il 10 x soluzione di lisi per cellule rosse con 82,91 g di cloruro di ammonio, bicarbonato di ammonio 7,91 g e 2 mL di soluzione di acido etilendiamminotetracetico 0,5 M ad un pH di 8,0 sciogliendo gli agenti in acqua bidistillata per un volume totale di 1 L.
- Soluzione di fissazione: 8.3 aggiungere µ l di una soluzione di idrossido di potassio di 1 M di paraformaldeide 360 mg (PFA) in un tubo di microtitolo. Riempire il tubo con tamponato fosfato salino (PBS) fino alla tacca 1 mL del tubo e di calore del tubo in un blocco di riscaldamento a 95 ° C per ottenere 1 mL di una soluzione PFA del 36%. Trasferire la soluzione PFA 36% 1 mL in una provetta con una capacità di 15 mL. Aggiungere 8 mL di PBS alla soluzione 1 mL 36% PFA, per ottenere 9 mL di una soluzione madre di PFA 4%. Aliquota del 4% soluzione di riserva di PFA e conservare a-18 ° C fino a utilizzare per la fissazione delle cellule.
Attenzione: la soluzione di idrossido di potassio 1) è corrosivo. Essere consapevoli di protezione degli occhi e della pelle. 2) PFA è cancerogeno. Evitare il contatto con la pelle e l'inalazione. Preparare la soluzione di fissaggio sotto un cofano. - Soluzione di permeabilizzazione: aggiungere 50 µ l octoxinolo 9 a 50 mL di PBS per ottenere una soluzione di circa 0.1% octoxinolo 9.
- Soluzione bloccante: preparare 5% e 2% soluzioni di blocco di miscelazione l'agente bloccante della proteina con PBS e store a 6 – 8 ° C.
2. Preparazione dei campioni
- fibroblasti in coltura delle cellule: coltivare fibroblasti umani della linea cellulare NHDF in un umidificata 5% CO 2 atmosfera a 37 ° C in RPMI 1640 supplementato con 10% siero fetale di vitello, 4 mM Glutammina e 1% di penicillina/streptomicina.
- Preparazione di un vetrino da microscopio con aderente fibroblasti
- rimuovere il supporto dal pallone (area di crescita di 75 cm 2) con fibroblasti NHDF in crescita esponenziale. Aggiungere 10 mL di PBS al pallone. Lavare delicatamente i fibroblasti aderenti agitando manualmente la beuta per 1 min.
- Rimuovere il PBS e aggiungere tripsina 1 mL nel pallone. Agitare il matraccio delicatamente per garantire che tutte le cellule aderenti sono coperti dalla tripsina. Rimuovere la tripsina dal pallone. Mettere il pallone in incubatrice per 5 min a 37 ° C.
- Prendere il pallone fuori l'incubatrice e aggiungere 10 mL RPMI 1640 liquido nel pallone. Pipettare il mezzo su e giù più volte per disperdere i fibroblasti.
- Pipetta 0,3 mL dei fibroblasti dispersi su ciascuno dei due campi del vetrino da microscopio e inserire la diapositiva nell'incubatrice per 24 h in modo che i fibroblasti aderiscono alla diapositiva. Per immunostaining di γH2AX e 53BP1 nei nuclei dei fibroblasti, passare alla fase 3.1.
- Preparazione di un vetrino da microscopio con aderente fibroblasti
- Campioni di pazienti
- campioni di sangue: utilizzare i tubi di raccolta che sono stati riempiti con 2 mL di soluzione di riserva dell'anticoagulante e aggiungere 7 mL di sangue nelle provette. Conservare i campioni durante la notte a temperatura ambiente (cioè, 18-20 ° C). Il giorno successivo, isolare la fase G0/G1 cellule mononucleari di riposo di centrifugazione in gradiente di densità (punto 2.2.3).
- Campioni del midollo osseo: utilizzare i tubi di raccolta che sono stati riempiti con 2 mL di soluzione di riserva dell'anticoagulante (punto 1.1) e aggiungere midollo osseo 7 mL nelle provette. Conservare i campioni durante la notte a temperatura ambiente (cioè, 18-20 ° C). Il giorno successivo, isolare la fase G0/G1 cellule mononucleari di riposo di centrifugazione in gradiente di densità (punto 2.2.3). Utilizzare microsfere di CD34 e colonne di separazione per l'isolamento delle cellule CD34 + di cell.
- Isolamento delle cellule mononucleari di centrifugazione in gradiente di densità
Nota: Cellule mononucleari sono isolate da campioni di sangue e midollo osseo di centrifugazione su gradiente di densità 17 , 18 , 19.- Diluire il campione di sangue eparinizzato in un rapporto di 1:1 con PBS e il campione di midollo osseo eparinizzata in un rapporto di 1:3 con PBS. Sospendere le cellule delicatamente trascinandoli dentro e fuori la pipetta due volte.
- Aggiungere un volume di mezzo di gradienti di densità in una nuova provetta. Delicatamente strato il sangue diluito o midollo osseo sopra il mezzo del gradiente di densità. Fare attenzione a non per mescolare i due strati.
- Centrifugare la provetta per 30 min a temperatura ambiente e 400 g. x lo strato superiore del plasma prelevare con la pipetta. Poi accuratamente raccolto le cellule mononucleari nello strato di sopra il mezzo del gradiente di densità. Le cellule mononucleari di trasferimento in una nuova provetta.
- Aggiungere almeno tre volumi di PBS a cellule mononucleari nel tubo. Sospendere le cellule delicatamente trascinandoli dentro e fuori la pipetta due volte. Centrifugare la provetta per 10 min a temperatura ambiente e 400 x g.
- Dopo la rotazione, rimuovere il supernatante e aggiungere 10 mL di 4 ° C, 1 x soluzione di lisi di cellule rosse. Risospendere delicatamente le cellule trascinandoli dentro e fuori la pipetta due volte e posizionare il tubo sul ghiaccio per 5 min. Aggiungere 30 mL di PBS a 4 ° C, quindi centrifugare la provetta per 10 min a temperatura ambiente e 400 x g.
- Preparazione dei cytospins
- preparare due cytospins con cellule mononucleari dei campioni dei pazienti (cioè, un cytospin per γH2AX colorazione di immunofluorescenza e un cytospin per γH2AX e 53BP1 combinato di immunofluorescenza) mediante centrifugazione (300 x g, 10 min) di 1.0 x 10 5 celle per ogni preparazione ( Figura 3 e 4).
3. γH2AX e colorazione di immunofluorescenza 53BP1
- fissazione e permeabilizzazione: fissare le cellule con 200 µ l di 4% PFA per 10 min. Dopo la fissazione, lavare delicatamente le cellule tre volte con 30 mL di PBS per 5 minuti ciascuno su un agitatore di laboratorio. Quindi permeabilize le cellule con 200 µ l di 0,1% octoxinolo 9 per 10 min. lavare le cellule delicatamente tre volte con 30 mL di soluzione bloccante 5% per 5 minuti ciascuno su un agitatore di laboratorio. Bloccare le cellule in 30 mL di fresco 5% soluzione per 1 h. di blocco
- Incubazione con gli anticorpi
- Incubare una preparazione delle cellule con un anticorpo monoclonale anti-γH2AX di topo (1: 500) e l'altra preparazione delle cellule con un anticorpo monoclonale anti-γH2AX di topo (1: 500) e una anticorpo policlonale del coniglio di anti-53BP1 (1: 500) durante la notte a 4 ° C.
- Dopo incubazione lavare le cellule delicatamente 3 volte con 30 mL di soluzione bloccante 2% per ogni 5 minuti su un agitatore di lab.
- Rimuovere la soluzione di blocco e incubare la prima preparazione delle cellule con un anticorpo secondario anti-topo di capra Alexa488-coniugati (1: 500) e la seconda preparazione delle cellule con un (anticorpo secondario anti-topo di capra Alexa488-coniugato 1: 500) e un asino Alexa555-coniugato anticorpo secondario anti-coniglio (1: 500) per 1 h a temperatura ambiente.
- Mezzo di montaggio: mettere il vetrino con le cellule in una ciotola e lavare le cellule delicatamente tre volte con 30 mL di PBS per ogni 5 minuti su un agitatore di laboratorio. Rimuovere il PBS e montare le cellule con mezzo di montaggio contenente 4,6-diamidino-2-phenylindole. Prudentemente messo un vetrino coprioggetto sopra il mezzo di montaggio in modo che bolle d'aria non sono incorporato. Attendere almeno 3 ore per l'indurimento di mezzo di montaggio prima di analizzare le cellule mediante microscopia a fluorescenza.
4. Analisi di γH2AX e 53BP1 i fuochi
- microscopia di fluorescenza: analizzare i fuochi γH2AX e 53BP1 nei nuclei delle cellule con un microscopio a fluorescenza dotato di filtri per DAPI, Alexa 488 e Cy3 durante la formazione immagine a un obiettivo 100x ingrandimento. Registrare immagini con una macchina fotografica ed elaborare le immagini con software di imaging appropriato.
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Representative Results
Analisi dei fuochi di γH2AX in cellule è più accurata in fase G0/G1 e la fase G2 quando i fuochi di γH2AX vengono visualizzati come punti fluorescenti distinti (Figura 5A). Al contrario, analisi dei fuochi di γH2AX nelle cellule durante la fase S sono complicata da macchioline dispersi γH2AX pan-nucleare causate dal processo di replica (figura 5B).
Fissazione delle cellule è stata realizzata con 4% PFA (10 min) e permeabilizzazione con 0,1% octoxinolo 9 (10 min). Metanolo può essere utilizzato per la fissazione e la permeabilizzazione, troppo; Tuttavia, metanolo può spezzare i nuclei cellulari abbastanza gravemente e striscio fuori i fuochi di γH2AX così i fuochi di γH2AX potrebbero non essere distinti rispetto ai fuochi γH2AX ottenuti dal trattamento con 4% PFA e 0,1% octoxinolo 9.
La scelta degli anticorpi efficiente è fondamentale per la microscopia di immunofluorescenza efficace. Gli esperimenti sono stati eseguiti con un anticorpo monoclonale anti-γH2AX mouse primario e un anticorpo policlonale anti-53BP1 coniglio primario per colorazione di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1, rispettivamente.
Come ogni focus γH2AX è considerato per rappresentare un singolo DSB, colorazione di immunofluorescenza di γH2AX può essere utilizzato per la quantificazione del DSB in tessuti irradiati. Livelli di γH2AX fuochi nei linfociti irradiati (Figura 6) sono proporzionali all'irradiazione dose20,21. I fuochi di γH2AX possono raggiungere un massimo già 5 min di irradiazione20,22. Il decadimento dei fuochi γH2AX in punti successivi del tempo può essere monitorato e riflette la riparazione del DSB20,21,22.
Instabilità genetica può essere analizzato mediante colorazione di immunofluorescenza combinato di γH2AX e 53BP1 in linee cellulari di tumore esemplari10,11,12,13,14. Un'analisi esemplare è stata effettuata nelle cellule CD34 + di un paziente con la leucemia mieloide acuta (Figura 7). Co-localizzazione di γH2AX e 53BP1 indicata la promozione di meccanismi di riparazione NHEJ 53BP1-mediati in siti di DSB mentre HR è stata evitata. Tuttavia, la percentuale di co-localizzazione γH2AX ed i fuochi 53BP1 negli scoppi della leucemia mieloide acuta era variabile. I fuochi di γH2AX senza un segnale di ulteriori 53BP1 potrebbero sono impegnati HR per la riparazione di DSB in fase tardiva S/G2. Il ruolo dei fuochi 53BP1 singolare è rimanere evasivo.
Figura 1: Origini e conseguenze del DNA endogeno ed esogeno danneggiano1,2,3,4. DSB, rotture a doppio filamento del DNA; NHEJ, nonhomologous fine-adesione.
Figura 2 : Vista schematica delle principali rotture a doppio filamento del DNA (DSB) riparazione meccanismi in cellule di mammifero. Ricombinazione omologa utilizza un'intatta sorella cromatidio della fine della fase S/G2 per riparazione potenzialmente privo di errori del DSB. Nonhomologous fine-joining (NHEJ) è attiva in tutto il ciclo cellulare e potenzialmente soggetto a errori come poche coppie di basi può essere aggiunto o resecate prima legatura delle estremità del DSB. Fine-partecipare alternativo è un meccanismo di lento mutagene backup ripristino che potrebbe essere impegnato in caso di carenza di NHEJ. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Dispositivo per la preparazione del cytospins. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Preparazione dei cytospins. Due cytospins di ciascun campione sono preparato mediante centrifugazione di 1.0 x 105 celle a 300 x g per 10 min. Uno cytospin viene utilizzato per la colorazione di immunofluorescenza di γH2AX e un altro cytospin viene utilizzata per γH2AX combinato e 53BP1 colorazione di immunofluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Ciclo cellulare dipendente modelli dei fuochi γH2AX in fibroblasti normali della linea cellulare NHDF. I fuochi di γH2AX (A) (verde, Alexa 488) nei nuclei (blu, DAPI) dei fibroblasti NHDF vengono visualizzati come punti distinti nella fase G0/G1 o G2. I fuochi di γH2AX (B) nei nuclei dei fibroblasti nella fase S appaiono come macchioline di pan-nucleari dispersione (barra della scala = 5 µm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 I fuochi di γH2AX : a raggi x irradiati linfociti di un individuo sano. Le immagini dei fuochi di γH2AX (verde, Alexa 488) nei nuclei (blu, DAPI) dei linfociti sono registrate a 5 min dopo irradiazione con 100 mGy (barra della scala = 5 µm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 : Co-localizzazione di foci γH2AX e 53BP1 in cellule CD34 + di un paziente con la leucemia mieloide acuta. Co-localizzazione dei fuochi γH2AX (verde, Alexa 488) e fuochi 53BP1 (rosso, Cy3) indica la promozione di 53BP1-mediata nonhomologous fine-unendo i meccanismi di riparazione presso siti di rotture a doppio filamento del DNA (barra della scala = 5 µm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 è un metodo utile per analizzare la formazione e la riparazione di DSB in un ampio spettro di settori di ricerca. I parametri critici che influenzano il risultato degli esperimenti sono la fase del ciclo cellulare, gli agenti utilizzati per la fissazione e la permeabilizzazione delle cellule, la scelta di anticorpi e l'hardware e il software di microscopio di fluorescenza.
L'influenza del ciclo cellulare sui modelli i fuochi di γH2AX è stata dimostrata da fibroblasti normali della linea cellulare NHDF in crescita esponenziale. I fuochi di γH2AX è comparso come punti distinti fluorescente in G0/G1 e fasi G2 rispetto macchiettature γH2AX pan-nucleari dispersi in fase S (Figura 5). I fuochi di γH2AX distinte in G0/G1 fase e in G2 indicato transitorio e/o costitutivo danno del DNA che potrebbe acquistarsi durante i passaggi ripetitivi ciclo cellulare; al contrario, le macchioline dispersione in fase S si è verificato solo transitoriamente e sono stati presumibilmente associate con il processo di replica. Come la γH2AX pan-nucleare macchioline possono disturbare l'analisi dei fuochi γH2AX genuino, l'esclusione delle cellule di fase S da analisi raccomanda, prontamente che avviene tramite il modello di γH2AX specifici di fase S. In alternativa, le cellule nella fase S possono essere escluso tramite la misura dell'intensità del segnale DAPI o dall'applicazione di marcatori specifici di S fase (ad es., ciclina A). Inoltre, l'induzione dell'arresto di crescita con la sincronizzazione delle cellule in fase G0/G1 può essere utile prima di preparare il cytospins memorizzando i campioni a temperatura ambiente (cioè, 18-20 ° C) durante la notte.
Le procedure di fissazione e di permeabilizzazione sono passaggi critici nel immunostaining di γH2AX e 53BP1. La fissazione è necessaria per preservare la morfologia e l'antigenicità delle cellule23. Permeabilizzazione consente l'accesso al24antigeni intracellulari e nucleare. PFA è un agente relativamente delicato per la fissazione e stabilizza le cellule mantenendo strutture proteiche reagendo con amminoacidi basici a forma legami crociati di metilene. Dopo la fissazione con PFA, cytospins memorizzabili per giorni e settimane fino al procedimento successivo. Per il rilevamento di γH2AX e 53BP1, le cellule devono essere permeabilizzate. Octoxinolo 9 è stato utilizzato come un detergente non ionico contenenti gruppi testa idrofili uncharged consistente di poliossietilene moiety. Octoxinolo 9 rompe delicatamente i nuclei cellulari e conserva i fuochi γH2AX abbastanza distintamente. In alternativa, metanolo può essere utilizzato per la fissazione e la permeabilizzazione delle cellule, troppo. Metanolo precipita le proteine e scioglie i lipidi dalla membrana cellulare, che li rende permeabile agli anticorpi. Tuttavia, il trattamento con metanolo è presumibilmente più aggressivo e γH2AX i fuochi non compaiono come distintamente rispetto ai fuochi γH2AX ottenuti dal trattamento con 4% PFA e 0,1% octoxinolo 9. Nonostante, efficienti anticorpi svolgono un ruolo chiave per immunostaining di γH2AX e 53BP1. Pertanto, si raccomanda l'uso di anticorpi provati (Vedi Tabella dei materiali/attrezzature). Una diluizione seriale degli anticorpi può essere utile per la determinazione delle concentrazioni ottimali dell'anticorpo.
I fuochi di γH2AX sono utilizzati come un marcatore in biodosimetry di radiazioni a basse dosi > 1 mGy25. I fuochi di γH2AX sono stati analizzati nei linfociti a 5 min dopo irradiazione con raggi x con una dose di 100 mGy in vitro (Figura 6). Come H2AX è fosforilata rapidamente ai siti di DSB dopo irradiazione, il numero dei fuochi γH2AX già può raggiungere al massimo a 5 min dopo irradiazione20,22. Tuttavia, il processo di ripristino inizia immediatamente dopo l'irradiazione e γH2AX i fuochi vengono rimossi in un tasso di decadimento distinti. Quindi, per monitorare il numero dei fuochi di γH2AX in una sequenza cronologica, è consigliabile interrompere il processo di riparazione mettendo il campione sul ghiaccio nel punto specificato in tempo dopo irradiazione.
Microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 è un metodo utile per l'analisi di instabilità genetica in cellule tumorali. Cellule CD34 + sono state arricchite dal midollo osseo di un paziente con la leucemia mieloide acuta utilizzando microsfere di CD34. Immagini di γH2AX i fuochi ed i fuochi 53BP1 sono state ottenute utilizzando filtri di fluorescenza specifica. Un'illuminazione brillante del cytospin è importante per indurre la fluorescenza adeguata dei fuochi γH2AX e 53BP1. Dopo aver registrato l'immagine, adattamento dell'intensità dei fuochi e il segnale di fondo è necessario utilizzando il software di imaging. Per analizzare la co-localizzazione di foci γH2AX e 53BP1, le immagini vengono unite (Figura 7). Un microscopio a epifluorescenza base dotato di filtri per DAPI, Alexa 488 e Cy3 in combinazione con un sistema di telecamere e software di imaging è sufficiente per l'analisi di γH2AX e i fuochi 53BP1 in DAPI macchiato i nuclei delle cellule. Tuttavia, alcune applicazioni (ad es., analisi di danno del DNA lungo binari di singola particella) possono richiedere una maggiore risoluzione e riduzione della fluorescenza di fondo (come ad es., fornito di microscopia a scansione laser confocale). Inoltre, la tecnologia del microscopio è un settore in rapida evoluzione e una risoluzione inferiore a 200 nm è fattibile con state-of-the-art microscopi.
In sintesi, questo manoscritto evidenzia problemi critici di formazione DSB e riparazione e fornisce un protocollo passo-passo per un'analisi dettagliata delle DSB da microscopia di immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1. La ricerca sul DSB chiaramente potranno beneficiare di sviluppi recenti e futuri nella tecnologia del microscopio.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Il progetto è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca José Carreras leucemia (14 DJCLS R/2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
| Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
| Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
| Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
| Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
| Cytospin device | |||
| Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
| Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
| Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
| Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
| Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
| Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
| Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-31572 | Secondary antibody |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
| Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
| Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |
References
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