Summary
Bu el yazması bir iletişim kuralı tarafından γH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu DNA çift iplikli kırılmalara analiz için sağlar.
Abstract
DNA çift iplikli kırılmalara (DSB) ciddi DNA lezyonlardir. Oluşumu ve DSB tamiri analizi araştırma alanlarına genom bütünlük, genotoxicity, radyasyon biyolojisi, yaşlanma, kanser ve ilaç geliştirme de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede uygun olur. DSB yanıt olarak, Histon H2AX serin 139 ayrı nükleer foci tespit şekillendirme birkaç megabase çiftleri bir bölgede, ayirt mikroskobu tarafından fosforile. Buna ek olarak, 53BP1 (p53 bağlayıcı protein 1) başka bir önemli DSB-duyarlı protein DSB tamiri katılarak nonhomologous sonu-homolog rekombinasyon önlenmesi ise teşvik olduğunu. ΓH2AX ve 53BP1 belirli fonksiyonları göre γH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu ile kombine analizi DSB ayrıntılı bir analiz için makul bir yaklaşım olabilir. Bu el yazması teknik gerçekleştirmek için metodik notları ile desteklenmiş bir adım adım iletişim kuralı sağlar. Özellikle, hücre döngüsünün etkisi γH2AX foci örgülerine hücre kültürünü NHDF normal fibroblastlar içinde gösterilmiştir. Ayrıca, γH2AX resimde değeri bir biyomarker olarak sağlıklı bir bireyin ışınlanmış x-ray lenfosit tasvir edilir. Son olarak, genetik istikrarsızlık tarafından γH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu hücrelerdeki CD34 + olan bir hastanın akut myeloid lösemi soruşturma.
Introduction
DNA sürekli zarar görmüş endojen tarafından (örneğin, çoğaltma stres, Reaktif oksijen türleri, DNA'ın iç istikrarsızlık) ve eksojen (örneğin, kimyasal radikaller, ışınlama) (Resim 1)1,2 kaynakları ,3,4. DNA hasarı arasında DNA çift iplikli kırılmalara (DSB) özellikle ciddi lezyonlardir ve hücre ölümü veya karsinojenezis neden olabilir. Yaklaşık 50 DSB hücre ve hücre döngüsü5başına ortaya çıkabilir. Memeli hücrelerinde homolog rekombinasyon (İK) ve nonhomologous sonu-katılma (NHEJ) DSB (Şekil 2) tamiri için büyük yollar olarak geliştirilmiştir. Saat geç S/G2 aşamasında oluşur ve sağlam bir kız kardeşi kullanır Kromatit potansiyel olarak hatasız onarım için bir şablon olarak. Baz çifti eklendiğinde veya kırık uçları ligasyonu önce rezeke karşılık, hücre döngüsü boyunca aktif ve potansiyel olarak mutajenik NHEJ. Buna ek olarak, alternatif son katılma NHEJ eksikliği6,7durumunda yavaş mutajenik yedekleme onarım mekanizması olarak meşgul olabilir.
DSB fosforilasyon Histon H2AX serin 139 birkaç megabase çiftleri her DSB çevresinde bir bölgede, bir neden. Şekillendirme nükleer resimde γH2AX foci adlı ve ayirt mikroskobu8tarafından algılanabilir. ΓH2AX daha fazla DSB-duyarlı protein alımı teşvik ve Kromatin remodeling, DNA tamiri ve sinyal iletim9ilgilenmektedir. Her γH2AX odak tek bir DSB temsil etmek için kabul edilir gibi DSB miktar ayirt mikroskobu tarafından hangi kanser hücre satırları ve hasta örnekleri10,11, göstermiş olduğu, mümkün 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 bağlayıcı protein 1) DSB onarım arabuluculuk içinde başka bir anahtar protein olduğunu. DSB-duyarlı proteinler, denetim noktası sinyal ve DSB biter15synapsis istihdamı ilgilenmektedir. Buna ek olarak, 53BP1 DSB onarım yolu seçiminde kritik bir rol oynamaktadır. İK EngellediBRÜKSEL16iken NHEJ doğru DSB tamiri tetikler. ΓH2AX ve 53BP1 DSB tamir hakiki fonksiyonları göz önüne alındığında, γH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu tarafından eş zamanlı analiz oluşumu ve DSB tamiri kesin çözümleme için yararlı bir yöntem olabilir.
Bu el yazması ayirt mikroskobu, γH2AX ve 53BP1 hücre çekirdeği içinde gerçekleştirmek için adım adım bir protokol sağlar. Özellikle, teknik hücre kültürünü NHDF, x-ışını ışınlanmış lenfositler sağlıklı bir bireyin ve CD34 + bir hastada akut myeloid lösemi hücrelerinin normal fibroblastlar uygulanır. Yöntem ayrıntıları sunulan sonuçları bağlamında dikkat çekti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada Heidelberg Üniversitesi Tıp Fakültesi Mannheim Etik Komitesi II tarafından onaylanmıştır. Aydınlatılmış onam tüm bireyler elde edilen yazılı.
1. hazırlık malzemeleri
- antikoagülan hisse senedi çözüm: mL % 0,9 Sodyum Klorür başına 200 IU heparin bir antikoagülan hisse senedi çözüm hazırlamak. Her koleksiyon tüpleri doldurun (birim çizmek 9 mL) 2 mL kan veya kemik iliği örnekleri geri çekilmesi önce antikoagülan stok çözeltisi ile.
- Lizis çözüm kırmızı hücreleri için: hazırla 10 x kırmızı hücreleri 82.91 g amonyum klorür, 7,91 g amonyum bikarbonat ve 2 mL ajanları eriterek tarafından 8,0 pH için 0, 5 M ethylenediaminetetraacetic asit çözeltisi ile lizis çözüm Çift distile su için toplam hacmi 1 L.
- Fiksasyon çözüm: ekleyin 8.3 µL 360 mg paraformaldehyde (PFA) bir microtiter tüp bir 1 M potasyum hidroksit çözüm. Tüp, tüp ve ısı Isıtma blok 95 ° C'de 1 mL % 36 PFA çözeltisi almak için tüpe 1 mL işaretine fosfat tamponlu tuz (PBS) ile doldurun. 1 mL % 36 PFA çözüm 15 mL kapasiteli bir tüp aktarın. 8 mL PBS 9 mL % 4 İngiltere'de yılın stok çözeltisi almak için 1 mL % 36 PFA, ekleyin. Aliquot % 4 İngiltere'de yılın hisse senedi çözüm ve mağaza-18 ° c kadar kullanmak için hücrelerin fiksasyon.
Dikkat: 1) potasyum hidroksit aşındırıcı bir çözümdür. Göz ve deri korunması unutmayın. 2) İngiltere'de yılın kanserojen. Ciltle temas ve inhalasyon kaçının. Bir başlık altında fiksasyon çözüm hazırlayın. - Permeabilization çözüm: ekleyin 50 µL Octoxinol 9-50 mL PBS yaklaşık % 0.1 bir çözüm elde etmek için Octoxinol 9.
- Çözüm engelleme: hazırlamak % 5 ve 6'protein engelleme aracı PBS ve mağaza ile karıştırılarak çözümleri engelleme % 2 – 8 ° C.
2. Örnekleri hazırlanması
- fibroblast hücre kültüründe: insan fibroblast hücre satırının NHDF oksijen %5 yetiştirmek CO 2 atmosfer RPMI 1640 orta % 10 fetal buzağı serum, 4 mM ile desteklenmiş olarak 37 ° C'de glutamin ve % 1 penisilin/streptomisin.
- Bir mikroskop slayt hazırlanması ile yapışık fibroblastlar
- Orta NHDF fibroblastlar katlanarak büyüyen ile şişeye (75 cm 2 büyüme alanı) kaldırın. 10 mL PBS şişesi için ekleyin. Yapisan fibroblastlar hafifçe el ile 1 dk. şişeye sallayarak yıkama
- PBS kaldırın ve 1 mL tripsin balonun ekleyin. Yavaşça tüm yapışık hücreleri tripsin tarafından karşılanmaktadır sağlamak için balonun sallamak. Tripsin balonun kaldırın. 37 5 min için kuluçka şişeye koyun ° C.
- Kuluçka makinesi dışında şişesi alıp 10 mL RPMI 1640 orta balonun ekleyin. Yukarı ve aşağı fibroblastlar dağıtmak için birkaç kez orta pipette.
- Her iki alanın mikroskop slaydın üzerine dağınık fibroblastlar 0.3 mL pipet ve böylece fibroblastlar slayt için uygun kuluçka makinesi 24 h için slayt koymak. Adıma 3.1 için immunostaining γH2AX ve 53BP1 fibroblastlar çekirdekleri içinde geçin.
- Bir mikroskop slayt hazırlanması ile yapışık fibroblastlar
- Hasta numuneleri
- kan örnekleri: 2 mL antikoagülan stok çözeltisi ile doluydu koleksiyonu tüpler kullanıp 7 mL kan tüpler içine ekleyebilirsiniz. Örnekleri gecede oda sıcaklığında (Yani, 18-20 ° C) depolar. Ertesi gün, mononükleer hücreler tarafından yoğunluk gradient Santrifüjü (Adım 2.2.3) dinlenme G0/G1 evresi yalıtmak.
- Kemik iliği örnekleri: 2 mL antikoagülan stok çözeltisi (Adım 1.1) ile doluydu koleksiyonu tüpler kullanıp 7 mL kemik iliği tüpler içine ekleyebilirsiniz. Örnekleri gecede oda sıcaklığında (Yani, 18-20 ° C) depolar. Ertesi gün, mononükleer hücreler tarafından yoğunluk gradient Santrifüjü (Adım 2.2.3) dinlenme G0/G1 evresi yalıtmak. CD34 lastikteki kullanma ve ayırma sütunlar için yalıtım CD34 + hücre hücre.
- Yalıtım mononükleer hücre yoğunluğu degrade Santrifüjü tarafından
Not: Mononükleer hücreler kemik iliği örnekleri ve kan yoğunluk gradient Santrifüjü 17 , 18 , 19 tarafından izole edilmiştir.- Dilute PBS ile 1:1 oranında heparinized kan örneğinde ve oranı 1:3 PBS ile heparinized kemik iliği örneği. Hücreleri nazikçe onları iki kez girip pipet çizerek askıya alma.
- Yoğunluğu degrade orta hacmi için taze bir tüp ekleyin. Yavaşça seyreltilmiş kan veya kemik iliği üzerine yoğunluk gradient orta katman. İki kat karıştırmak için değil dikkat.
- Tüp, oda sıcaklığında 30 dakika santrifüj kapasitesi ve 400 x g. uzaklaştırmak üst plazma katmanın pipet ile. O zaman dikkatle üzerinde yoğunluk gradient orta katman mononükleer hücrelerde hasat. Mononükleer hücreler taze bir tüpün içine transfer.
- Tüp mononükleer hücrelerde en az üç PBS hacimleri ekleyin. Hücreleri nazikçe onları iki kez girip pipet çizerek askıya alma. Tüp için oda sıcaklığında ve 400 x g. 10 dk santrifüj kapasitesi
- Sonra spin süpernatant kaldırmak ve 4 ° C, 1 kırmızı hücreleri için lizis çözüm x 10 mL ekleyin. Hücreleri nazikçe onları iki kez girip pipet çizerek resuspend ve 5 min için buz tüpü yerleştirin. Daha sonra 4 ° C'de 30 mL PBS ekleyin ve 10 dakika oda sıcaklığında ve 400 x g. tüp santrifüj kapasitesi
- Cytospins hazırlanması
- (Yani, γH2AX ayirt boyama için bir cytospin ve γH2AX ve 53BP1 için bir cytospin hasta örnekleri mononükleer hücreler ile iki cytospins hazırlamak ayirt boyama kombine) tarafından Santrifüjü (300 x g, 10 dk) 1.0 x 10 5 hücreler için her hazırlık ( şekil 3 ve 4).
3. γH2AX ve 53BP1 ayirt boyama
- fiksasyon ve permeabilization: %4 200 µL ile hücreleri tamir PFA 10 dk için. Fiksasyon sonra hücreleri nazikçe üç kez PBS 30 mL bir laboratuvar shaker üzerinde her 5 min için yıkayın. Hücreleri permeabilize %0,1 200 µL ile Octoxinol 9 10 dakika süreyle yıkayın hücreleri nazikçe bir laboratuvar shaker üzerinde her 5 min için 30 mL % 5 engelleme çözeltisi ile üç kez. 30 mL taze %5 1 h. için çözüm engelleme hücrelerde blok
- Kuluçka antikorlar ile
- kuluçkaya bir fare monoklonal anti-γH2AX antikor (1:500) içeren hücrelerin bir hazırlık ve hücreleri bir fare monoklonal anti-γH2AX antikor (1:500) ile diğer hazırlanması ve bir poliklonal tavşan anti-53BP1 antikor (1:500) bir gecede, 4 ° C.
- Kuluçka yıkadıktan sonra hücreleri nazikçe bir laboratuvar shaker üzerinde her 5 min için 30 mL % 2 engelleme çözeltisi ile 3 kez.
- Engelleme çözümü kaldırmak ve bir Alexa488 Birleşik keçi Anti-fare ikincil antikor (1:500) içeren hücrelerin ilk hazırlık ve bir Alexa488 Birleşik keçi Anti-fare ikincil antikor (hücrelerle ikinci hazırlanması kuluçkaya 1:500) ve bir eşek Alexa555 Birleşik Anti-tavşan ikincil antikor (1:500) oda sıcaklığında 1 h için.
- Montaj orta: hücreleri içeren bir kaseye ve hücreleri nazikçe bir laboratuvar shaker üzerinde her 5 min için PBS 30 mL ile üç kez yıkayın. PBS kaldırmak ve montaj orta 4,6-diamidino-2-phenylindole içeren hücrelerin bağlayabilirsiniz. Böylece hiçbir hava kabarcıkları dikkatli bir coverslip montaj orta üstüne koymak gömülü. Hücreleri floresan mikroskopi tarafından analiz önce montaj orta sertliği için en az 3 saat bekleyin.
4. ΓH2AX ve 53BP1 analizi Foci
- Floresans mikroskobu: hücre çekirdeği içinde γH2AX ve 53BP1 resimde DAPI, Alexa 488 ve Cy3 için düşsel vasıl 100 X amaç sırasında filtreleri ile donatılmış bir floresan mikroskop ile analiz büyütme. Bir kamera ile görüntüleri kaydetmek ve uygun görüntüleme yazılımlarıyla görüntüleri işlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ΓH2AX foci hücrelerdeki G0/G1 evresi ve ne zaman γH2AX foci farklı floresan noktalar (5A rakam) görünür G2 faz en doğru analizidir. Buna ek olarak, γH2AX foci S aşamasında hücrelerdeki analizi (şekil 5B) çoğaltma işlemi tarafından neden dağınık pan-nükleer γH2AX speckles tarafından karmaşıktır.
Hücreleri fiksasyonu %4 ile gerçekleştirilen PFA (10 dakika) ve % 0.1 ile permeabilization Octoxinol 9 (10 dakika). Metanol fiksasyon ve permeabilization, için de kullanılabilir; Ancak, metanol hücre çekirdeği kadar oldukça ciddi kırmak ve smear γH2AX resimde γH2AX resimde %4 PFA ve % 0.1 ile tedavi elde γH2AX resimde karşılaştırıldığında farklı görünebilir bu yüzden Octoxinol 9.
Verimli antikorlar etkili ayirt mikroskopi için kritik bir seçimdir. Deneyler gerçekleştirilen bir birincil fare monoklonal anti-γH2AX antikor ve γH2AX ve 53BP1, ayirt boyama için birincil tavşan poliklonal anti-53BP1 antikor ile anılan sıraya göre.
Her γH2AX odak tek bir DSB temsil etmek için kabul edilir gibi ayirt γH2AX boyama DSB miktar radyasyonlu dokularda için kullanılabilir. Radyasyonlu lenfositler (şekil 6) γH2AX foci düzeyde ışınlama dozu20,21' e orantılıdır. ΓH2AX resimde en zaten 5 dk ışınlama20,22elde edebilir. Zamanında sonraki noktalarda γH2AX resimde çürümesi izlenebilir ve onarım DSB20,21,22yansıtır.
Genetik istikrarsızlık γH2AX ve hücre satırları ve tümör numuneler10,11,12,13,1453BP1 kombine ayirt boyama tarafından çözümlenebilir. Örnek bir analizi olan bir hastanın Akut Miyeloid Lösemi (Şekil 7) CD34 + hücrelerde gerçekleştirildi. İK engellendi süre co yerelleştirme γH2AX ve 53BP1 53BP1-aracılı NHEJ tamir mekanizmaları DSB sitelerde teşviki belirtti. Ancak, ortak belirleyici γH2AX ve patlamaların akut myeloid lösemi 53BP1 foci yüzdesi değişken oldu. ΓH2AX resimde bir ek 53BP1 sinyal olmadan DSB onarım için İK geç S/G2 aşamasında meşgul. Tekil 53BP1 foci rolünü zor kaldı.
Şekil 1: Kaynakları ve endojen ve eksojen DNA sonuçlarını1,2,3,4zarar. DSB, DNA çift iplikli kırılmalara; NHEJ, nonhomologous son-katılmadan.
Resim 2 : Şematik büyük DNA iki iplikçikli Break (DSB) tamir mekanizmaları memeli hücrelerinde. Homolog rekombinasyon kullanır sağlam bir kardeş Kromatit DSB potansiyel olarak hatasız tamiri için geç S/G2 aşamasında. Birkaç baz çifti eklendiğinde veya DSB biter ligasyonu önce rezeke nonhomologous sonu-(NHEJ) hücre döngüsü boyunca aktif ve potansiyel olarak hataya var. Alternatif sonu-NHEJ eksikliği söz konusu olduğunda nişanlı bir yavaş mutajenik yedekleme onarım mekanizması var. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Cytospins hazırlanması için aygıt. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Cytospins hazırlanması. İki cytospins her örneğinin Santrifüjü 1.0 x 300 x g 10 dk 105 hücreleri tarafından hazırlanır. Bir cytospin ayirt γH2AX boyama için kullanılır ve başka bir cytospin kombine γH2AX ve 53BP1 ayirt boyama için kullanılmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Hücre döngüsünün normal fibroblast hücre kültürünü NHDF γH2AX foci bağımlı alışkanlıkları. (A)γH2AX foci (yeşil, Alexa 488) çekirdekleri (mavi, DAPI) NHDF fibroblastlar G0/G1 veya G2 aşamasında farklı noktalardan olarak görünür. (B) γH2AX foci fibroblastlar S aşamasında çekirdekleri içinde dağınık pan-nükleer speckles görünür (ölçek çubuğu 5 mikron =). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : ΓH2AX foci x-ray içinde lenfositler sağlıklı bir bireyin ışınlanmış. ΓH2AX foci (yeşil, Alexa 488) çekirdekleri lenfositler (mavi, DAPI) görüntülerini 5 dk sonra ışınlama ile 100 mGy kaydedilir (ölçek çubuğu 5 mikron =). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 : Hücrelerdeki CD34 + olan bir hastanın akut myeloid lösemi γH2AX ve 53BP1 foci co lokalizasyonu. ΓH2AX resimde (yeşil, Alexa 488) ve 53BP1 foci (kırmızı, Cy3) Co yerelleştirme gösterir 53BP1-aracılı nonhomologous son katılma tamir mekanizmaları, DNA çift iplikli kırılmalara sitelerin tanıtımı (ölçek çubuğu 5 mikron =). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ΓH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu oluşumu ve DSB tamiri araştırma konuları geniş bir yelpazede yapılan analiz etmek için kullanışlı bir yöntemdir. Deneyler sonucu etkileyen kritik hücre döngüsünün fiksasyon ve permeabilization hücrelerinin antikor ve donanım seçimi ve floresan mikroskop bilgisayar yazılımı için kullanılan ajanlar aşamasında parametreleridir.
Hücre döngüsünün etkisi γH2AX foci örgülerine katlanarak büyüyen hücre kültürünü NHDF normal fibroblastlar tarafından sunuldu. ΓH2AX resimde G0/G1 farklı floresan nokta olarak ortaya ve dağınık pan-nükleer γH2AX speckles ile karşılaştırıldığında G2 aşamalarında S faz (şekil 5). G0/G1 içinde farklı γH2AX resimde faz ve G2 içinde tekrarlayan hücre döngüsü geçişleri sırasında edinilen belirtilen geçici ve/veya kurucu DNA hasarı aşama; tersine, dağınık speckles S aşamasında sadece geçici oluştu ve muhtemelen çoğaltma işlemi ile ilişkili bulunmuştur. Speckles rahatsız pan-nükleer γH2AX hakiki γH2AX foci, S faz hücreleri hariç analiz analizi, önerilen hangi kolayca S faz belirli γH2AX desenine göre yapılır. Alternatif olarak, hücre S aşamasında DAPI sinyal yoğunluğu ölçümü veya uygulama S faz belirli işaretleri (örneğin, Cyclin A) tarafından çıkarıldı olabilir. Ayrıca, büyüme tutuklama indüksiyon hücre eşitlemede G0/G1 evresi ile cytospins örnekleri, oda sıcaklığında (Yani, 18-20 ° C) bir gecede depolayarak hazırlamadan önce yararlı olabilir.
İmmunostaining γH2AX ve 53BP1 kritik adımlarda fiksasyon ve permeabilization işlemlerdir. Fiksasyon morfoloji ve antigenicity23hücreleri korumak gereklidir. Permeabilization hücre içi ve nükleer antijenleri24erişim sağlar. İngiltere'de yılın fiksasyon için nispeten yumuşak bir ajan ve hücrelerin temel amino asitler için formu Metilen Glossar ile tepki tarafından protein yapıları koruyarak stabilize. PFA ile fiksasyon sonra cytospins gün ve hafta daha fazla işleme kadar depolanabilir. ΓH2AX ve 53BP1 tespiti için hücreleri permeabilized zorunda. Octoxinol 9 polyoxyethylene moieties oluşan doldurulmamış hidrofilik baş gruplarını içeren bir non-iyonik deterjan kullanıldı. Octoxinol 9 hücre çekirdeği kadar nazikçe keser ve γH2AX resimde oldukça belirgin bir biçimde korur. Alternatif olarak, metanol fiksasyon ve permeabilization hücre için de kullanılabilir. Metanol proteinler precipitates ve lipidler hücre membran, onları antikorlar geçirgen hale gelen çözünür. Ancak, metanol ile tedavi muhtemelen daha agresif ve o γH2AX foci gösterilmeyebilir olarak belirgin zaman tedavi %4 PFA ve % 0.1 ile elde edilen γH2AX resimde göre Octoxinol 9. Rağmen verimli antikorlar immunostaining γH2AX ve 53BP1 için önemli bir rol oynar. Bu nedenle, kanıtlanmış antikorlar kullanılması tavsiye edilir (bkz. Tablo malzemeleri/ekipman). Bir seri seyreltme antikorların en uygun antikor konsantrasyonu tayini için yararlı olabilir.
ΓH2AX resimde bulunan düşük dozda radyasyon biodosimetry bir işareti olarak kullanılır > 1 mGy25. ΓH2AX foci lenfositler 5 dk içinde sonra x-ray ışınlama doz 100 mGy vitro (şekil 6) ile analiz edildi. Işınlama sonra H2AX hızla DSB sitelerinde fosforile gibi γH2AX foci sayısı zaten en fazla 5 dk sonra ışınlama20,22adresinden ulaşabilirsiniz. Ancak, onarım işlemi anında ışınlama sonra başlar ve γH2AX foci bir ayrı çürüme oranda kaldırılır. Bu nedenle, γH2AX foci kronolojik bir sıra sayısını izlemek için örnek belirtilen noktada buzda süre sonra ışınlama koyarak onarım işlemini kesmek için tavsiye edilir.
Ayirt mikroskobu, γH2AX ve 53BP1 kanser hücrelerinin genetik istikrarsızlık analiz etmek için kullanışlı bir yöntemdir. CD34 + hücre hastanın kemik iliği CD34 lastikteki kullanarak akut myeloid lösemi ile zenginleştirilmiş. ΓH2AX foci ve 53BP1 foci görüntülerini belirli Floresans filtreleri kullanarak elde edilmiştir. Cytospin parlak bir ışık γH2AX ve 53BP1 resimde yeterli Floresans ikna etmek önemlidir. Görüntüyü kaydettikten sonra resimde ve arka plan sinyalin yoğunluğunu adaptasyon görüntüleme yazılımı kullanarak gereklidir. ΓH2AX ve 53BP1 foci co lokalizasyonu analiz etmek için görüntüleri birleştirilir (Şekil 7). DAPI, Alexa 488 ve Cy3 için bir kamera sistemi ile birlikte filtre ile donatılmış ve görüntüleme yazılımı temel epifluorescence mikroskop γH2AX analiz için yeterli ve hücre çekirdeği 53BP1 foci DAPI içinde lekeli. Ancak, bazı uygulamalar (örneğin, tek parçacık parça boyunca DNA hasar analizi) daha yüksek çözünürlük ve arka plan Floresans azalma (örneğin, confocal lazer mikroskobu tarama tarafından sağlanan gibi) kullanmanız gerekebilir. Ayrıca, mikroskop hızla gelişen bir alan ve bir çözünürlük 200 teknolojidir nm state-of--art mikroskoplar ile uygulanabilir.
Özet olarak, bu el yazması DSB oluşumu ve onarım kritik konuları vurgular ve DSB ayrıntılı bir analiz ayirt mikroskobu, γH2AX ve 53BP1 tarafından için adım adım bir protokol sağlar. DSB üzerinde araştırma mikroskobu teknoloji son ve gelecekteki gelişmeler açıkça yararlanacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Proje Alman Jose Carreras lösemi Vakfı (DJCLS 14 R/2017) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
| Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
| Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
| Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
| Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
| Cytospin device | |||
| Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
| Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
| Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
| Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
| Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
| Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
| Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-31572 | Secondary antibody |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
| Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
| Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |
References
- Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Zeman, M. K., Cimprich, K. A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).
- IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf (1994).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).
- Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70. Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Scully, R., Xie, A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).
- Walters, D. K., et al. Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX. Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).
- Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).
- Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence. Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).
- Chen, E., et al. JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).
- Popp, H. D., et al. Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Leuk Res. 57, 112-118 (2017).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).
- Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Boyum, A. Separation of White Blood Cells. Nature. 204, 793-794 (1964).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
- Bain, B., Pshyk, K. Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).
- Popp, H. D., et al. Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology. Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).
- Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
- Lobrich, M., et al. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
- Rothkamm, K., Lobrich, M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).
