Summary
Ce manuscrit fournit un protocole pour l’analyse des cassures double brin de l’ADN par la microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1.
Abstract
Cassures double brin de l’ADN (DSB) sont de graves lésions de l’ADN. Analyse de la formation et la réparation d’ORD est pertinente dans un large éventail de domaines de recherche, y compris l’intégrité du génome, génotoxicité, radiobiologie, vieillissement, le cancer et le développement de médicaments. En réponse à l’ORD, l’histone H2AX est phosphorylé à sérine 139 dans une région de plusieurs paires de megabase formant discrètes foyers nucléaires détectables par microscopie d’immunofluorescence. En outre, 53BP1 (p53 GRB2 1) est une autre protéine favorisant l’ORD importante favorisant la réparation de l’ORD par fin-joining non-homologues tout en empêchant la recombinaison homologue. Selon les fonctions spécifiques de γH2AX et 53BP1, l’analyse combinée de γH2AX et 53BP1 par la microscopie en immunofluorescence peut être une approche raisonnable pour une analyse détaillée de l’ORD. Ce manuscrit fournit un protocole étape par étape complété par des notes méthodiques pour effectuer la technique. Plus précisément, l’influence du cycle cellulaire sur les habitudes des foyers γH2AX est démontrée dans les fibroblastes normaux de la lignée cellulaire NHDF. En outre, la valeur des foyers γH2AX comme biomarqueur est représentée dans les lymphocytes de radiographie irradié d’un individu sain. Enfin, instabilité génétique est étudiée dans les cellules CD34 + d’un patient souffrant de leucémie myéloïde aiguë par microscopie d’immunofluorescence de γH2AX et 53BP1.
Introduction
ADN est endommagé en permanence par endogène (par exemple, la réplication stress, espèces réactives de l’oxygène, l’instabilité intrinsèque de l’ADN) et exogènes (par exemple, des radicaux chimiques, irradiation) sources (Figure 1)1,2 ,3,4. Parmi les lésions de l’ADN, cassures double brin de l’ADN (DSB) sont particulièrement graves lésions et peuvent induire la mort cellulaire ou la carcinogenèse. Environ 50 ORD peut-être survenir par cellule et cycle cellulaire5. Dans les cellules de mammifères, la recombinaison (HR) et non-homologues fin-rejoindre (NHEJ) mis au point comme principales voies pour la réparation d’ORD (Figure 2). HR se produit à la fin de la phase S/G2 et utilise une sœur intacte chromatid comme gabarit pour réparation potentiellement exempt d’erreurs. En comparaison, NHEJ est active tout au long du cycle cellulaire et potentiellement mutagènes comme paires de bases peuvent être ajoutés ou réséqués avant la ligature de l’extrémité cassée. En outre, la fin alternative-rejoindre peut être engagé comme un mécanisme lent mutagènes réparation de secours en cas de carence NHEJ6,7.
DSB induit la phosphorylation de l’histone H2AX à sérine 139 dans une région de plusieurs paires de megabase autour de chaque ORD. Les foyers nucléaires formant sont nommées γH2AX foyers et sont détectés par immunofluorescence microscopie8. ΓH2AX favorise le recrutement des autres protéines sensibles à la DSB et participe au remodelage de la chromatine, la réparation de l’ADN et de transduction de signal9. Comme chaque accent γH2AX est considéré comme un simple ORD, la quantification de l’ORD par microscopie d’immunofluorescence est possible, ce qui a été démontrée dans les lignées de cellules cancéreuses et les échantillons de patient10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 GRB2 1) est une autre protéine clé dans la médiation réparation ORD. Il est impliqué dans le recrutement de DSB-souples protéines, signalisation de point de contrôle et la synapse de DSB se termine15. En outre, 53BP1 joue un rôle essentiel dans le choix de voie de réparation ORD. Il déclenche la réparation d’ORD vers NHEJ, tandis que les RH sont empêchés16. Si l'on considère les véritables fonctions de γH2AX et 53BP1 dans la réparation de l’ORD, l’analyse simultanée de γH2AX et 53BP1 par la microscopie en immunofluorescence peut être une méthode utile pour l’analyse précise de la formation et la réparation de l’ORD.
Ce manuscrit fournit un protocole étape par étape pour l’exécution de la microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 dans les noyaux des cellules. Plus précisément, la technique est appliquée dans les fibroblastes normaux de la lignée cellulaire NHDF, dans les lymphocytes de radiographie irradié d’une personne en bonne santé et dans les cellules CD34 + d’un patient souffrant de leucémie myéloïde aiguë. Les détails de la méthode sont soulignées dans le contexte des résultats présentés.
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Protocol
toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité d’éthique II de Mannheim faculté médicale de l’Université de Heidelberg. Écrit le consentement éclairé a été obtenu de tous les individus.
1. préparation des matériaux
- solution d’Anticoagulant : préparer une solution anticoagulante de 200 UI héparine par millilitre dans le chlorure de sodium 0,9 %. Remplir chacun des tubes de collection (dessiner volume 9 mL) avec 2 mL de la solution anticoagulante avant retrait des échantillons de sang ou de moelle osseuse.
- Solution de lyse des globules rouges : Prepare le 10 x solution de lyse des globules rouges avec 82,91 g de chlorure d’ammonium, bicarbonate d’ammonium 7,91 g et 2 mL de solution d’acide éthylènediaminetétraacétique 0,5 M à un pH de 8,0 en dissolvant les agents de eau bidistillée pour un volume total de 1 L.
- Solution de fixation : 8.3 Ajouter µL d’une solution 1 M d’hydroxyde de potassium paraformaldéhyde 360 mg (PFA) dans un tube de microplaques. Remplir le tube avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS) jusqu'à la marque de 1 mL du tube et le tube dans un bloc chauffant à 95 ° C pour obtenir 1 mL d’une solution PFA de 36 % de chaleur. Transférer la solution PFA de 36 % de 1 mL dans un tube avec une capacité de 15 mL. Ajoutez 8 mL de PBS à la solution 1 mL des PFA 36 %, pour obtenir 9 mL d’une solution mère de PFA de 4 %. Aliquote de la solution-mère 4 % PFA et conserver à-18 ° C jusqu’au utilisent pour la fixation des cellules.
ATTENTION : la solution d’hydroxyde de Potassium 1) est corrosive. Soyez conscient de protection oculaires et cutanées. 2) PFA est cancérigène. Éviter le contact avec la peau et inhalation. Préparer la solution de fixation sous une hotte à. - Solution perméabilisation : ajouter 50 µL Octoxinol 9 à 50 mL PBS pour obtenir une solution d’environ 0,1 % Octoxinol 9.
- Solution de blocage : préparer 5 % et 2 % des solutions de blocage en mélangeant l’agent bloquant de protéine avec PBS et magasin à 6 – 8 ° C.
2. Préparation des échantillons,
- fibroblastes en culture cellulaire : cultiver des fibroblastes humains de la lignée cellulaire NHDF dans un humidifié 5 % CO 2 atmosphère à 37 ° C dans un milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de sérum de veau foetal, 4 mM glutamine et 1 % la pénicilline/streptomycine.
- Préparation d’une lame de microscope avec adherent fibroblastes
- enlever le support du flacon (zone de croissance de 2 75 cm) avec en croissance exponentielle des fibroblastes NHDF. Ajouter 10 mL de PBS dans le ballon. Lavez les fibroblastes adhérents doucement en agitant manuellement pendant 1 min.
- Supprimer le PBS et ajouter la trypsine 1 mL dans le flacon. Agiter le flacon doucement pour s’assurer que toutes les cellules adhérentes sont couverts par la trypsine. Enlever le ballon de la trypsine. Placer la fiole dans l’incubateur pendant 5 min à 37 ° C.
- Prendre le ballon hors de l’incubateur et ajouter 10 mL de milieu RPMI 1640 médium dans le ballon. Déposer le support de haut en bas plusieurs fois pour disperser les fibroblastes.
- 0,3 mL des fibroblastes dispersés sur chacun des deux champs de la lame de microscope, déposer et mettre la lame dans l’incubateur pendant 24 h pour que les fibroblastes adhèrent à la diapositive. Pour immunostaining des γH2AX et 53BP1 dans les noyaux des fibroblastes, passez à étape 3.1.
- Préparation d’une lame de microscope avec adherent fibroblastes
- Des échantillons de patients
- des échantillons de sang : utilisez les tubes de prélèvement qui ont été remplis avec 2 mL de la solution anticoagulante et ajoutez 7 mL de sang dans les tubes. Stocker les échantillons pendant une nuit à température ambiante (c.-à-d., 18-20 ° C). Le lendemain, isoler la phase G0/G1 au repos des cellules mononucléaires par centrifugation en gradient de densité (étape 2.2.3).
- Des échantillons de moelle osseuse : utilisez les tubes de prélèvement qui ont été remplis avec 2 mL de la solution anticoagulante stock (point 1.1) et ajouter la moelle osseuse 7 mL dans les tubes. Stocker les échantillons pendant une nuit à température ambiante (c.-à-d., 18-20 ° C). Le lendemain, isoler la phase G0/G1 au repos des cellules mononucléaires par centrifugation en gradient de densité (étape 2.2.3). Utilisez CD34 microbilles et cellules de colonnes de séparation pour isoler des cellules CD34 +.
- Isolation des cellules mononucléaires par centrifugation en gradient de densité
Remarque : Les cellules mononucléaires sont isolées du sang et des échantillons de moelle osseuse par centrifugation en gradient de densité 17 , 18 , 19.- Diluer l’échantillon de sang hépariné dans un rapport de 1:1 avec du PBS et l’échantillon de moelle épinière hépariné dans un ratio de 1:3 avec du PBS. Suspendre les cellules doucement en les dessinant deux fois dans et hors de la pipette.
- Ajouter un volume de milieu de gradient de densité à un nouveau tube. La couche doucement le sang dilué ou la moelle osseuse sur le dessus du milieu de gradient de densité. Prendre soin de ne pas pour mélanger les deux couches.
- Centrifuger le tube pendant 30 min à température ambiante et 400 x g. Retirer la couche de plasma supérieur avec la pipette. Ensuite soigneusement récolter les cellules mononucléées dans la couche au-dessus du milieu de gradient de densité. Transférer les cellules mononucléaires dans un nouveau tube.
- Ajouter au moins trois volumes de PBS aux cellules mononucléaires dans le tube. Suspendre les cellules doucement en dessinant dans et hors de la pipette deux fois. Centrifuger le tube pendant 10 min à température ambiante et 400 x g.
- Le spin, éliminer le surnageant et ajouter 10 mL de 4 ° C, 1 x solution de lyse des globules rouges. Remettre en suspension les cellules doucement en dessinant dans et hors de la pipette deux fois et placer le tube sur la glace pendant 5 min. Ajouter 30 mL de PBS à 4 ° C, puis centrifuger le tube pendant 10 min à température ambiante et 400 x g.
- Préparation de le cytospins
- préparer deux cytospins avec des cellules mononucléaires des patients échantillons (c'est-à-dire, un cytospin pour γH2AX immunofluorescence souillant et un cytospin pour γH2AX et 53BP1 combiné d’immunofluorescence souillant) par centrifugation (300 x g, 10 min) de 1,0 x 10 5 cellules, pour chaque préparation ( figures 3 et 4).
3. γH2AX et 53BP1 Immunofluorescence souillant
- Fixation et permeabilization : fixer les cellules avec 200 µL de 4 % PFA pendant 10 min. Après fixation, laver les cellules doucement trois fois avec 30 mL de PBS de 5 min chacun sur un agitateur de laboratoire. Puis permeabilize les cellules avec 200 µL de 0,1 % 9 Octoxinol pour 10 min. laver les cellules doucement trois fois avec 30 mL de solution de blocage de 5 % de 5 min chacun sur un agitateur de laboratoire. Bloquer les cellules dans 30 mL de frais 5 % bloquant la solution pendant 1 h.
- L' incubation avec l’anticorps incuber une préparation des cellules avec un anticorps monoclonal anti-γH2AX de souris (1/500) et l’autre préparation des cellules avec un anticorps monoclonal anti-γH2AX de souris (1/500) et un anticorps anti-53BP1 d’anticorps polyclonal de lapin (1/500) pendant une nuit à 4 ° C.
- Après incubation des cellules lave doucement 3 fois avec 30 mL de solution de saturation de 2 % pour chaque 5 min sur un agitateur lab.
- Enlever la solution de blocage et incuber la première préparation de cellules avec un anticorps secondaire de conjugué Alexa488 chèvre anti-souris (1/500) et la deuxième préparation des cellules avec un conjugué Alexa488 chèvre anti-souris anticorps secondaire ( 1/500) et d’un âne Alexa555 conjugué anti-lapin anticorps secondaire (1/500) pendant 1 h à température ambiante.
- Milieu de montage : mettre la lame avec les cellules dans un bol et laver les cellules doucement trois fois avec 30 mL de PBS pour chaque 5 min sur un agitateur de laboratoire. Retirez le PBS et montez les cellules avec support de montage contenant 4, 6-diamidino-2-phénylindole. Mettre prudemment un lamelle couvre-objet sur le dessus du milieu de montage, afin qu’aucune bulle d’air ne sont Embedded. Attendre au moins 3 h pour la trempe du milieu de montage avant d’analyser les cellules en microscopie par fluorescence.
4. Analyse des γH2AX et 53BP1 foyers
- la microscopie de Fluorescence : analyser les foyers de γH2AX et 53BP1 dans le noyau de la cellule avec un microscope à fluorescence équipé de filtres pour DAPI, Alexa 488 et Cy3 pendant la formation image à un objectif X 100 grossissement. Enregistrer des images avec un appareil photo et de traiter les images avec des logiciels d’imagerie appropriées.
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Representative Results
Analyse des foyers de γH2AX dans les cellules est plus précis dans la phase G0/G1 et la phase G2 quand γH2AX foyers apparaissent comme des points distincts de fluorescence (Figure 5 a). En revanche, analyse des foyers de γH2AX dans les cellules en phase S est compliquée par taches dispersées γH2AX pan-nucléaire causées par le processus de réplication (Figure 5 b).
Fixation des cellules a été réalisée avec 4 % PFA (10 min) et perméabilisation avec 0,1 % Octoxinol 9 (10 min). Méthanol peut être utilisé pour la fixation et la perméabilisation, aussi ; Cependant, le méthanol peut briser les noyaux des cellules très sévèrement et frottis sur les foyers de γH2AX donc la γH2AX de foyers peuvent ne pas apparaître distincts par rapport à des foyers de γH2AX obtenus par traitement avec 4 % PFA et 0,1 % Octoxinol 9.
Le choix des anticorps efficaces est essentiel pour la microscopie en immunofluorescence efficace. Des expériences ont été réalisées avec un anticorps monoclonal anti-γH2AX de souris primaire et un anticorps polyclonal anti-53BP1 primaire lapin immunofluorescence souillant de γH2AX et 53BP1, respectivement.
Comme chaque accent γH2AX est considéré comme un simple ORD, immunofluorescence souillant de γH2AX peut être utilisé pour la quantification de l’ORD dans les tissus irradiés. Niveaux de γH2AX foyers dans les lymphocytes irradiés (Figure 6) sont proportionnels à l’irradiation dose20,21. ΓH2AX foyers peuvent atteindre un maximum déjà 5 min d’irradiation20,22. La désintégration des foyers γH2AX à points plus tard dans le temps peut être surveillée et reflète la réparation du DSB20,21,22.
Instabilité génétique peut être analysée par immunofluorescence combiné coloration de γH2AX et 53BP1 dans les lignées de cellules et de tumeur spécimens10,11,12,13,14. Une analyse exemplaire a été réalisée dans les cellules CD34 + d’un patient souffrant de leucémie myéloïde aiguë (Figure 7). Co-localisation de γH2AX et 53BP1 indiqué promotion de 53BP1 par l’intermédiaire des mécanismes de réparation NHEJ aux sites d’ORD alors que HR a été empêchée. Toutefois, le pourcentage de γH2AX co localisation et des foyers de 53BP1 dans les explosions de la leucémie myéloïde aiguë était variable. Les foyers de γH2AX sans un signal supplémentaire 53BP1 pourraient ont engagé HR pour la réparation d’ORD S/G2 la dernière étape. Le rôle des foyers 53BP1 singulière restait insaisissable.
Figure 1 : Sources et conséquences de l’ADN endogène et exogène endommagent1,2,3,4. ORD, des cassures double brin de l’ADN ; NHEJ, non-homologues fin-rejoindre.
Figure 2 : Vue schématique de la rupture majeure du double brin ADN (DSB) réparation de mécanismes dans les cellules de mammifères. La recombinaison homologue utilise une sœur intacte chromatides S/G2 la dernière étape pour réparation potentiellement exempts d’ORD. Non-homologues fin-rejoindre (NHEJ) est active tout au long du cycle cellulaire et potentiellement sujettes à erreur que quelques paires de bases peuvent être ajoutées ou réséqués avant la ligature de l’extrémité de l’ORD. Fin alternative-joining est un mécanisme lent mutagènes réparation de secours qui pourrait être engagé en cas d’insuffisance NHEJ. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Appareil pour la préparation de la cytospins. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Préparation de la cytospins. Deux cytospins de chaque échantillon sont préparés par centrifugation de 1,0 x 105 cellules à 300 g pendant 10 min. Un cytospin est utilisé pour γH2AX immunofluorescence souillant et un autre cytospin est utilisée pour γH2AX combiné et 53BP1 immunofluorescence souillant. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Cycle cellulaire les modes dépendants de γH2AX foyers dans les fibroblastes normaux de la lignée cellulaire NHDF. (A) γH2AX foyers (vert, Alexa 488) dans les noyaux (DAPI bleu) des fibroblastes NHDF apparaissent comme des points distincts en phase G0/G1 ou G2. (B) γH2AX foyers dans les noyaux des fibroblastes en phase S apparaissent sous forme de mouchetures pan-nucléaires dispersées (barre d’échelle = 5 µm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : ΓH2AX foyers dans x-ray irradié lymphocytes d’un individu sain. Les images de γH2AX (vert, Alexa 488) au niveau des noyaux (DAPI bleu) des lymphocytes sont enregistrées à 5 min après irradiation avec 100 mGy (barre d’échelle = 5 µm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Co-localisation des foyers de γH2AX et 53BP1 en cellules CD34 + d’un patient souffrant de leucémie myéloïde aiguë. Co-localisation des foyers γH2AX (vert, Alexa 488) et 53BP1 foyers (rouge, Cy3) indique la promotion des 53BP1-mediated non-homologues fin-joining mécanismes de réparation sur les sites de cassures double brin de l’ADN (section Echelle = 5 µm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 est une méthode utile pour analyser la formation et la réparation de l’ORD dans un large éventail de domaines de recherche. Les paramètres essentiels qui influencent les résultats des expériences sont la phase du cycle cellulaire, les agents utilisés pour la fixation et la perméabilisation des cellules, le choix de l’anticorps et le matériel et les logiciels de la microscopie à fluorescence.
L’influence du cycle cellulaire sur les habitudes des foyers γH2AX a été démontrée par la croissance exponentielle des fibroblastes normaux de la lignée cellulaire NHDF. Les foyers de γH2AX est apparu comme des points distincts fluorescents dans le G0/G1 et phases G2 par rapport aux mouchetures γH2AX pan-nucléaires dispersées dans la phase S (Figure 5). Les foyers de γH2AX distincts dans le G0/G1 phase et phase G2 indiqué transitoire et/ou constitutif dommages à l’ADN qui pourraient avoir été acquis au cours de passages répétitifs cycle cellulaire ; à l’inverse, les taches dispersées en phase S s’est produite seulement transitoirement et étaient vraisemblablement associés au processus de réplication. Comme le pan-nucléaire γH2AX mouchetures peuvent perturber l’analyse des véritables γH2AX foyers, l’exclusion des cellules en phase S de l’analyse est recommandé, qui est facilement fait par le patron de γH2AX spécifiques de phase S. Par ailleurs, les cellules en phase S peuvent être exclus par la mesure de l’intensité du signal DAPI ou par application de S phase des marqueurs spécifiques (p. ex., cycline A). De plus, l’induction de l’arrêt de la croissance avec synchronisation des cellules en phase G0/G1 peut être utile avant de préparer le cytospins en stockant les échantillons à la température ambiante (c.-à-d., 18-20 ° C) pendant la nuit.
Les modalités de fixation et permeabilization sont des étapes cruciales dans immunostaining des γH2AX et 53BP1. La fixation est nécessaire pour respecter la morphologie et l’antigénicité des cellules23. Perméabilisation permet d’accéder aux antigènes intracellulaires et nucléaire24. PFA est un produit relativement doux pour la fixation et stabilise les cellules tout en préservant les structures des protéines par réaction avec des acides aminés basiques à forme méthylène crosslinks. Après fixation avec IFP, cytospins peuvent être stockés pendant des jours et des semaines jusqu'à ce que la poursuite de la procédure. Pour la détection de γH2AX et 53BP1, les cellules doivent être perméabilisées. Octoxinol 9 a été utilisé comme un détergent non ionique contenant des groupes de tête hydrophiles sans inculpation, comprenant des portions de polyoxyéthylène. Octoxinol 9 rompt doucement les noyaux cellulaires et préserve γH2AX foyers assez distinctement. Par ailleurs, méthanol peut être utilisé pour la fixation et la perméabilisation des cellules, trop. Méthanol précipite protéines et dissout les lipides de la membrane cellulaire, ce qui les rend plus perméables aux anticorps. Toutefois, le traitement avec du méthanol est sans doute plus agressif et γH2AX foyers peuvent ne pas apparaître comme nettement par rapport à des foyers de γH2AX obtenus par traitement avec 4 % PFA et 0,1 % Octoxinol 9. Nonobstant, les anticorps efficaces jouent un rôle clé pour l’immunomarquage de γH2AX et 53BP1. Par conséquent, il est recommandé d’utiliser des anticorps éprouvées (voir Table des matières et équipements). Une dilution en série des anticorps peut être utile pour la détermination de la concentration d’anticorps optimale.
ΓH2AX foyers sont utilisés comme un marqueur de biodosimétrie des rayonnements à faibles doses > 1 mGy25. ΓH2AX foyers ont été analysés dans les lymphocytes à 5 min après irradiation aux rayons x avec une dose de 100 mGy in vitro (Figure 6). Comme H2AX est phosphorylé rapidement aux sites d’ORD après l’irradiation, le nombre de foyers γH2AX peut déjà atteindre un maximum après 5 min après irradiation20,22. Toutefois, le processus de réparation démarre immédiatement après l’irradiation et γH2AX foyers sont retirés à un taux de désintégration distinctes. Par conséquent, pour surveiller le nombre de foyers de γH2AX dans un ordre chronologique, il est conseillé d’interrompre le processus de réparation en mettant l’échantillon sur la glace au point spécifié dans le temps après l’irradiation.
La microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 est une méthode utile pour analyser une instabilité génétique dans les cellules cancéreuses. Cellules CD34 + ont été enrichis de la moelle osseuse d’un patient souffrant de leucémie myéloïde aiguë, à l’aide de microbilles CD34. Images des foyers de γH2AX et 53BP1 foyers ont été obtenues à l’aide de filtres de fluorescence spécifique. Un éclairage le cytospin est important pour induire une fluorescence adéquate des foyers γH2AX et 53BP1. Après l’enregistrement de l’image, adaptation de l’intensité de la réaction de foyers et le signal de fond est nécessaire en utilisant le logiciel d’imagerie. Pour analyser la co-localisation des foyers γH2AX et 53BP1, les images sont fusionnées (Figure 7). Un microscope à épifluorescence base équipée de filtres pour DAPI, Alexa 488 et Cy3 en combinaison avec un système de caméras et de logiciels d’imagerie est suffisant pour l’analyse de γH2AX et 53BP1 foyers au DAPI colorées des noyaux cellulaires. Toutefois, certaines applications (p. ex., analyse des lésions de l’ADN le long des pistes de la particule) peuvent exiger résolution plus élevée et la réduction de la fluorescence de fond (comme par exemple, par laser confocal, microscopie à balayage). En outre, la technologie de microscope est un champ connaissent un développement rapide et une résolution inférieure à 200 nm est réalisable avec des microscopes state-of-the-art.
En résumé, ce manuscrit met en évidence les questions cruciales de la formation de l’ORD et réparation et fournit un protocole étape par étape pour une analyse détaillée de l’ORD par microscopie d’immunofluorescence de γH2AX et 53BP1. La recherche sur l’ORD bénéficieront clairement des développements récents et à venir dans la technologie de microscope.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Le projet a été soutenu par la Fondation allemande José Carreras leucémie (DJCLS 14 R/2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
| Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
| Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
| Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
| Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
| Cytospin device | |||
| Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
| Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
| Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
| Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
| Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
| Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
| Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-31572 | Secondary antibody |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
| Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
| Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |
References
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