Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1 لتحليل تكوين وإصلاح الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل

Published: November 3, 2017 doi: 10.3791/56617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Hematology and Oncology, Medical Faculty Mannheim of the Heidelberg University

Summary

هذه المخطوطة يوفر بروتوكول لتحليل الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1.

Abstract

فواصل مزدوجة-حبلا الحمض النووي (جهاز تسوية المنازعات) خطيرة الحمض النووي آفات. تحليل لتشكيل وإصلاح جهاز تسوية المنازعات ذات الصلة بطائفة واسعة من مجالات البحوث بما في ذلك سلامة الجينوم وسمية جينية وبيولوجيا الإشعاع، والشيخوخة، والسرطان وتطوير العقاقير. ردا على جهاز تسوية المنازعات، هو فوسفوريلاتيد هيستون H2AX 139 سيرين في منطقة من مناطق عدة أزواج ميجاباسي تشكيل بؤر النووية منفصلة يمكن كشفها بالفحص المجهري الفلورة. وبالإضافة إلى ذلك، 53BP1 (البروتين p53 1) آخر بروتين المراعية لجهاز تسوية المنازعات الهامة تعزيز إصلاح جهاز تسوية المنازعات قبل نونهومولوجوس الانضمام إلى نهاية بينما تمنع جزئ مثلى. وفقا للمهام المحددة في γH2AX و 53BP1، قد يكون الجمع بين تحليل γH2AX و 53BP1 بالفحص المجهري الفلورة نهجاً معقولاً لإجراء تحليل مفصل لجهاز تسوية المنازعات. وتوفر هذه المخطوطة بروتوكول خطوة بخطوة وتستكمل مع ملاحظات منهجية لأداء التقنية. على وجه التحديد، يتضح تأثير دورة الخلية في أنماط البؤر γH2AX الليفية العادي الخط الخلية نهدف. علاوة على ذلك، يبين قيمة البؤر γH2AX كالعلامات البيولوجية لمفاوية المشع بالأشعة السينية لشخص سليم. وأخيراً، عدم الاستقرار الوراثي هو التحقيق في CD34 + خلايا المريض بسرطان الدم النقوي الحاد مجهرية الفلورة γH2AX و 53BP1.

Introduction

تلف الحمض النووي بشكل مستمر بالذاتية (مثلاً، الإجهاد النسخ المتماثل، الأنواع الأكسجين التفاعلية، وعدم استقرار جوهري للحمض النووي) وخارجية (مثلاً، الجذور الكيميائية، والتشعيع) مصادر (الشكل 1)1،2 ،،من34. بين الأضرار الحمض النووي، والحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل (جهاز تسوية المنازعات) آفات خطيرة بصفة خاصة وقد تؤدي إلى موت الخلايا أو التسرطن. وقد تنشأ حوالي 50 جهاز تسوية المنازعات كل خلية ودورة الخلية5. في خلايا الثدييات، وضع جزئ المتجانسة (الموارد البشرية) ونونهومولوجوس نهاية-الالتحاق بالعمل (نج) كمسارات رئيسية لإصلاح جهاز تسوية المنازعات (الشكل 2). الموارد البشرية يحدث في أواخر المرحلة S/G2 ويستخدم أخت سليمة تشروماتيد كقالب لإصلاح يحتمل أن تكون خالية من الأخطاء. وبالمقارنة، نج نشطة في جميع أنحاء دورة الخلية، ويحتمل أن تكون مطفرة كما يمكن إضافة زوج قاعدي أو مستأصل قبل ربط نهايات مكسورة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تمارس من الانضمام إلى نهاية بديلة كآلية بطيئة مطفرة إصلاح احتياطية في حالة عوز نهيج6،7.

حمل جهاز تسوية المنازعات الفسفرة هيستون H2AX 139 سيرين في منطقة من مناطق عدة أزواج مجباس حول كل جهاز تسوية المنازعات. البؤر النووية تشكل تسمى البؤر γH2AX ويمكن كشفها ب الفحص المجهري الفلورة8. ΓH2AX تشجع توظيف المزيد من البروتينات المراعية لجهاز تسوية المنازعات، وهو يشارك في الكروماتين يعيد البناء وإصلاح الحمض النووي، والإشارات تنبيغ9. كما يعتبر كل بؤرة γH2AX لتمثيل هيئة تسوية المنازعات واحد، التحديد الكمي لجهاز تسوية المنازعات مجهر الفلورة من الممكن، الذي أثبت في خطوط خلايا السرطان وعينات المرضى10،11، 12 , 13 , 14-53BP1 (البروتين p53 1) بروتين رئيسي آخر في التوسط لإصلاح جهاز تسوية المنازعات. أنها تشارك في تجنيد المراعية لجهاز تسوية المنازعات البروتينات، مما يشير إلى نقطة تفتيش، وتشابك جهاز تسوية المنازعات تنتهي15. وبالإضافة إلى ذلك، 53BP1 يلعب دوراً حاسما في اختيار مسار إصلاح جهاز تسوية المنازعات. فإنه بتشغيل إصلاح جهاز تسوية المنازعات نحو نج بينما منعت16ساعة. قد يكون التحليل المتزامن ل γH2AX و 53BP1 بالفحص المجهري الفلورة نظراً لمهام حقيقية γH2AX و 53BP1 في إصلاح جهاز تسوية المنازعات، وسيلة مفيدة لتحليل دقيق لتشكيل وإصلاح جهاز تسوية المنازعات.

هذه المخطوطة يوفر بروتوكول خطوة بخطوة لإجراء الفحص المجهري الفلورة γH2AX و 53BP1 في نواة الخلية. على وجه التحديد، يتم تطبيق التقنية في الخلايا الليفية العادي الخط الخلية نهدف، في الأشعة السينية المشع لمفاوية فرد صحية وفي CD34 + خلايا المريض بسرطان الدم النقوي الحاد. تفاصيل الأسلوب هي أشارت في سياق النتائج المعروضة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا من "الثاني لجنة الأخلاقيات" في "مانهايم كلية الطب" في جامعة هايدلبرغ. كتب تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع الأفراد-

1. "إعداد مواد"

  1. حل الأسهم تخثر الدم: تعد حلاً أسهم التخثر 200 وحدة دولية الهيبارين كل مل في كلوريد الصوديوم 0.9%. ملء كل من أنابيب جمع (رسم حجم مل 9) مع 2 مل الحل الأسهم التخثر قبل سحب عينات الدم أو نخاع العظم.
  2. حل تحلل للخلايا الحمراء: تحضير 10 × حل تحلل للخلايا الحمراء مع ز 82.91 كلوريد الأمونيوم وبيكربونات الأمونيوم 7.91 ز 2 مل من 0.5 م الإيثيلين حل حمض pH 8.0 بتذويب الوكلاء في الماء المقطر مزدوجة لإجمالي حجم 1 ل.
  3. حل التثبيت: ميليلتر 8.3 إضافة حل هيدروكسيد البوتاسيوم 1 متر إلى 360 ملغ بارافورمالدهيد (PFA) في أنبوب ميكروتيتير. ملء الأنبوب مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) للعلامة 1 مل من الأنبوب والحرارة الأنبوب في كتلة تدفئة في 95 درجة مئوية للحصول على 1 مل حل منهاج العمل 36%. نقل الحل منهاج العمل 36% 1 مل إلى أنبوب بسعة 15 مل. إضافة 8 مل برنامج تلفزيوني في حل منهاج العمل 36% 1 مل، للحصول على 9 مل حل الأسهم منهاج العمل 4%. قاسمة 4% PFA الحل المخزون والمخزن عند-18 درجة مئوية حتى تستخدم لتثبيت الخلايا.
    تنبيه: 1) هيدروكسيد البوتاسيوم والحل التآكل. كن على علم من حماية العين والجلد. 2) منهاج عمل بيجين المسببة للسرطان. تجنب تماس الجلد والاستنشاق. إعداد الحل التثبيت تحت غطاء محرك السيارة-
  4. الحل بيرميبيليزيشن: إضافة 50 ميليلتر أوكتوكسينول 9 إلى 50 مل برنامج تلفزيوني الحصول على حل حوالي 0.1% 9 أوكتوكسينول-
  5. عرقلة الحل: إعداد 5% و % 2 عرقلة الحلول بخلط البروتين عامل حجب مع برنامج تلفزيوني ومخزن في 6 – 8 ° C.

2. إعداد العينات

  1. الليفية في ثقافة الخلية: زراعة الخلايا الليفية البشرية خط الخلية نهدف في هوميديفيد 5% CO 2 الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية في المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 10% مصل العجل الجنين، 4 مم الجلوتامين، و 1% البنسلين/ستربتوميسين. إزالة الليفية
    1. إعداد شريحة مجهر مع تمسكا
      1. المتوسطة من قارورة (منطقة النمو 2 75 سم) مع تزايد الليفية نهدف أضعافاً مضاعفة. إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني قارورة. أغسل الليفية ملتصقة بلطف بالهز يدوياً قارورة للحد الأدنى 1
        2. إزالة برنامج تلفزيوني
      2. وإضافة التربسين 1 مل إلى قارورة. هز قارورة بلطف لضمان شمول جميع الخلايا ملتصقة التربسين. إزالة التربسين من قارورة. وضع في قارورة في الحاضنة لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية.
        3. تأخذ قارورة خارج الحاضنة
      3. وإضافة 10 مل RPMI 1640 المتوسطة إلى قارورة. "الماصة؛" المتوسط صعودا وهبوطاً عدة مرات لتفريق الخلايا الليفية.
      4. "الماصة؛" 0.3 مل الليفية متناثرة على كل من هذين المجالين من الشريحة المجهر ووضع الشريحة في الحاضنة ل 24 ساعة حيث أن الخلايا الليفية الانضمام إلى الشريحة. ل immunostaining γH2AX و 53BP1 في نويات الخلايا الليفية، انتقل إلى الخطوة 3، 1-
  2. عينات المرضى
    1. عينات الدم: استخدام أنابيب جمع يتم ملؤها مع 2 مل الحل الأسهم التخثر وإضافة 7 مل الدم في الأنابيب. تخزين العينات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (أي، 18-20 درجة مئوية). وفي اليوم التالي عزل مرحلة G0/G1 يستريح الخلايا وحيدات النوى بكثافة التدرج الطرد المركزي (الخطوة 2.2.3)-
    2. عينات نخاع العظام: استخدام أنابيب جمع يتم ملؤها مع 2 مل من محلول الأسهم التخثر (الخطوة 1، 1) وإضافة 7 مل نخاع العظام في الأنابيب. تخزين العينات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (أي، 18-20 درجة مئوية). وفي اليوم التالي عزل مرحلة G0/G1 يستريح الخلايا وحيدات النوى بكثافة التدرج الطرد المركزي (الخطوة 2.2.3). استخدام CD34 ميكروبيدس والخلية أعمدة الفصل لعزل الخلايا CD34 +-
    3. عزل الخلايا وحيدات النوى بكثافة التدرج الطرد المركزي
      ملاحظة: الخلايا وحيدات النوى معزولة من عينات نخاع العظم والدم بكثافة الطرد المركزي التدرج 17 ، ، من 18 19.
      1. ديلوتى عينة الدم هيبارينيزيد بنسبة 1:1 مع برنامج تلفزيوني وعينه نخاع العظم هيبارينيزيد بنسبة 1:3 مع برنامج تلفزيوني. تعليق الخلايا بلطف عن طريق الرسم وخارجها الماصة مرتين.
        2. إضافة
      2. حجم متوسط الكثافة المتدرجة إلى أنبوب جديد. بلطف طبقة الدم المخفف أو نخاع العظام فوق المتوسطة الكثافة المتدرجة. الحرص على عدم خلط الطبقتين.
      3. الطرد المركزي في أنبوب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 400 غ. س رسم طبقة البلازما العليا قبالة مع الماصة. ثم بعناية حصاد الخلايا وحيدات النوى في الطبقة فوق المتوسطة الكثافة المتدرجة. نقل الخلايا وحيدات النوى في أنبوب جديد.
        4. إضافة
      4. على الأقل ثلاثة مجلدات من برنامج تلفزيوني للخلايا وحيدات النوى في الأنبوب. تعليق الخلايا بلطف عن طريق الرسم وخارجها الماصة مرتين. الطرد المركزي في أنبوب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 400 غ. س
      5. بعد تدور إزالة المادة طافية وإضافة 10 مل من 4 درجة مئوية، 1 x حل تحلل للخلايا الحمراء. ريسوسبيند الخلايا بلطف عن طريق الرسم وخارجها الماصة مرتين، ووضع الأنبوب على الجليد لمدة 5 دقائق. ثم إضافة 30 مل برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية والطرد المركزي في أنبوب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 400 غ. س
    4. إعداد سيتوسبينس
      1. إعداد سيتوسبينس اثنين مع الخلايا وحيدات النوى من عينات المرضى (أي، سيتوسبين واحد لتلطيخ الفلورة γH2AX وسيتوسبين واحد ل γH2AX و 53BP1 جنبا إلى جنب تلطيخ الفلورة) بالطرد المركزي (300 x ز، 10 دقيقة) 1.0 × 10 5 خلايا لكل إعداد ( الشكل 3 و 4)-

3-γH2AX و "تلطيخ الفلورة" 53BP1

  1. التثبيت وبيرميبيليزيشن: إصلاح الخلايا مع 200 ميليلتر من 4% منهاج العمل لمدة 10 دقائق. بعد التثبيت، غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع 30 مل من برنامج تلفزيوني لمدة كل 5 دقائق على شاكر معمل. ثم بيرميبيليزي الخلايا مع 200 ميليلتر من 0.1% 9 أوكتوكسينول للحد الأدنى 10 يغسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع 30 مل من محلول حظر 5% لمدة كل 5 دقائق على شاكر معمل. كتلة الخلايا في 30 مل الطازجة 5% إعاقة الحل حاء – 1
  2. الحضانة مع الأجسام المضادة
    1. احتضان إعداد واحدة من الخلايا بجسم [مونوكلونل] مكافحة--γH2AX ماوس (1: 500) وإعداد أخرى من الخلايا بجسم [مونوكلونل] مكافحة--γH2AX ماوس (1: 500) أرنب [بولكلونل] جسم المضادة-53BP1 (1: 500) بين عشية وضحاها في 4 ° C.
    2. بعد الاحتضان غسل الخلايا بلطف 3 مرات مع 30 مل محلول حظر 2% لكل 5 دقائق على شاكر مختبر.
    3. إزالة الحل حظر واحتضان إعداد الخلايا بجسم ماعز مترافق Alexa488 المضادة ماوس ثانوي (1: 500) الأولى والثانية إعداد الخلايا مع (المضادة ماوس ثانوي جسم ماعز مترافق Alexa488 1: 500) ودونكي Alexa555 مترافق أرنب المضادة ثانوية جسم (1: 500) ح 1 في درجة حرارة الغرفة-
  3. المتوسطة التركيب: وضع الشريحة مع الخلايا في وعاء وغسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع 30 مل من برنامج تلفزيوني لكل 5 دقائق على شاكر معمل. إزالة برنامج تلفزيوني وجبل الخلايا مع تصاعد المتوسطة التي تحتوي على 4,6-دياميدينو-2-فينيليندولي. حذر وضع ساترة من فوق المتوسطة متصاعدة حيث تكون لا فقاعات الهواء المضمنة. الانتظار على الأقل 3 ح لتصلّب المتوسطة المتصاعدة قبل تحليل الخلايا بالميكروسكوب fluorescence.

4. تحليل γH2AX و 53BP1 البؤر

  1. المجهري Fluorescence: تحليل البؤر γH2AX و 53BP1 في نواة الخلية مجهر الأسفار مزودة بمرشحات DAPI و 488 أليكسا Cy3 أثناء التصوير إلى هدف X 100 التكبير. تسجيل الصور مع كاميرا ومعالجة الصور مع برامج التصوير المناسبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحليل للبؤر γH2AX في الخلايا الأكثر دقة في مرحلة G0/G1 و G2 عند ظهور بؤر γH2AX كنقاط مضيئة مميزة (الشكل 5A). على النقيض من ذلك، تحليل للبؤر γH2AX في الخلايا أثناء مرحلة ثانية يعقدها تلامس مشتتة γH2AX عموم النووية الناجمة عن عملية النسخ المتماثل (الشكل 5 (ب)).

تم إجراء تثبيت الخلايا مع 4% منهاج عمل بيجين (10 دقيقة) وبيرميبيليزيشن مع 0.1% 9 أوكتوكسينول (10 دقيقة). يمكن استخدام الميثانول للتثبيت وبيرميبيليزيشن، أيضا؛ ومع ذلك، قد تفكك نواة الخلية تماما شدة الميثانول ومسحه من البؤر γH2AX حيث قد لا تظهر بؤر γH2AX متميزة بالمقارنة مع بؤر γH2AX التي حصل عليها المعاملة مع 4% منهاج عمل بيجين و 0.1% 9 أوكتوكسينول.

اختيار أجسام مضادة فعالة أمر حاسم للفحص المجهري الفلورة فعالة. وأجريت تجارب مع جسم [مونوكلونل] مكافحة--γH2AX الرئيسي لماوس وجسم 53BP1 مكافحة [بولكلونل] أرنب الأولية لتلطيخ الفلورة γH2AX و 53BP1، على التوالي.

كما يعتبر كل بؤرة γH2AX لتمثيل هيئة تسوية المنازعات واحد، يمكن استخدام الفلورة تلطيخ من γH2AX للتحديد الكمي لجهاز تسوية المنازعات في الأنسجة المشع. تتناسب مستويات بؤر γH2AX في الخلايا الليمفاوية المشع (الشكل 6) إلى20،21جرعة الإشعاع. قد يحقق البؤر γH2AX كحد أقصى 5 دقيقة بالفعل تشعيع20،22. انحلال البؤر γH2AX في نقاط لاحقة في وقت يمكن رصدها ويعكس إصلاح جهاز تسوية المنازعات20،،من21إلى22.

يمكن تحليل عدم الاستقرار الجيني تلطيخ الفلورة مجتمعة γH2AX و 53BP1 في خطوط الخلايا والورم العينات10،11،12،،من1314. وأجرى تحليلاً نموذجياً في الخلايا CD34 + المريض بسرطان الدم النقوي الحاد (الشكل 7). التعريب المشارك γH2AX و 53BP1 أشارت إلى تعزيز آليات إصلاح نج 53BP1 بوساطة في مواقع من جهاز تسوية المنازعات في حين منعت الموارد البشرية. ومع ذلك، كانت النسبة المئوية لإضفاء الطابع المحلي المشترك γH2AX والبؤر 53BP1 في الانفجارات من سرطان الدم النقوي الحاد متغير. قد انخرطت البؤر γH2AX دون وجود إشارة إضافية 53BP1 الموارد البشرية للإصلاح لجهاز تسوية المنازعات في أواخر المرحلة S/G2. دور 53BP1 المفرد البؤر ظل بعيد المنال.

Figure 1
رقم 1: مصادر وآثار الحمض النووي الداخلية والخارجية الأضرار1،2،،من34. جهاز تسوية المنازعات، وفواصل مزدوجة-حبلا الحمض النووي؛ نهيج، نونهومولوجوس نهاية الانضمام.

Figure 2
الشكل 2 : عرض تخطيطي من كسر مزدوج-حبلا الحمض النووي الرئيسية (جهاز تسوية المنازعات) إصلاح الآليات في خلايا الثدييات. يستخدم ممارسو مثلى أخت سليمة تشروماتيد في أواخر المرحلة S/G2 لإصلاح يحتمل أن تكون خالية من الأخطاء من جهاز تسوية المنازعات. نونهومولوجوس نهاية-الالتحاق بالعمل (نهيج) نشطة في جميع أنحاء دورة الخلية، ويحتمل أن تكون معرضة للخطأ كما يجوز إضافة قليل قاعدة أزواج أو مستأصل قبل ربط طرفي جهاز تسوية المنازعات. الانضمام إلى نهاية بديلة هو إليه بطء إصلاح احتياطية مطفرة التي قد تشارك في حالة عوز نهيج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : جهاز لإعداد سيتوسبينس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : إعداد سيتوسبينس. وتعد سيتوسبينس اثنين لكل عينة بالطرد المركزي 1.0 × 105 خلايا في 300 غرام x لمدة 10 دقائق. ويستخدم سيتوسبين واحد لتلطيخ الفلورة γH2AX وسيتوسبين أخرى تستخدم للجمع بين γH2AX وتلطيخ الفلورة 53BP1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : دورة الخلية تعتمد أنماط من البؤر γH2AX في الخلايا الليفية العادي للخلية خط نهدف. (A) γH2AX البؤر (الأخضر، 488 أليكسا) في نويات الخلايا الليفية نهدف (أزرق، DAPI) تظهر كنقاط متميزة في مرحلة G0/G1 أو G2. (ب) γH2AX البؤر في نويات الخلايا الليفية في مرحلة ثانية تبدو وكأنها تلامس عموم النووية مشتتة (شريط المقياس = 5 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : ΓH2AX البؤر في الأشعة السينية المشع لمفاوية صحة الفرد. وتسجل صور بؤر γH2AX (أخضر، 488 أليكسا) في نويات الخلايا الليمفاوية (أزرق، DAPI) في 5 دقائق بعد التشعيع مع مجي 100 (شريط المقياس = 5 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7 : تعريب المشارك من البؤر γH2AX و 53BP1 في CD34 + خلايا المريض بسرطان الدم النقوي الحاد. تعريب المشارك γH2AX البؤر (الأخضر، أليكسا 488) والبؤر 53BP1 (الأحمر، Cy3) يشير إلى النهوض بوساطة 53BP1 نونهومولوجوس الانضمام إلى نهاية إصلاح الآليات في مواقع فواصل مزدوجة-حبلا الحمض النووي (شريط المقياس = 5 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1 طريقة مفيدة لتحليل تكوين وإصلاح جهاز تسوية المنازعات في نطاق عريض من المجالات البحثية. معلمات الحرجة التي تؤثر على نتائج هذه التجارب هي مرحلة دورة الخلية، العوامل المستخدمة لتثبيت و permeabilization للخلايا، والاختيار من الأجسام المضادة، والأجهزة والبرمجيات من المجهر الأسفار.

وتجلى تأثير دورة الخلية في أنماط البؤر γH2AX تزايد أضعافاً مضاعفة الليفية العادي الخط الخلية نهدف. ظهرت بؤر γH2AX كنقاط مضيئة مميزة في G0/G1 ومراحل G2 بالمقارنة مع تلامس γH2AX عموم النووية المتناثرة في مرحلة ثانية (الشكل 5). بؤر γH2AX متميزة في G0/G1 المرحلة والمرحلة في G2 تلف الحمض النووي عابر و/أو التأسيسي المشار إليه قد تم الحصول عليها خلال الممرات دورة الخلية المتكررة؛ على العكس من ذلك، حدث عابر فقط تلامس مشتتة في مرحلة ثانية وكانت يفترض أن ترتبط بعملية النسخ المتماثل. كما γH2AX عموم النووية التي قد تخل بتلامس ينصح بتحليل حقيقي γH2AX البؤر، استبعاد الخلايا مرحلة ثانية من التحليل، الذي يقوم به سهولة نمط γH2AX محددة المرحلة S. وبدلاً من ذلك، يمكن استبعاد الخلايا في مرحلة ثانية بقياس كثافة إشارة DAPI أو بواسطة تطبيق S المرحلة علامات محددة (مثلاً، A سيكلين). وعلاوة على ذلك، قد يكون مفيداً التعريفي للقبض على النمو مع المزامنة للخلايا في مرحلة G0/G1 قبل إعداد سيتوسبينس واسطة تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة (أي، 18-20 درجة مئوية) بين عشية وضحاها.

إجراءات التثبيت و permeabilization خطوات حاسمة في إيمونوستينينج γH2AX و 53BP1. التثبيت ضروري للحفاظ على مورفولوجيا وأنتيجينيسيتي من الخلايا23. بيرميبيليزيشن تمكن من الوصول إلى المستضدات داخل الخلايا والنووية24. منهاج عمل بيجين هو وكيل لطيف نسبيا للتثبيت وتستقر الخلايا مع الحفاظ على هياكل البروتين نتيجة للتفاعل مع الأحماض الأمينية الأساسية للنموذج الميثيلين كروسلينكس. بعد التثبيت مع منهاج عمل بيجين، ويمكن تخزين سيتوسبينس لأيام وأسابيع حتى مزيد من المعالجة. وقد الخلايا للكشف عن γH2AX و 53BP1، أن بيرميبيليزيد. 9 أوكتوكسينول كمنظفات غير الأيونية التي تحتوي على مجموعات رأسه ماء دون توجيه تهمة إليه تتكون من مويتيس polyoxyethylene. 9 أوكتوكسينول يكسر نواة الخلية بلطف، ويحافظ على البؤر γH2AX واضح تماما. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام الميثانول للتثبيت و permeabilization للخلايا، جداً. رواسب البروتينات الميثانول وتذوب الدهون من غشاء الخلية، مما يجعلهم إنفاذا للأجسام المضادة. بيد أن المعاملة مع الميثانول يفترض أنها أكثر عدوانية والبؤر γH2AX قد لا تظهر واضح عند البؤر γH2AX التي حصل عليها المعاملة مع 4% منهاج عمل بيجين و 0.1% بالمقارنة مع 9 أوكتوكسينول. على الرغم من الأجسام المضادة الفعالة دوراً رئيسيا ل immunostaining γH2AX و 53BP1. ولذلك، يوصي باستخدام الأجسام المضادة ثبت (انظر الجدول للمواد والمعدات). إضعاف مسلسل من الأجسام المضادة التي قد تكون مفيدة لتحديد تركيزات جسم المثلى.

ΓH2AX البؤر تستخدم كعلامة في بيودوسيميتري الإشعاع في الجرعات المنخفضة > 1 مجي25. وجرى تحليل البؤر γH2AX في الخلايا الليمفاوية في 5 دقائق بعد التشعيع بالأشعة السينية بجرعة من 100 مجي في المختبر (الشكل 6). كما هو فوسفوريلاتيد H2AX سرعة في مواقع من جهاز تسوية المنازعات بعد التشعيع، قد تصل عدد البؤر γH2AX بالفعل كحد أقصى في 5 دقائق بعد التشعيع20،22. ومع ذلك، عملية الإصلاح يبدأ على الفور بعد التشعيع وتتم إزالة البؤر γH2AX بمعدل انحلال متميزة. ومن ثم، لرصد عدد البؤر γH2AX في تسلسل زمني، فمن المستحسن لمقاطعة عملية الإصلاح عن طريق وضع العينة على الجليد في نقطة محددة في الوقت المناسب بعد التشعيع.

مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1 طريقة مفيدة لتحليل عدم الاستقرار الجيني في الخلايا السرطانية. تم إثراء CD34 + خلايا من نخاع العظم للمريض بسرطان الدم النقوي الحاد باستخدام ميكروبيدس CD34. تم الحصول على صور من البؤر γH2AX والبؤر 53BP1 استخدام مرشحات fluorescence محددة. مهم إضاءة ساطعة من سيتوسبين حمل الأسفار كافية من بؤر γH2AX و 53BP1. بعد تسجيل الصورة، تكييف كثافة البؤر والإشارات الخلفية اللازمة باستخدام برامج التصوير. لتحليل التعريب المشارك من بؤر γH2AX و 53BP1، يتم دمج الصور (الشكل 7). مجهر ابيفلوريسسينسي أساسية مزودة بمرشحات DAPI و 488 أليكسا Cy3 في تركيبة مع نظام كاميرا والتصوير برامج كافية لتحليل γH2AX والبؤر 53BP1 في DAPI الملون نواة الخلية. ومع ذلك، قد تتطلب تطبيقات معينة (مثلاً، تحليل الحمض النووي الضرر على طول مسارات الجسيمات مفردة) أعلى من القرار والحد من الأسفار الخلفية (كما قدمها [كنفوكل] ليزر المسح المجهري مثلاً). وعلاوة على ذلك، تقنية المجهر هو حقل التطور السريع وقرار أدناه 200 نانومتر ممكن مع مجاهر الدولة للفنون.

وباختصار، يسلط الضوء على القضايا الحرجة لتشكيل هيئة تسوية المنازعات وإصلاح هذه المخطوطة ويوفر بروتوكول خطوة بخطوة لإجراء تحليل مفصل لجهاز تسوية المنازعات مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1. البحث عن جهاز تسوية المنازعات وضوح ستستفيد من التطورات الأخيرة والمقبلة في مجال تكنولوجيا المجهر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد المشروع "الألماني خوسيه كاريراس اللوكيميا المؤسسة" (14 دجكلس R/2017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI medium Sigma-Aldrich R0883 Medium for cell culture
Heparin sodium ratiopharm PZN 3029843  Heparin 5,000 I.U. / mL
Sodium chloride solution 0.9% B. Braun PZN 1957154 Component of the anticoagulant stock solution
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 Medium for isolation of mononuclear cells
Trypsin solution 10X Sigma-Aldrich 59427C Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture
CD34 MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-046-702 Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells
Diagnostic microscope slides Thermo Scientific ER-203B-CE24 Microscope slides
Megafuge 1.0 R Heraeus 75003060  Tabletop centrifuge 
Cytospin device
Lid Heraeus 76003422 Lid for working without micro-tubes
Cyto container Heraeus 75003416 Cyto container with 2 conical bores
Clip carrier Heraeus 75003414 Carrier for holding a cyto container and a slide
Support insert Heraeus 75003417 Support insert for holding a clip carrier
Triton X-100 (Octoxinol 9) Thermo Scientific 85112 Detergent for permeabilization of cell membranes
Potassium hydroxide solution 1M Merck Millipore 109107 Necessary for preparing the paraformaldehyde solution
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Fixation agent
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 Balanced salt solution
Chemiblocker Merck Millipore 2170 Blocking agent
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) Merck Millipore 05-636 Primary antibody for detection of γH2AX
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) Novus Biologicals NB100-304 Primary antibody for detection of 53BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody Invitrogen A-11001 Secondary antibody
Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody Invitrogen A-31572 Secondary antibody
Vectashield mounting medium Vector Laboratories H-1200 Contains DAPI for staining of DNA
Axio Scope.A1 Zeiss 490035 Fluorescence microscope
Cool Cube 1 CCD camera Metasystems H-0310-010-MS Camera system for digital recording
Isis software Metasystems Not applicable Microscope software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
  2. Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
  3. Zeman, M. K., Cimprich, K. A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).
  4. IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf (1994).
  5. Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).
  6. Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).
  7. Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70. Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).
  8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  9. Scully, R., Xie, A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).
  10. Walters, D. K., et al. Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX. Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).
  11. Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).
  12. Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence. Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).
  13. Chen, E., et al. JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).
  14. Popp, H. D., et al. Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Leuk Res. 57, 112-118 (2017).
  15. Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).
  16. Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
  17. Boyum, A. Separation of White Blood Cells. Nature. 204, 793-794 (1964).
  18. Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
  19. Bain, B., Pshyk, K. Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).
  20. Popp, H. D., et al. Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology. Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).
  21. Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
  22. Lobrich, M., et al. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).
  24. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
  25. Rothkamm, K., Lobrich, M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).

Tags

البيولوجيا الخلوية، 129 قضية، ومجهر الفلورة، γH2AX، 53BP1، الأشعة السينية، عدم الاستقرار الوراثي، فواصل مزدوجة-حبلا الحمض النووي، إصلاح الحمض النووي
مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1 لتحليل تكوين وإصلاح الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann,… More

Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J. Vis. Exp. (129), e56617, doi:10.3791/56617 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter