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Cancer Research

γH2AX 和53BP1 的免疫荧光显微镜分析 DNA 双链断裂的形成和修复

Published: November 3, 2017 doi: 10.3791/56617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Hematology and Oncology, Medical Faculty Mannheim of the Heidelberg University

Summary

这篇手稿提供了一个协议的分析 DNA 双断裂的免疫荧光显微镜的γH2AX 和53BP1。

Abstract

dna 双断裂 (争端) 是严重的 dna 损伤。对争端研究组的形成和修复的分析在包括基因组完整性、遗传毒性、辐射生物学、衰老、癌症和药物开发在内的广泛范围内是相关的。针对争端处理, 组蛋白 H2AX 磷酸化在丝氨酸139在一个区域的几个 megabase 对形成离散核病灶检测的免疫荧光显微镜。此外, 53BP1 (p53 结合蛋白 1) 是另一种重要的争端应变蛋白促进修复的争端, 通过 nonhomologous 端加入, 同时防止同源重组。根据γH2AX 和53BP1 的具体功能, 通过免疫荧光显微镜对γH2AX 和53BP1 进行综合分析, 可以为解决争端的详细分析提供一种合理的方法。这份手稿提供了一个 step-by 步骤的协议, 辅以有条不紊的说明来执行这项技术。具体而言, 细胞周期对γH2AX 病灶形态的影响表现在细胞系 NHDF 的正常成纤维细胞中。此外, γH2AX 病灶作为一个生物标志物的价值被描述在一个健康个体的 x 射线照射的淋巴细胞中。最后, 用γH2AX 和53BP1 免疫荧光显微镜对急性髓系白血病患者的 CD34+ 细胞进行遗传不稳定性研究。

Introduction

dna 不断被内源性破坏 (例如, 复制应力, 活性氧种类, dna 的内在不稳定性) 和外源 (如如, 化学自由基, 辐照) 源 (图 1)1,2 ,3,4。在 dna 损伤中, dna 双断裂是特别严重的病变, 可能导致细胞死亡或癌变。每个单元格和单元格周期5可能会出现大约50争端。在哺乳动物细胞中, 同源重组 (HR) 和 nonhomologous 端接 (NHEJ) 被开发为修复争端解决的主要途径 (图 2)。HR 发生在后期 S/G2 阶段, 并使用完整的姐妹染色单体作为一个模板, 潜在的无差错修复。相比之下, NHEJ 是活跃的整个细胞周期和潜在的诱变作为基础对可以添加或切除前结扎的两端。另外, 在 NHEJ 缺陷6,7的情况下, 可选择的最终连接可作为一种慢诱变备份修复机制。

争端解决 H2AX 在丝氨酸139中诱导了组蛋白的磷酸化, 在每一个不同的 megabase 对周围的一个区域。形成核灶被命名为γH2AX 病灶, 并可通过免疫荧光显微镜检测8。γH2AX 促进了对进一步的争端处理反应蛋白的招募, 并参与染色质重塑, DNA 修复, 和信号转导9。由于每一个γH2AX 的焦点被认为代表一个单一的争端, 通过免疫荧光显微镜来定量的争端分析是可能的, 这已被证明在癌细胞系和患者标本10,11,12,13,14. 53BP1 (p53 结合蛋白 1) 是调解争端修复的另一个关键蛋白质。它参与了对争端应对的蛋白质、检查点信号的招募, 以及争端联会的结束15。此外, 53BP1 在争端修复路径选择中起着关键作用。当 HR 被阻止16时, 它将触发对 NHEJ 的修复。考虑到γH2AX 和53BP1 在争端修复中的真正作用, 用免疫荧光显微镜同时分析γH2AX 和 53BP1, 可为精确分析争端的形成和修复提供一种有用的方法。

这篇手稿提供了一个 step-by 步骤的协议, 执行免疫荧光显微镜的γH2AX 和53BP1 在细胞核。具体而言, 该技术适用于细胞系 NHDF 的正常成纤维细胞、健康个体的 x 射线照射的淋巴细胞和急性髓系白血病患者的 CD34+ 细胞。该方法的细节在所提出的结果的背景下被指出。

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Protocol

这里描述的所有方法都已获得海德堡大学的医学学院曼海姆伦理委员会的批准。从所有个人获得书面知情同意.

1. 材料的制备

  1. 抗凝血液: 在0.9% 氯化钠中制备每毫升200单位肝素的抗凝血溶液。在提取血液或骨髓样本之前, 用2毫升的抗凝液溶液填充每个收集管 (绘制容积9毫升).
  2. 针对红细胞的裂解解决方案: 准备10x 和 #160; 用82.91 克氯化铵、7.91 克碳酸氢铵和2毫升0.5 米的乙酸酸溶液溶解溶液, 以 pH 值8.0 通过溶解剂双水为总容量1升.
  3. 固定解决方案: 在孔管中添加8.3 和 #181; 1 米氢氧化钾溶液中的360毫克甲醛 (粉煤灰)。将磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 填充到管的1毫升标记上, 并在95和 #176 的加热块中加热管; C 得到1毫升的36% 的粉煤灰溶液。将1毫升36% 的煤灰溶液转移到一个容量为15毫升的管子上。添加8毫升 PBS 到1毫升36% 粉煤灰溶液, 以获得9毫升的4% 的粉煤灰库存解决方案。分4% 粉煤灰库存解决方案和存储在-18 和 #176; C 直到使用固定的细胞.
    警告: 1) 氢氧化钾溶液具有腐蚀性。注意眼睛和皮肤保护。2) 粉煤灰是致癌的。避免皮肤接触和吸入。准备好固定液罩.
  4. 性解决方案: 添加50和 #181; L Octoxinol 9 到 50 mL PBS 以获得大约 0.1% Octoxinol 9 的解决方案.
  5. 阻止解决方案: 通过将蛋白阻断剂与 PBS 混合并存储在6和 #8211; 以及 #160; 8 和 #176; C.

2。样品的制备

  1. 细胞培养中的成纤维细胞: 在37和 #176 的湿化 5% CO 2 大气中培养细胞系 NHDF 的人成纤维细胞; C 在 RPMI 1640 培养基中补充10% 胎小牛血清, 4 毫米谷氨酰胺和1% 青霉素/链霉素。
    1. 用带粘连的成纤维细胞的显微镜幻灯片的制备
      1. 将培养基从烧瓶 (75 厘米 2 生长区域) 中移除, 并以指数形式生长的 NHDF 成纤维细胞。在烧瓶中加入10毫升 PBS。用手动摇动烧瓶1分钟, 轻轻地冲洗贴壁成纤维细胞.
      2. 取出 PBS 并将1毫升胰蛋白酶添加到烧瓶中。轻轻摇动烧瓶, 确保所有附着的细胞都被胰蛋白酶覆盖。从烧瓶中取出胰蛋白酶。将烧瓶放入孵化箱中5分钟, 在 37 #176; C.
      3. 从孵化器中取出烧瓶, 并将10毫升 RPMI 1640 培养基放入烧瓶中。将培养基上下移几次, 以分散成纤维细胞.
      4. 将分散成纤维细胞的0.3 毫升移到显微镜滑动的两个领域, 并将滑块放入孵化箱中24小时, 使成纤维细胞附着在幻灯片上。免疫和 #947; H2AX 和53BP1 成纤维细胞的细胞核, 移到步骤 3.1.
  2. 患者样本
    1. 血液样本: 使用2毫升的抗凝液溶液填充管, 并在试管中加入7毫升血液。在室温下过夜 ( 即 , 18-20 和 #176; C) 存储样品。第二天, 通过密度梯度离心分离 G0/G1 相休眠的单核细胞 (步骤 2.2.3).
    2. 骨髓样本: 使用2毫升抗凝液溶液 (步骤 1.1) 填充的收集管, 并将7毫升骨髓注入试管。在室温下过夜 ( 即 , 18-20 和 #176; C) 存储样品。第二天, 通过密度梯度离心分离 G0/G1 相休眠的单核细胞 (步骤 2.2.3)。使用 CD34 微和细胞分离柱来隔离 CD34+ 细胞.
    3. 密度梯度离心分离单个核细胞
      注: 单核细胞从血液和骨髓样本中分离, 密度梯度离心 17 , 18 , 19 。
      1. 将素的血液样本稀释到 pbs 和素的骨髓样本比例为 1:1, 与 pbs 的比值为1:3。轻轻地将细胞从吸管中取出两次, 使其悬浮.
      2. 将密度渐变介质的体积添加到新的管中。将稀释的血液或骨髓在密度梯度培养基上轻轻地分层。小心别把这两层混在一起.
      3. 在室温下离心管30分钟, 400 x g. 用吸管绘制上层等离子层。然后仔细地在密度梯度介质的层上收获单个核细胞。将单个核细胞转移到新鲜的试管中.
      4. 向试管中的单个核细胞添加至少三体积的 PBS。将细胞轻轻地从吸管中取出两次, 使其悬浮。离心管10分钟室温和 400 x g.
      5. 自旋移除上清液后, 加入10毫升的4和 #176; C、1x 和 #160; 红细胞溶解溶液。重细胞轻轻地把它们从吸管中取出两次, 然后将管子放在冰上5分钟。然后在4和 #176 中加入30毫升 PBS, 在室温和 400 x g 上离心管10分钟.
    4. 准备 cytospins
      1. 准备两个 cytospins 与患者样本的单个核细胞 ( 即 , 一个 cytospin 和 #947; H2AX 免疫荧光染色和一个 cytospin 为和 #947; H2AX 和53BP1联合免疫荧光染色) 的离心 (300 x g, 10 分钟) 的 1.0 x 10 5 细胞为每个准备 ( 图 3 和 4 )。

3. 和 #947; H2AX 和53BP1 免疫荧光染色

  1. 固定和性: 用200和 #181 固定细胞; 10 分钟4%。在固定后, 用30毫升 PBS 轻轻地冲洗三次细胞, 在实验室振动器上5分钟。然后 permeabilize 200 和 #181 的细胞; 0.1% Octoxinol 9, 10 分钟, 用三毫升30次, 在实验室摇床上5% 分钟冲洗细胞。在30毫升的新鲜5% 拦截解决方案的1小时内阻止细胞.
  2. 孵育与抗体
    1. 用鼠标单克隆抗 #947 培养细胞的一个制备; H2AX 抗体 (1:500) 和其他制备细胞与小鼠单克隆抗 #947; H2AX 抗体 (1:500) 和多克隆兔 anti-53BP1 抗体 (1:500) 过夜在4和 #176; C.
    2. 孵化后, 在实验室振动器上每5分钟轻轻冲洗细胞3次, 30 毫升2% 堵液.
    3. 移除阻塞解决方案, 并用 Alexa488-conjugated 山羊 anti-mouse 二次抗体 (1:500) 和 Alexa488-conjugated 山羊 anti-mouse 二次抗体的第二个细胞制备1:500) 和 Alexa555-conjugated 驴兔在室温下为1小时的二次抗体 (1:500).
  3. 安装介质: 将幻灯片与单元格放在一个碗中, 然后用30毫升 PBS 轻轻地清洗三次, 在实验室的每5分钟进行一次。卸下 PBS 并安装包含 46-diamidino-2-吲的安装介质的单元格。小心地把一个片在安装介质的顶部, 使没有气泡嵌入式.在用荧光显微镜分析细胞之前, 至少要等待3小时的硬化.

4。分析与 #947; H2AX 和53BP1 焦点

  1. 荧光显微镜: 分析和 #947; H2AX 和53BP1 在细胞核内的病灶, 荧光显微镜配有 DAPI、Alexa 488 和 Cy3 的过滤器, 在100X 和 #160 中进行成像; 目标放大.使用照相机记录图像, 并使用适当的图像处理软件来进行映像.

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Representative Results

在 G0/G1 期和 G2 期, 当γH2AX 病灶出现为明显的荧光点 (图 5A) 时, 细胞中γH2AX 病灶的分析最为准确。相比之下, 由于复制过程 (图 5B) 引起的分散的泛核γH2AX 斑点, γH2AX 的细胞在 S 期内的病灶的分析是复杂的。

固定的细胞进行了4% 粉煤灰 (10 分钟) 和性 0.1% Octoxinol 9 (10 分钟)。甲醇可用于固定和性;然而, 甲醇可能会破坏细胞核相当严重, 并涂抹了γH2AX 病灶, 因此γH2AX 病灶可能不会出现明显的γH2AX 病灶与治疗获得4% 粉煤灰和 0.1% Octoxinol 9。

有效的抗体的选择是关键的免疫荧光显微镜。实验分别采用小鼠单克隆 anti-γH2AX 抗体和原兔多克隆 anti-53BP1 抗体对γH2AX 和53BP1 进行免疫荧光染色。

由于每个γH2AX 的焦点被认为代表一个单一的争端, γH2AX 的免疫荧光染色可用于定量的争端在辐射组织。照射的淋巴细胞中γH2AX 病灶的水平 (图 6) 与辐照剂量成正比20,21。γH2AX 病灶可能达到最大已经5分钟的辐照20,22。γH2AX 焦点的衰变在以后的时间点可以被监视并且反射故障的修理20,21,22。

遗传不稳定性可通过γH2AX 和53BP1 在细胞系和肿瘤标本中的联合免疫荧光染色分析,10,11,12,13,14。对急性髓系白血病患者的 CD34+ 细胞进行了典型的分析 (图 7)。γH2AX 和53BP1 的联合定位表明, 在防止 HR 的同时, 促进53BP1 介导的 NHEJ 修复机制。然而, co-localizing γH2AX 和53BP1 灶在急性髓系白血病爆炸中的比例是可变的。无附加53BP1 信号的γH2AX 灶可能在后期 S/G2 阶段参与了修复争端处理的 HR。奇异53BP1 灶的作用仍然难以捉摸。

Figure 1
图 1:内源性和外源性 DNA 损伤的来源及后果1,2,3,4。DNA 双断裂;NHEJ, nonhomologous 最终加入。

Figure 2
图 2:哺乳动物细胞主要 DNA 双断裂修复机制的原理图。同源重组使用了一个完整的姐妹染色单体在后期 S/G2 阶段的潜在无差错修复的争端. Nonhomologous 末端连接 (NHEJ) 是活跃的整个细胞周期和潜在的错误倾向, 因为少数碱基对可能会增加或切除前结扎的争端结束。选择性末端连接是一种缓慢致突变的后备修复机制, 可能参与 NHEJ 缺乏症的情况。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3:用于准备 cytospins 的设备。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4:cytospins 的制备。每个样品的两个 cytospins 是通过离心 1.0 x 105细胞在 300 x g 上的10分钟来制备的。一种 cytospin 用于γH2AX 免疫荧光染色, 另一种 cytospin 用于联合γH2AX 和53BP1 免疫荧光染色。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5:NHDF 细胞系正常成纤维细胞中γH2AX 灶的胞周期依赖性模式。(A) γH2AX 病灶 (绿色, Alexa 488) 在 NHDF 成纤维细胞的核 (蓝色, DAPI) 中出现的 G0/G1 或 G2 阶段的明显点。(B) 在 S 期成纤维细胞的细胞核中, γH2AX 病灶呈现为分散的泛核斑点 (刻度条 = 5 µm)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: γH2AX 病灶 x 射线照射的健康个体淋巴细胞。γH2AX 病灶 (绿色, Alexa 488) 在细胞核 (蓝色, DAPI) 的图像记录在5分钟的照射后与 100 mGy (规模酒吧 = 5 µm)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 急性髓系白血病患者 CD34+ 细胞γH2AX 和53BP1 灶的联合定位。γH2AX 病灶 (绿色、Alexa 488) 和53BP1 病灶 (红、Cy3) 的联合定位表明, 在 DNA nonhomologous 断裂部位 (标尺 = 5 双), 促进53BP1 介导的µm 末端连接修复机制。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

γH2AX 和53BP1 的免疫荧光显微镜是分析广泛的研究领域的一个有效方法。影响实验结果的关键参数是细胞周期的阶段, 细胞的固定和性, 抗体的选择, 荧光显微镜的硬件和软件。

细胞周期对γH2AX 病灶形态的影响表现为细胞系 NHDF 正常成纤维细胞的指数生长。与 S 相中分散的泛核γH2AX 斑点 ( 图 5) 相比, γH2AX 病灶在 G0/G1 和 G2 阶段出现为明显的荧光点。在 G0/G1 期和 G2 期, 明显的γH2AX 病灶表明在重复的细胞周期段内可能获得的瞬时和/或本构 DNA 损伤;相反地, S 相中的散斑只是瞬时发生的, 可能与复制过程有关。由于泛核γH2AX 斑点可能会干扰真正的γH2AX 病灶的分析, 建议从分析中排除 s 相细胞, 这很容易由 s 相特定的γH2AX 模式来完成。或者, s 阶段中的单元可以通过测量 DAPI 信号的强度或应用 s 相特定标记 (例如, 细胞周期蛋白 A) 来排除。此外, 通过在室温下 (即, 18-20 ° c) 过夜, 在制备 cytospins 的过程中, 在 G0/G1 相的细胞同步诱导生长骤停可能是有用的。

固定和性的程序是γH2AX 和53BP1 免疫的关键步骤。固定是必要的保存形态学和抗原性的细胞23。性允许访问细胞内和核抗原24。粉煤灰是一种相对温和的固定和稳定细胞的药物, 同时通过与碱性氨基酸反应形成亚甲基通道, 以保持蛋白质结构。在与粉煤灰固定后, cytospins 可贮存数天至数周, 直至进一步处理。为了检测γH2AX 和 53BP1, 细胞必须化。Octoxinol 9 被用作非离子洗涤剂, 含有不聚氧乙烯基的亲水的头组。Octoxinol 9 将细胞细胞核轻轻折断, 并保持γH2AX 病灶。另外, 甲醇也可用于固定和性细胞。甲醇沉淀蛋白质, 从细胞膜中溶解脂质, 使其对抗体具有渗透性。然而, 用甲醇治疗可能更具侵袭性, γH2AX 病灶与4% 的粉煤灰和 0.1% Octoxinol 9 的γH2AX 治疗方法相比, 似乎没有明显的效果。尽管如此, 有效的抗体在γH2AX 和53BP1 的免疫中起着关键作用。因此, 建议使用已证实的抗体 (参见材料表/设备)。抗体的序列稀释可能是有用的确定最佳抗体浓度。

γH2AX 病灶在低剂量和 #62 下用作辐射剂量的标记, 1 mGy25。γH2AX 病灶在 x 射线照射后5分钟的淋巴细胞内进行分析, 剂量为 100 mGy体外(图 6)。由于 H2AX 在辐照后在争端点的地点迅速磷酸化, γH2AX 病灶的数量在辐照后的5分钟内可能已经达到最大值20,22。然而, 在照射和γH2AX 病灶以不同的衰变速率去除后, 修复过程立即开始。因此, 为了在时间序列中监测γH2AX 病灶的数量, 最好在辐照后的指定点上将样品放在冰上, 以此中断修复过程。

γH2AX 和53BP1 的免疫荧光显微镜是分析肿瘤细胞遗传不稳定性的有效方法。CD34+ 细胞是由 CD34 微的急性髓系白血病患者骨髓中富集的。利用特定的荧光过滤器, 获得了γH2AX 病灶和53BP1 病灶的图像。cytospin 的明亮光照对诱导γH2AX 和53BP1 灶的充分荧光具有重要意义。在对图像进行记录后, 需要利用成像软件对病灶的强度和背景信号进行适应。为了分析γH2AX 和53BP1 焦点的共存, 将图像合并 (图 7)。一个基本的荧光显微镜配备了过滤器的 DAPI, Alexa 488, 和 Cy3 结合相机系统和成像软件, 足以分析γH2AX 和53BP1 病灶在 DAPI 染色细胞核。然而, 某些应用 (例如, 对单粒子轨道的 DNA 损伤的分析) 可能需要更高的分辨率和减少背景荧光 (如提供的, 通过共焦激光扫描显微镜)。此外, 显微镜技术是一个迅速发展的领域和分辨率低于 200 nm 是可行的与先进的显微镜。

总之, 这篇手稿突出了争端解决的形成和修复的关键问题, 并提供了一个 step-by 一步的协议, 详细分析了γH2AX 和53BP1 的免疫荧光显微镜。在显微镜技术的最新发展中, 对争端分析系统的研究将会明显受益。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

该项目得到了德国 jos é卡雷拉斯白血病基金会 (DJCLS 14 R/2017) 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI medium Sigma-Aldrich R0883 Medium for cell culture
Heparin sodium ratiopharm PZN 3029843  Heparin 5,000 I.U. / mL
Sodium chloride solution 0.9% B. Braun PZN 1957154 Component of the anticoagulant stock solution
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 Medium for isolation of mononuclear cells
Trypsin solution 10X Sigma-Aldrich 59427C Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture
CD34 MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-046-702 Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells
Diagnostic microscope slides Thermo Scientific ER-203B-CE24 Microscope slides
Megafuge 1.0 R Heraeus 75003060  Tabletop centrifuge 
Cytospin device
Lid Heraeus 76003422 Lid for working without micro-tubes
Cyto container Heraeus 75003416 Cyto container with 2 conical bores
Clip carrier Heraeus 75003414 Carrier for holding a cyto container and a slide
Support insert Heraeus 75003417 Support insert for holding a clip carrier
Triton X-100 (Octoxinol 9) Thermo Scientific 85112 Detergent for permeabilization of cell membranes
Potassium hydroxide solution 1M Merck Millipore 109107 Necessary for preparing the paraformaldehyde solution
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Fixation agent
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 Balanced salt solution
Chemiblocker Merck Millipore 2170 Blocking agent
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) Merck Millipore 05-636 Primary antibody for detection of γH2AX
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) Novus Biologicals NB100-304 Primary antibody for detection of 53BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody Invitrogen A-11001 Secondary antibody
Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody Invitrogen A-31572 Secondary antibody
Vectashield mounting medium Vector Laboratories H-1200 Contains DAPI for staining of DNA
Axio Scope.A1 Zeiss 490035 Fluorescence microscope
Cool Cube 1 CCD camera Metasystems H-0310-010-MS Camera system for digital recording
Isis software Metasystems Not applicable Microscope software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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细胞生物学 问题 129 免疫荧光显微镜 γH2AX 53BP1 X 射线 遗传不稳定性 dna 双断裂 dna 修复
γH2AX 和53BP1 的免疫荧光显微镜分析 DNA 双链断裂的形成和修复
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Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann,… More

Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J. Vis. Exp. (129), e56617, doi:10.3791/56617 (2017).

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