Summary
Håndskriftet indeholder en protokol til analyse af DNA dobbelt-strenget pauser ved immunfluorescens mikroskopi af γH2AX og 53BP1.
Abstract
DNA dobbelt-strenget pauser (DSB) er alvorlige DNA læsioner. Analyse af dannelse og reparation af DSB er relevante i et bredt spektrum af forskningsområder herunder genom integritet, genotoksicitet, stråling biologi, aldring, kræft og udvikling af lægemidler. Svar på DSB, er Histon H2AX fosforyleret på Serin 139 i en region af flere megabase par danner diskrete nukleare foci påvises ved immunfluorescens mikroskopi. Desuden er 53BP1 (p53 bindende protein 1) er en anden vigtig DSB-responderende protein fremmer reparation af DSB ved nonhomologous afslutning-tiltræder samtidig forhindre homologe rekombination. Ifølge de specifikke funktioner i γH2AX og 53BP1, kan den kombinerede analyse af γH2AX og 53BP1 ved immunfluorescens mikroskopi være en rimelig tilgang for en detaljeret analyse af DSB. Dette håndskrift giver en trinvis protokol suppleret med metodisk noter til at udføre teknikken. Konkret er indflydelse af cellecyklus på γH2AX foci mønstre demonstreret i normal fibroblaster af cellelinie NHDF. Yderligere, værdien af γH2AX foci som en biomarkør er afbildet i x-ray bestrålet lymfocytter af en sund person. Endelig er genetiske ustabilitet i CD34 + celler af en patient med akut myeloid leukæmi undersøgt ved immunfluorescens mikroskopi af γH2AX og 53BP1.
Introduction
DNA er løbende beskadiget af endogene (fx, replikering stress, reaktive ilt arter, iboende ustabilitet af DNA) og eksogen (fx, kemiske radikaler, bestråling) kilder (figur 1)1,2 ,3,4. Blandt DNA-skader, DNA dobbelt-strenget pauser (DSB) er særligt alvorlige læsioner og kan fremkalde celledød eller carcinogenese. Omkring 50 DSB kan opstå pr. celle og cellecyklus5. I pattedyrceller homologe rekombination (HR) og nonhomologous ende-sammenføjning (NHEJ) udviklet som store veje for reparation af DSB (figur 2). HR opstår i slutningen S/G2 fase og bruger en intakt søster chromatid som en skabelon for potentielt fejlfri reparation. I sammenligning er NHEJ aktive i hele cellecyklus og potentielt mutagene som basepar kan være tilføjet eller resektion før ligatur af de brudte ender. Derudover kan alternative ende-sammenføjning være ansat som en langsom mutagene back-up reparation mekanisme i tilfælde af NHEJ mangel6,7.
DSB fremkalde fosforylering af Histon H2AX på Serin 139 i en region af flere megabase par omkring hver DSB. De danner nukleare foci er opkaldt γH2AX foci og påvises ved immunfluorescens mikroskopi8. ΓH2AX fremmer ansættelse af yderligere DSB-responderende proteiner og er involveret i kromatin remodeling, DNA reparation og signaltransduktion9. Som hver γH2AX fokus anses for at repræsentere et enkelt DSB, er kvantificering af DSB ved immunfluorescens mikroskopi mulige, som er blevet påvist i kræft cellelinjer og patient prøver10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 bindende protein 1) er en anden vigtig protein i mægle DSB reparation. Det er involveret i ansættelse af DSB-responderende proteiner, checkpoint signalering og synapsis DSB slutter15. Derudover spiller 53BP1 en afgørende rolle i DSB reparation pathway valg. Det udløser reparation af DSB mod NHEJ, mens HR er forhindret16. I betragtning af den ægte funktioner γH2AX og 53BP1 i DSB reparation, kan simultan analyse af γH2AX og 53BP1 ved immunfluorescens mikroskopi være en nyttig metode til præcis analyse af dannelse og reparation af DSB.
Dette håndskrift giver en trinvis protokol for at udføre immunofluorescens mikroskopi af γH2AX og 53BP1 i cellekerner. Specifikt, anvendes teknikken i normal fibroblaster af cellelinie NHDF, x-ray bestrålet lymfocytter af en sund person og CD34 + celler af en patient med akut myeloid leukæmi. Nærmere oplysninger om metoden, der er påpeget i forbindelse med præsenteres resultaterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af de etiske komité II af den medicinske fakultet Mannheim i Heidelberg Universitet. Skrevet blev indhentet informeret samtykke fra alle enkeltpersoner.
1. forberedelse af materialer
- antikoagulans stamopløsning: forberede en antikoagulerende stamopløsning af 200 IE heparin pr. mL i 0,9% natriumchlorid. Fyld hver indsamling rør (tegne bind 9 mL) med 2 mL af den antikoagulerende stamopløsning før tilbagetrækning af blod eller knoglemarv prøverne.
- Lysis løsning for røde celler: Forbered 10 x lysis løsning for røde celler med 82.91 g ammoniumchlorid, 7.91 g ammoniumbicarbonat og 2 mL 0,5 M ethylendiamintetra syre til pH 8,0 ved at opløse agenterne i dobbeltdestilleret vand til et volumen på 1 L.
- Fiksering løsning: tilføje 8.3 µL af en 1 M kaliumhydroxid opløsning til 360 mg PARAFORMALDEHYD (PFA) i et mikrotiter rør. Fyld glasset med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til 1 mL mærket af rør og varme rør i en varme blok ved 95 ° C at få 1 mL af en 36% PFA løsning. 1 mL 36% PFA opløsning overføres til en tube med en kapacitet på 15 mL. Tilføje 8 mL PBS til 1 mL 36% PFA løsning, at få 9 mL af en 4% PFA stamopløsning. Alikvot 4% PFA stamopløsning og opbevares ved-18 ° C indtil brug til fiksering af cellerne.
Forsigtig: 1) kaliumhydroxid er ætsende. Vær opmærksom på beskyttelse af øjne og hud. 2) PFA er kræftfremkaldende. Undgå hudkontakt og indånding. Forberede fiksering løsning under en hætte. - Permeabilization løsning: tilsættes 50 µL Octoxinol 9 til 50 mL PBS til at få en løsning på ca 0,1% Octoxinol 9.
- Blokerer løsning: forberede 5% og 2% blokering løsninger ved at blande protein blokerende agent med PBS og butik på 6 – 8 ° C.
2. Forberedelse af prøverne
- fibroblaster i cellekultur: dyrke humane fibroblaster af cellelinie NHDF i en fugtig 5% CO 2 atmosfære ved 37 ° C i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt kalveserum, 4 mM Glutamin, og 1% penicillin/streptomycin.
- Udarbejdelse af et objektglas med tilhænger fibroblaster
- fjerne medium fra kolben (75 cm 2 vækstområde) med eksponentielt voksende NHDF fibroblaster. Kolben tilsaettes 10 mL PBS. Vaske de vedhængende fibroblaster forsigtigt ved manuelt at ryste kolben i 1 min.
- Fjern PBS og tilsæt 1 mL trypsin i kolben. Kolben rystes forsigtigt for at sikre, at alle vedhængende celler er omfattet af trypsin. Fjerne trypsin fra kolben. Sætte kolben i inkubator for 5 min. ved 37 ° C.
- Tag kolben ud af rugemaskinen og tilsæt 10 mL RPMI 1640 medium i kolben. Afpipetteres medium op og ned flere gange for at sprede fibroblaster.
- Afpipetteres 0,3 mL af de spredte fibroblaster på hver af de to felter i objektglas og sætte diaset i inkubator i 24 timer, så fibroblaster overholde diaset. For immunfarvning af γH2AX og 53BP1 i kerner af fibroblaster, gå videre til trin 3.1.
- Udarbejdelse af et objektglas med tilhænger fibroblaster
- Patientprøver
- blodprøver: bruge indsamling rør, der var udfyldt med 2 mL af antikoagulerende stamopløsningen og tilføje 7 mL blod ind i rørene. Opbevare prøver natten over ved stuetemperatur (dvs. 18-20 ° C). Den næste dag, isolere G0/G1 fase hvilende mononukleære celler ved tæthed gradient centrifugering (trin 2.2.3).
- Knoglemarv prøver: bruge indsamling rør, der var udfyldt med 2 mL af antikoagulerende stamopløsningen (trin 1.1) og tilføje 7 mL knoglemarv ind i rørene. Opbevare prøver natten over ved stuetemperatur (dvs. 18-20 ° C). Den næste dag, isolere G0/G1 fase hvilende mononukleære celler ved tæthed gradient centrifugering (trin 2.2.3). Brug af CD34 microbeads og celle adskillelse kolonner til isolering af CD34 + celler.
- Isolering af mononukleære celler ved tæthed gradient centrifugering
Bemærk: Mononukleære celler er isoleret fra blodet og knoglemarven prøver af tæthed gradient centrifugering 17 , 18 , 19.- Dilute heparinized blodprøven i forholdet 1:1 med PBS og heparinized knoglemarv prøven i et forhold på 1:3 med PBS. Suspendere cellerne forsigtigt ved at trække dem ind og ud af pipetten to gange.
- Tilføje en volumen af tæthed gradient medium til en frisk tube. Forsigtigt lag fortyndet blod eller knoglemarv på toppen af tæthed gradient medium. Passe på ikke for at blande de to lag.
- Centrifugeres røret i 30 min. ved stuetemperatur og 400 x g. trække laget øverste plasma med en pipette. Derefter omhyggeligt høst af mononukleære celler i lag over tæthed gradient medium. Overførsel af mononukleære celler ind i en frisk rør.
- Tilføje mindst tre bind af PBS til de mononukleære celler i røret. Suspendere cellerne forsigtigt ved at trække dem ind og ud af pipetten to gange. Centrifugeres røret i 10 min. ved stuetemperatur og 400 x g.
- Efter spin Fjern supernatanten og der tilsættes 10 mL af 4 ° C, 1 x lysis løsning for røde blodlegemer. Resuspend cellerne forsigtigt ved at trække dem ind og ud af pipetten to gange, og røret anbringes i isbad i 5 min. Derefter tilsættes 30 mL PBS ved 4 ° C og centrifugeres røret i 10 min. ved stuetemperatur og 400 x g.
- Forberedelse af cytospins
- forberede to cytospins med mononukleære celler af patientprøver (dvs., en cytospin for γH2AX immunofluorescens farvning og en cytospin for γH2AX og 53BP1 kombineret immunofluorescens farvning) ved centrifugering (300 x g i 10 min.) på 1,0 x 10 5 celler for hvert præparat ( figur 3 og 4).
3. γH2AX og 53BP1 immunofluorescens farvning
- fiksering og permeabilization: Fix cellerne med 200 µL af 4% PFA i 10 min. Efter fiksering, cellerne vaskes forsigtigt tre gange med 30 mL PBS i 5 min på en lab shaker. Derefter permeabilize cellerne med 200 µL af 0,1% Octoxinol 9 i 10 min. Cellerne vaskes forsigtigt tre gange med 30 mL 5% blokerende løsning for 5 min på en lab shaker. Blokere cellerne i 30 mL frisk 5% blokering løsning for 1 h.
- Inkubering med antistoffer
- inkuberes en forberedelse af celler med et muse monoklonalt anti-γH2AX-antistof (1: 500) og anden forberedelse af celler med et muse monoklonalt anti-γH2AX-antistof (1: 500) og en polyklonale kanin anti-53BP1 antistof (1: 500) natten over ved 4 ° C.
- Efter inkubation cellerne vaskes forsigtigt 3 gange med 30 mL 2% blokerende løsning for hver 5 min på en lab shaker.
- Fjerner blokerende løsningen og Inkuber den første forberedelse af celler med en Alexa488-konjugeret gede anti-mus sekundær antistof (1: 500) og den anden forberedelse af celler med en Alexa488-konjugeret gede anti-mus sekundær antistof ( 1: 500) og en Alexa555-konjugeret æsel anti-kanin sekundær antistof (1: 500) i 1 time ved stuetemperatur.
- Montering medium: sætte dias med celler i en skål og cellerne vaskes forsigtigt tre gange med 30 mL PBS i hvert 5 min på en lab shaker. Fjerne PBS og montere cellerne med montering medium indeholdende 4,6-diamidino-2-phenylindole. Forsigtigt sætte en coverslip på toppen af montering medium, således at ingen luftbobler indlejret. Vent mindst 3 h for hærdning af montering medium før analysere cellerne af Fluorescens mikroskopi.
4. Analyse af γH2AX og 53BP1 Foci
- Fluorescens mikroskopi: analysere γH2AX og 53BP1 foci i cellekerner med et fluorescens mikroskop udstyret med filtre for DAPI, Alexa 488 og Cy3 under imaging på et 100 X mål forstørrelse. Optage billeder med et kamera og behandle billeder med passende billedbehandlingsprogrammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyse af γH2AX foci i celler er mest nøjagtige i den G0/G1 og G2 fase når γH2AX foci vises som adskilte fluorescerende prikker (figur 5A). Derimod kompliceres analyse af γH2AX foci i celler i S-fasen af spredte pan-nukleare γH2AX pletter forårsaget af replikering proces (figur 5B).
Fiksering af celler blev udført med 4% PFA (10 min) og permeabilization med 0,1% Octoxinol 9 (10 min). Methanol kan bruges til fiksering og permeabilization, også; men metanol kan bryde op cellekerner ganske alvorligt og smøre ud γH2AX foci, så γH2AX foci ikke vises muligvis særskilt i forhold til de γH2AX foci fremstillet ved behandling med 4% PFA og 0,1% Octoxinol 9.
Valg af effektive antistoffer er kritisk for effektiv immunofluorescens mikroskopi. Eksperimenter blev udført med en primær muse-antistof, monoklonale anti-γH2AX og en primær kanin polyklonale anti-53BP1 antistoffer for immunofluorescens farvning af γH2AX og 53BP1, henholdsvis.
Som hver γH2AX fokus anses for at repræsentere et enkelt DSB, skal immunofluorescens farvning af γH2AX bruges til kvantificering af DSB i bestrålede væv. Niveauer af γH2AX foci i bestrålede lymfocytter (figur 6) er proportional med bestråling dosis20,21. ΓH2AX foci kan opnå en maksimal allerede 5 min af bestråling20,22. Henfald af γH2AX foci på senere punkter i tid kan overvåges og afspejler reparation af DSB20,21,22.
Genetiske ustabilitet kan analyseres af kombinerede immunofluorescens farvning af γH2AX og 53BP1 i cellelinjer og tumor prøver10,11,12,13,14. En eksemplarisk analyse blev udført i CD34 + cellerne af en patient med akut myeloid leukæmi (figur 7). Co lokalisering af γH2AX og 53BP1 anført fremme af 53BP1-medieret NHEJ reparation mekanismer på lokaliteter af DSB mens HR blev forhindret. Procentdelen af lokalisering af co γH2AX og 53BP1 foci i eksplosionerne af akut myeloid leukæmi var dog variabel. ΓH2AX foci uden en yderligere 53BP1 signal kan har engageret HR til reparation af DSB i slutningen S/G2 fase. Rollen som ental 53BP1 foci forblev undvigende.
Figur 1: Kilder og konsekvenserne af endogene og eksogene DNA skader1,2,3,4. DSB, DNA dobbelt-strenget pauser; NHEJ, nonhomologous ende-sammenføjning.
Figur 2 : Skematisk oversigt over den store DNA dobbelt-strenget pause (DSB) reparation mekanismer i pattedyrsceller. Homologe rekombination bruger en intakt søster chromatid i slutningen S/G2 fase for potentielt fejlfri reparation af DSB. Nonhomologous ende-sammenføjning (NHEJ) er aktiv i hele cellecyklus og potentielt fejlbehæftet som par basepar kan være tilføjet eller resektion før ligatur af DSB ender. Alternative ende-sammenføjning er en langsom mutagene back-up reparation mekanisme, som kan være involveret i tilfælde af NHEJ mangel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Enhed for at forberede cytospins. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Forberedelse af cytospins. To cytospins af hver prøve er fremstillet ved centrifugering af 1,0 x 105 celler ved 300 x g i 10 min. En cytospin bruges til γH2AX immunofluorescens farvning og en anden cytospin er udnyttet til kombineret γH2AX og 53BP1 immunofluorescens farvning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Cellecyklus afhængige mønstre af γH2AX foci i normal fibroblaster af cellelinie NHDF. (A) γH2AX foci (grøn, Alexa 488) i kerner (blå, DAPI) af NHDF fibroblaster vises som adskilte prikker i G0/G1 eller G2 fase. (B) γH2AX foci i kerner af fibroblaster i S fase vises som spredte pan-nukleare prikker (skalalinjen = 5 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : ΓH2AX foci i x-ray bestrålet lymfocytter af en sund person. Billeder af γH2AX foci (grøn, Alexa 488) i kerner (blå, DAPI) af lymfocytter er indspillet på 5 min efter bestråling med 100 mGy (skalalinjen = 5 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Co lokalisering af γH2AX og 53BP1 foci i CD34 + celler af en patient med akut myeloid leukæmi. Co lokalisering af γH2AX foci (grøn, Alexa 488) og 53BP1 foci (rød, Cy3) angiver fremme af 53BP1-medieret nonhomologous at deltage i slutningen reparations-mekanismer på lokaliteter af DNA dobbelt-strenget pauser (skalalinjen = 5 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunfluorescens mikroskopi af γH2AX og 53BP1 er en nyttig metode til at analysere dannelse og reparation af DSB i et bredt spektrum af forskningsområder. Kritiske parametre, der påvirker resultatet af forsøgene er fasen af cellecyklus, de midler, som anvendes til fiksering og permeabilization af celler, valget af antistoffer, og hardware og software af fluorescens mikroskop.
Indflydelse af cellecyklus på γH2AX foci mønstre blev demonstreret af eksponentielt voksende normale fibroblaster af cellelinie NHDF. ΓH2AX foci optrådte som forskellige fluorescerende prikker i G0/G1 og G2 faser i forhold til spredte pan-nukleare γH2AX pletter i S fase (figur 5). Særskilte γH2AX foci i G0/G1 fase og i G2 fase angivne forbigående og/eller konstitutiv DNA skader, der kan have været erhvervet under gentagne cellecyklus passager; omvendt, de spredte pletter i S fase opstod kun forbigående og var formentlig knyttet til replikering proces. Som den pan-nukleare γH2AX pletter kan forstyrre anbefales analyse af ægte γH2AX foci, udelukkelsen af S fase celler fra analyse, som gøres let ved S fase specifikke γH2AX mønster. Alternativt, celler i S fase kan udelukkes ved måling af intensiteten af DAPI signal eller ved anvendelse af S fase specifikke markører (fxCyclin A). Induktion af vækst anholdelse med synkronisering af celler i G0/G1 fase kan endvidere være nyttigt før der udarbejdes en cytospins ved at gemme prøver ved stuetemperatur (dvs., 18-20 ° C) natten over.
Fiksering og permeabilization procedurer er kritisk trin i immunfarvning af γH2AX og 53BP1. Fiksering er nødvendigt at bevare morfologi og antigenicity af celler23. Permeabilization giver adgang til de intracellulære og nukleare antigener24. PFA er en forholdsvis blid agent for fiksering og stabiliserer celler samtidig bevare proteinstrukturer ved at reagere med grundlæggende aminosyrer til form methylen krydsbindinger. Efter fiksering med PFA, kan cytospins opbevares i dage og uger indtil videre forarbejdning. Til påvisning af γH2AX og 53BP1 skal cellerne være permeabilized. Octoxinol 9 blev brugt som et ikke-ionisk indeholdende tomt hydrofile hoved grupper bestående af polyoxyetylen fraspaltning vaskemiddel. Octoxinol 9 bryder op cellekerner forsigtigt og bevarer γH2AX foci ganske tydeligt. Alternativt, methanol kan bruges til fiksering og permeabilization af cellerne, også. Methanol udfældes proteiner og lipider fra cellens membran, hvilket gør dem gennemtrængelig for antistoffer er opløst. Men behandling med methanol er formentlig mere aggressive og γH2AX foci kan ikke vises som udpræget i forhold til de γH2AX foci fremstillet ved behandling med 4% PFA og 0,1% Octoxinol 9. Uanset spiller effektive antistoffer en central rolle for immunfarvning af γH2AX og 53BP1. Derfor brugen af påviste antistoffer anbefales (Se Tabel af materialer/udstyr). En seriel fortynding af antistofferne kan være nyttige for bestemmelse af optimal antistof.
ΓH2AX foci bruges som markør i stråling biodosimetry ved lave doser > 1 mGy25. ΓH2AX foci blev analyseret i lymfocytter på 5 min efter x-ray bestråling med en dosis på 100 mGy i vitro (figur 6). Som H2AX er fosforyleret hurtigt på lokaliteter af DSB efter bestråling, kan antallet af γH2AX foci allerede nå et maksimum på 5 min efter bestråling20,22. Men reparationsprocessen starter straks efter bestråling og γH2AX foci er fjernet ved en særskilt henfaldet. Derfor, for at overvåge antallet af γH2AX foci i kronologisk rækkefølge, det er tilrådeligt at afbryde reparationsprocessen ved at sætte prøven på is på det angivne punkt i tid efter bestråling.
Immunfluorescens mikroskopi af γH2AX og 53BP1 er en nyttig metode til at analysere genetiske ustabilitet i kræftceller. CD34 + celler blev beriget fra knoglemarven af en patient med akut myeloid leukæmi brug af CD34 microbeads. Billeder af γH2AX foci og 53BP1 foci blev opnået ved hjælp af specifikke fluorescens filtre. En lys belysning af cytospin er vigtigt at fremkalde passende fluorescens af γH2AX og 53BP1 foci. Efter optagelse af billede, er tilpasning af intensiteten af foci og baggrunden signal nødvendige ved hjælp af billedbehandling software. Til at analysere Co lokaliseringen af γH2AX og 53BP1 foci, billederne flettes (figur 7). En grundlæggende epifluorescensmikroskop udstyret med filtre for DAPI, Alexa 488 og Cy3 i kombination med et kamera-system og tænkelig programmel er tilstrækkelig til analyse af γH2AX og 53BP1 foci i DAPI farves cellekerner. Dog kan visse programmer (f.eks., analyse af DNA skade langs enkelt partikel spor) kræve højere opløsning og reduktion af baggrunden fluorescens (som fx som Konfokal laser scanning mikroskopi). Derudover mikroskop teknologi er en hurtigt udviklende område og en opløsning under 200 nm er muligt med state-of-the-art mikroskoper.
Sammenfattende dette manuskript fremhæver kritiske spørgsmål om DSB dannelse og reparation og giver en trinvis protokol for en detaljeret analyse af DSB ved immunfluorescens mikroskopi af γH2AX og 53BP1. Forskning på DSB vil klart drage fordel af seneste og fremtidige udvikling i mikroskop teknologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Projektet blev støttet af den tyske José Carreras leukæmi Foundation (DJCLS 14 R/2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
| Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
| Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
| Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
| Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
| Cytospin device | |||
| Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
| Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
| Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
| Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
| Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
| Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
| Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-31572 | Secondary antibody |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
| Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
| Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |
References
- Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Zeman, M. K., Cimprich, K. A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).
- IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf (1994).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).
- Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70. Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Scully, R., Xie, A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).
- Walters, D. K., et al. Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX. Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).
- Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).
- Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence. Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).
- Chen, E., et al. JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).
- Popp, H. D., et al. Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Leuk Res. 57, 112-118 (2017).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).
- Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Boyum, A. Separation of White Blood Cells. Nature. 204, 793-794 (1964).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
- Bain, B., Pshyk, K. Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).
- Popp, H. D., et al. Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology. Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).
- Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
- Lobrich, M., et al. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
- Rothkamm, K., Lobrich, M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).
