Summary
Dit manuscript biedt een protocol voor de analyse van DNA dubbele-strand einden door immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1.
Abstract
DNA dubbele-strand einden (DSB) zijn ernstige DNA-beschadigingen. Analyse van de vorming en de reparatie van DSB is relevant in een breed spectrum van onderzoek op gebieden zoals genoom integriteit genotoxiciteit, straling biologie, veroudering, kanker en Geneesmiddelenontwikkeling. In reactie op DSB, is de Histon H2AX phosphorylated op Serine 139 in een regio van verschillende megabase paren vormen discrete nucleaire foci aantoonbaar door immunofluorescentie microscopie. Bovendien is 53BP1 (p53 bindende eiwit 1) is een ander belangrijk DSB-responsieve eiwit bevordering van reparatie van DSB door nonhomologous einde-toe te treden terwijl het voorkomen van homologe recombinatie. Volgens de specifieke functies van γH2AX en 53BP1 kunnen de gecombineerde analyse van γH2AX en 53BP1 door immunofluorescentie microscopie een redelijke benadering voor een gedetailleerde analyse van DSB. Dit manuscript biedt een stapsgewijze protocol, aangevuld met methodische notities voor het uitvoeren van de techniek. Specifiek, blijkt de invloed van de celcyclus op γH2AX foci patronen in normale fibroblasten van de cellijn NHDF. Verder, is de waarde van de γH2AX foci een biomarker teljaren in x-ray bestraald lymfocyten bij een gezonde persoon. Tot slot wordt de genetische instabiliteit in CD34 + cellen van een patiënt met acute myeloïde leukemie onderzocht door immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1.
Introduction
DNA is permanent beschadigd door endogene (bv, replicatie stress, reactieve zuurstof soorten, intrinsieke instabiliteit van DNA) en exogene (bv, chemische radicalen, bestraling) bronnen (Figuur 1)1,2 ,3,4. Onder DNA schade, DNA dubbele-strand einden (DSB) zijn bijzonder ernstige letsels en kunnen leiden tot celdood of carcinogenese. Ongeveer 50 DSB voordoen per cel en celcyclus5. Bij zoogdiercellen homologe recombinatie (HR) en nonhomologous eind-verbinden (NHEJ) ontwikkeld als belangrijke trajecten voor de reparatie van DSB (Figuur 2). HR treedt op in laat S/G2-fase en maakt gebruik van een intact zus chromatide als een sjabloon voor reparatie mogelijk vrij van fouten. Ter vergelijking: NHEJ is actief gedurende de celcyclus en potentieel mutagene zoals basenparen kunnen worden toegevoegd of gereseceerd voordat Afbinding van de gebroken uiteinden. Daarnaast mogen alternatieve einde-toetreding worden gebruikt als een langzame mutagene reparatie van de back-up mechanisme in geval van NHEJ deficiëntie6,7.
DSB induceren de fosforylering van de Histon H2AX op Serine 139 in een regio van verschillende megabase paren rond elke DSB. De vormende nucleaire foci heten γH2AX foci en door immunofluorescentie microscopie8worden opgespoord. ΓH2AX bevordert de aanwerving van verdere DSB-responsieve eiwitten en is betrokken bij de chromatine remodeling, reparatie van DNA en signaaltransductie9. Zoals elke γH2AX focus wordt beschouwd als een enkele DSB vertegenwoordigen, is de kwantificering van DSB door immunofluorescentie microscopie het mogelijk, dat is aangetoond in kanker cellijnen en patiënt exemplaren10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 bindende eiwit 1) is een andere belangrijke eiwit in het bemiddelen van DSB reparatie. Het is betrokken bij de aanwerving van DSB-responsieve eiwitten, checkpoint signalering en de synapsis van DSB uiteinden15. Daarnaast speelt 53BP1 een cruciale rol bij de keuze van DSB reparatie traject. Er wordt de reparatie van DSB richting NHEJ gegenereerd terwijl HR verhinderd16 is. Gelet op de daadwerkelijke functies van γH2AX en 53BP1 in DSB reparatie, de gelijktijdige analyse van γH2AX en 53BP1 door immunofluorescentie microscopie mogelijk een handige methode voor de nauwkeurige analyse van de vorming en de reparatie van DSB.
Dit manuscript biedt een stapsgewijze protocol voor het uitvoeren van immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 in de celkernen. In het bijzonder wordt de techniek toegepast in normale fibroblasten voor de cellijn NHDF, x-ray bestraald lymfocyten van een gezond individu en CD34 + cellen van een patiënt met acute myeloïde leukemie. De details van de methode zijn gewezen in het kader van de gepresenteerde resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de ethische commissie II van de Mannheim van de medische faculteit van de Universiteit van Heidelberg. Schriftelijke toestemming is verkregen van alle individuen.
1. voorbereiding van materialen
- antistollingsmiddel stockoplossing: bereiden een anticoagulatie stockoplossing van 200 I.E. heparine per mL in natriumchloride 0,9%. Vul elk van de collectie buizen (tekenen volume 9 mL) met 2 mL van de anticoagulatie stockoplossing vóór terugtrekking van de monsters van bloed of beenmerg.
- Lysis oplossing voor rode bloedcellen: voorbereiden de 10 x lysis oplossing voor rode bloedcellen met 82.91 g ammoniumchloride, 7.91 g Ammoniumbicarbonaat en 2 mL 0,5 M ethyleendiamminetetra zure oplossing aan een pH van 8.0 door ontbinding van de agenten in tweemaal gedestilleerd water voor een totaal volume van 1 L.
- Fixatie oplossing: toevoegen 8.3 µL van een 1 M kaliumhydroxide-oplossing voor 360 mg paraformaldehyde (PFA) in een buis van de microtiterplaat. Vul de buis met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot de maatstreep met 1 mL van de buis en warmte de buis in een blok van de verwarming op 95 ° C om 1 mL van een oplossing van de PFA 36%. Breng de 1 mL 36% PFA oplossing over in een buis met een inhoud van 15 mL. 8 mL PBS aan de 1 mL 36% PFA oplossing, om 9 mL van een 4% PFA stockoplossing toevoegen. Aliquot de 4% PFA stockoplossing en winkel bij-18 ° C tot voor fixatie van de cellen gebruiken.
Let op: 1) kaliumhydroxideoplossing is corrosief. Zich bewust zijn van de bescherming van de ogen en huid. 2) PFA is kankerverwekkend. Vermijd contact met de huid en inhalatie. Bereid de oplossing van de fixatie onder een motorkap. - Permeabilization oplossing: toevoegen 50 µL Octoxinol 9 tot en met 50 mL PBS om een oplossing van ongeveer 0,1% Octoxinol 9.
- Blokkeren oplossing: bereiden van 5% en 2% voor het blokkeren van oplossingen door het mengen van de blokkerende agent van eiwit met PBS en winkel op 6 – 8 ° C.
2. Bereiding van de monsters
- fibroblasten in celkweek: cultiveren van menselijke fibroblasten voor de cellijn NHDF in een bevochtigde 5% CO 2 atmosfeer bij 37 ° C in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 4 mM glutamine, en 1% penicilline/streptomycine.
- Voorbereiding van een microscoopglaasje met aanhanger fibroblasten
- Verwijder het medium van de kolf (75 cm 2 groeigebied) met een exponentieel groeiende NHDF fibroblasten. Voeg aan de maatkolf toe 10 mL PBS. Wassen van de aanhangend fibroblasten zachtjes door handmatig schudden de kolf gedurende 1 min.
- Verwijder van de PBS en voeg 1 mL trypsine in de kolf. Schud de kolf voorzichtig om ervoor te zorgen dat alle aanhangend cellen trypsine vallen. Verwijder de Trypsine van de kolf. Zet de kolf in de incubator gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Neem de kolf uit de incubator en voeg 10 mL RPMI 1640 medium in de kolf. Pipetteer van het medium op en neer meerdere malen te verspreiden van de fibroblasten.
- Pipetteer 0.3 mL van de verspreide fibroblasten op elk van de twee velden van het microscoopglaasje en zet de dia in de incubator voor 24u zodat de fibroblasten aan de dia houden. Voor immunokleuring van γH2AX en 53BP1 in de kernen van fibroblasten, gaan naar stap 3.1.
- Voorbereiding van een microscoopglaasje met aanhanger fibroblasten
- Patiënt monsters
- bloed monsters: gebruik van de collectie buizen die voorheen waren opgevuld met 2 mL van de stockoplossing voor anticoagulatie en voeg 7 mL bloed in de buizen. Bewaar de monsters 's nachts bij kamertemperatuur (d.w.z., 18-20 ° C). De volgende dag, isoleren de G0/G1-fase rusten mononucleaire cellen door dichtheid kleurovergang centrifugeren (stap 2.2.3).
- Het beenmerg monsters: gebruik van de collectie buizen die voorheen waren opgevuld met 2 mL van de stockoplossing anticoagulatie (stap 1.1) en 7 mL beenmerg toevoegen in de buizen. Bewaar de monsters 's nachts bij kamertemperatuur (d.w.z., 18-20 ° C). De volgende dag, isoleren de G0/G1-fase rusten mononucleaire cellen door dichtheid kleurovergang centrifugeren (stap 2.2.3). Gebruik CD34 microbeads en cel scheiding kolommen voor de isolatie van de CD34 +-cellen.
- Isolatie van mononucleaire cellen door dichtheid kleurovergang centrifugeren
Opmerking: Mononucleaire cellen zijn geïsoleerd uit bloed en beenmerg monsters door dichtheid kleurovergang centrifugeren 17 , 18 , 19.- Dilute het EDTA bloedmonster in een verhouding van 1:1 met PBS en het beenmerg EDTA monster in een verhouding van 1:3 met PBS. Opschorten van de cellen zachtjes door het tekenen van segmenten in en uit de pipet tweemaal. Een volume van de kleurovergang medium dichtheid toevoegen
- aan een verse buis. Zachtjes laag het verdunde bloed of beenmerg bovenop het verloop medium dichtheid. Wees voorzichtig niet te mengen de twee lagen.
- Centrifugeren de buis gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en 400 x g. tekent de bovenste plasma laag af met de pipet. Vervolgens oogst zorgvuldig de mononucleaire cellen in de laag boven het verloop medium dichtheid. Breng de mononucleaire cellen in een verse buis. Ten minste drie volumes van PBS toevoegen
- aan de mononucleaire cellen in de buis. Opschorten van de cellen zachtjes door het tekenen van segmenten in en uit de pipet twee keer. Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en 400 x g.
- Na de spin het supernatant verwijderen en voeg 10 mL van 4 ° C, 1 x lysis oplossing voor rode bloedcellen. Resuspendeer de cellen zachtjes door het tekenen van segmenten in en uit de pipet twee keer, en plaats de buis op ijs gedurende 5 minuten. Klik Voeg toe 30 mL PBS bij 4 ° C en centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en 400 x g.
- Voorbereiding van de cytospins
- twee cytospins met mononucleaire cellen van de patiënt monsters (dat wil zeggen, een cytospin voor γH2AX immunofluorescentie kleuring en een cytospin voor γH2AX en 53BP1 voor te bereiden gecombineerd immunofluorescentie kleuring) door middel van centrifugeren (300 x g, 10 min) van 1,0 x 10 5 cellen voor elk preparaat ( Figuur 3 en 4).
3. γH2AX en 53BP1 immunofluorescentie kleuring
- fixatie en permeabilization: herstellen van de cellen met de 200 µL van 4% PFA gedurende 10 minuten. Na fixatie, wassen de cellen zachtjes driemaal met 30 mL PBS gedurende 5 minuten op een lab-shaker. Dan permeabilize de cellen met 200 µL van 0,1% Octoxinol 9 voor 10 min. Spoel de cellen zachtjes driemaal met 30 mL van blokkerende 5%-oplossing gedurende 5 minuten op een lab-shaker. Blokkeren van de cellen in 30 mL vers 5% blokkeren oplossing voor 1 h.
- Incubatie met de antilichamen
- broeden één preparaat van de cellen met een muis monoklonaal anti-γH2AX antistof (1:500) en de andere voorbereiding van de cellen met een muis monoklonaal anti-γH2AX antistof (1:500) en een Polyclonal konijn van het antilichaam van anti-53BP1 (1:500) 's nachts bij 4 ° C.
- Na incubatie wassen de cellen zachtjes 3 keer met 30 mL van blokkerende 2%-oplossing gedurende elke 5 minuten op een lab-shaker.
- Verwijderen van de blokkerende oplossing en Incubeer de eerste voorbereiding van de cellen met een Alexa488-geconjugeerde geit anti-muis secundair antilichaam (1:500) en de tweede voorbereiding van de cellen met een Alexa488-geconjugeerde geit anti-muis secundair antilichaam ( 1:500) en een Alexa555-geconjugeerde ezel anti-konijn secundair antilichaam (1:500) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Montage medium: zet de dia met de cellen in een kom en spoel de cellen zachtjes driemaal met 30 mL PBS voor elke 5 min op een lab-shaker. De PBS verwijderen en monteren van de cellen met montage medium dat 4,6-diamidino-2-phenylindole. Voorzichtig zetten een dekglaasje aan op de top van het montage-medium, zodat er geen luchtbellen zijn ingesloten. Wacht ten minste 3 h voor verharding van het montage-medium voor het analyseren van de cellen door fluorescentie microscopie.
4. Analyse van γH2AX en 53BP1 Foci
- fluorescentie microscopie: analyseren van de γH2AX en 53BP1 foci in de celkernen met een fluorescentie Microscoop uitgerust met filters voor DAPI, Alexa 488 en Cy3 tijdens beeldvorming op een 100 X-doelstelling vergroting. Beelden met een camera registreren en verwerken van de beelden met passende imagingsoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyse van γH2AX foci in cellen is nauwkeurigste in de G0/G1-fase en de G2-fase als γH2AX foci worden weergegeven als verschillende TL stippen (figuur 5A). In tegenstelling, wordt analyse van γH2AX foci in cellen in de S-fase bemoeilijkt door verspreide pan-nucleaire γH2AX spikkels veroorzaakt door het replicatieproces (figuur 5B).
Fixatie van de cellen is uitgevoerd met 4% PFA (10 min) en permeabilization met 0,1% Octoxinol 9 (10 min). Methanol kan worden gebruikt voor fixatie en permeabilization, ook; echter, methanol kan breken de celkernen heel ernstig en uitstrijkje uit de γH2AX foci zodat de γH2AX foci verschijnen niet onderscheiden in vergelijking met de γH2AX foci verkregen door behandeling met 4% PFA en 0,1% Octoxinol 9.
De keuze van efficiënte antilichamen is essentieel voor effectieve immunofluorescentie microscopie. Experimenten werden uitgevoerd met een antilichaam primaire muisknop monoklonaal anti-γH2AX en een primaire konijn polyklonale anti-53BP1 antilichaam voor immunofluorescentie kleuring van γH2AX en 53BP1, respectievelijk.
Zoals elke γH2AX focus wordt beschouwd als een enkele DSB vertegenwoordigen, kan immunofluorescentie kleuring van γH2AX worden gebruikt voor de kwantificering van DSB in het bestraalde weefsel. Niveaus van γH2AX foci in bestraalde lymfocyten (Figuur 6) zijn in verhouding tot de bestraling dosis20,21. ΓH2AX foci kunnen bereiken een maximale al 5 min van bestraling20,22. Het verval van γH2AX foci op latere tijdstippen in tijd kan worden gecontroleerd en weerspiegelt de reparatie van DSB20,21,22.
Genetische instabiliteit kan worden geanalyseerd door gecombineerde immunofluorescentie kleuring van γH2AX en 53BP1 in de cellijnen en tumor exemplaren10,11,12,13,14. Een voorbeeldige analyse werd uitgevoerd in de CD34 + cellen van een patiënt met acute myeloïde leukemie (Figuur 7). Co lokalisatie van γH2AX en 53BP1 aangegeven bevorderingvan NHEJ herstelmechanismes 53BP1-gemedieerde op sites van DSB terwijl HR werd verhinderd. Echter was het percentage mede lokaliseren γH2AX en 53BP1 foci in ontploffing van acute myeloïde leukemie variabele. De γH2AX foci zonder een extra 53BP1 signaal kunnen aangegaan HR voor de reparatie van DSB laat S/G2-fase. De rol van enkelvoud 53BP1 foci bleef ongrijpbaar.
Figuur 1: Bronnen en gevolgen van endogene en exogene DNA schade1,2,3,4. DSB, DNA dubbele fronten pauzes; NHEJ, nonhomologous einde-bundelen.
Figuur 2 : Schematische weergave van de grote pauze van de DNA dubbele-strand (DSB) herstelmechanismen in zoogdiercellen. Homologe recombinatie gebruikt een intact zus chromatide in laat S/G2-fase voor potentieel foutloos reparatie van DSB. Nonhomologous einde-deelnemen aan (NHEJ) is actief in heel de celcyclus en potentieel foutgevoelige als paar basenparen kunnen worden toegevoegd of gereseceerd voordat Afbinding van de DSB-uiteinden. Alternatieve einde-deelnemen is een langzame mutagene reparatie van de back-up-mechanisme dat kan worden ingezet in het geval van deficiëntie van de NHEJ. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Apparaat voor het voorbereiden van de cytospins. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Voorbereiding van de cytospins. Twee cytospins van elk monster worden voorbereid door centrifugeren van 1,0 x 105 cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten. Een cytospin wordt gebruikt voor γH2AX immunofluorescentie kleuring en een ander cytospin wordt gebruikt voor de gecombineerde γH2AX en 53BP1 immunofluorescentie kleuring. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Celcyclus afhankelijke patronen van γH2AX foci in normale fibroblasten van de cellijn NHDF. (A) γH2AX foci (groen, Alexa 488) in kernen (blauw, DAPI) van NHDF fibroblasten weergegeven als afzonderlijke puntjes in G0/G1 of G2 fase. (B) γH2AX foci in de kernen van de fibroblasten in de S-fase weergegeven als verspreide pan-nucleaire spikkels (schaal bar = 5 µm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : ΓH2AX foci in x-ray bestraald lymfocyten bij een gezonde persoon. De beelden van γH2AX foci (groen, Alexa 488) in kernen (blauw, DAPI) van lymfocyten worden afgelezen op 5 min na bestraling met 100 mGy (schaal bar = 5 µm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : Co lokalisatie van γH2AX en 53BP1 foci in CD34 + cellen van een patiënt met acute myeloïde leukemie. Co lokalisatie van γH2AX foci (groen, Alexa 488) en 53BP1 foci (rood, Cy3) geeft aan dat de bevordering van 53BP1-gemedieerde nonhomologous einde-toetreding herstelmechanismes op sites van DNA dubbele-strand einden (schaal bar = 5 µm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 is een handige methode voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DSB in een breed spectrum van onderzoeksgebieden. Kritische parameters die invloed hebben op de resultaten van de experimenten zijn de fase van de celcyclus, de stoffen die worden gebruikt voor de fixatie en permeabilization van de cellen, de keuze van de antilichamen, en de hardware en software van de fluorescentie Microscoop.
De invloed van de celcyclus op γH2AX foci patronen werd aangetoond door een exponentieel groeiende normale fibroblasten van de cellijn NHDF. De γH2AX foci verscheen als verschillende TL stippen in de G0/G1 en de fasen van de G2 in vergelijking tot de verspreide pan-nucleaire γH2AX spikkels in S fase (Figuur 5). De verschillende γH2AX foci in de G0/G1 fase en in G2 fase aangegeven voorbijgaande en/of constitutieve DNA schade die zou zijn verkregen tijdens herhaalde celcyclus passages; daarentegen de verspreide spikkels in de S-fase is alleen Transient opgetreden en werden vermoedelijk geassocieerd met het replicatieproces. De pan-nucleaire γH2AX spikkels kunnen verstoren de analyse van de echte γH2AX foci, de uitsluiting van cellen in de S fase van analyse is het raadzaam, die gemakkelijk wordt gedaan door de S-fase specifieke γH2AX-patroon. Alternatief, kunnen de cellen in de S-fase worden uitgesloten door meting van de intensiteit van het signaal van de DAPI of door toepassing van de S fase specifieke markers (b.v.Cyclin A). Bovendien, de inductie van de arrestatie van de groei met synchronisatie van cellen in G0/G1-fase nuttig kan zijn voor de voorbereiding van de cytospins door de opslag van de monsters bij kamertemperatuur (d.w.z., 18-20 ° C) 's nachts.
De procedures van fixatie en permeabilization zijn kritische stappen in immunokleuring van γH2AX en 53BP1. Fixatie is nodig voor het behoud van de morfologie en de antigenicity van de cellen23. Permeabilization maakt toegang tot de intracellulaire en nucleaire antigenen24. PFA is een relatief zachte agent voor fixatie en cellen met behoud van eiwit structuren door te reageren met fundamentele aminozuren te formulier methyleen crosslinks stabiliseert. Na fixatie met PFA, kunnen cytospins worden opgeslagen voor dagen en weken totdat zij worden verwerkt. Voor de detectie van γH2AX en 53BP1 moeten de cellen worden permeabel. Octoxinol 9 werd gebruikt als een niet-ionogene detergenten die ongeladen hydrofiele kop groepen bestaande uit polyoxyethyleen wordt. Octoxinol 9 breekt de celkernen voorzichtig en behoudt γH2AX foci heel duidelijk. Als alternatief, methanol kan worden gebruikt voor de fixatie en permeabilization van de cellen, ook. Methanol precipitaten van eiwitten en lipiden van de celmembraan, waardoor ze antilichamen luchtdoorlatend oplost. Echter, behandeling met methanol is vermoedelijk agressiever en γH2AX foci verschijnen niet als duidelijk in vergelijking met de γH2AX foci verkregen door behandeling met 4% PFA en 0,1% Octoxinol 9. Niettegenstaande sleutelrol efficiënte antilichamen een voor de immunokleuring van γH2AX en 53BP1. Dus, het gebruik van bewezen antistoffen wordt aanbevolen (Zie Tabel van materialen/uitrusting). Een seriële verdunning van de antilichamen kan nuttig zijn voor bepaling van de concentraties van de optimale antilichaam.
ΓH2AX foci worden gebruikt als een marker in straling biodosimetry bij lage doses > 1 mGy25. ΓH2AX foci werden geanalyseerd in lymfocyten op 5 min na x-ray bestraling met een dosis van 100 mGy in vitro (Figuur 6). Als H2AX is snel op sites van DSB phosphorylated na bestraling, het aantal γH2AX foci kan al oplopen tot maximaal om 5 min na bestraling20,22. Echter het herstelproces begint direct na de bestraling en γH2AX foci worden verwijderd in een afzonderlijke verval-tempo. Daarom voor de controle van het aantal γH2AX foci in chronologische volgorde, is het raadzaam om het herstelproces te onderbreken door de invoering van het monster op het ijs op het opgegeven punt in de tijd na bestraling.
Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 is een handige methode voor het analyseren van de genetische instabiliteit in kankercellen. CD34 + cellen werden verrijkt uit het beenmerg van een patiënt met acute myeloïde leukemie met behulp van CD34 microbeads. Beelden van γH2AX foci en 53BP1 foci werden verkregen met behulp van specifieke fluorescentie filters. Een heldere verlichting van de cytospin is belangrijk voor het opwekken van voldoende fluorescentie van de γH2AX en 53BP1 foci. Na het opnemen van de afbeelding, is de aanpassing van de intensiteit van de foci en de achtergrond-signaal nodig met behulp van het imaging software. Voor het analyseren van de co lokalisatie van γH2AX en 53BP1 foci, de beelden worden samengevoegd (Figuur 7). Een fundamentele epifluorescence Microscoop uitgerust met filters voor DAPI, Alexa 488 en Cy3 in combinatie met een camerasysteem en beeldbewerkingssoftware is voldoende voor de analyse van γH2AX en 53BP1 foci in DAPI gekleurd celkernen. Bepaalde toepassingen (bv, analyse van DNA-schade langs één deeltje sporen) kunnen echter hogere resolutie en vermindering van de fluorescentie van de achtergrond (zoals die bijvoorbeeld door confocale laser scanning microscopie). Bovendien, Microscoop technologie is een zich snel ontwikkelende gebied en een resolutie onder 200 nm is haalbaar met state-of-the-art microscopen.
Kortom, dit manuscript hoogtepunten van kritieke problemen van DSB vorming en de reparatie en een stapsgewijze protocol voorziet een gedetailleerde analyse van DSB door immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1. Het onderzoek op DSB zullen duidelijk profiteren van de recente en toekomstige ontwikkelingen in de technologie van de Microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het project werd ondersteund door de Duitse José Carreras leukemie Stichting (DJCLS 14 R/2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
| Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
| Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
| Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
| Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
| Cytospin device | |||
| Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
| Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
| Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
| Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
| Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
| Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
| Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-31572 | Secondary antibody |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
| Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
| Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |
References
- Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Zeman, M. K., Cimprich, K. A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).
- IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf (1994).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).
- Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70. Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Scully, R., Xie, A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).
- Walters, D. K., et al. Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX. Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).
- Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).
- Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence. Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).
- Chen, E., et al. JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).
- Popp, H. D., et al. Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Leuk Res. 57, 112-118 (2017).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).
- Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Boyum, A. Separation of White Blood Cells. Nature. 204, 793-794 (1964).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
- Bain, B., Pshyk, K. Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).
- Popp, H. D., et al. Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology. Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).
- Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
- Lobrich, M., et al. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
- Rothkamm, K., Lobrich, M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).
