Summary
Este manuscrito fornece um protocolo de análise de quebras de DNA dobro-costa pela microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1.
Abstract
Quebras de DNA dobro-Costa (DSB) são graves lesões do ADN. Análise da formação e reparação do DSB é relevante em um amplo espectro de domínios de investigação, incluindo a integridade do genoma, genotoxicidade, biologia da radiação, envelhecimento, câncer e desenvolvimento de drogas. Em resposta ao ORL, o histona H2AX é fosforilado em serina 139 em uma região de vários pares de megabase formando discretos focos nucleares detectáveis pela microscopia de imunofluorescência. Além disso, 53BP1 (p53 binding protein 1) é outra importante proteína DSB-responsivo promover a reparação de DSB, juntando-se não-homólogos final-evitando a recombinação homóloga. De acordo com as funções específicas de γH2AX e 53BP1, a análise combinada de γH2AX e 53BP1 por microscopia de imunofluorescência pode ser uma abordagem razoável para uma análise detalhada de ORL. Este manuscrito fornece um protocolo passo a passo, complementado com notas metódicas para executar a técnica. Especificamente, a influência do ciclo celular em padrões de focos γH2AX é demonstrada em fibroblastos normais da linha celular NHDF. Além disso, o valor dos focos de γH2AX como um biomarcador é retratado em linfócitos de raio-x irradiado de um indivíduo saudável. Finalmente, a instabilidade genética é investigada em células CD34 + de um paciente com leucemia mieloide aguda por microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1.
Introduction
O DNA é danificado continuamente por endógenos (por exemplo, estresse de replicação, espécies reativas de oxigênio, instabilidade intrínseca do DNA) e exógenos (por exemplo, os radicais químicos, irradiação) fontes (Figura 1)1,2 ,3,4. Entre os danos do DNA, DNA dupla quebras (DSB) são particularmente graves lesões e podem induzir a morte celular ou carcinogênese. Cerca de 50 DSB pode surgir por célula e ciclo celular5. Em células de mamíferos, recombinação homóloga (HR) e não-homólogos final-adesão (NHEJ) desenvolveram-se como principais vias para a reparação de ORL (Figura 2). RH ocorre no final da fase S/G2 e usa uma irmã intacta cromátides irmãs como um modelo para reparação potencialmente livre de erros. Em comparação, NHEJ é ativo ao longo do ciclo celular e potencialmente mutagénicas como pares de base pode ser adicionados ou ressecados antes da ligadura das extremidades quebradas. Além disso, final alternativo-adesão pode ser contratado como um mecanismo lento mutagénicas backup reparação em caso de deficiência NHEJ6,7.
DSB induzir a fosforilação da histona H2AX em serina 139 em uma região de vários pares de megabase ao redor de cada DSB. Os focos de formação nucleares são denominados focos de γH2AX e são detectáveis por microscopia de imunofluorescência8. ΓH2AX promove o recrutamento de mais proteínas DSB-responsiva e está envolvido na cromatina remodelação, reparação de DNA e de transdução de sinal9. Como cada foco de γH2AX é considerado para representar um único DSB, a quantificação do DSB por microscopia de imunofluorescência é possível, que tem sido demonstrada em linhas de células de câncer e espécimes paciente10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 binding protein 1) é outra proteína-chave na mediação reparação de ORL. Está envolvido no recrutamento de DSB-responsivo proteínas, sinalização de ponto de verificação e a sinapse de ORL termina15. Além disso, 53BP1 desempenha um papel crítico na escolha de caminho de reparação de ORL. Ele aciona a reparação de ORL para NHEJ enquanto HR é impedido de16. Considerando as funções genuínas de γH2AX e 53BP1 no reparo DSB, a análise simultânea de γH2AX e 53BP1 por microscopia de imunofluorescência pode ser um método útil para a análise precisa da formação e reparação de ORL.
Este manuscrito fornece um protocolo passo a passo para a realização de microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 no núcleo de células. Especificamente, a técnica é aplicada em fibroblastos normais da linha celular NHDF, em linfócitos de raio-x irradiado de um indivíduo saudável e em células CD34 + de um paciente com leucemia mieloide aguda. Os detalhes do método são apontados no contexto dos resultados apresentados.
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Protocol
todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê ética II de a Mannheim faculdade médica da Universidade de Heidelberg. Escrito foi obtido o consentimento de todos os indivíduos.
1. preparação de materiais
- solução anticoagulante: preparar uma solução anticoagulante de 200 heparina UI / mL de cloreto de sódio 0,9%. Encha cada um dos tubos de coleta (desenhar volume 9 mL) com 2 mL da solução anticoagulante antes da retirada das amostras de sangue ou de medula óssea.
- Solução de lise de eritrócitos: preparar a 10 x solução de lise de eritrócitos com 82,91 g de cloreto de amônio, bicarbonato de amónio 7,91 g e 2 mL de solução de ácido etilenodiaminotetracético 0,5 M para um pH 8.0, dissolvendo os agentes em água bidestilada, para um volume total de 1 L.
- Solução de fixação: adicionar 8,3 µ l de uma solução de hidróxido de potássio 1m de paraformaldeído 360 mg (PFA) em um tubo de microtitulação. Encha o tubo com solução salina tamponada fosfato (PBS) até a marca de 1 mL do tubo e calor do tubo em um bloco de aquecimento a 95 ° C para 1 mL de uma solução PFA de 36%. Transferi a solução PFA 36% 1 mL para um tubo com uma capacidade de 15 mL. Adicione 8 mL de PBS para a solução PFA de 36% de 1 mL, para obter 9 mL de uma solução stock de PFA 4%. Alíquota da solução estoque de PFA de 4% e loja a-18 ° C até usam para a fixação das células.
Cuidado: solução 1) hidróxido de potássio é corrosiva. Esteja ciente de proteção da pele e olhos. 2) PFA é cancerígeno. Evite a inalação e contacto com a pele. Preparar a solução de fixação sob um capô. - Solução de permeabilização: adicionar 50 µ l Octoxinol 9 a 50 mL PBS para obter uma solução de aproximadamente 0,1% Octoxinol 9.
- Obstrui a solução: preparar 5% e 2% de bloqueio soluções misturando o agente bloqueio de proteína com PBS e loja em 6 – 8 ° C.
2. Preparação das amostras
- fibroblastos em cultura de células: cultivar fibroblastos humanos da linha celular NHDF em um umidificado 5% CO 2 atmosfera a 37 ° C em meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro fetal bezerro, 4 mM glutamina e 1% penicilina/estreptomicina.
- a preparação de uma lâmina de microscópio com aderente fibroblastos
- remover o meio do balão (área de crescimento de 2 de 75 cm), com crescimento exponencial fibroblastos NHDF. Adicione 10 mL de PBS no balão. Lave os fibroblastos aderentes suavemente agitando manualmente o frasco de 1 min.
- Remover a PBS e adicionar tripsina 1 mL para o frasco. Agite o frasco com cuidado para assegurar que todas as células aderentes são cobertas por tripsina. Retire o balão a tripsina. Colocar o balão em incubadora para 5 min a 37 ° C.
- Tomar o frasco fora da incubadora e adicionar 10 mL de RPMI 1640 de meio para o balão. Pipetar o meio subindo e descendo várias vezes para dispersar os fibroblastos.
- Pipetar 0,3 mL dos fibroblastos dispersos em cada um dos dois campos da lâmina de microscópio e colocar o slide em incubadora para 24h para que os fibroblastos aderirem ao slide. Para imunocoloração de γH2AX e 53BP1 em núcleos de fibroblastos, avançar para o passo 3.1.
- a preparação de uma lâmina de microscópio com aderente fibroblastos
- Amostras de pacientes
- amostras de sangue: usar os tubos de coleta que foram preenchidos com 2 mL da solução anticoagulante e adicionar sangue 7 mL para os tubos. Armazene as amostras durante a noite em temperatura ambiente (ou seja, 18-20 ° C). No dia seguinte, isolar a fase G0/G1 descansando células mononucleares por centrifugação gradiente de densidade (etapa 2.2.3).
- Amostras de medula óssea: usar os tubos de coleta que foram preenchidos com 2 mL da solução anticoagulante (etapa 1.1) e adicionar 7 mL medula para os tubos. Armazene as amostras durante a noite em temperatura ambiente (ou seja, 18-20 ° C). No dia seguinte, isole a fase G0/G1 descansando células mononucleares por centrifugação gradiente de densidade (etapa 2.2.3). Use microbeads CD34 e colunas de separação para o isolamento de células CD34 + da pilha.
- Isolamento de células mononucleares por centrifugação gradiente de densidade
Nota: As células mononucleares são isoladas de amostras de sangue e medula óssea por centrifugação gradiente de densidade 17 , 18 , 19.- Diluir a amostra de sangue heparinizado em uma proporção de 1:1 com PBS e a amostra heparinizada medula óssea na proporção de 1:3 com PBS. Suspender as células suavemente desenhando-as dentro e fora da pipeta duas vezes.
- Adicionar um volume de meio de gradiente de densidade para um tubo de fresco. Camada delicadamente o sangue diluído ou medula óssea em cima do meio de gradiente de densidade. Tome cuidado para não misturar as duas camadas.
- Centrifugar o tubo durante 30 min à temperatura ambiente e 400 g. x desviar a camada superior de plasma com a pipeta. Então, cuidadosamente Colha as células mononucleares na camada acima do meio de gradiente de densidade. Transferir as células mononucleares em um tubo fresco.
- Adicionar pelo menos três volumes de PBS para as células mononucleares no tubo. Suspenda as células suavemente desenhando-as dentro e fora da pipeta duas vezes. Centrifugar o tubo para 10 min a temperatura ambiente e 400 g. x
- Após o spin remover o sobrenadante e adicionar 10 mL de 4 ° C, 1 x solução de lise de eritrócitos. Ressuspender as células suavemente desenhando-as dentro e fora da pipeta duas vezes e colocar o tubo no gelo por 5 min. Em seguida, adicionar 30 mL de PBS a 4 ° C e centrifugar o tubo para 10 min a temperatura ambiente e 400 g. x
- Preparação da cytospins
- preparar dois cytospins com células mononucleares das amostras (ou seja, um cytospin para coloração de imunofluorescência de γH2AX e um cytospin para γH2AX e 53BP1 combinado a mancha da imunofluorescência) por centrifugação (300 x g, 10 min) de 1,0 x 10 5 células para cada preparação ( Figura 3 e 4).
3. γH2AX e coloração de imunofluorescência de 53BP1
- fixação e permeabilização: consertar as células com 200 µ l de 4% PFA por 10 min. Após a fixação, lave suavemente as células três vezes com 30 mL de PBS por 5 min num agitador de laboratório. Em seguida, permeabilize as células com 200 µ l de 0.1% Octoxinol 9 de 10 min. lavar as células suavemente três vezes com 30 mL de solução de bloqueio de 5% por 5 min num agitador de laboratório. Bloquear as células em 30 mL de fresco 5%, que obstrui a solução por 1 h.
- De incubação com anticorpos
- incuba uma preparação das células com um anticorpo monoclonal anti-γH2AX de rato (1: 500) e a outra preparação das células com um anticorpo monoclonal anti-γH2AX de rato (1: 500) e um anticorpo de coelho policlonal anti-53BP1 (1: 500) durante a noite em 4 ° C.
- Após incubação lavar as células suavemente 3 vezes com 30 mL de solução de bloqueio de 2% por cada 5 min em um shaker laboratório.
- Remover a solução de bloqueio e incubar a primeira preparação das células com um anticorpo secundário de anti-rato conjugada Alexa488 cabra (1: 500) e a segunda preparação das células com uma cabra Alexa488-conjugado anticorpo secundário anti-rato ( 1: 500) e um burro Alexa555-conjugado anticoelho anticorpo secundário (1: 500) por 1h à temperatura ambiente.
- Meio de montagem: Coloque o slide com as células em uma tigela e lave as células suavemente três vezes com 30 mL de PBS para cada 5 min num agitador de laboratório. Remover a PBS e montar as células com o meio de montagem contendo 4,6-diamidino-2-phenylindole. Cautelosamente, colocar uma lamela em cima do meio de montagem para que nenhuma bolha de ar incorporado. Espere pelo menos 3 h para endurecimento do meio de montagem antes de analisar as células por microscopia de fluorescência.
4. Análise de γH2AX e 53BP1 focos
- microscopia de fluorescência: analisar os focos de γH2AX e 53BP1 no núcleo de células com um microscópio de fluorescência, equipado com filtros para DAPI, Alexa 488 e Cy3 durante a imagem latente em um objetivo X 100 ampliação. Gravar imagens com uma câmera e processar as imagens com o software de imagem adequado.
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Representative Results
Análise dos focos de γH2AX nas células é mais preciso na fase G0/G1 e a G2 fase quando γH2AX focos aparecem como distintos pontos fluorescentes (Figura 5A). Em contraste, análise dos focos de γH2AX nas células durante a fase S é complicado por manchas dispersas γH2AX pan-nuclear causadas pelo processo de replicação (Figura 5B).
Fixação das células foi realizada com 4% PFA (10 min) e permeabilização com 0,1% Octoxinol 9 (10 min). Metanol pode ser usado para fixação e permeabilização, também; no entanto, metanol pode romper o núcleo de células muito severamente e espalhar para fora os focos de γH2AX para os focos de γH2AX podem não aparecer distintos quando comparado com os focos de γH2AX obtidos por tratamento com 4% PFA e 0,1% Octoxinol 9.
A escolha de anticorpos eficientes é fundamental para a microscopia de imunofluorescência eficaz. Foram realizados experimentos com um anticorpo monoclonal anti-γH2AX do mouse principal e um anticorpo primário policlonal anti-53BP1 para a mancha da imunofluorescência de γH2AX e 53BP1, respectivamente.
Como cada foco de γH2AX é considerado para representar um único DSB, mancha da imunofluorescência de γH2AX pode ser usado para a quantificação de ORL em tecidos irradiados. Níveis de γH2AX focos em linfócitos irradiados (Figura 6) são proporcionais a dose de irradiação20,21. Focos de γH2AX podem atingir um máximo já a 5 min de irradiação20,22. A decadência dos γH2AX focos em pontos mais tarde no tempo pode ser monitorizada e reflete a reparação do DSB20,21,22.
Instabilidade genética pode ser analisada por imunofluorescência combinada coloração de γH2AX e 53BP1 em linhas celulares e tumor espécimes10,11,12,13,14. Realizou-se uma análise exemplar nas células CD34 + de um paciente com leucemia mieloide aguda (Figura 7). Localização co de γH2AX e 53BP1 indicado promoção da mediada por 53BP1 mecanismos de reparo NHEJ nos locais de ORL enquanto HR foi impedido. No entanto, a percentagem de co-financiamento localização γH2AX e 53BP1 focos em explosões de leucemia mieloide aguda foi variável. Os focos de γH2AX sem um sinal adicional 53BP1 podem ter envolvido HR para o reparo de ORL no final da fase S/G2. O papel dos focos 53BP1 singular permaneceu indescritível.
Figura 1: Fontes e consequências de DNA exógeno e endógeno danificam1,2,3,4. DSB, quebras de DNA dobro-costa; NHEJ, não-homólogos final-adesão.
Figura 2 : Visão esquemática da ruptura grande DNA dobro-Costa (DSB) reparação mecanismos em células de mamíferos. Recombination homologous usa uma irmã intacta cromátides irmãs no final da fase S/G2 para reparação potencialmente livre de erros de ORL. Não-homólogos final-adesão (NHEJ) é ativo ao longo do ciclo celular e potencialmente sujeito a erros como alguns pares de base pode ser adicionados ou ressecados antes da ligadura das extremidades DSB. Final alternativo-adesão é um mecanismo de lento mutagénicas reparação de backup que possa estar envolvido no caso de deficiência NHEJ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Dispositivo para preparar a cytospins. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Preparação do cytospins. Dois cytospins de cada amostra são preparados por centrifugação de 1,0 x 105 células em 300 x g durante 10 minutos. Um cytospin é usado para coloração de imunofluorescência de γH2AX e outro cytospin é utilizado para γH2AX combinada e mancha de 53BP1 da imunofluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Ciclo celular padrões dependentes de γH2AX focos em fibroblastos normais da linha celular NHDF. (A) γH2AX focos (verde, Alexa 488) em núcleos (azul, DAPI) dos fibroblastos NHDF aparecem como pontos distintos em fase G0/G1 ou G2. (B) γH2AX focos em núcleos de fibroblastos em fase S aparecem como speckles pan-nuclear dispersos (barra de escala = 5 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : ΓH2AX focos em raio-x irradiados linfócitos de um indivíduo saudável. As imagens dos focos de γH2AX (verde, Alexa 488) em núcleos (azul, DAPI) dos linfócitos são registradas em 5 min após a irradiação com 100 mGy (barra de escala = 5 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Co localização dos focos de γH2AX e 53BP1 em células CD34 + de um paciente com leucemia mieloide aguda. Co localização de focos de γH2AX (verde, Alexa 488) e focos de 53BP1 (vermelho, Cy3) indica promoção da 53BP1-não-homólogos final-adesão reparação mecanismos mediados em sites de quebras de DNA dobro-Costa (barra de escala = 5 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 é um método útil para analisar a formação e reparação de ORL em um amplo espectro de domínios de investigação. Parâmetros críticos que influenciam o resultado dos experimentos são a fase do ciclo celular, os agentes utilizados para a fixação e permeabilização das células, a escolha dos anticorpos e o hardware e software, o microscópio de fluorescência.
A influência do ciclo celular em padrões de focos γH2AX foi demonstrada pelo crescimento exponencial fibroblastos normais da linha celular NHDF. Os focos de γH2AX apareceram como distintos pontos fluorescentes em G0/G1 e fases G2 em comparação com os salpicos de γH2AX pan-nuclear disperso na fase S (Figura 5). Os focos de γH2AX distintas no G0/G1 fase e no G2 fase indicado transitório e/ou constitutivo dano do ADN que talvez tenham sido adquirido durante passagens repetitivo ciclo celular; por outro lado, a cegueta dispersas na fase S ocorreu apenas transitoriamente e foram presumivelmente associadas com o processo de replicação. Como o γH2AX pan-nuclear pode perturbar o cegueta recomenda-se a análise de focos γH2AX genuíno, a exclusão de células em fase S de análise, que é facilmente feito pelo padrão de γH2AX específico de fase S. Alternativamente, as células na fase S podem ser excluídas por medição da intensidade do sinal DAPI ou por aplicação de S fase marcadores específicos (por exemplo, A Cyclin). Além disso, a indução da detenção do crescimento com sincronização de células em fase G0/G1 pode ser útil antes de preparar o cytospins, armazenando as amostras à temperatura ambiente (ou seja, 18-20 ° C) durante a noite.
Os procedimentos de fixação e permeabilização são passos críticos em immunostaining de γH2AX e 53BP1. A fixação é necessária preservar a morfologia e antigenicidade da células23. Permeabilização permite acesso para os antígenos nucleares e intracelular24. PFA é um agente relativamente suave para fixação e estabiliza as células preservando estruturas proteicas por reagir com aminoácidos básicos para formulário de metileno ligações cruzadas. Após a fixação com PFA, cytospins pode ser armazenado por dias e semanas até processamento adicional. Para detecção de γH2AX e 53BP1, as células têm que ser permeabilizado. Octoxinol 9 foi usado como um detergente não-iônico contendo grupos de cabeça hidrofílicos descarregados consistindo de polioxietileno metades. Octoxinol 9 rompe-se o núcleo de células suavemente e preserva γH2AX focos muito distintamente. Alternativamente, metanol pode ser usado para a fixação e permeabilização das células, também. Metanol precipita proteínas e lipídios de membrana celular, tornando-as permeáveis aos anticorpos dissolve-se. No entanto, o tratamento com metanol é presumivelmente mais agressivo e γH2AX focos podem não aparecer como distintamente quando comparado com os focos de γH2AX obtidos por tratamento com 4% PFA e 0,1% Octoxinol 9. Não obstante, anticorpos eficientes desempenham um papel fundamental para a imunocoloração de γH2AX e 53BP1. Portanto, recomenda-se o uso de anticorpos comprovados (ver Tabela de materiais e equipamentos). Uma diluição serial dos anticorpos pode ser útil para determinar as concentrações de anticorpo.
Focos de γH2AX são usados como um marcador em biodosimetry de radiação em doses baixas e > 1 mGy25. ΓH2AX focos foram analisados em linfócitos em 5 min após a irradiação de raios-x com uma dose de 100 mGy em vitro (Figura 6). Como H2AX é phosphorylated rapidamente em sites de ORL após a irradiação, o número de focos de γH2AX já pode atingir um máximo em 5 min após irradiação20,22. No entanto, o processo de reparação começa imediatamente após a irradiação e focos de γH2AX são removidos em uma taxa de decaimento distintas. Portanto, para monitorar o número de focos de γH2AX em uma sequência cronológica, é aconselhável interromper o processo de reparação, colocando a amostra em gelo no ponto especificado no tempo após a irradiação.
Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 é um método útil para a análise de instabilidade genética em células cancerosas. Células CD34 + foram enriquecidas da medula óssea de um paciente com leucemia mieloide aguda usando microbeads CD34. Imagens de focos de γH2AX e 53BP1 focos foram obtidas usando filtros de fluorescência específica. Uma iluminação brilhante do cytospin é importante para induzir a fluorescência adequada dos focos de γH2AX e 53BP1. Depois de gravar a imagem, uma adaptação da intensidade dos focos e o sinal de fundo é necessária usando o software de imagem. Para analisar a localização co de focos de γH2AX e 53BP1, as imagens são mescladas (Figura 7). Um microscópio de epifluorescência básico equipado com filtros para DAPI, Alexa 488 e Cy3 em combinação com um sistema de câmera e software de imagem é suficiente para a análise de γH2AX e 53BP1 focos em DAPI manchado do núcleo de células. No entanto, determinadas aplicações (por exemplo, análise de danos de DNA ao longo das trilhas de partícula única) podem exigir maior resolução e redução da fluorescência fundo (conforme fornecido por exemplo, pelo laser confocal, microscopia eletrônica de varredura). Além disso, a tecnologia do microscópio é um campo em rápido desenvolvimento e uma resolução abaixo de 200 nm é viável com microscópios de estado-da-arte.
Em resumo, este manuscrito destaca questões críticas de reparação e formação de ORL e fornece um protocolo passo a passo para uma análise detalhada de ORL por microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1. A pesquisa sobre ORL claramente beneficiará desenvolvimentos recentes e futuros em tecnologia do microscópio.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
O projeto foi apoiado pela Fundação de leucemia do alemão José Carreras (14 DJCLS R/2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
| Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
| Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
| Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
| Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
| Cytospin device | |||
| Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
| Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
| Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
| Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
| Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
| Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
| Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-31572 | Secondary antibody |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
| Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
| Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |
References
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