Summary
Эта рукопись обеспечивает протокол для анализа двухнитевые разрывы ДНК, иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1.
Abstract
Двухнитевые разрывы ДНК (DSB) являются серьезные повреждения ДНК. Анализ формирования и ремонт DSB актуальна в широком спектре областей исследований, включая целостности генома, генотоксичности, радиационной биологии, старение, рак и разработки лекарственных средств. В ответ на DSB гистон H2AX фосфорилированных 139 Серина в регионе несколько пар megabase, образуя дискретных ядерной очагов обнаружено в иммунофлуоресценции. Кроме того, 53BP1 (белок p53 привязки 1) является другим важным DSB-отзывчивым белком, поощрение ремонт DSB nonhomologous конце-присоединиться к предотвращая гомологичная рекомбинация. Согласно конкретных функций γH2AX и 53BP1 совокупный анализ γH2AX и 53BP1, иммунофлуоресценции может быть разумный подход для детального анализа DSB. Эта рукопись предоставляет пошаговые протокол дополнена Методические заметки для выполнения метода. В частности влияние клеточный цикл на γH2AX очагов модели проявляется в нормальной фибробласты клетки линии NHDF. Кроме того значение очагов γH2AX качестве биомаркера изображен в рентгеновских облученных лимфоцитах здорового человека. Наконец генетическая нестабильность в CD34 + клеток у пациентов с острой миелоидной лейкемии расследуется иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1.
Introduction
ДНК постоянно разрушен эндогенных (например, стресс репликации, реактивнооксигенных видов, внутренняя нестабильность ДНК) и внешних (например, химических радикалов, облучение) источников (рис. 1)1,2 ,3,4. Среди повреждения ДНК двухнитевые разрывы ДНК (DSB) являются особенно серьезных поражений и может вызвать смерть клетки или канцерогенеза. Около 50 ОУС могут возникнуть за5клеток и клеточного цикла. В клетках млекопитающих гомологичная рекомбинация (HR) и nonhomologous конце присоединение (NHEJ) разработан как основных путей для ремонта ДГЖД (рис. 2). HR происходит в конце S/G2 фазе и использует нетронутыми сестра хроматиды как шаблон для ремонта потенциально без ошибок. В сравнении NHEJ активным на протяжении клеточного цикла и потенциально мутагенных как пар могут быть добавлены или резецируется перед лигирование сломанной заканчивается. Кроме того альтернативные присоединения конца могут привлекаться в качестве механизма медленно мутагенных резервного восстановления в случае NHEJ дефицит6,7.
DSB побудить фосфорилирование гистон H2AX 139 Серина в регионе несколько пар megabase вокруг каждого DSB. Формируя ядерной очагов названы γH2AX очагов и поддаются обнаружению с помощью микроскопии иммунофлуоресценции8. ΓH2AX способствует набору далее DSB-отзывчивым белков и участвует в chromatin remodeling, репарации ДНК и трансдукции сигнала9. Как считается, что каждый γH2AX фокус представляют единый DSB, количественная оценка DSB, иммунофлуоресценции возможно, которая была продемонстрирована в рак клеточных линий и пациентов образцов10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (белок p53 привязки 1) является другой ключевой белок в посредничестве DSB ремонт. Он участвует в наборе DSB-отзывчивым белков, контрольно-пропускной пункт сигнализации и Синапсис DSB заканчивается15. Кроме того 53BP1 играет решающую роль в выборе пути ремонт DSB. Это вызывает ремонт DSB к NHEJ время HR16. С учетом подлинных функций γH2AX и 53BP1 в ремонт DSB одновременный анализ γH2AX и 53BP1, иммунофлуоресценции может быть полезным методом для точного анализа формирования и ремонт DSB.
Эта рукопись содержит пошаговые протокол для выполнения иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1 в клеточных ядер. В частности техника применяется в нормальной фибробласты клетки линии NHDF, в рентгеновских облученных лимфоцитах здорового человека и CD34 + клеток у пациентов с острой миелоидной лейкемией. Подробности метода указано в контексте представленных результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
все методы, описанные здесь были одобрены II Комитет этики медицинского факультета Мангейма Гейдельбергского университета. Написанных информированное согласие было получено от всех лиц.
1. Подготовка материалов
- Стоковый раствор антикоагулянта: подготовить антикоагулянт Стоковый раствор 200 И.Ю гепарина на мл 0,9% хлорида натрия. Заполните каждый из коллекции трубок (рисовать объём 9 мл) с 2 мл антикоагулянт Стоковый раствор до вывода образцов крови или костного.
- Лизис решение для красных клеток: подготовка 10 x лизис решение для красных клеток с 82.91 г, аммония хлорида, бикарбонат аммония 7,91 g и 2 мл 0,5 М Этилендиаминтетрауксусная кислота раствора для рН 8,0, растворяя агентов в Двухместный дистиллированной воды для общим объемом 1 л
- Фиксации решение: добавить 8.3 мкл раствором гидроксида калия 1 M параформальдегида (PFA) 360 мг в микротитровальных трубке. Заполните трубу с фосфатный буфер (PBS) до отметки 1 мл трубки и тепловых труб в блоке Отопление на 95 ° C для получения 1 мл раствора PFA 36%. Передать решение PFA 36% 1 мл трубку с объемом 15 мл. Добавьте 8 мл PBS в 1 мл 36% PFA решение, чтобы получить 9 мл 4% раствора запасов PFA. Алиготе, 4% раствор PFA и хранить при температуре-18 ° C до использовать для фиксации клеток.
Предупреждение: 1) калия гидроксида раствор обладает коррозионными свойствами. Помните о защиты глаз и кожи. 2) PFA канцерогенами. Избегайте контакта с кожей и ингаляции. Приготовляют раствор фиксации под капотом. - Permeabilization решение: добавьте 50 мкл Octoxinol 9 до 50 мл PBS для получения решения приблизительно 0,1% Octoxinol-9.
- Преграждая разрешение: подготовить 5% и 2%, блокирование решений путем смешивания агент блокирования белка с PBS и хранить в 6 – 8 ° с.
2. Подготовка образцов
- фибробластов в культуре клеток: культивировать фибробластов клетки линии NHDF в увлажненные 5% CO 2 атмосфера при 37 ° C в среде RPMI 1640 с 10% плода телячьей сыворотки, 4 мм глютамин и 1% пенициллина/стрептомицина.
- Подготовка микроскопа с сторонником фибробласты
- удалить носитель из колбу (район рост 75 см 2) с экспоненциально растет NHDF фибробластов. PBS на 10мл флакон. Мыть нежно адэрентных фибробластов, вручную встряхивая колбу за 1 мин
- Удаление PBS и добавьте 1 mL трипсина в колбу. Встряхните флакон осторожно, чтобы обеспечить охват всех адэрентных клеток трипсином. Удаление трипсина из колбы. Поставьте колбу в инкубатор для 5 минут при 37 ° с.
- Принимают настой из инкубатора и добавляют 10 мл RPMI 1640 среднего в колбу. Пипетка средних вверх и вниз несколько раз, чтобы разогнать фибробласты.
- Пипетка 0,3 мл дисперсной фибробластов на каждой из двух полей микроскопа и поставить слайд в инкубатор на 24 часа, так что фибробласты присоединиться к слайду. Для иммуноокрашивания γH2AX и 53BP1 в ядрах фибробластов, переходите к шагу 3.1.
- Подготовка микроскопа с сторонником фибробласты
- Пациентов образцов
- кровь образцов: использовать коллекции трубок, которые были заполнены с 2 мл раствора антикоагулянт запасов и добавить 7 мл крови в трубы. Храните образцы на ночь при комнатной температуре (т.е., 18-20 ° C). Следующий день, изолировать G0/G1 фазе покоя мононуклеарных клеток центрифугированием градиента плотности (шаг 2.2.3).
- Образцы костного мозга: использовать коллекции трубок, которые были заполнены с 2 мл раствора антикоагулянт штока (шаг 1.1) и добавить 7 мл костного мозга в трубы. Храните образцы на ночь при комнатной температуре (т.е., 18-20 ° C). Следующий день, изолируйте G0/G1 фазе покоя мононуклеарных клеток центрифугированием градиента плотности (шаг 2.2.3). Использование CD34 микрошарики и клеточной разделения столбцов для изоляции CD34 + клеток.
- Изоляции мононуклеарных клеток центрифугированием градиента плотности
Примечание: Мононуклеаров изолированы от крови и костного образцы по плотности градиентного центрифугирования 17 , 18 , 19.- Развести гепаринизированным крови в соотношении 1:1 с PBS и образца гепаринизированным костного мозга в соотношении 1:3 с PBS. Осторожно приостановить клетки путем их рисования и из пипетки в два раза.
- Добавить объем среднего градиента плотности свежего трубки. Аккуратно слой разбавленной крови или костного мозга на вершине средний градиент плотности. Будьте осторожны, чтобы не смешивать два слоя.
- Центрифуга трубки для 30 мин при комнатной температуре и 400 x g. снимать верхний плазменный слой с пипеткой. Затем тщательно урожай мононуклеарных клеток в слое над средний градиент плотности. Передача мононуклеарных клеток в свежий трубку.
- Добавить по крайней мере три тома PBS мононуклеарных клеток в трубе. Осторожно приостановите клетки путем их рисования и из пипетки в два раза. Центрифуга для трубки для 10 мин при комнатной температуре и 400 x г.
- После отжима удалить супернатант и добавляют 10 мл 4 ° C, 1 x лизис решение для красных клеток. Нежно ресуспензируйте клетки путем их рисования и из пипетки в два раза и поместить трубку на льду на 5 мин. Затем добавьте 30 мл PBS на 4 ° C и центрифуги трубки для 10 мин при комнатной температуре и 400 x г.
- Подготовка cytospins
- подготовить два cytospins с мононуклеарных клеток пациента образцов (то есть, один из cytospin для γH2AX иммунофлюоресценции окрашивания и один cytospin для γH2AX и 53BP1 комбинированный пятнать иммунофлюоресценции) центрифугированием (300 x g, 10 мин) 1,0 x 10 5 клетки для каждого приготовления ( рис. 3 и 4).
3. γH2AX и 53BP1 иммунофлюоресценции окрашивание
- фиксации и permeabilization: исправить клетки с 200 мкл 4% ПФА за 10 мин. После фиксации Вымойте клетки мягко три раза с 30 мл PBS для 5 мин на шейкере лаборатории. Затем разрушения клеток с 200 мкл 0,1% Octoxinol 9 10 мин мыть клетки мягко три раза за 5 мин на лаборатории шейкер с 30 мл 5% раствора и блокировки. Заблокировать ячейки в 30 мл свежего 5%, преграждая разрешение для 1 ч.
- Инкубации с антител
- инкубировать один подготовки клетки с моноклонального анти γH2AX антитела мыши (1: 500) и другой подготовки клетки с моноклонального анти γH2AX антитела мыши (1: 500) и кролика polyclonal антитела анти 53BP1 (1: 500) на ночь в отеле 4 ° C.
- После инкубации вымыть клетки мягко 3 раза с 30 мл 2% раствора и блокировки для каждого 5 мин на лаборатории шейкер.
- Удалить блокирующий решение и инкубировать первый подготовки клетки с анти мыши вторичное антитело проспряганное Alexa488 коза (1: 500) и второй подготовки клетки с (анти мыши вторичное антитело проспряганное Alexa488 коза 1: 500) и анти кролик вторичные антитела конъюгированных Alexa555 осла (1: 500) за 1 ч при комнатной температуре.
- Среднего монтажа: слайд с клетками в миску и вымыть клетки мягко три раза для каждого 5 мин на лаборатории шейкер с PBS по 30 мл. Удаление PBS и смонтировать клетки с монтажа носитель, содержащий 4,6-diamidino-2-phenylindole. Осторожно положите coverslip поверх средства монтажа, так что нет пузырьков воздуха Встроенный. Подождите, по крайней мере 3 h для упрочнения среды монтажа до анализа клеток по микроскопии флуоресцирования.
4. Анализ γH2AX и 53BP1 очагов
- микроскопии флуоресцирования: анализ γH2AX и 53BP1 центрами в ядрах клеток с флуоресцентным микроскопом оснащены фильтрами для DAPI, Alexa 488 и Cy3 во время визуализации на объектив 100 X увеличение. Запись изображения с камеры и обрабатывать изображения с соответствующим программным обеспечением обработки изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ γH2AX очагов в клетках является наиболее точным в фазе G0/G1 и G2 фазе, когда γH2AX очаги появляются как собственный люминесцентные точки (Рисунок 5A). В отличие от анализа очагов γH2AX клеток в S фазе осложняется дисперсной Пан ядерных γH2AX крапинками, вызванные процессом репликации (Рисунок 5B).
Фиксация клеток была выполнена с 4% PFA (10 мин) и permeabilization с 0,1% Octoxinol 9 (10 мин). Метанол может использоваться для фиксации и permeabilization, тоже; Однако, метанола может разрушить клеточных ядер довольно сильно и мазок из очагов γH2AX так γH2AX очаги могут не отображаться различные по сравнению с γH2AX очагов, полученные путем обращения с 4% PFA и 0,1% Octoxinol 9.
Выбор эффективных антител имеет решающее значение для эффективного иммунофлуоресценции. Были проведены эксперименты с моноклонального анти γH2AX антитела мыши и поликлональными анти 53BP1 антитела первичной кролика для иммунофлюоресценции окрашивание γH2AX и 53BP1, соответственно.
Как считается, что каждый γH2AX фокус представляют единый DSB, иммунофлюоресценции окрашивание γH2AX может использоваться для количественной оценки ДГЖД в облученных тканей. Уровни γH2AX очагов в облученных лимфоцитов (рис. 6) пропорциональны облучения доза20,21. ΓH2AX очагов может достигнуть максимума уже 5 минут облучения20,22. Распад γH2AX очагов в более поздних моменты времени может контролироваться и отражает ремонт DSB20,21,22.
Генетическая нестабильность может быть проанализированы комбинированных иммунофлюоресценции окрашивание γH2AX и 53BP1 в клеточных линиях и опухоль образцов10,11,12,,1314. Образцовый анализ проводился в CD34 + клеток у пациентов с острой миелоидной лейкемии (рис. 7). Совместное локализации γH2AX и 53BP1 указал поощрения механизмов 53BP1-опосредованной NHEJ ремонта на объектах DSB, хотя HR было предотвращено. Однако доля совместно локализация γH2AX и 53BP1 очагов в взрывов острой миелоидной лейкемии был переменной. Очаги γH2AX без дополнительных 53BP1 сигнал может HR для ремонта DSB занимались конце S/G2 фазе. По-прежнему недостижимой роль единственного 53BP1 очагов.
Рисунок 1: Источники и последствия эндогенных и экзогенных ДНК повреждения1,2,3,4. DSB, двухнитевые разрывы ДНК; NHEJ, nonhomologous конец присоединение.
Рисунок 2 : Схема основных ДНК двухручьевой перерыва (DSB) ремонт механизмов в mammalian клетках. Гомологичная рекомбинация использует нетронутыми сестра хроматиды в конце S/G2 фазе для потенциально ошибка свободный ремонт DSB. Nonhomologous конце присоединение (NHEJ) активный повсюду клеточного цикла и потенциально подверженным ошибкам, как несколько пар могут быть добавлены или резецируется перед лигирование DSB заканчивается. Альтернативный конец присоединение является медленно мутагенных ремонт резервного копирования механизм, который может привлекаться в случае NHEJ дефицит. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Устройство для приготовления cytospins. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Подготовка cytospins. Два cytospins каждого образца подготавливаются центрифугированием 1,0 x 10 клеток5 в 300 g x 10 мин. Один cytospin используется для окрашивания γH2AX иммунофлюоресценции и другой cytospin используется для комбинированных γH2AX и 53BP1 иммунофлюоресценции окрашивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Клеточный цикл зависимых моделей γH2AX очагов в нормальной фибробласты клетки линии NHDF. (A) γH2AX очагов (зеленый, Alexa 488) в ядрах (синий, DAPI) NHDF фибробластов отображаются в виде отдельных точек в G0/G1 или G2 фазе. (B) γH2AX очагов в ядрах фибробластов в S фазе отображаются как дисперсной Пан ядерной крапинками (шкала бар = 5 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : ΓH2AX очагов в рентгеновских облученных лимфоцитах здорового человека. Изображения γH2AX очагов (зеленый, Alexa 488) в ядрах (синий, DAPI) лимфоцитов записываются в 5 мин после облучения с 100 мГр (шкала бар = 5 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 : Совместное локализация очагов γH2AX и 53BP1 в CD34 + клеток у пациентов с острой миелоидной лейкемией. Совместное локализации очагов γH2AX (зеленый, Alexa 488) и 53BP1 очагов (красный, Cy3) указывает на продвижение 53BP1-опосредованной nonhomologous прихода в конце ремонт механизмов на местах двухнитевые разрывы ДНК (шкала бар = 5 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1 является полезным методом для анализа формирования и ремонт ДГЖД в широком спектре областей исследований. Критические параметры, которые влияют на результаты экспериментов являются фазы клеточного цикла, агенты, используемые для фиксации и permeabilization клеток, выбор антител и аппаратное и программное обеспечение флуоресцентным микроскопом.
Влияние клеточный цикл на модели очагов γH2AX была продемонстрирована экспоненциально растет нормальной фибробласты клетки линии NHDF. Очаги γH2AX появился собственный флуоресцентные точками в G0/G1 и фазы G2 по сравнению с крапинками дисперсной Пан ядерных γH2AX в S-фазе (рис. 5). Собственный γH2AX очагов в G0/G1 фазе и в G2 фазе указанной временной и/или учредительный повреждения ДНК, которые возможно были приобретены во время повторяющихся клеточного цикла проходов; и наоборот рассеянных крапинками в S фазе произошло только временно и были предположительно связаны с процессом репликации. Пан ядерных γH2AX, которые могут нарушить крапинками рекомендуется анализ подлинных γH2AX очагов, исключение S фазе клетки из анализа, который легко делается в шаблоне конкретных γH2AX фазы S. Кроме того клетки в S-фазе могут быть исключены путем измерения интенсивности сигнала DAPI или применение S фазу определенных маркеров (например, Cyclin A). Кроме того индукции роста ареста с синхронизацией клеток в G0/G1 фазе может оказаться полезным до подготовки cytospins, сохраняя образцы при комнатной температуре (т.е., 18-20 ° C) на ночь.
Процедуры фиксации и permeabilization являются важнейшие шаги в иммуноокрашивания γH2AX и 53BP1. Фиксация необходима для сохранения морфологии и антигенностью клетки23. Permeabilization позволяет получить доступ к внутриклеточной и ядерных антигенов24. PFA является относительно мягким агент для фиксации и стабилизирует клетки при сохранении белковых структур, реагируя с основных аминокислот в форме метиленовой сшивки. После фиксации с PFA cytospins может храниться на дни и недели до дальнейшей обработки. Для обнаружения γH2AX и 53BP1 клетки должны быть permeabilized. Octoxinol 9 был использован как неионных моющих средств, содержащих незаряженных гидрофильной головки группы, состоящие из оксиэтилированных постановление. Octoxinol 9 разбивает клеточных ядер, нежно и сохраняет γH2AX очагов довольно отчетливо. Кроме того метанол может использоваться для фиксации и permeabilization клеток, тоже. Метанол осаждает протеины и растворяет липиды из клеточной мембраны, что делает их проницаемой для антител. Однако, лечение с метанолом предположительно более агрессивными и γH2AX очаги могут не отображаться как отчетливо по сравнению с γH2AX очагов, полученные путем обращения с 4% PFA и 0,1% Octoxinol 9. Несмотря на это эффективной антитела играют ключевую роль для иммуноокрашивания γH2AX и 53BP1. Поэтому, рекомендуется использовать проверенные антител (см. Таблицу материалов/оборудования). Серийный разбавления антитела могут быть полезны для определения концентрации оптимального антитела.
Очаги γH2AX используются в качестве маркера в Биодозиметрические излучения в малых дозах > 1 МГР25. Очаги γH2AX были проанализированы в лимфоцитах в 5 мин после рентгеновского облучения дозой 100 МГР в пробирке (рис. 6). Как H2AX быстро фосфорилированных на участках DSB после облучения, количество очагов γH2AX уже может достигать максимум в 5 мин после облучения20,22. Однако процесс восстановления начинается сразу после облучения и γH2AX очагов удаляются со скоростью собственный упадок. Таким образом для мониторинга числа очагов γH2AX в хронологической последовательности, желательно чтобы прервать процесс ремонта, поставив образца на льду в указанной точке во времени после облучения.
Иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1 является полезным методом для анализа генетической нестабильности в раковых клетках. CD34 + клеток из костного мозга пациента были обогащенный острого миелоидного лейкоза с помощью CD34 микрошарики. Изображения γH2AX очагов и 53BP1 очагов были получены с помощью конкретных флуоресценции фильтров. Яркого освещения cytospin имеет важное значение для стимулирования надлежащего флуоресценции очагов γH2AX и 53BP1. После записи образа, адаптация интенсивности медальоном и фонового сигнала необходимо с помощью визуализации программного обеспечения. Для анализа сотрудничества локализации очагов γH2AX и 53BP1, объединяются изображения (рис. 7). Основные эпифлуоресцентного микроскопа оснащены фильтрами для DAPI, Alexa 488 и Cy3 в сочетании с системой камер и обработки изображений программное обеспечение является достаточным для анализа γH2AX и 53BP1 очагов в DAPI окрашенных клеточных ядер. Однако некоторые приложения (например, анализ ДНК повреждения вдоль треков одной частицы) может потребовать выше резолюции и сокращение флуоресценции фон (как например, предоставляемые Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия). Кроме того, технология микроскопа является быстро развивающейся области и резолюции ниже 200 Нм осуществимо с Микроскопы искусства.
В целом эта рукопись освещаются важнейшие вопросы формирования ОУС и ремонт и предоставляет пошаговые протокол для детального анализа DSB, иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1. Исследования на ДЖД явно выиграют от недавних и будущих изменений в Микроскоп технологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Проект был поддержан фондом немецкого Хосе Каррерас лейкемии (DJCLS 14 R/2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
| Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
| Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
| Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
| Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
| Cytospin device | |||
| Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
| Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
| Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
| Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
| Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
| Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
| Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-31572 | Secondary antibody |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
| Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
| Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |
References
- Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Zeman, M. K., Cimprich, K. A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).
- IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf (1994).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).
- Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70. Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Scully, R., Xie, A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).
- Walters, D. K., et al. Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX. Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).
- Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).
- Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence. Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).
- Chen, E., et al. JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).
- Popp, H. D., et al. Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Leuk Res. 57, 112-118 (2017).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).
- Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Boyum, A. Separation of White Blood Cells. Nature. 204, 793-794 (1964).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
- Bain, B., Pshyk, K. Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).
- Popp, H. D., et al. Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology. Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).
- Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
- Lobrich, M., et al. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
- Rothkamm, K., Lobrich, M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).
