Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Immunofluorescens mikroskopi av γH2AX och 53BP1 för att analysera bildning och reparation av DNA dubbel-strand Breaks

Published: November 3, 2017 doi: 10.3791/56617

Summary

Detta manuskript ger ett protokoll för analys av DNA dubbel-strand raster genom immunofluorescens mikroskopi av γH2AX och 53BP1.

Abstract

DNA dubbel-strand raster (DSB) är allvarliga DNA skador. Analys av bildandet och reparation av DSB är relevant i ett brett spektrum av forskningsområden inklusive genomet integritet, genotoxicitet, strålningsbiologi, åldrande, cancer och läkemedelsutveckling. Svar på DSB, är Histon H2AX fosforyleras på Serine 139 i en region i flera megabase par bildar diskret nukleära foci kan upptäckas med hjälp av immunofluorescens mikroskopi. Dessutom 53BP1 (p53 bindande protein 1) är en annan viktig DSB-lyhörd protein att främja reparation av DSB genom nonhomologous slut-att gå samtidigt förhindra homolog rekombination. Enligt den specifika funktion γH2AX och 53BP1, kan den kombinerade analysen av γH2AX och 53BP1 genom immunofluorescens mikroskopi vara en rimlig strategi för en detaljerad analys av DSB. Detta manuskript ger en steg för steg-protokollet kompletteras med metodisk noter för att utföra tekniken. Specifikt, demonstreras påverkan av cellcykeln på γH2AX foci mönster i normala fibroblaster av raden cell NHDF. Vidare, värdet av de γH2AX foci som en biomarkör är avbildad i röntgen bestrålade lymfocyter av en frisk individ. Slutligen undersöks genetisk instabilitet i CD34 + celler hos en patient med akut myeloisk leukemi med hjälp av immunofluorescens mikroskopi av γH2AX och 53BP1.

Introduction

DNA skadas kontinuerligt av endogena (t.ex., replikering stress, reaktiva syreradikaler, inneboende instabilitet av DNA) och exogena (t.ex., kemisk radikaler, bestrålning) källor (figur 1)1,2 ,3,4. Bland DNA-skador, DNA dubbel-strand raster (DSB) är särskilt allvarliga lesioner och kan inducera celldöd eller karcinogenicitet. Ca 50 DSB uppstå per cell och cell cykel5. I däggdjursceller utvecklade homolog rekombination (HR) och nonhomologous slutet-sammanfogning (NHEJ) som större vägar för reparation av DSB (figur 2). HR uppstår i sena S/G2-fasen och använder en intakt syster kromatida som en mall för potentiellt felfri reparation. I jämförelse är NHEJ aktiv under hela cellcykeln och potentiellt mutagena som baspar kan läggas till eller resected före ligering av brutna ändarna. Dessutom kan alternativa slut-att gå vara engagerade som en långsam mutagena säkerhetskopiera reparation mekanism vid NHEJ brist6,7.

DSB inducera fosforyleringen av Histon H2AX på Serine 139 i en region i flera megabase par runt varje DSB. De bildar kärnkraft foci namnges γH2AX foci och kan påvisas med immunofluorescens mikroskopi8. ΓH2AX främjar rekrytering av ytterligare DSB-lyhörd proteiner och är involverad i kromatin remodeling, DNA-reparation och signaltransduktion9. Eftersom varje γH2AX fokus anses representera en enda DSB, är kvantifiering av DSB med hjälp av immunofluorescens mikroskopi möjligt, vilket har visats i cancer cellinjer och patientprover10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 bindande protein 1) är en annan Nyckelprotein medla DSB reparation. Det är involverade i rekryteringen av DSB-lyhörd proteiner, checkpoint signalering och synapsis DSB avslutar15. Dessutom spelar 53BP1 en avgörande roll i DSB reparation väg valet. Reparation av DSB mot NHEJ utlöser medan HR är förhindrade16. Med tanke på den äkta funktionen γH2AX och 53BP1 i DSB reparation, kan samtidig analys av γH2AX och 53BP1 genom immunofluorescens mikroskopi vara en användbar metod för exakt analys av bildning och reparation av DSB.

Detta manuskript ger en steg för steg-protokoll för att utföra immunofluorescens mikroskopi av γH2AX och 53BP1 i cellkärnan. Specifikt, tillämpas tekniken i normala fibroblaster av cellen fodrar NHDF, röntgen bestrålade lymfocyter av en frisk individ och CD34 + celler hos en patient med akut myeloisk leukemi. Information om metoden är påpekade i samband med de presenterade resultaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den etiska kommittén II av den medicinska fakulteten Mannheim vid universitetet i Heidelberg. Skriftligt informerat samtycke erhållits från alla individer.

1. beredning av material

  1. antikoagulans stamlösning: förbereda en blodförtunnande stamlösning av 200 IE heparin per mL 0,9% natriumklorid. Fylla varje samling rören (Rita volym 9 mL) med 2 mL av antikoagulerande stamlösning före uttag av blod eller benmärg proverna.
  2. Lysis lösning för erytrocyter: Förbered 10 x lysis lösning för erytrocyter med 82.91 g ammoniumklorid, 7.91 g hjorthornssalt och 2 mL 0,5 M etylendiamintetraättiksyra syra lösning för ett pH på 8,0 genom upplösning agenterna i dubbeldestillerat vatten för en total volym av 1 L.
  3. Fixering lösning: lägga till 8,3 µL av en 1 M kaliumhydroxid till 360 mg PARAFORMALDEHYD (PFA) i mikrotiter rör. Fyll röret med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till 1 mL märket tube och värme röret i ett värmeblock vid 95 ° C att få 1 mL av en lösning med 36% i PFA. Överför 1 mL 36% PFA lösningen till ett rör med en kapacitet på 15 mL. Tillsätt 8 mL PBS till 1 mL 36% PFA lösningen, för att få 9 mL 4% PFA stamlösning. Alikvot en 4% PFA stamlösning och förvaras vid-18 ° C fram till användning för fixering av cellerna.
    FÖRSIKTIGHET: 1) kaliumhydroxid är frätande. Tänk på ögon och hud. (2) PFA är cancerframkallande. Undvik hudkontakt och inandning. Bereda fixering lösning under en huv.
  4. Permeabilisering lösning: Tillsätt 50 µL oktoxinol 9 till 50 mL PBS att få en lösning av cirka 0,1% oktoxinol 9.
  5. Blockerar lösningen: förbereda 5% och 2% blockering lösningar genom att blanda det blockerande medlet för protein med PBS och store på 6 – 8 ° C.

2. Beredningen av proverna

  1. fibroblaster i cellodling: odla mänskliga fibroblaster av cellen fodrar NHDF i en fuktad 5% CO 2 atmosfär vid 37 ° C i RPMI 1640 medium kompletteras med 10% fetalt kalvserum, 4 mM glutamin, och 1% penicillin/streptomycin.
    1. Förberedelser inför ett objektglas med anhängare fibroblaster
      1. ta bort mediet från kolven (75 cm 2 tillväxtområde) med exponentiellt växande NHDF fibroblaster. Tillsätt 10 mL PBS till kolven. Tvätta de vidhäftande fibroblaster försiktigt genom att manuellt skaka kolven för 1 min.
      2. Ta bort PBS och tillsätt 1 mL trypsin i kolven. Skaka kolven försiktigt för att säkerställa att alla vidhäftande celler omfattas av trypsin. Ta bort trypsin från kolven. Sätt kolven i inkubatorn för 5 min vid 37 ° C.
      3. Ta kolven ur inkubatorn och tillsätt 10 mL RPMI 1640 medium i kolven. Pipettera medium upp och ner flera gånger att skingra fibroblaster.
      4. Pipettera 0,3 mL av de spridda fibroblaster på varje av de två områdena av objektglas och sätta bilden i inkubatorn för 24 h så att fibroblaster följa bilden. För immunfärgning av γH2AX och 53BP1 i kärnor av fibroblaster, gå till steg 3.1.
  2. Patientprover
    1. blod prover: använda samling rören som var fyllda med 2 mL av antikoagulerande stamlösning och lägga till 7 mL blod in i rören. Lagra proverna över natten i rumstemperatur (dvs. 18-20 ° C). Nästa dag, isolera den G0/G1-fasen vilar mononukleära celler genom täthet lutning centrifugering (steg 2.2.3).
    2. Benmärg prover: använda samling rören som var fyllda med 2 mL av antikoagulerande stamlösning (steg 1.1) och lägga till 7 mL benmärg in i rören. Lagra proverna över natten i rumstemperatur (dvs. 18-20 ° C). Nästa dag, isolera den G0/G1-fasen vilar mononukleära celler genom täthet lutning centrifugering (steg 2.2.3). Använda CD34 mikrokulor och cell Separationskolonner för isolering av CD34 + celler.
    3. Isolering av mononukleära celler genom täthet lutning centrifugering
      Obs: Mononukleära celler isoleras från blod och benmärg prover av täthet lutning centrifugering 17 , 18 , 19.
      1. Dilute hepariniserad blodprovet i förhållandet 1:1 med PBS och den hepariniserad benmärgsprov i förhållandet 1:3 med PBS. Avbryta cellerna försiktigt genom att rita dem in och ut ur pipetten två gånger.
      2. Lägga till en volym av täthet lutning medium till en frisk slang. Försiktigt lager utspätt blod eller benmärg ovanpå täthet lutning medium. Se till att inte blanda de två skikten.
      3. Centrifugera röret för 30 min i rumstemperatur och 400 x g. Rita lagrets övre plasma off med pipetten. Sedan noga skörd mononukleära celler i lagret ovanför täthet lutning medium. Överför de mononukleära cellerna till en färsk tube.
      4. Lägga till minst tre volymer av PBS mononukleära celler i röret. Avbryta cellerna försiktigt genom att rita dem in och ut ur pipetten två gånger. Centrifugera röret i 10 minuter vid rumstemperatur och 400 x g.
      5. Efter spin avlägsna supernatanten och tillsätt 10 mL av 4 ° C, 1 x lysis lösning för röda blodkroppar. Omsuspendera cellerna försiktigt genom att rita dem in och ut ur pipetten två gånger, och placera röret på is för 5 min. Tillsätt 30 mL PBS vid 4 ° C och centrifugera röret i 10 minuter vid rumstemperatur och 400 x g.
    4. Beredning av cytospins
      1. förbereda två cytospins med mononukleära celler av patientproverna (dvs, en cytospin för γH2AX immunofluorescens färgning och en cytospin för γH2AX och 53BP1 kombinerad immunofluorescens färgning) genom centrifugering (300 x g, 10 min) av 1,0 x 10 5 celler för varje beredning ( figur 3 och 4).

3. γH2AX och 53BP1 immunofluorescens färgning

  1. fixering och permeabilisering: fixa cellerna med 200 µL 4% PFA i 10 min. Efter fixering, tvätta cellerna försiktigt tre gånger med 30 mL PBS för 5 min varje på en lab shaker. Sedan permeabilize cellerna med 200 µL 0,1% oktoxinol 9 för 10 min. Tvätta cellerna försiktigt tre gånger med 30 mL 5% blockering för 5 min varje på en lab shaker. Blockera cellerna i 30 mL färsk 5% blockering lösning för 1 h.
  2. Inkubation med antikroppar
    1. Inkubera en beredning av cellerna med en mus monoklonal anti-γH2AX antikropp (1: 500) och annan beredning av cellerna med en mus monoklonal anti-γH2AX antikropp (1: 500) och ett polyklonala kanin-anti-53BP1 antikropp (1: 500) under natten vid 4 ° C.
    2. Efter inkubation tvätta cellerna försiktigt 3 gånger med 30 mL 2% blockerande lösning för varje 5 min på en lab skakapparat.
    3. Ta bort blockering lösningen och inkubera första beredning av cellerna med en Alexa488-konjugerad get antimus sekundär antikropp (1: 500) och andra utarbetandet av cellerna med en Alexa488-konjugerad get sekundära antimus-antikropp ( 1: 500) och en Alexa555-konjugerad åsna anti-kanin sekundär antikropp (1: 500) för 1 h i rumstemperatur.
  3. Monteringsmedium: Lägg bilden med celler i en skål och tvätta cellerna försiktigt tre gånger med 30 mL PBS för varje 5 min på en lab shaker. Ta bort PBS och montera cellerna med monteringsmedium som innehåller 4,6-diamidin-2-fenylindol. Försiktigt sätta ett täckglas ovanpå monteringsmedium så att inga luftbubblor är inbäddade. Vänta minst 3 h för härdning av monteringsmedium innan analysera cellerna av fluorescensmikroskopi.

4. Analys av γH2AX och 53BP1 Foci

  1. fluorescensmikroskopi: analysera de γH2AX och 53BP1 foci i cellkärnan med fluorescens Mikroskop utrustade med filter för DAPI, Alexa 488 och Cy3 under imaging på ett 100 X-objektiv förstoringen. Spela in bilder med en kamera och bearbeta bilder med lämpliga avbildningsprogrammet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analys av γH2AX foci i cellerna är mest korrekt i fasen G0/G1 och G2 fas när γH2AX foci visas som distinkta fluorescerande prickar (figur 5A). Analys av γH2AX foci i celler under S-fasen kompliceras däremot av spridda pan-nukleära γH2AX fläckar orsakade av replikeringen (figur 5B).

Fixering av cellerna utfördes med 4% PFA (10 min) och permeabilisering med 0,1% oktoxinol 9 (10 min). Metanol kan användas för fixering och permeabilisering, också; dock metanol kan bryta upp cellkärnorna ganska allvarligt och smeta ut de γH2AX foci så de γH2AX foci inte visas distinkta jämfört med de γH2AX foci erhålls genom behandling med 4% PFA och 0,1% oktoxinol 9.

Valet av effektiv antikroppar är avgörande för effektiv immunofluorescens mikroskopi. Experimenten utfördes med en primär mus monoklonal anti-γH2AX antikropp och en primär kanin polyklonala anti-53BP1 antikropp för immunofluorescens färgning av γH2AX och 53BP1, respektive.

Eftersom varje γH2AX fokus anses representera en enda DSB, kan immunofluorescens färgning av γH2AX användas för kvantifiering av DSB i bestrålade vävnaderna. Nivåer av γH2AX foci i bestrålade lymfocyter (figur 6) är proportionell till bestrålning dos20,21. ΓH2AX foci kan uppnå en maximal redan 5 min av bestrålning20,22. Sönderfallet av γH2AX foci vid senare tidpunkter kan övervakas och återspeglar reparation av DSB20,21,22.

Genetisk instabilitet kan analyseras genom kombinerade immunofluorescens färgning av γH2AX och 53BP1 i cellinjer och tumör exemplar10,11,12,13,14. En exemplarisk analys utfördes i CD34 + celler hos en patient med akut myeloisk leukemi (figur 7). Samtidig lokalisering av γH2AX och 53BP1 anges främjandet av 53BP1-medierad NHEJ reparationsmekanismer på platser för DSB medan HR hindrades. Men var andelen Co-lokalisera γH2AX och 53BP1 foci i Blaster av akut myeloisk leukemi variabel. De γH2AX foci utan en ytterligare 53BP1 signal kan ha bedrivit HR för reparation av DSB sen S/G2 fas. Rollen som singular 53BP1 foci återstod svårfångade.

Figure 1
Figur 1: Källor och konsekvenserna av endogena och exogena DNA skada1,2,3,4. DSB, DNA dubbel-strand raster; NHEJ, nonhomologous slut-att gå.

Figure 2
Figur 2 : Schematisk bild av den stora DNA dubbel-strand pausen (DSB) reparera mekanismer i däggdjursceller. Homolog rekombination använder en intakt syster kromatid i sen S/G2 fas för potentiellt felfri reparation av DSB. Nonhomologous slut-anslutning (NHEJ) är aktiv under hela cellcykeln och potentiellt felbenägna som några baspar kan läggas till eller resected före ligering av DSB ändarna. Alternativa slut-fogning är en långsam mutagena säkerhetskopiera reparation mekanism som kan anlitas när det gäller NHEJ-brist. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Enheten för att förbereda cytospins. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Beredning av cytospins. Två cytospins av varje prov bereds genom centrifugering av 1,0 x 105 celler vid 300 x g i 10 min. En cytospin används för γH2AX immunofluorescens färgning och en annan cytospin utnyttjas för kombinerade γH2AX och 53BP1 immunofluorescens färgning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Cellcykeln beroende mönster av γH2AX foci i normala fibroblaster cellens linje NHDF. (A) γH2AX foci (grön, Alexa 488) i kärnor (blå, DAPI) av NHDF fibroblaster visas som punkter i G0/G1 eller G2-fasen. (B) γH2AX foci i kärnor av fibroblaster i S fas visas som spridda pan-nukleära prickar (skalstapeln = 5 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : ΓH2AX foci i röntgen bestrålade lymfocyter av en frisk individ. Bilder av γH2AX foci (grön, Alexa 488) i kärnor (blå, DAPI) av lymfocyter är inspelade på 5 min efter bestrålning med 100 mGy (skalstapeln = 5 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Samtidig lokalisering av γH2AX och 53BP1 foci i CD34 + celler hos en patient med akut myeloisk leukemi. Samtidig lokalisering av γH2AX foci (grön, Alexa 488) och 53BP1 foci (röd, Cy3) indikerar främjande av 53BP1-medierad nonhomologous slutet-förbinder reparationsmekanismer på platser av DNA dubbel-strand breaks (skalstapeln = 5 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Immunofluorescens mikroskopi av γH2AX och 53BP1 är en användbar metod för att analysera bildandet och reparation av DSB i ett brett spektrum av forskningsområden. Kritiska parametrar som påverkar resultatet av experimenten är fasen i cellcykeln, de medel som används för fixering och permeabilisering av cellerna, valet av antikropparna, och den maskinvara och programvara av fluorescens Mikroskop.

Påverkan av cellcykeln på γH2AX foci mönster visades av exponentiellt växande normala fibroblaster av raden cell NHDF. De γH2AX foci framträdde som distinkta fluorescerande prickar i G0/G1 och G2 faser jämfört med de spridda pan-nukleära γH2AX prickarna i S fas (figur 5). De distinkta γH2AX foci i G0/G1 fas och i G2 fas indikerade övergående eller konstituerande DNA-skador som kan ha förvärvats under repetitiv cellcykeln passager; omvänt, de spridda fläckarna i S fas inträffade endast övergående och var förmodligen förknippade med replikeringsprocessen. Den pan-nukleära γH2AX prickar kan störa rekommenderas analys av äkta γH2AX foci, uteslutandet av S fas celler från analys, vilket görs lätt av S fas specifika γH2AX mönster. Alternativt kan celler i S-fas uteslutas genom mätning av intensiteten av DAPI signalen eller genom tillämpning av S fas specifika markörer (t.ex., Cyclin A). Induktionen av tillväxt gripandet med synkronisering av celler i G0/G1-fasen kan dessutom vara användbar innan du förbereder cytospins genom att lagra proverna i rumstemperatur (dvs., 18-20 ° C) över natten.

Förfarandena för fixering och permeabilisering är kritiska steg i immunfärgning av γH2AX och 53BP1. Fixering är nödvändigt att bevara morfologi och antigenicitet av celler23. Permeabilisering ger tillgång till den intracellulära och nukleära antigener24. PFA är en relativt mild agent för fixering och stabiliserar celler samtidigt bevara proteinstrukturer genom att reagera med grundläggande aminosyror till formuläret metylen antipyridinantikropp. Efter fixering med PFA, kan cytospins lagras i dagar och veckor tills vidare bearbetning. För påvisande av γH2AX och 53BP1 har cellerna till vara permeabilized. Oktoxinol 9 användes som ett icke-joniskt rengöringsmedel innehåller oladdat hydrofil huvud grupper bestående av polyoxyetylen beståndsdelarna. Oktoxinol 9 bryter upp cellkärna varsamt och bevarar γH2AX foci ganska tydligt. Alternativt kan metanol användas för fixering och permeabilisering av cellerna, alltför. Metanol påskyndar proteiner och upplöser lipider från cellmembranet, vilket gör dem genomsläppliga för antikroppar. Men behandling med metanol är förmodligen mer aggressiv och γH2AX foci kan inte visas som påtagligt jämfört med de γH2AX foci erhålls genom behandling med 4% PFA och 0,1% oktoxinol 9. Trots spelar effektiv antikroppar en nyckelroll för immunfärgning av γH2AX och 53BP1. Därför rekommenderas användning av beprövade antikroppar (se Tabell av material/utrustning). En seriell utspädning av antikroppar kan vara användbar för bestämning av optimala antikropp halterna.

ΓH2AX foci används som en markör i strålning biodosimetry vid låga doser > 1 mGy25. ΓH2AX foci analyserades i lymfocyter vid 5 min efter röntgen strålning med en dos av 100 mGy i vitro (figur 6). Som H2AX är fosforyleras snabbt på platser för DSB efter bestrålning, kan antalet γH2AX foci redan uppgå till högst 5 min efter bestrålning20,22. Dock reparationsprocessen startar omedelbart efter bestrålning och γH2AX foci tas bort med en distinkt decay hastighet. Därför för att övervaka antalet γH2AX foci i en kronologisk sekvens, är det lämpligt att avbryta reparationsprocessen genom att lägga provet på isen vid den angivna punkten i tid efter bestrålning.

Immunofluorescens mikroskopi av γH2AX och 53BP1 är en användbar metod för att analysera genetisk instabilitet i cancerceller. CD34 + celler berikades från benmärgen hos en patient med akut myeloisk leukemi med hjälp av CD34 mikrokulor. Bilder av γH2AX foci och 53BP1 foci erhölls med specifika fluorescens filter. En ljusa belysning av cytospin är viktigt att framkalla tillräcklig fluorescens av de γH2AX och 53BP1 foci. Efter inspelning bilden, är anpassning av intensiteten av foci och bakgrund signal nödvändigt med hjälp av avbildningsprogrammet. För att analysera samtidig localizationen av γH2AX och 53BP1 foci, bilderna sammanfogas (figur 7). En grundläggande epifluorescensmikroskop utrustade med filter för DAPI, Alexa 488 och Cy3 i kombination med ett kamerasystem och bildhanteringsprogram räcker för analys av γH2AX och 53BP1 foci i DAPI målat cellkärnor. Vissa program (t.ex., analys av DNA-skador längs enda partikel spår) kan dock kräva högre upplösning och minskning av den bakgrunden fluorescensen (enligt exempelvis confocal microscopy för laserscanning). Dessutom Mikroskop teknik är ett snabbt växande fält och en resolution nedanföra 200 nm är genomförbart med state-of-the-art Mikroskop.

Sammanfattningsvis, Detta manuskript belyser kritiska frågor av DSB bildandet och reparation och erbjuder en steg för steg-protokollet för en detaljerad analys av DSB med hjälp av immunofluorescens mikroskopi av γH2AX och 53BP1. Forskning om DSB gynnas tydligt senaste och framtida utvecklingen i mikroskopet teknik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Projektet stöddes av tyska José Carreras leukemi stiftelse (DJCLS 14 R/2017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI medium Sigma-Aldrich R0883 Medium for cell culture
Heparin sodium ratiopharm PZN 3029843  Heparin 5,000 I.U. / mL
Sodium chloride solution 0.9% B. Braun PZN 1957154 Component of the anticoagulant stock solution
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 Medium for isolation of mononuclear cells
Trypsin solution 10X Sigma-Aldrich 59427C Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture
CD34 MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-046-702 Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells
Diagnostic microscope slides Thermo Scientific ER-203B-CE24 Microscope slides
Megafuge 1.0 R Heraeus 75003060  Tabletop centrifuge 
Cytospin device
Lid Heraeus 76003422 Lid for working without micro-tubes
Cyto container Heraeus 75003416 Cyto container with 2 conical bores
Clip carrier Heraeus 75003414 Carrier for holding a cyto container and a slide
Support insert Heraeus 75003417 Support insert for holding a clip carrier
Triton X-100 (Octoxinol 9) Thermo Scientific 85112 Detergent for permeabilization of cell membranes
Potassium hydroxide solution 1M Merck Millipore 109107 Necessary for preparing the paraformaldehyde solution
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Fixation agent
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 Balanced salt solution
Chemiblocker Merck Millipore 2170 Blocking agent
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) Merck Millipore 05-636 Primary antibody for detection of γH2AX
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) Novus Biologicals NB100-304 Primary antibody for detection of 53BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody Invitrogen A-11001 Secondary antibody
Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody Invitrogen A-31572 Secondary antibody
Vectashield mounting medium Vector Laboratories H-1200 Contains DAPI for staining of DNA
Axio Scope.A1 Zeiss 490035 Fluorescence microscope
Cool Cube 1 CCD camera Metasystems H-0310-010-MS Camera system for digital recording
Isis software Metasystems Not applicable Microscope software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
  2. Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
  3. Zeman, M. K., Cimprich, K. A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).
  4. IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf (1994).
  5. Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).
  6. Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).
  7. Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70. Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).
  8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  9. Scully, R., Xie, A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).
  10. Walters, D. K., et al. Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX. Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).
  11. Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).
  12. Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence. Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).
  13. Chen, E., et al. JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).
  14. Popp, H. D., et al. Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Leuk Res. 57, 112-118 (2017).
  15. Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).
  16. Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
  17. Boyum, A. Separation of White Blood Cells. Nature. 204, 793-794 (1964).
  18. Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
  19. Bain, B., Pshyk, K. Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).
  20. Popp, H. D., et al. Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology. Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).
  21. Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
  22. Lobrich, M., et al. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).
  24. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
  25. Rothkamm, K., Lobrich, M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).

Tags

Frågan 129 γH2AX immunofluorescens mikroskopi cellbiologi 53BP1 röntgen genetisk instabilitet DNA dubbel-strand raster DNA-reparation
Immunofluorescens mikroskopi av γH2AX och 53BP1 för att analysera bildning och reparation av DNA dubbel-strand Breaks
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann,More

Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J. Vis. Exp. (129), e56617, doi:10.3791/56617 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter